ABNORMALITAS KROMOSOM YPADA PENDERITA AMBIGUS GENITALIA Y CHROMOSOME ABNORMALITY IN PATIENTS WITH AMBIGUOUS GENITALIA - Diponegoro University | Institutional Repository (UNDIP-IR)

1

Lampiran 1.

Prosedur Pemeriksaan Sitogenetik

1. Preparasi Kromosom
- Bahan yang digunakan yaitu :
darah penderita 5 cc dalam heparin, media MEM, PHA, FBS, colcemid,
thymidin, KCL 0.075M, larutan carnoy’s.
- Peralatan yang digunakan yaitu :
spuit, tabung Heparin, tabung falcon 10cc, laminary flow, inkubator,pipet
ependrof, tip pipet, centrifuge, waterbath, pipet ukur, deck glass,
mikroskop cahaya.
- Cara kerja : 5 tetes ‘buffy coat’ dan 5 tetes darah dimasukan ke dalam
tabung yang berisi 2 media yang berbeda (TC199 dan MEM) yang
mengandung 10% FBS dan 100µL PHA-P.

Kemudian kedua tabung

diinkubasi pada suhu 37o C selama 72-96 jam dengan sudut kemiringan

tabung ~ 45o di dalam inkubator.

Sehari sebelum pemanenan, pada

masing-masing tabung ditambahkan 2 tetes ethidium bromide 10mg/mL.
Selanjutnya dilakukan pemanenan dengan meneteskan 3 tetes colcemid
pada setiap tabung, kemudian inkubasi diteruskan selama 30 menit.
Setelah itu dipusingkan selama 10 menit pada 1000 RPM. Supernatan
yang terbentuk dibung, kemudian endapan (pelet) diresuspensikan dan
ditambah larutan hipotonik hangat KCL 0,075 M, diresuspensikan lagi

2

sampai homogen dan diinkubasi 37o C dalam waterbath selama 15-30
menit.

Berikutnya tabung-tabung dipusingkan 1000 RPM selama 10

menit, supernatan dibuang dan ditambahkan 5ml larutan fiksasi Carnoy’s
pelan-pelan melalui dinding tabung, kemudian dikocok.

Pemberian

larutan fiksasi ini diulangi sebanyak 3 kali sampai didapatkan presipitat
yang jernih.

Residu yang terbentuk disuspensikan dengan larutan

Carnoy’s secukupnya sesuai dengan banyaknya pelet.

Kemudian

disebarkan pada gelas objek dengan meneteskan 2 tetes suspensi pada
lokasi yang berbeda.
2. GTG banding (G-banding)
Pengecatan ini menggunakan reagen sebagai berikut :
-

H2O2 30%

-

Larutan Trypsin 1% stok dalam buffer Hanks

-

Larutan buffer Hanks (HBSS) pH 6,8-7,2

-

Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 6,8

Pengecatan Trypsin dilakukan tanpa penghangatan

yaitu setelah

membiarkan slide menjadi tua lebih kurang selama 3 – 5 hari kemudian
dicelupkan ke dalam larutan trypsin 0,1% (yang dilarutkan dengan PBS
pH 6,8) selama sekitar 10-20 detik, kemudian dicuci dengan air mengalir
selanjutnya dimasukkan ke dalam staining jar yang berisi cat Giemsa 10%

dalam phosphate buffer selama 4-10 menit. Setelah dicat, slide dicuci
dengan air mengalir lalu dikeringkan, kemudian siap dianalisa di bawah
mikroskop.

3

3. CBG Banding (C-banding)
Pengecatan ini menggunakan reagen berikut:
-

0,2 N HCl

-

5% Ba(OH)2 ; 5 g Ba(OH)2 dalam 100mL aqua bidest

-

2 x SSC (0.3M sodium klorid, 0.03 M sodium sitrat, pH 7.0): 17.53 g
NaCL dan 8.82 sodium sitrat dalam 1 L aqua bidest

-

Cat Giemsa 2% dalam buffer fosfat pH 6.8

Slide yang telah dituakan, dicuci di bawah air mengalir. Kemudian
dimasukkan ke dalam wadah berisi 50 mL Ba(OH)2 5% yang dihangatkan
dalam water bath 50o C, selama beberapa detik. Setelah dicuci di bawah
air mengalir, slide dimasukkan ke dalam SSC selama 1 jam, kemudian
dicuci kembali dengan air mengalir. Selanjutnya, dimasukkan ke dalam
staining jar yang berisi cat Giemsa selama 4 – 10 menit.37

4

Lampiran 2.
Hasil Preliminary Study Panjang Kromosom Y
pada 20 orang laki-laki bukan penderita ambigus genitalia
No.

Kode Sampel

Banding
Level
Kariotipe

Panjang kromosom Y
(µm) menurut program
leica CW4000

1.
2.

Y31
Y15

586
574

3,16
4,32

3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.

Y14
N10

N36
Y3
L
KG82
N41
N2
PI02
KG20
N37
KG15
KG9
KG12
KG13
KG17

557
580
555
574
589

572
581
555
559
561
604
571
562
552
591
590

2,53
2,84
2,74
3,16
2,95
3,58
2,74
2,74

3,26
2,53
2,74
2,74
3,26
2,95
3,19
2,42

19.
KG19
20
KG4
Minimum
Maximum
Rerata
Simpang baku

562
554

3,05
2,00
2,00
4,32
2,88
0,53

5

Lampiran 3.

Hasil Tes Statistik perbedaan Panjang Kromosom Y antara Subyek dan
Kontrol Penelitian
Descriptives
ukuran rata-rata

Kelompok
Kontrol

Pasien

Mean
95% Confidence
Interval for Mean
5% Trimmed Mean
Median
Variance
Std. Deviation
Minimum
Maximum
Range
Interquartile Range
Skewness
Kurtosis
Mean
95% Confidence
Interval for Mean

Lower Bound
Upper Bound

Lower Bound
Upper Bound

5% Trimmed Mean
Median
Variance
Std. Deviation
Minimum
Maximum
Range
Interquartile Range
Skewness
Kurtosis

Statistic
2.5454
2.4138

Std. Error
.06360

2.6770
2.5536
2.5600
.097
.31158
1.79
3.12
1.33
.39
-.315
.406
2.4324
2.2807

.472
.918
.07329

2.5840
2.4001
2.3717
.129
.35905
1.97
3.54
1.58
.27
1.597
3.210

.472
.918

Tests of Normality
a

ukuran rata-rata

Kelompok
Kontrol
Pasien

Kolmogorov-Smirnov
Statistic
df
Sig.
.065
24
.200*
.224
24
.003

*. This is a lower bound of the true significance.
a. Lilliefors Significance Correction

Statistic
.986
.859

Shapiro-Wilk
df
24
24

Sig.
.974
.003

6

4.00

48
3.50

39

ukuran rata-rata
42

3.00

2.50

2.00

1.50
Kontrol

Pasien

Kelompok

NPar Tests

Mann-Whitney Test
Ranks
ukuran rata-rata

Kelompok
Kontrol
Pasien
Total

Test Statisticsa

Mann-Whitney U
Wilcoxon W
Z
Asymp. Sig. (2-tailed)

ukuran
rata-rata
199.500
499.500
-1.826
.068

a. Grouping Variable: Kelompok

N
24
24
48

Mean Rank
28.19
20.81

Sum of Ranks
676.50
499.50

7

Lampiran 4.
Contoh kariotip dari metafase yang memenuhi kriteria banding level 550