Makalah Seminar BBRP2B Ace Baehaki
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI PROTEASE DARI MIKROORGANISME
PERAIRAN RAWA INDRALAYA SUMATERA SELATAN1
(Purification and Characterization a Protease from Microorganism Isolated from
Indralaya Swamp South Sumatera)
Oleh:
Ace Baehaki2), Rinto2)
ABSTRAK
Tujuan penelitan ini adalah untuk melakukan purifikasi dan karakterisasi protease dari
bakteri perairan rawa Indralaya. Isolat A6S3 dipilih karena memiliki aktivitas protease
tertinggi. Hasil purifikasi dengan kolom gel sephadex G-100 menunjukkan peningkatan
derajat kemurnian enzim protease bakteri isolat A6S3. Untuk fraksi 5 terjadi peningkatan
kemurnian menjadi 3,3 kali, untuk fraksi 10 terjadi peningkatan kemurnian menjadi 3,8,
sedangkan fraksi 46 derajat kemurniannya 3,5. Protease ini mempunyai pH optimum 8
dan suhu optimum sekitar 50 oC, Inhibitor ion logam yang kuat terhadap protease dari
bakteri A6S3 adalah Fe2+ (1 mM), K+ dan Zn2+ dan dapat dihambat oleh EDTA. Analisis
SDS-PAGE dan zimogram pada protease ekstrak kasar didapatkan protease untuk isolat
A6S3 memiliki 2 pita dengan berat molekul 106 kD dan 121 kD.
Kata Kunci: Purifikasi, Karakterisasi, Protease, Rawa Indralaya
1)
Makalah pada Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan
Perikanan II, Jakarta 9 Agustus 2010
2)
Program Studi Teknologi Hasil Perikanan, Fakultas Pertanian Universitas Sriwijaya
Jl. Palembang-Prabumulih Km32 Indaralaya Ogan Ilir Sumatera Selatan,
E-mail: ace76_none@yahoo.com
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
1
ABSTRACT
The purpose of the research was to study the purification and characterization of
extracellular protease produced from microorganism isolated from Indralaya Swamp
South Sumatera. The A6S3 isolate was selected due to its high protease activity The was
purified in sephadex G-100 gel permeation chromatography showed that increased degree
of purified this enzyme. The fraction 5, 10 and 46 were purified 3,3; 3,8 and 3,5 fold,
respectively. The optimum pH and temperature of proteases from A6S3 were 8 and
500C, respectively. Effect of metal ions, Fe2+, K+ and Zn2+ showed strong inhibited
protease A6S3. Effect of specific inhibitor (EDTA) showed EDTA inhibited protease
A6S3.
Moleculer weights were determinited by using SDS-PAGE and zymogram
technique. Moleculer weight protease isolate A6S3 was 106 kD and 120 kD.
Keywords: Purification, Characterization, Protease, Indralaya Swamp
PENDAHULUAN
Protease adalah enzim yang mengkatalisasi pemecahan ikatan peptida dalam
peptida, polipeptida dan protein dengan menggunakan reaksi hidrolisis menjadi molekul
yang lebih sederhana seperti peptida rantai pendek dan asam amino (Naiola dan
Widyastuti 2002). Protease merupakan kelompok enzim-enzim yang kompleks yang
menduduki posisi sentral dalam aplikasinya pada bidang fisiologis dan produk-produk
komersial.
Protease ekstraseluler sebagian besar berperan dalam hidrolisis substrat
polipetida besar. Enzim proteolitik intraseluler memainkan peran penting dalam
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
2
metabolisme dan proses regulasi pada sel hewan, tumbuhan dan mikroorganisme, seperti
mengganti protein, memelihara kesetimbangan antara degradasi dan sintesis protein.
Protease intraseluler juga berperan dalam fungsi fisiologis lainnya seperti pencernaan,
maturasi hormon, perakitan virus, respon imun, inflamasi, fertilisasi, koagulasi darah,
fibrinolisis, kontrol tekanan darah, sporulasi, germinasi dan patogenesis (Rao et al 1989).
Protease juga diimplikasikan dalam peran regulasi ekspresi gen, perbaikan DNA dan
sintesis DNA (Kalisz 1988).
Protease merupakan enzim penting yang digunakan secara luas pada aplikasi
industri melalui reaksi sintesis dan reaksi is, yang hampir mencapai 65% dari total
penjualan enazim di dunia (Huang 2006). Protease digunakan pada beberapa aplikasi
industri seperti detergen, farmasi, produk-produk kulit, pengempukan daging, hidrolisat
protein, produk-produk makanan dan proses pengolahan limbah industri.
Salah satu sumber enzim protease adalah dari mikroba. Pemilihan mikroba
sebagai sumber enzim mempunyai keuntungan bila dibandingkan dengan yang diisolasi
dari tanaman ataupun hewan. Antara lain adalah sel mikroba relatif lebih mudah
ditumbuhkan, kecepatan pertumbuhan relatif lebih cepat, skala produksi sel lebih mudah
ditingkatkan bila dikhendaki produksi yang lebih besar, biaya produksinya relatif rendah,
kondisi selama produksi tidak tergantung oleh adanya pergantian musim dan waktu yang
dibutuhkan dalam proses produksi lebih pendek (Meyrath dan Volvasek 1975 dalam
Pakpahan 2009). Penelitian mikroba sebagai sumber alami penghasil enzim ini sudah
banyak dilakukan akan tetapi penelitian mikroba dengan habitat tertentu seperti dari rawa
masih sedikit. Sehingga penelitian enzim protease dari mikroba rawa penting untuk
dilakukan sebagai alternatif baru sebagai sumber penghasil enzim mengingat daerah
Sumatera Selatan termasuk daerah Indralaya memiliki daerah rawa yang sangat luas yang
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
3
tentunya terdapat mikroba yang memiliki keanekaragaman yang tinggi sebagai penghasil
protease ini.
METODE PENELITIAN
Metode penelitian yang dilakukan terdiri dari beberapa tahap meliputi : produksi
protease ekstrak kasar, purifikasi dengan kromatografi filtrasi gel dan karakterisasi
terhadap protease ekstrak kasar.
Produksi Protease Ekstrak Kasar
Mikroba diinokulasi sebanyak 1-2 lup pada media Luria Broth (LB) dengan
komposisi tripton 1%, NaCl 1% dan yeast extract 0,5%.
Proses diawali dengan
penentuan umur prekultur (dalam media LB) yang tepat untuk keperluan produksi enzim.
Pengamatan dilakukan dengan mengukur optical density (OD) sampai nilai OD = 0,8
pada λ = 620 nm. Media LB yang sudah mempunyai OD = 0,8 diambil 10% kemudian
ditambahkan pada media LB yang baru sebagai media untuk memproduksi protease.
Pada media LB ini diukur nilai OD, aktivitas protease dan kadar protein setiap 8 jam
selama 56 jam. Untuk memisahkan sel dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 3000
rpm selama 15 menit pada suhu 4 0C.
Pengukuran Aktivitas Protease dan Kadar Protein
Aktivitas
protease
diukur
dengan
metode
menggunakan substrat kasein Hammerstein 2% (b/v).
Bergmeyer
(1983)
dengan
Satu unit aktivitas protease
didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat menghasilkan satu μmol produk tirosin
per menit pada kondisi pengukuran. Kadar protein ditentukan dengan metode Bradford
(1976) menggunakan Bovine Serum Albumin Fraction V sebagai standar protein.
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
4
Purifikasi Protease
Purifikasi dilakukan dengan menggunakan kromatografi filtrasi gel menggunakan
Sephadex G-100. Sebelum dilakukan pemurnian terlebih dahulu dilakukan pengendapan
dengan amonium sulfat teknis dengan konsentrasi amonium sulfat 20-90%
yang
dilanjutkan dengan dialisis menggunakan kantong dialisis cut-off 10 kD (Sigma).
Sebanyak 0,75 gram Sephadex G-100 (Sigma) dibasahkan dengan 75 ml air bebas
ion kemudian dipanaskan 900C sambil diaduk perlahan selama 90 menit dan dibiarkan
sampai dingin, kemudian simpan dalam ruangan 40C semalam. Larutan didekantasi lalu
supernatan diganti dengan buffer Tris-HCl 0,1 M pH 8 sambil diaduk perlahan. Larutan
protease sebanyak 1 ml dimasukan dengan pipet secara perlahan ke dalam kolom tepat di
atas permukaan gel. Kolom diisi dengan pengelusi yaitu buffer Tris-HCl 10 mM pH 8.
Diambil setiap fraksi masing-masing 70 (2 ml) tetes ditampung dalam fraction collector
(Redifrac, Pharmacia-Biotech).
Karakterisasi protease
Uji karakterisasi protease yang meliputi pengaruh pH (6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9)
menggunakan buffer Tris-HCl, suhu (30 0C, 40 0C, 50 0C, 60 0C, 70 0C), ion logam (K+,
Mn2+, Zn2+ dan Fe2+) dan inhibitor spesifik (EDTA). Konsentrasi ion logam dan inhibitor
spesifik yang digunakan masing-masing adalah 1 mM dan 5 mM.
SDS PAGE dan Zimogram
Penentuan berat molekul dilakukan menggunakan SDS PAGE (Laemmli 1970).
Sedangkan zimogram menggunakan modifikasi metode Choi et al, (2001). Gel akrilamid
8% dikopolimerisasi dengan substrat kasein 2%. Setelah gel dilakukan elektroforesis, gel
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
5
direndam dengan Triton X-100 2,5% selama 1 jam dan dilakukan inkubasi dalam buffer
Tris-Cl 10 mM, pH 8 selama 24 jam. Pewarnaan dengan silver staining yaitu : gel
direndam dalam larutan fikasasi (25% metanol dan 12% asam asetat) selama 1 jam
kemudian direndam dalam 50% etanol selama 20 menit, kemudian diganti dengan 30%
etanol selama 2 x 20 menit, larutannya diganti dengan enhancer kemudian dicuci dengan
akuadestilata, setelah dicuci ditambahkan larutan silver nitrat selama 30 menit kemudian
dicuci lagi dengan akuadestilata 2 x 20 detik dan ditambahkan larutan campuran Na2CO3
dan formaldehida dan terakhir dengan larutan fiksasi.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Produksi protease ekstrak kasar
Isolat yang digunakan untuk produksi protease ekstrak kasar dan selanjutnya
dilakukan pemurnian adalah isolat dari A6S3. Pemilihan isolat ini berdasarkan hasil
penelitian sebelumnya yaitu memiliki aktivitas protease tertinggi dibandingkan dengan
isolat lainnya.
Produksi protease dilakukan dengan cara bakteri isolat A6S3 diinokulasi sebanyak
1-2 lup pada media Luria Bertani Broth (LB) dengan komposisi tripton 1%, NaCl 1%,
yeast extract 0,5% dan skim milk
Proses diawali dengan penentuan umur prekultur
(dalam media LB) yang tepat untuk keperluan produksi enzim. Pengamatan dilakukan
dengan mengukur optical density (OD) sampai nilai OD = 0,8 pada λ = 620 nm. Media
LB yang sudah mempunyai OD = 0,8 diambil 10% kemudian ditambahkan pada media
LB yang baru sebagai media untuk memproduksi protease. Media yang baru sebanyak 3
liter selanjutnya diinkubasi selama 48 jam (waktu optimum produksi protease isolat
A6S3). Untuk memisahkan sel dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama
15 menit pada suhu 4 0C. Dengan teknik ini, sel akan mengendap oleh adanya gaya
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
6
gravitasi sedangkan enzim tetap terdapat pada supernatan. Sentrifugasi dilakukan pada
suhu rendah untuk mencegah terjadinya kerusakan struktur enzim, selanjutnya dilakukan
pengujian aktivitas protease.
Pengendapan dengan ammonium sulfat dan dialisis
Pengendapan protease dilakukan bertujuan untuk mengendapkan protein protease.
Pengendapan dilakukan dengan menggunakan ammonium sulfat dengan beberapa
perlakuan yaitu 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% dan 90%. Penambahan
ammonium sulfat dilakukan secara perlahan-lahan sambil larutan enzim distirer pada
kondisi suhu 4 0C. Selanjutnya didiamkan semalam dan dilakukan sentrifugasi. Endapan
dan filtrat masing-masing perlakuan diuji aktivitasnya. Aktivitas tertinggi pada endapan
dan aktivitas terendah pada filtrat yang selanjutnya dipilih. Hasil pengendapan dapat
dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Pengendapan dengan ammonium sulfat
Figure 1. Ammonium sulfate precipitation
Hasil pengendapan dengan ammonium sulfat menunjukkan aktivitas protease
tertinggi pada endapan adalah dengan pengendapan ammonium sulfat 70%. Sedangkan
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
7
aktivitas terendah pada filtrat adalah 60%, akan tetapi pada filtrat 70% memiliki aktivitas
yang rendah sehingga pengendapan selanjutnya adalah dengan ammonium sulfat 70%.
Hasil pengendapan ammonium sulfat 70% selanjutnya dilakukan dialisis dengan
menggunakan kantong dialisis untuk menghilangkan garam-garam ammonium sulfat.
Purifikasi dengan kromatografi kolom Sephadex G-100
Purifikasi atau pemurnian protease isolat A6S3 dengan kromatografi filtrasi gel
menggunakan Sephadex G-100 sebagai matriks, dan bufer Tris-HCl 0,05 M, pH 8
sebagai pengelusinya. Sebelum dilakukan pemurnian dengan kromatografi gel, terlebih
dahulu dilakukan pengendapan amonium sulfat 70% yang dilanjutkan dengan dialisis.
Setiap fraksi yang keluar dari kolom diukur aktivitas protease dan kadar protein, hasil
tertera pada Gambar 2. Hasil kromatografi menunjukkan terdapat 3 (tiga) puncak fraksi
yang memiliki aktivitas tertinggi yaitu fraksi 6, 10 dan 46.
Gambar 2. Kromatogram protease isolat A6S3 dengan Sephadex G-100
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
8
Figure 2. Kromatogram of isolate A6S3 protease with Sephadex-G-100
Hasil purifikasi protease bakteri isolat A6S3 dilakukan dengan kolom Sephadex
G-100 tertera pada Tabel 1. Dibandingkan dengan crude protease hasil ekstraksi dengan
ammonium sulfat terjadi peningkatan derajat kemurnian enzim dengan kromatografi
kolom ini. Untuk fraksi 5 terjadi peningkatan kemurnian menjadi 3,3 kali, untuk fraksi
10 terjadi peningkatan kemurnian menjadi 3,8, sedangkan fraksi 46 derajat kemurniannya
3,5.
Tabel 1. Tahapan purifikasi protease isolat A6S3
Table 1. Purification steps of isolate A6S3 protease
Tahapan
pemurnian
Volume
(ml)
Total
Total Aktivitas
aktivitas protein spesifik
(IU)
(mg)
(IU/mg)
Derajat
kemurnian
relatif
0,14
1600
41,76
224
0,186
1
0,0273
0,0306
0,013
3
3
3
0,0507
0,066
0,0258
0,0819
0,0918
0,039
0,619
0,719
0,662
3,3
3,8
3,5
Aktivitas Kadar
Protease protein
(IU/ml)
(mg)
Pengendapan 0,0261
(NH4)2SO4
Sephadex G100
Fraksi 5
0,0169
Fraksi 10
0,022
Fraksi 46
0,0086
Protease yang telah dimurnikan dengan filtrasi gel menggunakan Sephadex G-100
mempunyai aktivitas spesifik dan tingkat kemurnian yang lebih tinggi dari tahap
sebelumnya.
Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa Sephadex G-100 dapat
digunakan untuk memisahkan protein yang dikhendaki yaitu enzim dari senyawasenyawa lain sebagai pengotor. Ekstrak kasar protein tercampur dengan asam nukleat,
karbohidrat dan garam organik. Logam berat dan asam nukleat biasanya mengganggu
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
9
kerja enzim, sehingga dapat menghilangkan kontaminan tersebut terjadi peningkatan
aktivitas enzim (Haris dan Angal 1989).
Karakterisasi Protease ekstrak kasar
Pengaruh pH
Perubahan pH pada skala deviasi kecil dapat menyebabkan turunnya aktivitas
enzim karena dengan perubahan ionisasi gugus-gugus fungsionilnya. Gugus ionik
berperan penting dalam menjaga konformasi sisi aktif enzim untuk mengikat dan
mengubah substrat menjadi produk. Pada perubahan skala deviasi besar, perubahan pH
akan mengakibatkan enzim mengalami denaturasi karena adanya gangguan terhadap
berbagai interaksi nonkovalen yang menjaga kestabilan struktur tiga dimensi enzim
(Hames dan Hopper 2000)
Gambar 3. Pengaruh pH pada protease isolate A6S3
Figure 3. Effect of pH on isolate A6S3 protease
pH sangat berpengaruh terhadap aktivitas protease bakteri A6S3 (Gambar 3). pH
optimum aktivitas protease berkisar 8. Protease bakteri Pseudomonas aeruginosa
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
10
memiliki pH yang sama dengan isolat A6S3 yaitu pada pH 8 (Baehaki et al 2008).
Semakin jauh dari pH optimal enzim semakin tidak stabil sehingga aktivitasnya semakin
rendah.
Hal ini karena enzim merupakan protein yang tersusun atas asam amino,
pengaruh pH berhubungan dengan sifat asam basa yang dimiliki oleh protein.
PH
ekstrim dapat menyebabkan denaturasi protein enzim yang mengubah susunan ruang tiga
dimensi molekul protein enzim. Menurut Naz (2002) perubahan keaktifan enzim akibat
perubahan lingkungan menyebabkan terjadinya perubahan ionisasi enzim. Wong (1995)
menambahkan, pH ekstrim berpengaruh terhadap struktur enzim dan muatan substrat.
Kelebihan atau kekurangan ion H+ menyebabkan perubahan konformasi sisi aktif enzim,
sehingga substrat tidak lagi berikatan dengan enzim, selanjutnya berakibat pula pada
pembentukan produk.
Pengaruh Suhu
Pada umumnya setiap enzim memiliki aktivitas maksimum pada suhu tertentu,
aktivitas enzim akan semakin meningkat dengan bertambahnya suhu sampai suhu
optimum tercapai. Setelah itu kenaikan lebih lanjut akan menyebabkan aktivitas enzim
menurun. Pengaruh suhu terhadap aktivitas protease ekstrak kasar bakteri isolat air rawa
terdapat pada Gambar 4.
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
11
Gambar 4. Pengaruh suhu pada protease isolate A6S3
Figure 4. Effect of temperature on isolate A6S3 protease
Dari hasil pengukuran aktivitas enzim pada berbagai suhu, suhu optimum protease
bakteri isolat A6S3 dengan suhu inkubasi 500C. Penelitian protease bakteri lain
menujukkan bakteri yang berasal dari perairan memiliki suhu optimum yang cukup
tinggi, yaitu protease bakteri laut Alteromonas sp strain O7 memiliki suhu optimum 60 0C
(Miyamoto et al 2002) dan protease Pseudoalteromonas sp strain P96-47 dari laut
Artartik yang memiliki suhu optimum 45 0C (Vazquez et al 2008). Suhu mempengaruhi
laju reaksi katalisis enzim dengan dua cara. Pertama, kenaikan suhu akan meningkatkan
energi molekul substrat dan pada akhirnya meningkatkan laju reaksi enzim. Peningkatan
suhu juga berpengaruh terhadap perubahan konformasi substrat sehingga sisi aktif
substrat mengalami hambatan untuk memasuki sisi aktif enzim dan menyebabkan
turunnya aktivitas enzim. Kedua, peningkatan energi termal molekul yang membentuk
struktur protein enzim itu sendiri akan menyebabkan rusaknya interaksi-interaksi non
kovalen (ikatan hidrogen, ikatan van der walls, ikatan hidrofobik dan interaksi
elektrostatik) yang menjaga struktur 3D enzim secara bersama-sama sehingga enzim
mengalami denaturasi. Denaturasi menyebabkan struktur lipatan enzim membuka pada
bagian permukaannya sehingga sisi aktif enzim berubah dan mengakibatkan terjadi
penurunan aktivitas enzim (Hames dan Hooper 2000).
Pengaruh ion logam dan inhibitor spesifik
Beberapa enzim membutuhkan ion logam sebagai kofaktor untuk mendukung
efisiensi katalitik enzim. Logam tersebut membantu reaksi katalitik dengan cara mengikat
substrat pada sisi pemotongan. Selain berperan dalam pengikatan enzim dengan substrat,
beberapa logam juga dapat mengikat enzim secara langsung untuk menstabilkan
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
12
konformasi aktifnya atau menginduksi formasi situs pengikatan atau situs aktif suatu
enzim. Gambar 6 memperlihatkan pengaruh ion logam terhadap aktivitas protease bakteri
isolat A6S3.
Gambar 5.
Pengaruh ion logam pada protease isolate A6S3
Figure 5. Effect metal ions on isolate A6S3 protease
Inhibitor ion logam yang kuat terhadap protease dari bakteri A6S3 adalah Fe 2+, K+
dan Zn2+ (Gambar 5). Adanya penghambatan ion logam terhadap aktivitas protease pada
konsentrasi tertentu berkaitan dengan kekuatan ion, dimana kekuatan ion itu sendiri
mempengaruhi konformasi atau struktur tiga dimensi dari protein enzim atau protein
substrat (Suhartono 1989). Pada konsentrasi tertentu ion logam tertentu dapat bertindak
sebagai inhibitor, tetapi dapat juga bertindak sebagai aktivator pada konsentrasi lain
(Richardson dan Hyslop 1985).
Berdasarkan
mekanisme
reaksi
yang
dikatalisis,
endopeptidase
dapat
dikelompokkan menjadi empat yaitu: protease serin, protease aspartat, protease sistein
dan protease logam. Dalam penelitian ini penggolongan protease hasil produksi dilakukan
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
13
dengan cara mereaksikan dengan senyawa-senyawa inhibitor spesifik. Adapun pengaruh
inhibitor spesifik EDTA pada protease tanah rawa terdapat pada Tabel 2.
Tabel 2. Pengaruh inhibitor spesifik pada protease isolate A6S3
Table 2. Effect specific inhibitor on isolate A6S3 protease
Jenis bakteri
A6S3
Aktivitas residu (%)
EDTA
1 mM
5 mM
19,6
18,9
Tabel 2 menunjukkan EDTA (1mM dan 5 mM) dapat menghambat protease
isolat A6S3 hal ini dimungkinkan karena EDTA mengkelat logam-logam yang berperan
penting menjaga stabilitas serta logam yang berperan sebagai kofaktor enzim protease.
Karena protease ini dihambat oleh EDTA sehingga protease ini digolongkan sebagai
metaloprotease (protease logam).
Protease bakteri lain dari perairan yang termasuk
metalloprotease adalah Alteromonas sp O-7 (Miyamoto et al 2002).
Penentuan berat molekul dengan SDS PAGE dan Zimogram protease ekstrak kasar
Penentuan berat molekul dilakukan dengan teknik SDS-PAGE (Sodium dodesil
sulfat-Poliakrilamida gel elektroforesis) dan Zimogram merupakan metode yang sudah
digunakan secara luas. Pada penelitian ini ada dua macam gel yang digunakan yaitu gel
penahan (resolving gel) dan gel pemisah (stacking gel) yang mengandung akrilamid,
SDS, APS dan TEMED. Gel poliakrilamid diperoleh dengan cara polimerisasi akrilamid
dengan sejumlah cross linking agent metilena bis akrilamid dan amonium persulfat
(APS) sebagai katalisator. Radikal bebas yang terbentuk dari pelarutan ammonium
persulfat dalam air akan bereaksi dengan akrilamid membentuk akrilamid aktif yang
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
14
dapat bereaksi satu sama lain membentuk polimer. Hasil SDS-PAGE dan Zimogram
protease isolat bakteri air rawa dapat dilihat pada Gambar 6.
M
A6S3
M
A6S3
120 kD
106 kD
97 KDa
66 KDa
45 KDa
24 KDa
Gambar 6. SDS-PAGE dan Zimogram protease isolat A6S3 (M=marker)
Figure 6. SDS-PAGE and Zymogram of isolate A6S3 protease (M=marker)
Analisis SDS-PAGE pada protease ekstrak kasar didapatkan protease isolat A6S3
memiliki 12 pita dengan BM sekitar antara 19 kD sampai dengan 153 kD. Analisis
Zimogram pada protease ekstrak kasar didapatkan protease untuk isolat A6S3 memiliki 2
pita dengan BM
106 kD dan 120 kD. Bakteri TPS-2 yang diisolasi dari kawah
Tangkupan Perahu juga memiliki 2 pita dengan berat molekul 80 kD dan 45 kD
(Wahyuntari et al 2000).
KESIMPULAN
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
15
Hasil purifikasi dengan kolom gel sephadex G-100 menunjukkan peningkatan
derajat kemurnian enzim protease bakteri isolat A6S3. Untuk fraksi 5 terjadi peningkatan
kemurnian menjadi 3,3 kali, untuk fraksi 10 terjadi peningkatan kemurnian menjadi 3,8,
sedangkan fraksi 46 derajat kemurniannya 3,5. Protease ini mempunyai pH optimum 8,
suhu optimum sekitar 50 oC, Inhibitor ion logam yang kuat terhadap protease dari bakteri
A6S3 adalah Fe2+ (1 mM), K+ dan Zn2+ dan dapat dihambat oleh EDTA. Analisis SDSPAGE pada protease ekstrak kasar didapatkan protease isolat A6S3 memiliki 12 pita
dengan BM sekitar antara 19 kD sampai dengan 153 kD. Analisis Zimogram pada
protease ekstrak kasar didapatkan protease untuk isolat A6S3 memiliki 2 pita dengan BM
106 kD dan 120 kD.
UCAPAN TERIMA KASIH
Peneliti berterima kasih kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Depdiknas
yang telah membiayai penelitian ini melalui program Hibah Bersaing XVI tahun 2008.
DAFTAR PUSTAKA
Baehaki, A., Suhartono, M.T., Palupi, N.S. dan Nurhayati, T. 2008. Purifikasi dan
karakterisasi protease dari bakteri patogen Psudomonas aeruginosa. Jurnal Teknol
dan Industri Pangan 19: 80-86.
Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., and Graβl, M. 1983. Methods of Enzymatic Analysis.
Vol 2. Verlag Chemie., Weinheim.
Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive methodfor quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein dye-binding. Anal Biochem
72:234-254.
Choi, N.S., Yoon, K.S., Lee, J.Y., Han, K.Y., and Kim, S.H. 2001. Comparision of three
substrates (casein, fibrin, and gelatin) in zimographic gel. J Biochim Mol Biol
34:531-536.
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
16
Hames, B.D., and Hooper, N.M. 2000.
Springer-Verlag., Hongkong.
Biochemistry: The Instant Notes.
Ed.ke-2.
Harris, E.L.V., S, Angal. 1989. Protein Purification Methods.A Practical approach. IRL
Press., Oxford.
Huang, G., Ying, T., Huo, P., and Jiang, J. 2006. Purification and characterization of a
protease from thermophilic Bacillus strain HS08. African Biotecnol 5:2433-2438.
Kalisz, H.K. 1988. Microbial proteinases. Adv Biochim Eng Biotechnol 36; 1-65.
Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural protein during the assembly of the heat of
bacteriophag T4. Nature 227:680-685.
Miyamoto, K., Tsujibo, H., Nukui, E., Itoh, H., Kaidzu, Y., and Inamori, Y. 2002.
Isolation and characterization of the genes encoding two metalloproteases (MprI
and MprII) from a marine bacterium, Alteromonas sp. strain O-7. Biosci Biotecnol
Biochem 66:416-21
Naiola, E., dan Widhyastuti, N. 2002. Isolasi, seleksi dan optimasi produksi protease dari
beberapa isolat bakteri. Hayati 6:467-473.
Naz, S. 2002. Enzymes and Food. Oxford University Press., Pakistan.
Pakpahan R. 2009. Isolasi bakteri dan uji aktivitas protease termofilik dari sumber air
panas Sipoholon Tapanuli Utara Sumatera Utara. Tesis. Universitas Sumatera Utara.
Medan.
Rao, M.M., Tanksale, A.M., Gatge, M.S., and Desphande, V.V. 1998. Molecular and
biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiol And Mol Biol Rev
62:597-635.
Richardson, T., and Hyslop, D.B. 1985. Enzyme. In Fennema, O.R (Eds). Food
Chemistry. Mac Kerel Bekker, New York.
Suhartono MT. 1989. Enzim dan Bioteknologi. Pusat Antar Universitas Bioteknologi
IPB-Depdikbud. Bogor.
Vázquez, S.C., Hernández, E., and Cormack, W.P.M. 2008. Extracellular proteases from
the Antarctic marine Pseudoalteromonas sp. P96-47 strain. Revista Argentina
Microbiologia 40:63-71.
Wahyuntari, B., Suhartono, M.T., and Pyun, Y. 2000. Properties of extracelullar protease
from an extreme thermophilic microorganism isolated from Tangkupan Prahu
crater. Hayati 7: 6-10.
Wong, D.W.S. 1995. Food Enzymes: structure and mechanism. Chapman & Hall., New
York.
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
17
PERAIRAN RAWA INDRALAYA SUMATERA SELATAN1
(Purification and Characterization a Protease from Microorganism Isolated from
Indralaya Swamp South Sumatera)
Oleh:
Ace Baehaki2), Rinto2)
ABSTRAK
Tujuan penelitan ini adalah untuk melakukan purifikasi dan karakterisasi protease dari
bakteri perairan rawa Indralaya. Isolat A6S3 dipilih karena memiliki aktivitas protease
tertinggi. Hasil purifikasi dengan kolom gel sephadex G-100 menunjukkan peningkatan
derajat kemurnian enzim protease bakteri isolat A6S3. Untuk fraksi 5 terjadi peningkatan
kemurnian menjadi 3,3 kali, untuk fraksi 10 terjadi peningkatan kemurnian menjadi 3,8,
sedangkan fraksi 46 derajat kemurniannya 3,5. Protease ini mempunyai pH optimum 8
dan suhu optimum sekitar 50 oC, Inhibitor ion logam yang kuat terhadap protease dari
bakteri A6S3 adalah Fe2+ (1 mM), K+ dan Zn2+ dan dapat dihambat oleh EDTA. Analisis
SDS-PAGE dan zimogram pada protease ekstrak kasar didapatkan protease untuk isolat
A6S3 memiliki 2 pita dengan berat molekul 106 kD dan 121 kD.
Kata Kunci: Purifikasi, Karakterisasi, Protease, Rawa Indralaya
1)
Makalah pada Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan
Perikanan II, Jakarta 9 Agustus 2010
2)
Program Studi Teknologi Hasil Perikanan, Fakultas Pertanian Universitas Sriwijaya
Jl. Palembang-Prabumulih Km32 Indaralaya Ogan Ilir Sumatera Selatan,
E-mail: ace76_none@yahoo.com
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
1
ABSTRACT
The purpose of the research was to study the purification and characterization of
extracellular protease produced from microorganism isolated from Indralaya Swamp
South Sumatera. The A6S3 isolate was selected due to its high protease activity The was
purified in sephadex G-100 gel permeation chromatography showed that increased degree
of purified this enzyme. The fraction 5, 10 and 46 were purified 3,3; 3,8 and 3,5 fold,
respectively. The optimum pH and temperature of proteases from A6S3 were 8 and
500C, respectively. Effect of metal ions, Fe2+, K+ and Zn2+ showed strong inhibited
protease A6S3. Effect of specific inhibitor (EDTA) showed EDTA inhibited protease
A6S3.
Moleculer weights were determinited by using SDS-PAGE and zymogram
technique. Moleculer weight protease isolate A6S3 was 106 kD and 120 kD.
Keywords: Purification, Characterization, Protease, Indralaya Swamp
PENDAHULUAN
Protease adalah enzim yang mengkatalisasi pemecahan ikatan peptida dalam
peptida, polipeptida dan protein dengan menggunakan reaksi hidrolisis menjadi molekul
yang lebih sederhana seperti peptida rantai pendek dan asam amino (Naiola dan
Widyastuti 2002). Protease merupakan kelompok enzim-enzim yang kompleks yang
menduduki posisi sentral dalam aplikasinya pada bidang fisiologis dan produk-produk
komersial.
Protease ekstraseluler sebagian besar berperan dalam hidrolisis substrat
polipetida besar. Enzim proteolitik intraseluler memainkan peran penting dalam
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
2
metabolisme dan proses regulasi pada sel hewan, tumbuhan dan mikroorganisme, seperti
mengganti protein, memelihara kesetimbangan antara degradasi dan sintesis protein.
Protease intraseluler juga berperan dalam fungsi fisiologis lainnya seperti pencernaan,
maturasi hormon, perakitan virus, respon imun, inflamasi, fertilisasi, koagulasi darah,
fibrinolisis, kontrol tekanan darah, sporulasi, germinasi dan patogenesis (Rao et al 1989).
Protease juga diimplikasikan dalam peran regulasi ekspresi gen, perbaikan DNA dan
sintesis DNA (Kalisz 1988).
Protease merupakan enzim penting yang digunakan secara luas pada aplikasi
industri melalui reaksi sintesis dan reaksi is, yang hampir mencapai 65% dari total
penjualan enazim di dunia (Huang 2006). Protease digunakan pada beberapa aplikasi
industri seperti detergen, farmasi, produk-produk kulit, pengempukan daging, hidrolisat
protein, produk-produk makanan dan proses pengolahan limbah industri.
Salah satu sumber enzim protease adalah dari mikroba. Pemilihan mikroba
sebagai sumber enzim mempunyai keuntungan bila dibandingkan dengan yang diisolasi
dari tanaman ataupun hewan. Antara lain adalah sel mikroba relatif lebih mudah
ditumbuhkan, kecepatan pertumbuhan relatif lebih cepat, skala produksi sel lebih mudah
ditingkatkan bila dikhendaki produksi yang lebih besar, biaya produksinya relatif rendah,
kondisi selama produksi tidak tergantung oleh adanya pergantian musim dan waktu yang
dibutuhkan dalam proses produksi lebih pendek (Meyrath dan Volvasek 1975 dalam
Pakpahan 2009). Penelitian mikroba sebagai sumber alami penghasil enzim ini sudah
banyak dilakukan akan tetapi penelitian mikroba dengan habitat tertentu seperti dari rawa
masih sedikit. Sehingga penelitian enzim protease dari mikroba rawa penting untuk
dilakukan sebagai alternatif baru sebagai sumber penghasil enzim mengingat daerah
Sumatera Selatan termasuk daerah Indralaya memiliki daerah rawa yang sangat luas yang
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
3
tentunya terdapat mikroba yang memiliki keanekaragaman yang tinggi sebagai penghasil
protease ini.
METODE PENELITIAN
Metode penelitian yang dilakukan terdiri dari beberapa tahap meliputi : produksi
protease ekstrak kasar, purifikasi dengan kromatografi filtrasi gel dan karakterisasi
terhadap protease ekstrak kasar.
Produksi Protease Ekstrak Kasar
Mikroba diinokulasi sebanyak 1-2 lup pada media Luria Broth (LB) dengan
komposisi tripton 1%, NaCl 1% dan yeast extract 0,5%.
Proses diawali dengan
penentuan umur prekultur (dalam media LB) yang tepat untuk keperluan produksi enzim.
Pengamatan dilakukan dengan mengukur optical density (OD) sampai nilai OD = 0,8
pada λ = 620 nm. Media LB yang sudah mempunyai OD = 0,8 diambil 10% kemudian
ditambahkan pada media LB yang baru sebagai media untuk memproduksi protease.
Pada media LB ini diukur nilai OD, aktivitas protease dan kadar protein setiap 8 jam
selama 56 jam. Untuk memisahkan sel dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 3000
rpm selama 15 menit pada suhu 4 0C.
Pengukuran Aktivitas Protease dan Kadar Protein
Aktivitas
protease
diukur
dengan
metode
menggunakan substrat kasein Hammerstein 2% (b/v).
Bergmeyer
(1983)
dengan
Satu unit aktivitas protease
didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat menghasilkan satu μmol produk tirosin
per menit pada kondisi pengukuran. Kadar protein ditentukan dengan metode Bradford
(1976) menggunakan Bovine Serum Albumin Fraction V sebagai standar protein.
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
4
Purifikasi Protease
Purifikasi dilakukan dengan menggunakan kromatografi filtrasi gel menggunakan
Sephadex G-100. Sebelum dilakukan pemurnian terlebih dahulu dilakukan pengendapan
dengan amonium sulfat teknis dengan konsentrasi amonium sulfat 20-90%
yang
dilanjutkan dengan dialisis menggunakan kantong dialisis cut-off 10 kD (Sigma).
Sebanyak 0,75 gram Sephadex G-100 (Sigma) dibasahkan dengan 75 ml air bebas
ion kemudian dipanaskan 900C sambil diaduk perlahan selama 90 menit dan dibiarkan
sampai dingin, kemudian simpan dalam ruangan 40C semalam. Larutan didekantasi lalu
supernatan diganti dengan buffer Tris-HCl 0,1 M pH 8 sambil diaduk perlahan. Larutan
protease sebanyak 1 ml dimasukan dengan pipet secara perlahan ke dalam kolom tepat di
atas permukaan gel. Kolom diisi dengan pengelusi yaitu buffer Tris-HCl 10 mM pH 8.
Diambil setiap fraksi masing-masing 70 (2 ml) tetes ditampung dalam fraction collector
(Redifrac, Pharmacia-Biotech).
Karakterisasi protease
Uji karakterisasi protease yang meliputi pengaruh pH (6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9)
menggunakan buffer Tris-HCl, suhu (30 0C, 40 0C, 50 0C, 60 0C, 70 0C), ion logam (K+,
Mn2+, Zn2+ dan Fe2+) dan inhibitor spesifik (EDTA). Konsentrasi ion logam dan inhibitor
spesifik yang digunakan masing-masing adalah 1 mM dan 5 mM.
SDS PAGE dan Zimogram
Penentuan berat molekul dilakukan menggunakan SDS PAGE (Laemmli 1970).
Sedangkan zimogram menggunakan modifikasi metode Choi et al, (2001). Gel akrilamid
8% dikopolimerisasi dengan substrat kasein 2%. Setelah gel dilakukan elektroforesis, gel
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
5
direndam dengan Triton X-100 2,5% selama 1 jam dan dilakukan inkubasi dalam buffer
Tris-Cl 10 mM, pH 8 selama 24 jam. Pewarnaan dengan silver staining yaitu : gel
direndam dalam larutan fikasasi (25% metanol dan 12% asam asetat) selama 1 jam
kemudian direndam dalam 50% etanol selama 20 menit, kemudian diganti dengan 30%
etanol selama 2 x 20 menit, larutannya diganti dengan enhancer kemudian dicuci dengan
akuadestilata, setelah dicuci ditambahkan larutan silver nitrat selama 30 menit kemudian
dicuci lagi dengan akuadestilata 2 x 20 detik dan ditambahkan larutan campuran Na2CO3
dan formaldehida dan terakhir dengan larutan fiksasi.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Produksi protease ekstrak kasar
Isolat yang digunakan untuk produksi protease ekstrak kasar dan selanjutnya
dilakukan pemurnian adalah isolat dari A6S3. Pemilihan isolat ini berdasarkan hasil
penelitian sebelumnya yaitu memiliki aktivitas protease tertinggi dibandingkan dengan
isolat lainnya.
Produksi protease dilakukan dengan cara bakteri isolat A6S3 diinokulasi sebanyak
1-2 lup pada media Luria Bertani Broth (LB) dengan komposisi tripton 1%, NaCl 1%,
yeast extract 0,5% dan skim milk
Proses diawali dengan penentuan umur prekultur
(dalam media LB) yang tepat untuk keperluan produksi enzim. Pengamatan dilakukan
dengan mengukur optical density (OD) sampai nilai OD = 0,8 pada λ = 620 nm. Media
LB yang sudah mempunyai OD = 0,8 diambil 10% kemudian ditambahkan pada media
LB yang baru sebagai media untuk memproduksi protease. Media yang baru sebanyak 3
liter selanjutnya diinkubasi selama 48 jam (waktu optimum produksi protease isolat
A6S3). Untuk memisahkan sel dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama
15 menit pada suhu 4 0C. Dengan teknik ini, sel akan mengendap oleh adanya gaya
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
6
gravitasi sedangkan enzim tetap terdapat pada supernatan. Sentrifugasi dilakukan pada
suhu rendah untuk mencegah terjadinya kerusakan struktur enzim, selanjutnya dilakukan
pengujian aktivitas protease.
Pengendapan dengan ammonium sulfat dan dialisis
Pengendapan protease dilakukan bertujuan untuk mengendapkan protein protease.
Pengendapan dilakukan dengan menggunakan ammonium sulfat dengan beberapa
perlakuan yaitu 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% dan 90%. Penambahan
ammonium sulfat dilakukan secara perlahan-lahan sambil larutan enzim distirer pada
kondisi suhu 4 0C. Selanjutnya didiamkan semalam dan dilakukan sentrifugasi. Endapan
dan filtrat masing-masing perlakuan diuji aktivitasnya. Aktivitas tertinggi pada endapan
dan aktivitas terendah pada filtrat yang selanjutnya dipilih. Hasil pengendapan dapat
dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Pengendapan dengan ammonium sulfat
Figure 1. Ammonium sulfate precipitation
Hasil pengendapan dengan ammonium sulfat menunjukkan aktivitas protease
tertinggi pada endapan adalah dengan pengendapan ammonium sulfat 70%. Sedangkan
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
7
aktivitas terendah pada filtrat adalah 60%, akan tetapi pada filtrat 70% memiliki aktivitas
yang rendah sehingga pengendapan selanjutnya adalah dengan ammonium sulfat 70%.
Hasil pengendapan ammonium sulfat 70% selanjutnya dilakukan dialisis dengan
menggunakan kantong dialisis untuk menghilangkan garam-garam ammonium sulfat.
Purifikasi dengan kromatografi kolom Sephadex G-100
Purifikasi atau pemurnian protease isolat A6S3 dengan kromatografi filtrasi gel
menggunakan Sephadex G-100 sebagai matriks, dan bufer Tris-HCl 0,05 M, pH 8
sebagai pengelusinya. Sebelum dilakukan pemurnian dengan kromatografi gel, terlebih
dahulu dilakukan pengendapan amonium sulfat 70% yang dilanjutkan dengan dialisis.
Setiap fraksi yang keluar dari kolom diukur aktivitas protease dan kadar protein, hasil
tertera pada Gambar 2. Hasil kromatografi menunjukkan terdapat 3 (tiga) puncak fraksi
yang memiliki aktivitas tertinggi yaitu fraksi 6, 10 dan 46.
Gambar 2. Kromatogram protease isolat A6S3 dengan Sephadex G-100
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
8
Figure 2. Kromatogram of isolate A6S3 protease with Sephadex-G-100
Hasil purifikasi protease bakteri isolat A6S3 dilakukan dengan kolom Sephadex
G-100 tertera pada Tabel 1. Dibandingkan dengan crude protease hasil ekstraksi dengan
ammonium sulfat terjadi peningkatan derajat kemurnian enzim dengan kromatografi
kolom ini. Untuk fraksi 5 terjadi peningkatan kemurnian menjadi 3,3 kali, untuk fraksi
10 terjadi peningkatan kemurnian menjadi 3,8, sedangkan fraksi 46 derajat kemurniannya
3,5.
Tabel 1. Tahapan purifikasi protease isolat A6S3
Table 1. Purification steps of isolate A6S3 protease
Tahapan
pemurnian
Volume
(ml)
Total
Total Aktivitas
aktivitas protein spesifik
(IU)
(mg)
(IU/mg)
Derajat
kemurnian
relatif
0,14
1600
41,76
224
0,186
1
0,0273
0,0306
0,013
3
3
3
0,0507
0,066
0,0258
0,0819
0,0918
0,039
0,619
0,719
0,662
3,3
3,8
3,5
Aktivitas Kadar
Protease protein
(IU/ml)
(mg)
Pengendapan 0,0261
(NH4)2SO4
Sephadex G100
Fraksi 5
0,0169
Fraksi 10
0,022
Fraksi 46
0,0086
Protease yang telah dimurnikan dengan filtrasi gel menggunakan Sephadex G-100
mempunyai aktivitas spesifik dan tingkat kemurnian yang lebih tinggi dari tahap
sebelumnya.
Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa Sephadex G-100 dapat
digunakan untuk memisahkan protein yang dikhendaki yaitu enzim dari senyawasenyawa lain sebagai pengotor. Ekstrak kasar protein tercampur dengan asam nukleat,
karbohidrat dan garam organik. Logam berat dan asam nukleat biasanya mengganggu
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
9
kerja enzim, sehingga dapat menghilangkan kontaminan tersebut terjadi peningkatan
aktivitas enzim (Haris dan Angal 1989).
Karakterisasi Protease ekstrak kasar
Pengaruh pH
Perubahan pH pada skala deviasi kecil dapat menyebabkan turunnya aktivitas
enzim karena dengan perubahan ionisasi gugus-gugus fungsionilnya. Gugus ionik
berperan penting dalam menjaga konformasi sisi aktif enzim untuk mengikat dan
mengubah substrat menjadi produk. Pada perubahan skala deviasi besar, perubahan pH
akan mengakibatkan enzim mengalami denaturasi karena adanya gangguan terhadap
berbagai interaksi nonkovalen yang menjaga kestabilan struktur tiga dimensi enzim
(Hames dan Hopper 2000)
Gambar 3. Pengaruh pH pada protease isolate A6S3
Figure 3. Effect of pH on isolate A6S3 protease
pH sangat berpengaruh terhadap aktivitas protease bakteri A6S3 (Gambar 3). pH
optimum aktivitas protease berkisar 8. Protease bakteri Pseudomonas aeruginosa
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
10
memiliki pH yang sama dengan isolat A6S3 yaitu pada pH 8 (Baehaki et al 2008).
Semakin jauh dari pH optimal enzim semakin tidak stabil sehingga aktivitasnya semakin
rendah.
Hal ini karena enzim merupakan protein yang tersusun atas asam amino,
pengaruh pH berhubungan dengan sifat asam basa yang dimiliki oleh protein.
PH
ekstrim dapat menyebabkan denaturasi protein enzim yang mengubah susunan ruang tiga
dimensi molekul protein enzim. Menurut Naz (2002) perubahan keaktifan enzim akibat
perubahan lingkungan menyebabkan terjadinya perubahan ionisasi enzim. Wong (1995)
menambahkan, pH ekstrim berpengaruh terhadap struktur enzim dan muatan substrat.
Kelebihan atau kekurangan ion H+ menyebabkan perubahan konformasi sisi aktif enzim,
sehingga substrat tidak lagi berikatan dengan enzim, selanjutnya berakibat pula pada
pembentukan produk.
Pengaruh Suhu
Pada umumnya setiap enzim memiliki aktivitas maksimum pada suhu tertentu,
aktivitas enzim akan semakin meningkat dengan bertambahnya suhu sampai suhu
optimum tercapai. Setelah itu kenaikan lebih lanjut akan menyebabkan aktivitas enzim
menurun. Pengaruh suhu terhadap aktivitas protease ekstrak kasar bakteri isolat air rawa
terdapat pada Gambar 4.
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
11
Gambar 4. Pengaruh suhu pada protease isolate A6S3
Figure 4. Effect of temperature on isolate A6S3 protease
Dari hasil pengukuran aktivitas enzim pada berbagai suhu, suhu optimum protease
bakteri isolat A6S3 dengan suhu inkubasi 500C. Penelitian protease bakteri lain
menujukkan bakteri yang berasal dari perairan memiliki suhu optimum yang cukup
tinggi, yaitu protease bakteri laut Alteromonas sp strain O7 memiliki suhu optimum 60 0C
(Miyamoto et al 2002) dan protease Pseudoalteromonas sp strain P96-47 dari laut
Artartik yang memiliki suhu optimum 45 0C (Vazquez et al 2008). Suhu mempengaruhi
laju reaksi katalisis enzim dengan dua cara. Pertama, kenaikan suhu akan meningkatkan
energi molekul substrat dan pada akhirnya meningkatkan laju reaksi enzim. Peningkatan
suhu juga berpengaruh terhadap perubahan konformasi substrat sehingga sisi aktif
substrat mengalami hambatan untuk memasuki sisi aktif enzim dan menyebabkan
turunnya aktivitas enzim. Kedua, peningkatan energi termal molekul yang membentuk
struktur protein enzim itu sendiri akan menyebabkan rusaknya interaksi-interaksi non
kovalen (ikatan hidrogen, ikatan van der walls, ikatan hidrofobik dan interaksi
elektrostatik) yang menjaga struktur 3D enzim secara bersama-sama sehingga enzim
mengalami denaturasi. Denaturasi menyebabkan struktur lipatan enzim membuka pada
bagian permukaannya sehingga sisi aktif enzim berubah dan mengakibatkan terjadi
penurunan aktivitas enzim (Hames dan Hooper 2000).
Pengaruh ion logam dan inhibitor spesifik
Beberapa enzim membutuhkan ion logam sebagai kofaktor untuk mendukung
efisiensi katalitik enzim. Logam tersebut membantu reaksi katalitik dengan cara mengikat
substrat pada sisi pemotongan. Selain berperan dalam pengikatan enzim dengan substrat,
beberapa logam juga dapat mengikat enzim secara langsung untuk menstabilkan
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
12
konformasi aktifnya atau menginduksi formasi situs pengikatan atau situs aktif suatu
enzim. Gambar 6 memperlihatkan pengaruh ion logam terhadap aktivitas protease bakteri
isolat A6S3.
Gambar 5.
Pengaruh ion logam pada protease isolate A6S3
Figure 5. Effect metal ions on isolate A6S3 protease
Inhibitor ion logam yang kuat terhadap protease dari bakteri A6S3 adalah Fe 2+, K+
dan Zn2+ (Gambar 5). Adanya penghambatan ion logam terhadap aktivitas protease pada
konsentrasi tertentu berkaitan dengan kekuatan ion, dimana kekuatan ion itu sendiri
mempengaruhi konformasi atau struktur tiga dimensi dari protein enzim atau protein
substrat (Suhartono 1989). Pada konsentrasi tertentu ion logam tertentu dapat bertindak
sebagai inhibitor, tetapi dapat juga bertindak sebagai aktivator pada konsentrasi lain
(Richardson dan Hyslop 1985).
Berdasarkan
mekanisme
reaksi
yang
dikatalisis,
endopeptidase
dapat
dikelompokkan menjadi empat yaitu: protease serin, protease aspartat, protease sistein
dan protease logam. Dalam penelitian ini penggolongan protease hasil produksi dilakukan
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
13
dengan cara mereaksikan dengan senyawa-senyawa inhibitor spesifik. Adapun pengaruh
inhibitor spesifik EDTA pada protease tanah rawa terdapat pada Tabel 2.
Tabel 2. Pengaruh inhibitor spesifik pada protease isolate A6S3
Table 2. Effect specific inhibitor on isolate A6S3 protease
Jenis bakteri
A6S3
Aktivitas residu (%)
EDTA
1 mM
5 mM
19,6
18,9
Tabel 2 menunjukkan EDTA (1mM dan 5 mM) dapat menghambat protease
isolat A6S3 hal ini dimungkinkan karena EDTA mengkelat logam-logam yang berperan
penting menjaga stabilitas serta logam yang berperan sebagai kofaktor enzim protease.
Karena protease ini dihambat oleh EDTA sehingga protease ini digolongkan sebagai
metaloprotease (protease logam).
Protease bakteri lain dari perairan yang termasuk
metalloprotease adalah Alteromonas sp O-7 (Miyamoto et al 2002).
Penentuan berat molekul dengan SDS PAGE dan Zimogram protease ekstrak kasar
Penentuan berat molekul dilakukan dengan teknik SDS-PAGE (Sodium dodesil
sulfat-Poliakrilamida gel elektroforesis) dan Zimogram merupakan metode yang sudah
digunakan secara luas. Pada penelitian ini ada dua macam gel yang digunakan yaitu gel
penahan (resolving gel) dan gel pemisah (stacking gel) yang mengandung akrilamid,
SDS, APS dan TEMED. Gel poliakrilamid diperoleh dengan cara polimerisasi akrilamid
dengan sejumlah cross linking agent metilena bis akrilamid dan amonium persulfat
(APS) sebagai katalisator. Radikal bebas yang terbentuk dari pelarutan ammonium
persulfat dalam air akan bereaksi dengan akrilamid membentuk akrilamid aktif yang
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
14
dapat bereaksi satu sama lain membentuk polimer. Hasil SDS-PAGE dan Zimogram
protease isolat bakteri air rawa dapat dilihat pada Gambar 6.
M
A6S3
M
A6S3
120 kD
106 kD
97 KDa
66 KDa
45 KDa
24 KDa
Gambar 6. SDS-PAGE dan Zimogram protease isolat A6S3 (M=marker)
Figure 6. SDS-PAGE and Zymogram of isolate A6S3 protease (M=marker)
Analisis SDS-PAGE pada protease ekstrak kasar didapatkan protease isolat A6S3
memiliki 12 pita dengan BM sekitar antara 19 kD sampai dengan 153 kD. Analisis
Zimogram pada protease ekstrak kasar didapatkan protease untuk isolat A6S3 memiliki 2
pita dengan BM
106 kD dan 120 kD. Bakteri TPS-2 yang diisolasi dari kawah
Tangkupan Perahu juga memiliki 2 pita dengan berat molekul 80 kD dan 45 kD
(Wahyuntari et al 2000).
KESIMPULAN
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
15
Hasil purifikasi dengan kolom gel sephadex G-100 menunjukkan peningkatan
derajat kemurnian enzim protease bakteri isolat A6S3. Untuk fraksi 5 terjadi peningkatan
kemurnian menjadi 3,3 kali, untuk fraksi 10 terjadi peningkatan kemurnian menjadi 3,8,
sedangkan fraksi 46 derajat kemurniannya 3,5. Protease ini mempunyai pH optimum 8,
suhu optimum sekitar 50 oC, Inhibitor ion logam yang kuat terhadap protease dari bakteri
A6S3 adalah Fe2+ (1 mM), K+ dan Zn2+ dan dapat dihambat oleh EDTA. Analisis SDSPAGE pada protease ekstrak kasar didapatkan protease isolat A6S3 memiliki 12 pita
dengan BM sekitar antara 19 kD sampai dengan 153 kD. Analisis Zimogram pada
protease ekstrak kasar didapatkan protease untuk isolat A6S3 memiliki 2 pita dengan BM
106 kD dan 120 kD.
UCAPAN TERIMA KASIH
Peneliti berterima kasih kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Depdiknas
yang telah membiayai penelitian ini melalui program Hibah Bersaing XVI tahun 2008.
DAFTAR PUSTAKA
Baehaki, A., Suhartono, M.T., Palupi, N.S. dan Nurhayati, T. 2008. Purifikasi dan
karakterisasi protease dari bakteri patogen Psudomonas aeruginosa. Jurnal Teknol
dan Industri Pangan 19: 80-86.
Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., and Graβl, M. 1983. Methods of Enzymatic Analysis.
Vol 2. Verlag Chemie., Weinheim.
Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive methodfor quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein dye-binding. Anal Biochem
72:234-254.
Choi, N.S., Yoon, K.S., Lee, J.Y., Han, K.Y., and Kim, S.H. 2001. Comparision of three
substrates (casein, fibrin, and gelatin) in zimographic gel. J Biochim Mol Biol
34:531-536.
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
16
Hames, B.D., and Hooper, N.M. 2000.
Springer-Verlag., Hongkong.
Biochemistry: The Instant Notes.
Ed.ke-2.
Harris, E.L.V., S, Angal. 1989. Protein Purification Methods.A Practical approach. IRL
Press., Oxford.
Huang, G., Ying, T., Huo, P., and Jiang, J. 2006. Purification and characterization of a
protease from thermophilic Bacillus strain HS08. African Biotecnol 5:2433-2438.
Kalisz, H.K. 1988. Microbial proteinases. Adv Biochim Eng Biotechnol 36; 1-65.
Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural protein during the assembly of the heat of
bacteriophag T4. Nature 227:680-685.
Miyamoto, K., Tsujibo, H., Nukui, E., Itoh, H., Kaidzu, Y., and Inamori, Y. 2002.
Isolation and characterization of the genes encoding two metalloproteases (MprI
and MprII) from a marine bacterium, Alteromonas sp. strain O-7. Biosci Biotecnol
Biochem 66:416-21
Naiola, E., dan Widhyastuti, N. 2002. Isolasi, seleksi dan optimasi produksi protease dari
beberapa isolat bakteri. Hayati 6:467-473.
Naz, S. 2002. Enzymes and Food. Oxford University Press., Pakistan.
Pakpahan R. 2009. Isolasi bakteri dan uji aktivitas protease termofilik dari sumber air
panas Sipoholon Tapanuli Utara Sumatera Utara. Tesis. Universitas Sumatera Utara.
Medan.
Rao, M.M., Tanksale, A.M., Gatge, M.S., and Desphande, V.V. 1998. Molecular and
biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiol And Mol Biol Rev
62:597-635.
Richardson, T., and Hyslop, D.B. 1985. Enzyme. In Fennema, O.R (Eds). Food
Chemistry. Mac Kerel Bekker, New York.
Suhartono MT. 1989. Enzim dan Bioteknologi. Pusat Antar Universitas Bioteknologi
IPB-Depdikbud. Bogor.
Vázquez, S.C., Hernández, E., and Cormack, W.P.M. 2008. Extracellular proteases from
the Antarctic marine Pseudoalteromonas sp. P96-47 strain. Revista Argentina
Microbiologia 40:63-71.
Wahyuntari, B., Suhartono, M.T., and Pyun, Y. 2000. Properties of extracelullar protease
from an extreme thermophilic microorganism isolated from Tangkupan Prahu
crater. Hayati 7: 6-10.
Wong, D.W.S. 1995. Food Enzymes: structure and mechanism. Chapman & Hall., New
York.
Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II,
Jakarta 9 Agustus 2010
17