Aplikasi Metoda Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Terhadap Gen MPB64 (Rv3036c) Sebagai Diagnosis Cepat Infeksi M. tuberculosis

  

Prosiding Semirata FMIPA Universitas Lampung, 2013

Aplikasi Metoda Loop Mediated Isothermal Amplification

(LAMP) Terhadap Gen MPB64 (Rv3036c) Sebagai Diagnosis

  

Cepat Infeksi M. tuberculosis

Elizabeth Bahar *,Rahmatini **

  

Bagian Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Unand*

Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Unand**

Abstrak. Metoda Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) menggunakan taq

polymerase yang mempunyai aktivitas strand displacement, misalnya Bst, Pfu, dan Aac

polymerase. Metoda ini mampu mengamplifikasi DNA dan RNA secara sederhana, cepat ,

spesifik dan murah. Reaksi dilakukan dengan temparatur yang konstan (60 - 65°C) dengan

_{9 10}

lama antara 15 – 60 menit. Produk ampflifikasi mencapai 10 -10 kali. Sejumlah penelitian

memperlihatkan metoda ini mempunyai sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi. Penelitian

ini bertujuan untuk mengkaji nilai diagnostik LAMP terhadap gen MPB64 M. tuberculosis.

Gen MPB64 merupakan gen yang conserved dan spesifik untuk M. tuberculosis complex.

Potensi diagnostik LAMP MPB64 dibandingkan dengan metode diagnostik lain seperti PCR

dan pewarnaan Basil tahan Asam (BTA).Standar baku emas digunakan kultur pada media

Lowenstein Jensen (LJ). Penelitian dilakukan terhadap 117 sampel sputum. Preparasi sputum

dilakukan dengan N-Asetil sistein

• – NAOH – sitrat. Selanjutnya sputum dikultur pada media LowensteinJensen selama 4
• – 8 minggu. Isolasi DNA dilakukan 2 kali, yaitu dari sputum

  (menggunakan QIAamp DNA isolation kit, Qiagen) dan dari kultur (metoda Boiling). Desain

  primer LAMP terhadap gen MPB 64 dilakukan dengan Primer explorer. Hasil LAMP yang

  di dapatkan analisis kesesuaian antara PCR dengan LAMP memperlihatkan tingkat yang

  erat (p = 0.000 dan r = 0.747), sebaliknya tingkat kesesuaian antara LAMP dengan BTA atau

  PCR dengan BTA berada pada posisi kurang erat (masing-masing r = 0.249 dan r =

  0.396).Dari hasil kultur pada LAMP menyebabkan spesifisitas metoda ini menjadi rendah,

  yaitu 60.0%.

  Kata kunci: Tuberculosis, LAMP, MPB64, Diagnosis LATAR BELAKANG Dalam segala kelemahannya,

  pemeriksaan mikroskopis dengan Tuberkulosis (TB) masih merupakan pewarnaan Basil tahan Asam (BTA) tetap masalah kesehatan global. Infeksi menjadi pilar utama dalam strategi

  

Mycobacterium . tuberculosis (M pengendalian TB. Sensitivitas yang rendah,

tuberculosis ) merupakan penyebab antara 40

• – 60 % dan peningkatan kasus TB kematian akibat infeksi yang tertinggi dan di dunia, metoda diagnostik baru yang lebih berperan dalam 8 juta kasus baru dan 2 juta akurat, ekonomis dan sederhana sangat kematian setiap tahunnya. Perkembangan dibutuhkan. Kultur bakteri M tuberculosis HIV/AIDS dan adanya resisten multi obat dalam media spesifik merupakan diagnosis

  

M tuberculosis berperan dalam peningkatan pasti, namun membutuhkan waktu yang

  kasus TB di dunia. Diagnosis dini lama, sekitar 4

• – 8 minggu (van Deun and merupakan tahapan yang paling penting Portaels, 1998; Shen et al., 2009). dalam pencegahan penyakit dan Diagnosis TB berbasis reaksi pengembangan metoda diagnosis baru yang imunologis pertama kali dikembangkan lebih baik menjadi suatu hal yang sangat adalah Tuberculosis Skin Test (TST). penting. Metoda ini didasarkan respon imun seluler terhadap antigen Purified Protein derivatif

  Semirata 2013 FMIPA Unila

• – 60 menit dengan produk ampflifikasi mencapai 10
• – NaOH). Sputum dicampur dengan NAlc
• – NaOH sama banyak, divortex selama 15 menit. Hasil yang didapat disentrifus selama 20 menit pada suhu 4 C dengan kecepatan 3000 g. Supernatan dibuang.

• 10

  Kultur

  Pewarnaan tahan asam dilakukan terhadap sputum menggunakan metoda Ziehl Neelsen.

  Pewarnaan tahan asam

  dimana sputum yang memenuhi kriteria dipreparasi dengan N-asetil sistein dan NaOH (NAlc

  tuberculosis . dilakukan preparasi sputum

  Subjek penelitian 155 sputum penderita yang dicurigai dengan infeksi M.

  Persiapan kerja Pengumpulan dan preparasi sputum

  Penelitian dilakukan selama 6 (enam) bulan di laboratorium Biomedik FK. Unand dan Mikrobiologi FK UGM. Populasi penelitian adalah penderita yang dicurigai dengan infeksi M. tuberculosis berdasarkan keluhan klinis..Sampel penelitian merupakan populasi teliti yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi. Kriteria inklusi meliputi data klinis lengkap dan mengarah pada infeksi M. tuberculosis, kualitas sputum baik dengan jumlah yang mencukupi. Kriteria eksklusi adalah penderita yang telah didiagnosis dengan infeksi saluran nafas non tuberculosis berdasarkan hasil kultur dan radiologis. Besar sampel ditetapkan 155 berdasarkan perhitungan dengan rumus. Sampel dipilih secara konsekutif terhadap sputum yang memenuhi kriteria inklusi dan ekslusi.

  Penelitian ini merupakan uji diagnostik dengan pendekatan cross sectional study.

  bovis .

  membandingkan dengan metoda pemeriksaan lain, seperti PCR terhadap gen MPB64.. Pemilihan gen MPB64 atau Rv3036c didasarkan analisis molekuler yang memperlihatkan MPB64 merupakan gen yang sangat conserved dan spesifik untuk M. tuberculosis complex dan M.

  potensi diagnostik LAMP sebagai metoda diagnosis cepat infeksi M. tuberculosis dan

  Berdasarkan kondisi tersebut peneliti telah menganalisis potensi diagnostik LAMP dengan tujuan untuk mengetahui

  kali. LAMP. Identifikasi amplikon dapat dilakukan dengan reaksi turbiditas, perubahan warna setelah penambahan hydroxynaphthol blue (HNB) atau bahan flouresens, seperti SBYR green (Notomi et al., 2000; Vincent et al., 2004).

  10

  9

  yang menggunakan taq polymerase yang mempunyai aktivitas strand displacement, misalnya Bst, Pfu, dan Aac polymerase. Metoda ini mampu mengamplifikasi DNA dan RNA secara sederhana, cepat , spesifik dan murah. Reaksi dilakukan dengan temparatur yang konstan (60 - 65°C) dengan lama antara 15

  mediated Isothermal Amplification (LAMP)

  Pendekatan molekuler, seperti penggunaan PCR memperlihatkan hasil yang akurat, tetapi metoda ini memerlukan biaya yang besar serta sumber daya yang terlatih (Delavisio et al., 1996). Notomi dkk (2000) mengembangkan metoda Loop-

  Sensitivitas dan spesivitas metoda ini sangat dipengaruhi oleh adanya riwayat imunisasi BCG (Daniel et al., 1991). Untuk mengantisipasi reaksi silang antigen PPD maka dikembangkan antigen yang spesifik dengan M. tuberculosis, seperti esat-6 dan cfp-10 (Wang et al., 2007)

  

Elizabeth Bahar & Rahmatini: Aplikasi Metoda Loop Mediated Isothermal Amplification

(LAMP) Terhadap Gen MPB64 (Rv3036c) Sebagai Diagnosis Cepat Infeksi M.

tuberculosis

(PPD) M. bovis (Fogan et al., 1969).

  Menggunakan media Lowenstein Jensen sampel yang telah dipreparasi dimasukkan ke dalam medium LJ dan diinkubasi pada suhu 37 C. Amati pertumbuhan bakteri sejak minggu ke-2 hingga ke-8.

  

Prosiding Semirata FMIPA Universitas Lampung, 2013

Desain Primer metoda uji dengan kultur sebagai standar

  Menggunakan Primer Explorer terhadap baku emas. Nilai diagnostik dilakukan gen MPB64 M. tuberculosis. Sebelum dengan software excell for Windows desain primer dilakukan, telah dinilai (sensitvitas, spesivisitas, Nilai prediksi spesifisitas sekuens gen MPB64 dengan positif dan nilai prediksi negatif). Keeratan

  

  Blast hubungan (nilai Kappa) diuji menggunakan Hasil analisis mempelihatkan MPB64 software SPSS for Windows versi 16.0. merupakan sekuens yang conserved, terdiri dari 683 pasang basa (pb). Gen ini hanya HASIL DAN PEMBAHASAN ditemukan pada M. tuberculosis complex dan M. bovis, namun tidak terdapat pada Pada penelitian ini dilakukan kultur kelompok M.atipik. terhadap 117 sampel dengan pengamatan antara 2

• – 8 minggu. Rerata masa

  

Tahapan Kerja pertumbuhan koloni adalah 4.-6 minggu,

  dengan variasi antara 3

• – 6 minggu. Hasil

  

Isolasi DNA kultur memperlihatkan adanya

  Isolasi DNA dilakukan 2 kali, yaitu dari pertumbuhan pada 67 sampel (57.3%) dan sputum yang telah dipreparasi dan dari hasil 50 sampel (42.7%) tidak ada pertumbuhan. kultur. Isolasi DNA dari kultur menggunakan metoda pemanasan (Boiling). 1 koloni M. tuberculosis ditambahkan dengan 2 ml TE buffer dan dipanaskan pada 95°C selama 10 menit. Disentrifus pada kecepatan maksimal semalam 5

• – 10 menit. Isolasi DNA dari sputum menggunakan QIAamp DNA Isolation kit (Qiagen).

  Amplifikasi LAMP MPB64

  Amplifikasi menggunakan metoda LAMP menggunakan 1 tabung dan dilakukan dengan sejumlah tahapan optimasi. Optimasi dilakukan terhadap konsentrasi primer, Bst polimerase dan suhu. Hasil amplifikasi dideteksi dengan penambahan SBYR green 1 : 10.

  Amplifikasi PCR untuk deteksi MPB64

  Amplifikasi PCR juga dilakukan 2 kali tiap sampel, yaitu dari DNA sputum dan kultur.. Amplifikasi PCR menggunakan taq master mix (Qiagen).. Hasil dianalisis dengan elektroforesis gel agarose 1% dan diwarnai dengan SYBR Green.

  Analisis Data

  Data disusun dalam bentuk gambar/grafik dan tabel. Analisis dilakukan

  Gambar 1. Distribusi hasil kultur dan BTA

  untuk mengidentifikasi nilai diagnostik

  terhadap 117 sampel

  Semirata 2013 FMIPA Unila

  

Elizabeth Bahar & Rahmatini: Aplikasi Metoda Loop Mediated Isothermal Amplification

(LAMP) Terhadap Gen MPB64 (Rv3036c) Sebagai Diagnosis Cepat Infeksi M.

tuberculosis

  PCR Gambar 4. Distribusi hasil PCR terhadap 117 Gambar 2. Hasil elektroforesis sampel DNA sampel. menggunakan agarose 0.8%

  LAMP

  Isolasi DNA menggunakan metoda boom pada produk hasil preparasi sputum.

  Produk LAMP dianalisis menggunakan Hasil isolasi dideteksi menggunakan gel SYBR green dengan volume 1 : 10. agarose 0.8%.

  Produks positif akan memperlihatkan warna kehijauan sedangkan hasil negatif tetap Hasil amplifikasi produk PCR berwarna orange. Pada penelitian ini memperlihatkan daerah dengan ukuran 240 didapatkan 84 sampel (71.8%) positif bp. Produk dianalisis dengan gel sedangkan 33 sampel (28.2%) negative. elektroforesis 1% dan gel red (biotium).

  Suhu optimal LAMP yang didapatkan Visualisasi menggunakan gel dock. Hasil adalah 58°C. penelitian memperlihatkan 75 sampel (64.1%) positif dan sisanya 42 sampel (35.9%) negatif,

  Gambar 3. Hasil elektroforesis gel agarose 1% Gambar 5. Visualisasi Produk LAMP dengan terhadap gen MPB64 dengan daerah SYBR green. A. negative, B. amplifikasi 240 bp positif

  Pada penelitian ini diperlihatkan keberhasilan amplifikasi menggunakan metoda LAMP pada suhu 58°C dengan

  89.6

  kali. LAMP. Pada beberapa penelitian ditambahkan Helikase untuk mempercepat reaksi (Vincent et al., 2004). Adanya produk amplifikasi menunjukkan adanya gen target. Identifikasi amplikon dapat dilakukan dengan reaksi turbiditas, perubahan warna setelah penambahan hydroxynaphthol blue (HNB) atau bahan flouresens, seperti SBYR green.

  10

  9

  10

  Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) merupakan metoda amplifikasi DNA dan RNA yang sederhana, cepat, spesifik dan murah dan menggunakan taq polymerase yang mempunyai aktivitas strand displacement, misalnya Bst, Pfu, dan Aac polymerase. Metoda ini merupakan pengembangan dari SD pertama kali dikembangkan oleh Eiken Chemical Co., Ltd menggunakan 4 primer yang mengenal 6 daerah yang berbeda tahun 2000 melalui publikasi Notomi dkk (Notomi et al., 2000). Reaksi dilakukan dengan temparatur yang konstan (60 - 65°C) dengan lama antara 15

  PEMBAHASAN

  Analisis kesesuaian antara PCR dengan LAMP memperlihatkan tingkat yang erat (p = 0.000 dan r = 0.747), sebaliknya tingkat kesesuaian antara LAMP dengan BTA atau PCR dengan BTA berada pada posisi kurang erat (masing-masing r = 0.249 dan r = 0.396).

  90.9 76.2 0.608

  60.0

  95.5

  83.3 80.0 0.580 LAMP

  70.0

  57.2 PCR

  97.7

  66.2

  98.0

  62.7

  NPN NPP Uji Kappa BTA

  Metoda Sensiti vitas Spesif isitas

  standar baku emas

  Tabel 1. Nilai Diagnostik PCR, LAMP dan BTA menggunakan kultur sebagai

  Berdasarkan data penelitian diketahui LAMP mempunyai sensitivitas dan nilai duga negatif tertinggi, masing-masing 95.5% dan 90.%, sebaliknya BTA merupakan metoda yang mempunyai nilai prediksi positif terttinggi, yaitu 97.7% namun mempunyai sensitivitas terendah, yaitu 62.7%. Data dari uji kappa memperlihatkan kesesuaian hasil antara LAMP dan BTA dengan kultur berada pada katagori sedang, sebaliknya PCR memperlihatkan kesesuaian hasil dengan katagori erat dengan kultur ( r = 0.608).

  Uji diagnostic didasarkan pada empat variabel, yaitu sensitivitas, spesifisitas, nilai prediksi positif (NPP) dan nilai prediksi negatif (NPN). Standar baku emas yang dijadikan sebagai acuan adalah hasil kultur. Kesesuaian hasil antara metoda uji dengan kultur dinilai menggunakan uji kappa.Tingkat kesesuaian pada uji kappa didasarkan atas nilai koefisiennya (r), yang dibagi atas 5 katagori, yaitu sangat erat (0.8-1), erat (0.6-0.8), sedang (0.4-0.6), kurang erat (0.2-0.4) dan sangat kurang (0.0

  Gambar 6. Distribusi hasil LAMP terhadap 117 sampel sputum Uji diagnostik

• 10

  Semirata 2013 FMIPA Unila

  

Prosiding Semirata FMIPA Universitas Lampung, 2013

• – 0.2).
• – 60 menit. Produk ampflifikasi mencapai

  

Elizabeth Bahar & Rahmatini: Aplikasi Metoda Loop Mediated Isothermal Amplification

(LAMP) Terhadap Gen MPB64 (Rv3036c) Sebagai Diagnosis Cepat Infeksi M.

tuberculosis

  waktu optimal 45 menit. Penelitian ini mendesain lima variasi suhu, yaitu 56, 58, 60, 62 dan 64 serta lima variasi waktu, 25, 35, 45, 60, 75 menit. Hasil penelitian memperlihatkan pada suhu 58°C pemisahan

  double stranded DNA, penempelan primer,

  aktivitas enzim bst polimerase berlangsung secara optimal.

  Dari 117 subjek teliti ditemukan 67 sampel (57.3%) positif TB berdasarkan pemeriksaan kultur. Namun demikian, pemeriksaan BTA , PCR dan LAMP memperlihatkan hasil positif yang bervariasi, masing-masing 43, 75 dan 84 kasus. Hasil positif yang lebih banyak dibandingkan dengan kultur pada LAMP menyebabkan spesifisitas metoda ini menjadi rendah, yaitu 60.0%. Kondisi ini diduga disebabkan adanya kontaminasi tanpa sengaja pada sampel DNA karena sampel DNA berasal dari sputum bukan kultur M. tuberculosis. Kontaminasi dapat terjadi melalui 3 cara, yaitu :

  Kontaminasi terjadi dari satu bahan pemeiksaan ke bahan pemeriksaan berikutnya (sering terjadi dalam masalah diagnostik).

  Potensi amplifikasi dari materi yang menkontaminasi waktu LAMP dimulai. Kontaminasi yang terjadi pada tahap analisis dari pemeriksaan. Upaya yang dilakukan untuk menanggulangi kontaminasi adalah menyiapkan reagen steril dan secara aseptik dimasukan kedalam wadah steril untuk sekali pakai, specimen ditangani dengan sangat aseptik menggunakan aspirator dan wadah sekali pakai.

  Kemungkinan lain kemampuan LAMP dalam mendeteksi kuman dapat dipengaruhi oleh bebeapa faktor yaitu terdapat inhibitor internal dalam specimen, efisiensi lisis sel kuman, kondisi yang digunakan untuk amplifikasi dan deteksi DNA tidak optimal.

  Primer LAMP yang digunakan dalam penelitian ini spesifik untuk MPB64 seharusnya hasil sensitiviti dan spesivisitas cukup tinggi, namun belum tentu disebabkan oleh kuman M tuberculosis. Pada kompleks M tuberculosis pemeriksaan DNA tidak dapat membedakan M

  tuberculosis, M bovis, M bovis BCG, M aficanum dan M microti memiliki kultural,

  biokimia dan epidemiologi yang jelas berbeda akan tetapi dilihat dari basis DNA masih dianggap sebagai saru species yaitu M tuberculosis (Lima et al, 2005). Perbedaan kuman ini dapat dilihat waktu pertumbuhan, produksi niasin, bentuk koloni, reduksi nitrat dan zat yang ada dalam media.

  Notomi dkk (2000) menyatakan bahwa kontaminasi merupakan masalah utama pada LAMP, karena SYBR green yang digunakan bersifat tidak spesifik. Namun demikian, hasil ini hampir sama dengan yang ditemukan oleh Parida dkk (2004) atau Mori & Notomi (2009).

  Hasil penelitian terhadap LAMP memperlihatkan bahwa metoda ini sangat sensitif, akurat, mudah dan efisien Dari aspek ekonomi terlihat bahwa LAMP lebih murah dibanding PCR konvensional namun tetap lebih mahal dibanding pewarnaan BTA (Mori et al., 2009). Moslemi dkk (2009) melaporkan bahwa LAMP mempunyai kesesuain yang tinggi dengan PCR untuk diagnosis Virus Hepatitis B (VHB). Parida dkk memperlihatkan tingkat kesesuaian LAMP untuk deteksi Japanese Encephalitis Virus dengan RT-PCR mencapai 85%. Sentivitas dan Spesifisitas metoda ini adalah 100% dan 86%.

  Dibandingkan dengan PCR dan BTA, kesesuaian hasil LAMP dengan kultur memperlihatkan nilai yang hampir sama. Hasil uji kappa untuk menilai kesesuaian menunjukkan nilai yang tidak berbeda antara BTA, PCR dan LAMP, masing- masing 57.2%, 58.0% dan 60.8%. Berdasarkan katagori terlihat tingkat kesesuaian tersebut berada pada tingkatan sedang.

  Salah satu upaya meningkatkan hasil LAMP adalah mendesain probe spesifik yang dapat mendeteksi DNA target secara

  Das, S., Paramasivan, C.N., Lewis, D.B., Prabhakar, R., Narayanan, P.R., 1995. IS 6110 restriction fragment length polymorphism typing of clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis from patients with pulmonary tuberculosis in Madras, south India. Tuberc Lung Dis.

• –765 Dinh, D.T,Le, M.T.Q., Vuong, C.D, 2011.

  Arch. Intern. Med. 124:49 –54. Gennaro, M.L., 2000. Immunologic Diagnosis of Tuberculosis. Clin. Infect.

  

Prosiding Semirata FMIPA Universitas Lampung, 2013

  Fogan, L. 1969. PPD antigens and the diagnosis of mycobacterial diseases.

  KESIMPULAN

  Berdasarkan data penelitian diketahui 67 sampel positif kultur dan 43 sampel positif berdasarkan hasil BTA

  Analisis molekuler memperlihatkan 75 kasus TB berdasarkan hasil PCR dan 84 kasus berdasarkan hasil LAMP

  Uji diagnostic memperlihatkan LAMP merupakan metoda yang sangat sensitif namun tidak spesifik

  Tidak ada perbedaan tingkat kesesuaian hasil antara LAMP dengan PCR dan BTA menggunakan kultur sebagai standart baku emas.

  SARAN

  Berdasarkan data penelitian ini, disarankan hal berikut : Perlu dkembangkan probe spesifik terhadap daerah target amplifikasi LAMP, sehingga spesivisitas LAMP lebih baik. Perlu diketahui konsentrasi minimal bakteri yang dapat dideteksi menggunakan metoda LAMP.

  An Update Loop mediated isothermal amplification for rapid diagnosis H5N1 Avian Influenza Viruses. Medicine and Health. 39:3-7

  76 : 550-4 van Deun, A and Portaels, F., 1998. Limitations and requirements for quality control of sputum smear microscopy for acid-fast bacilli. Int. J.Tuberc. Lung Dis. 2:756

Dis . 30 : S243 – 6

• –1961 Lalvani, A., Pathan, A.A., McShane, H.,

  direct test, amplicor MTB PCR, and

  IS6110-PCR for detection of MTB in respiratory specimens. Clin. Infect. Dis . 23: 1099 –1106.

  Comparison of the amplified

  A. Kemmerly, C. F. Genre, R. Chambers, D. Greer, G. A. Pankey, D. M. Failla, K. G. Haydel, L. Hutchinson, M. F. Lindley, B. M. Nunez, A. Praba, K. D. Eisenach, and E. S. Cooper. 1996.

  DAFTAR PUSTAKA Dalovisio, J. R., S. Montenegro-James, S.

• –8 Lima DM. Bollela VR, Jacome BJT,

  Semirata 2013 FMIPA Unila lebih akurat. Dalam hal ini peneliti ingin melanjutkan penelitian ini ke tahap berikut dengan menggunakan Gold Nano Partikel (Au-NP) untuk meningkatkan nilai diagnostik LAMP dengan pencapaian spesivisitas tinggi.

  Hong, T. C. T., Q. L. Mai, D. V. Cuong, M.

  M. Parida, M. Harumi, M. Tsugunori, F. Hasebe, and K. Morita. 2004. Development and evaluation of a novel loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus.

  J. Clin. Microbiol. 42: 1956

  Wilkinson, R.J., Latif, M., Conlon, C.P., 2001. Rapid detection of Mycobacterium

  tuberculosis infection by enumeration of

  antigen-specific T cells. Am J Respir Crit Care Med.163:824

  Fonseca BAL. Identifikasi of Mycobacterium species in contaminited Cultures by Polymerase Chain Reaction. Chest 2005: 127:1283-8.

  Mycobacterium tuberculosis (MTB)

  Parida, M.M., Santhosh, S.R., Dash, P.K., Tripathi, N.K., Saxena, P., Ambuj, S., Sahni, A.K., Rao, L. and Morita, K.

  Piersimoni, C and, Scarparo, C., 2003.

  

Elizabeth Bahar & Rahmatini: Aplikasi Metoda Loop Mediated Isothermal Amplification

(LAMP) Terhadap Gen MPB64 (Rv3036c) Sebagai Diagnosis Cepat Infeksi M.

tuberculosis

  Mori, Y. and Notomi, T., 2009. Loop- mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost- effective diagnostic method for infectious diseases. J. Inf. Chemother. 15 : 62

• –Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid and Real-Time Detection of Japanese Encephalitis Virus. J. Clinn Microbiol. 44 : 4172 – 4178.
• –69 Moslemi, E., Javadi, G., Praivar, K., Sattari,

  T.N. and Amini, H.K., 2009. Loop mediated isothermal amplification (LAMP) for rapid detection of HBV in Iran. African Journal of Microbiology Research. 3 : 439-445.

  Nicol MP, Pienaar D, Wood K, Eley B, Wilkinson RJ, Henderson H, 2005.

  Enzyme-linked immunospot assay responses to early secretory antigenic target 6, culture filtrate protein 10, and purified protein derivative among children with tuberculosis: implications for diagnosis and monitoring of therapy.

  41:5355

  Mycobacterium tuberculosis complex in clinical samples. J Clin Microbiol.

  Relevance of commercial amplification methods for direct detection of

  2006. Development and Evaluation of Reverse Transcription

• –65 Shen, G., Bahera, D., Bhalla, M., Nadas, A and Laal, S., 2009. Peptide-Based Antibody Detection for Tuberculosis Diagnosis. Clin.Vacc. Immunol. 16 : 49 – 54.

Clin Infect Dis. 40:1301 –8

  Hasebe, and K. Morita., 2004. Real-time reverse transcription loop mediated isothermal amplification for rapid detection of West Nile virus. J. Clin. Microbiol. 42:257

  Parida, M. M., P. Guillermo, S. Inoue, F.

  Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanabe, K. . Amino, N and Hase, T., 2000. Loop mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acid research. 28 : e63.

  Vincent, M., Xu, Y. and Kong, H. 2004.

  Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 5: 795–800. Wang, JY., Chou, CH., Lee, LN., Hsu, HL.,

  Jan, IS., Hsueh, PR., Yang, PC and Luh, KT., 2007. Diagnosis of Tuberculosis by an Enzyme-Linked Immunospot Assay for Interferon-

  γ. Emerging Infectious Diseases 13 : 553 – 8.

• –263