Staff Site Universitas Negeri Yogyakarta PPT KA II KCKT SUSI

KROM ATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) atau H

igh Performance Liquid

Chromat ography (HPLC)

Oleh:

Susila Kristianingrum susila.k@uny.ac.id Kom pe t e nsi Da sa r:

Mahasiswa dapat mendeskr ipsikan pemisahan secar a KCKT dan

mengint er pr et asi kr omat ogr am, ser t a mengaplikasikan met ode ini unt uk analisis

PENDAHULUAN

 Perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom.

Pelarut yang menetes melalui kolom dibaw ah grafitasi (melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm), sehingga membuatnya lebih cepat.

 Partikel berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom akan memberi luas permukaan yang lebih besar memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.

 M empertimbangkan metode pendeteksian yang dapat

KROM ATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

•

Sist em elusi dg t ekanan t inggi (5000 psi)

•

Awalnya dikenal dg high pressure liquid

chromat ography (HPLC), kemudian digant i high performance liquid chromat ography (HPLC).

•

Teknik kromat ografi cair baru

•

Ist ilah Indonesia dikenal dg kromat ografi cair kinerja t inggi (KCKT)

•

Kemajuan t eknologi bahan dan elekt ronik sangat berpengaruh

PENDAHULUAN KCKT/ HPLC

•

Kunci keberhasilan: isi kolom (fs diam) yg memiliki diamet er kecil (<40

μ

m).

•

Eluen dipompa dg t ekanan t inggi dg laju 1-10 mL/ menit .

•

Analit yg keluar didet eksi oleh det ekt or yg sangat sensit if.

•

Teknologi kolom t erikat (Bonded phase)

•

M odifikasi sorben ut k Reverse phase (RP), dan KPI

TEORI KOLOM KCKT/ HPLC

N dipengaruhi oleh:

a. lebar pita (W ). M akin kecil W, N makin besar, karena itu N mjd ukuran baik/ tidaknya kolom b. ukuran butir

c. distribusi ukuran butir

d. sifat butir (porous penuh/ pelikuler)

Analisis yg sulit & rumit diperlukan kolom dg efisiensi tinggi

OPTIM ASI KCKT

•

Ada 3 langkah ut k memperoleh Rs t inggi: 1. Harga k’, 1-5 dg eluen sesuai

2. Harga

α

, dg eluen lain, t et api kekuat an elusi sama/ dg eluen ket iga sbg adit if (mengubah buffer, menambah garam, pasangan ion).

3. Harga N, dg cara mengurangi laju alir

eluen,menggunakan kolom yg lebih panjang, menggunakan but ir kolom lebih kecil.

M etode Pemisahan Umum dalam HPLC

Fasa normal

 Kolom (silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan). Sebuah kolom sederhana dg i.d <4.6 mm dan panjang 150-250 mm.

 Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan

melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding dg

senyawa-senyawa non polar,sehingga

senyawa non polar akan lebih cepat melewat i kolom.

 Fasa gerak non polar Fasa diam polar

Fasa terbalik (RP-HPLC)

 Kolom (silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekat an rant ai hidrokarbon panjang C8 at au C18 pada permukaannya secara

sederhana dan pelarut polar (misal campuran air dan alkohol sepert i met anol).

 M olekul-molekul polar akan

bergerak lebih cepat melalui kolom.

 Fasa gerak polar Fasa diam non polar

Komponen KCKT

•

penghant ar solven t ekanan t inggi

•

sist em injeksi sampel

•

kolom

•

sist em det ekt or & recorder

•

M icrocomput er dg kont rol & dat a processing soft ware

Asesoris Alat :

•

Dua pompa

•

Sist em eluen t erprogram

•

Pengat ur suhu kolom

Fungsi masing-masing komponen

• 1.GradienController/Solvent Reservoir :

Fungsinya untuk menampung fasa gerak yang akan dialirkan ke dalam kolom dengan bantuan pompa. Syarat fasa gerak yang digunakan harus dimilipore(pori-pori+5μm) dan didegass.

• 2.Pompa:

Fungsinya untuk mendorong fasa gerak masuk ke dalam kolom. • 3.Sample Introductions/Injector :

Fungsinya sebagai tempat memasukkan cuplikan/sampel dengan bantuan syringe.

• 4.Kolom:

Merupakan jantung dari sistem HPLC, karena di dalam kolomlah terjadi pemisahan komponen-komponen cuplikan.

• 5.Detektor:

Fungsinya untuk mendeteksi komponen-komponen cuplikan hasil pemisahan kolom.

• 6.Data Output :

KEUNTUNGAN KCKT/ HPLC

• Kerja lebih mudah dengan aut omat isasi dalam prosedur analisis dan pengolahan dat a

• Volume sampel kecil • Daya pisaht inggi

• M erupakan met ode analit is Cepat ,Peka, Akurat ,Tepat , Reproducible, Preparat if

• Dapat digunakan unt uk analisis sampel organik dan anorganik, bersifat volat il dan non-volat il, st abil dan t idak st abil secara t hermal.

KOLOM

• Kolom analisis:

a. ukuran 15 cm x 3,9 cm t erbuat dari baja t ahan karat b. ukuran 10 cm x 8 cm t erbuat dari plast ik (Radial-Pak) Besar but ir: 5 at au 10 μm

Jenis fasa diam bervariasi (silika at au C18)

• Kolom preparat if ada 2:

a. mikro (jumlah cupl 10mg-1,0 g) ut k kolom 15cmx19mm at au 21,5mm.

b. makro (jumlah cupl 1,0 g-1,0 kg) ut k kolom 30 cmx57mm. Besar but ir: >20 μm

Cont oh kualit as kolom KCKT M erck

jenis Luas perm

dp(μm) Vp(ml/ g) %C ∑bonded phase

Si-300 60 10 0,79

Si-1000 30 10 0,78

RP-8 340 4,5,10 1,25 12,5 4,3

Karakt erist ik kolom ODS

Kolom Kand. C N x 10-3 Asimet r ik pd 10% H

P (Psi) Diamet er

LC-18 10,76 73 1,03 950 5μ(spheri

cal)

LC-7 12,90 39 1,12 1500 5μ(irregu

lar)

C-18 15,28 80 1,29 1800 5μ(spheri

POM PA

•

Pompa resiprocat ing & pneumat ics

•

Syarat nya:

1. Bahan pompa harus t erbuat dari bahan t ahan t erhadap eluen

2. Daya pompa berkisar ant ara 500-5000psi

3. Harus bebas pulsa/ dilengkapi dg penghilang pulsa

4. M emiliki kemampuan laju alir eluen 3 mL / menit 5. Kedapat ulangan laju alir <<1%.

JENIS –JENIS POM PA

1. Pompa bolak–balik(reciprocat ing pump)

• Paling banyak digunakan

• Jumlah vol pelarut t idak t erbat as

• Dapat digunakan unt uk elusi gradien

• M enghasilkan aliran berpulsa

2. Pompajenispenyunt ik(syringe pump)

• Kapasit as ruang pelarut 250 –500 mL

• Unt uk kolom–kolom kecil(micro bore columns)

DETEKTOR

Tergant ung pada jenis senyawa

dalam eluat :

• Det ekt or indeks bias (Refract ive Index Det ect or)

• Det ekt or UV-Vis

• Det ekt or fluoresensi

• Det ekt or elekt rokimia

• IR

• LC-M S

Det ekt or UV

Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika anda menyinarkan sinar UV pada larut an

yang keluar melalui kolom dan sebuah det ekt or pada sisi yang

berlawanan, anda akan mendapat kan pembacaan langsung berapa besar sinar yang diserap.

Aplikasi KCKT

Preparat ive & Analyt ical Liquid Chrom at ography

•

Bidang farmasi

•

Bidang kimia

•

Bidang biokimia

•

Bidang kedokt eran

•

RP-HPLC

M acam KCKT

Berdasarkan t erjadinya int eraksi ant ara solut ,

fasa diam, dan eluen maka KCKT dibedakan 3 yait u:

1. Separat ion by size Krom Ukuran-Elusi 2. Separat ion by charge KPI (Krom

Pert ukaran Ion) & KIP (Krom Ion-Pasangan) 3. Separat ion by hydrophobicit y

Pemisahan berdasarkan hidrofobisit as

• Gugus yg diikat pada gugus siloksan dari silika gel bervariasi

• Gugus polar : CN, NH₂

Gugus non polar : C₈ at au C₁₈

Int eraksi solut dg fs diam dalam KFB melalui beb mekanisme: 1. Part isi ant ara lap hidrokarbon pd perm. pakan dan fs gerak

(K.cair-cair)

2. Part isi ant ara fs gerak dan fs diam t ermodifikasi

Solvent dalam KCKT

• N-heksana

• Sikloheksana

• Tet rakloromet ana

• M et ilbenzena

• Trikloromet ana

• Dikloromet ane

• THF

• Propanon

• Aset onit ril

• Iso-propanol

• Et anol

• M et anol

• Asam et anoat

Fasa diam dalam KCKT

Bonded phases:

• ODS (okt adesilsilika, C₁₈)

• Okt ilsilika

• Propilsilika

• Aminopropil

• Asam sulfonat

• Amina kuart ener

Polimer phases:

• Cross-linked st yrene at au DVB

• Unt uk Eksklusi at au Pert ukaran Ion

TUGAS

1. Jelaskan bagaimana analisis kualit at if dan kuant it at if dg KCKT?

2. Pemisahan dg KPI pd t eknik KCKT mempunyai beberapa kelemahan. Jelaskan jawaban anda! 3. Berikan beberapa cont oh fasa diam dan fasa

gerak yang digunakan dalam KCKT!

4. Jelaskan perbedaan ant ara KCKT fasa normal dan fasa t erbalik!

Aplikasi KCKT

Preparat ive & Analyt ical Liquid Chrom at ography

•

Bidang farmasi

•

Bidang kimia

•

Bidang biokimia

•

Bidang kedokt eran

•

RP-HPLC

M acam KCKT

Berdasarkan t erjadinya int eraksi ant ara solut ,

fasa diam, dan eluen maka KCKT dibedakan 3 yait u:

1. Separat ion by size Krom Ukuran-Elusi 2. Separat ion by charge KPI (Krom

Pert ukaran Ion) & KIP (Krom Ion-Pasangan) 3. Separat ion by hydrophobicit y

Pemisahan berdasarkan hidrofobisit as

• Gugus yg diikat pada gugus siloksan dari silika gel bervariasi

• Gugus polar : CN, NH₂

Gugus non polar : C₈ at au C₁₈

Int eraksi solut dg fs diam dalam KFB melalui beb mekanisme: 1. Part isi ant ara lap hidrokarbon pd perm. pakan dan fs gerak

(K.cair-cair)

2. Part isi ant ara fs gerak dan fs diam t ermodifikasi

Solvent dalam KCKT

• N-heksana

• Sikloheksana

• Tet rakloromet ana

• M et ilbenzena

• Trikloromet ana

• Dikloromet ane

• THF

• Propanon

• Aset onit ril

• Iso-propanol

• Et anol

• M et anol

• Asam et anoat

Fasa diam dalam KCKT

Bonded phases:

• ODS (okt adesilsilika, C₁₈)

• Okt ilsilika

• Propilsilika

• Aminopropil

• Asam sulfonat

• Amina kuart ener

Polimer phases:

• Cross-linked st yrene at au DVB

• Unt uk Eksklusi at au Pert ukaran Ion

TUGAS

1. Jelaskan bagaimana analisis kualit at if dan kuant it at if dg KCKT?

2. Pemisahan dg KPI pd t eknik KCKT mempunyai beberapa kelemahan. Jelaskan jawaban anda! 3. Berikan beberapa cont oh fasa diam dan fasa

gerak yang digunakan dalam KCKT!

4. Jelaskan perbedaan ant ara KCKT fasa normal dan fasa t erbalik!