876d76a1592a5462fdc799c26ca0fd79
PENGARUH PEMBERIAN CpG-ODN
TERHADAP SISTEM KEKEBALAN TUBUH
IKAN KERAPU MACAN (Epinephelus fuscoguttatus FORSSKÅL, 1775)
The Influence of CpG-ODN on Immunity Responses of Tiger Grouper Fish (Epinephelus fuscoguttatus
FORSSKAL, 1775)
Rhena Amalia Kani1, Alexander Rantetondok2, Asmi Citra Malina2
1) Universitas Hasanuddin Jurusan Perikanan, Makassar
2) Dosen Universitas Hasanuddin Jurusan Perikanan, Makassar
Alamat korespondensi:
Rhena Amalia Kani
Fakultas Ilmu Kelautan Dan Perikanan
Universitas Hasanuddin
Makassar
HP: 081355007910
Email: [email protected]
Abstrak
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi kemampuan CpG ODN dalam meningkatkan respon imun ikan
kerapu macan. Disamping itu juga untuk mengetahui sekuen spesifik dari CpG ODN yang cocok untuk ikan kerapu
macan. Bahan imunostimulan yang digunakan pada penelitian ini adalah CpG ODN dengan dua sekuen yang
berbeda Jenis CpG-ODN yang digunakan ada dua jenis yang diperoleh dari PT. Genetika Science Indonesia. CpGODN yang digunakan adalah CpG-ODN 1668 (TCCATGACGTTCCTGATGCT) (Tassakka dan Sakai, 2003) dan
CpG-ODN 2003 (TCGTCGTTGGTTGTCTTTTGGT) (Kreieg, 2000). Rancangan percobaan yang digunakan untuk
menguji pengaruh CpG-ODN dalam meningkatkan respon imun adalah rancangan acak lengkap dengan 6 perlakuan,
tiga ulangan dan kontrol. Ikan kerapu macan kontrol diinjeksi dengan fosfat buffer saline (PBS). Parameter yang
diamati dalam penelitian ini adalah indeks phagositosis, aktivitas lisosim dan respiratory burst. Penyuntikan
dilakukan pada bagian intramuscular dengan menggunakan spoit 1 mL. Untuk pengamatan respiratory burst (asai
letupan respirasi), asai lisozim (lysozyme), dan indeks pagositosis dilakukan dengan mengambilan sampel darah
yang dilakukan pada hari ke-1, hari ke-3, hari ke-5 dan hari ke-7 setelah penyuntikan. Hasil penelitian ini
menunjukkan bahwa CpG 2003 mengandung motif spesifik bagi ikan kerapu macan. Hasil indeks pagositosis
tertinggi ditunjukkan pada ikan yang diberikan CpG-ODN 1668 0,1 µg/ml pada hari pertama yaitu 76%. Hasil
lisosim tertinggi ditunjukkan oleh ikan yang diberikan CpG-ODN dengan sekuen 2003 dengan dosis 10 µg/ml pada
hari ketujuh yaitu sebesar 349 unit. Sedangkan hasil respiratory burst tertinggi di tunjukkan oleh ikan yang
diberikan CpG-ODN 2003 dengan dosis 0,1 µg/ml pada hari ketujuh yaitu sebesar 9,8 nmol O2-.
Kata Kunci: Ikan Kerapu Macan, Imunostimulan, CpG-ODN
Abstract
This study aims to evaluate the ability of CpG ODN in increase immune response of tiger grouper fish. And, to
know the specific sequence of CpG ODN which suitable for Tiger grouper. The immunostimulant material used of
this study was CpG ODN with two different sequence of CpG-ODN used there are two obtained of PT. Genetika
Science Indonesia. CpG-ODN used was CpG-ODN 1668 (TCCATGACGTT CCTGATGCT) (Tasakka and Sakai,
2003) and CPG-ODN 2003 (TCGTCGTTGGTTTCTTTTGGT) (Kreig, 2000). The design of experiment used to test
the influence of CpG-ODN in increase immune response was full random design with 6 treatments, three repeat and
control. The control is injected with fosfat buffer saline (PBS). The parameters observed of this study was
phagosytosis index, lysozime activity and respiratory burst. The injection is done in intramuscular part by using 1
mL spoit. For observation of respiratory burst, lysozime, and phagosythosis index is done by taking blood sample
with three times repeat for each group treatment and done at day before injection, days 1, 3, 5 dan 7 after
injection.Results of this study indicate that CpG 2003 represent optimal sequence of tiger grouper fish. The highest
phagosythosis index result is indicated of fish with CpG-ODN 1668 (0,1 µg/ml) at first day that is 76%. For highest
lisozyme result is indicated for fish with CpG-ODN 2003 with dose (0,1 µg/ml) at first day, while the highest
respiratory burst result is obtained for fish with CpG-ODN 2003 with 0,1 µg/ml.
Keyword : tiger grouper, immunostimulant, CpG-ODN 2003.
PENDAHULUAN
Salah satu komoditi ikan laut yang potensial dan sudah dapat dibudidayakan adalah ikan
Kerapu. Dari hasil penelitian ternyata komoditi Kerapu mempunyai nilai yang menguntungkan
antara lain (a) Ikan Kerapu merupakan makanan yang enak dan gurih dan disukai banyak orang
sehingga pemasaran ikan ini cukup baik, (b) Dari segi ekonomi, sangat menguntungkan karena
harga ikan kerapu macan di pasaran cukup tinggi; dan (c) Pertumbuhan ikan kerapu cepat dan
dapat di produksi massal untuk memenuhi permintaan pasar ikan kerapu dalam keadaan hidup
dan lain-lain
Pada awalnya para pembudidaya kerapu memperoleh bibit dari alam, namun sejak tahun
1993, ikan kerapu macan (Epinephelus fuscoguttatus) sudah dapat dibenihkan. Balai Budidaya
Laut Lampung sebagai unit Pelaksana tekhnik pembenihan ikan kerapu macan, telah melakukan
upaya untuk menghasilkan benih melalui pembenihan buatan manipulasi lingkungan dan
penggunaan hormon (Dirjen Bina Pembenihan, 2011)
Namun sebagaimana usaha budidaya lainnya, budidaya ikan Kerapu juga tidak luput dari
serangan penyakit seperti penyakit yang disebabkan oleh bakteri, virus, parasit, dan lain-lain.
Para pembudidaya harus mengeluarkan biaya ekstra yang cukup besar untuk membeli obatobatan kimia sebagai langkah mengatasi serangan penyakit. Untuk mengobati penyakit dari
kultivan khususnya yang disebabkan oleh mikroorganisme, biasanya para pembudidaya
menggunakan berbagai jenis antibiotik seperti ampisilin, neosin, gentamisin, penisilin G, dan
lain-lain. Fakta belakangan terungkap bahwa antibiotik yang umum digunakan para pembudidaya
ikan untuk menyembuhkan penyakit bakterial ternyata menimbulkan strain baru bakteri yang
resisten, sehingga tidak efektif dalam penanggulangan penyakit (Rantetondok, 2002).
Penggunaan imunostimulan bisa dijadikan alternatif sebagai upaya perlindungan terhadap
serangan penyakit, karena dapat meningkatkan sistem kekebalan natural dan adaptif pada ikan.
Salah satu jenis imunostimulan yang sangat potensial dan efektif meningkatkan kekebalan tubuh
mamalia, ikan, dan udang adalah sekuens nukleotida spesifik yang disebut motif unmethylated
cytosin phosphate guanin (CpG) (Tassakka, 2004). Setelah penemuan imunostimulan DNA
bakteri yang mengandung CpG (Tokunaga et al., 1984; Yamamoto et al., 1994), selanjutnya
ditemukan imunostimulan DNA sintetik yang sekuennya menyerupai CpG DNA bakteri yang
disebut CpG oligodeoxynucleotides atau CpG-ODN.
CpG-ODN ini berfungsi sebagai agen
pertahanan terhadap penyakit pada vertebrata (Kreig, 2002).
Pada ikan, selain terjadi
peningkatan respon imun, penelitian menunjukkan bahwa pemberian CpG-ODN pada ikan
Atlantik salmon (Salmo salar) juga dapat meningkatkan resistensi terhadap penyakit seperti
amoebic gill disease (Bridle et al., 2003).
Jørgensen et al. (2003) memperlihatkan adanya
peningkatan ketahanan tubuh ikan Atlantic salmon terhadap infeksi pancreatic necrosis virus
setelah diberi CpG-ODN.
CpG-ODN juga dapat berfungsi sebagai adjuvan pada goldfish
(Kanellos et al., 1999). Meskipun demikian, penelitian mengenai peranan CpG-ODN pada sistem
pertahanan tubuh ikan maupun hewan akuatik lainnya masih sangat sedikit dibandingkan pada
mamalia. Oleh karena itu, penelitian mengenai pengaruh CpG-ODN pada ikan ekonomis penting
seperti pada ikan kerapu macan sangat penting untuk mencegah perluasan penyakit, sekaligus
memberikan informasi baru mengenai efek CpG-ODN pada ikan yang nantinya dapat memberi
kontribusi bagi perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi di bidang vaksin DNA.
METODE PENELITIAN
Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Politani Pangkep. Untuk pengujian respon imun dilakukan di
Laboratorium Parasit dan Penyakit Ikan Fak. Ilmu Kelautan dan Perikanan Jurusan Perikanan
Universitas Hasanuddin dan Laboratorium Penyakit Politani Pangkep
Alat dan Bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah ikan kerapu macan yang berukuran 8
sampai 10cm dengan berat berkisar antara 7 sampai 10gr yang berasal dari Balai Besar Riset
Perikanan Budidaya Laut Bali, Aquades, Air Laut, Bakteri Staphyloccocus sp, Larutan Metanol,
Larutan Pbs, Imunostimulan berupa CpG ODN. Bahan imunostimulan yang digunakan pada
penelitian ini adalah CpG ODN dengan dua sekuen spesifik yang berbeda yang diperoleh dari PT
Genetika Science Indonesia. CpG oligodeoxynucleotides (CpG-ODN) yang digunakan adalah
CpG-ODN 1668 (TCCATGACGTTCCTGATGCT) (Tassakka dan Sakai, 2004) dan CpG-ODN
2003 (TCGTCGTTGGTTGTCTTTTGGT) (Krieg, 2000) dan bahan-bahan lainnya.
Prosedur Penelitian
Rancangan percobaan yang digunakan untuk menguji pengaruh CpG-ODN dalam
meningkatkan respon imun adalah rancangan acak lengkap dengan 6 perlakuan, tiga ulangan dan
kontrol. Kontrol yang digunakan dalam penelitian ini adalah kontrol positif dengan larutan
Phospat Buffer Solution (PBS). Parameter imun yang diuji adalah Indeks pagositosis
Teknik Analisis Data
Pengambilan data Indeks Pagositosis, aktivitas lisosim dan Respiratory burst dilakukan
pada hari ke-1, hari ke-3, hari ke-5 dan hari ke-7 setelah penyuntikan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Indeks Pagositosis
Dari hasil penghitungan Indeks Pagositosis pada ikan kerapu macan yang disuntikkan
CpG 1668 dan CpG 2003, datanya dapat dilihat pada Tabel 2 berikut:
Tabel 3. Rata-rata Persentasi Indeks Pagositosis dari Ikan Kerapu Macan
Perlakuan
Rata-rata ±SD
H1
H3
H5
H7
CpG 1668 (0,1µg/ml)
76d±3
45,1b±15
91,5d±2,5
76,5d±4
CpG 1668 (1µg/ml)
35c±6
29b±9,1
88,5d±3,5
98e±1
CpG 1668 (10µg/ml
3a±0
10a±3
89d±3
89e±1,1
CpG 2003 (0,1µg/ml)
11b±1
77,5c±3,5
72,5c±4
57c±6
CpG 2003 (1µg/ml)
5,5a±0,5
26ab±5
54b±5
87,3d±3,5
CpG 2003 (10µg/ml
4,8a±1
73c±1
19a±3
39,8b±9,3
Kontrol
10a±2
10a±2
10a±2
10a±2
Ket: Huruf yang sama dibelakang angka dalam satu kolom menyatakan tidak berbeda nyata
(P>0,05)
Hasil analisis ragam dari indeks pagositosis ikan kerapu macan menunjukkan bahwa
CpG-ODN yang diberikan memberikan pengaruh nyata (P
TERHADAP SISTEM KEKEBALAN TUBUH
IKAN KERAPU MACAN (Epinephelus fuscoguttatus FORSSKÅL, 1775)
The Influence of CpG-ODN on Immunity Responses of Tiger Grouper Fish (Epinephelus fuscoguttatus
FORSSKAL, 1775)
Rhena Amalia Kani1, Alexander Rantetondok2, Asmi Citra Malina2
1) Universitas Hasanuddin Jurusan Perikanan, Makassar
2) Dosen Universitas Hasanuddin Jurusan Perikanan, Makassar
Alamat korespondensi:
Rhena Amalia Kani
Fakultas Ilmu Kelautan Dan Perikanan
Universitas Hasanuddin
Makassar
HP: 081355007910
Email: [email protected]
Abstrak
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi kemampuan CpG ODN dalam meningkatkan respon imun ikan
kerapu macan. Disamping itu juga untuk mengetahui sekuen spesifik dari CpG ODN yang cocok untuk ikan kerapu
macan. Bahan imunostimulan yang digunakan pada penelitian ini adalah CpG ODN dengan dua sekuen yang
berbeda Jenis CpG-ODN yang digunakan ada dua jenis yang diperoleh dari PT. Genetika Science Indonesia. CpGODN yang digunakan adalah CpG-ODN 1668 (TCCATGACGTTCCTGATGCT) (Tassakka dan Sakai, 2003) dan
CpG-ODN 2003 (TCGTCGTTGGTTGTCTTTTGGT) (Kreieg, 2000). Rancangan percobaan yang digunakan untuk
menguji pengaruh CpG-ODN dalam meningkatkan respon imun adalah rancangan acak lengkap dengan 6 perlakuan,
tiga ulangan dan kontrol. Ikan kerapu macan kontrol diinjeksi dengan fosfat buffer saline (PBS). Parameter yang
diamati dalam penelitian ini adalah indeks phagositosis, aktivitas lisosim dan respiratory burst. Penyuntikan
dilakukan pada bagian intramuscular dengan menggunakan spoit 1 mL. Untuk pengamatan respiratory burst (asai
letupan respirasi), asai lisozim (lysozyme), dan indeks pagositosis dilakukan dengan mengambilan sampel darah
yang dilakukan pada hari ke-1, hari ke-3, hari ke-5 dan hari ke-7 setelah penyuntikan. Hasil penelitian ini
menunjukkan bahwa CpG 2003 mengandung motif spesifik bagi ikan kerapu macan. Hasil indeks pagositosis
tertinggi ditunjukkan pada ikan yang diberikan CpG-ODN 1668 0,1 µg/ml pada hari pertama yaitu 76%. Hasil
lisosim tertinggi ditunjukkan oleh ikan yang diberikan CpG-ODN dengan sekuen 2003 dengan dosis 10 µg/ml pada
hari ketujuh yaitu sebesar 349 unit. Sedangkan hasil respiratory burst tertinggi di tunjukkan oleh ikan yang
diberikan CpG-ODN 2003 dengan dosis 0,1 µg/ml pada hari ketujuh yaitu sebesar 9,8 nmol O2-.
Kata Kunci: Ikan Kerapu Macan, Imunostimulan, CpG-ODN
Abstract
This study aims to evaluate the ability of CpG ODN in increase immune response of tiger grouper fish. And, to
know the specific sequence of CpG ODN which suitable for Tiger grouper. The immunostimulant material used of
this study was CpG ODN with two different sequence of CpG-ODN used there are two obtained of PT. Genetika
Science Indonesia. CpG-ODN used was CpG-ODN 1668 (TCCATGACGTT CCTGATGCT) (Tasakka and Sakai,
2003) and CPG-ODN 2003 (TCGTCGTTGGTTTCTTTTGGT) (Kreig, 2000). The design of experiment used to test
the influence of CpG-ODN in increase immune response was full random design with 6 treatments, three repeat and
control. The control is injected with fosfat buffer saline (PBS). The parameters observed of this study was
phagosytosis index, lysozime activity and respiratory burst. The injection is done in intramuscular part by using 1
mL spoit. For observation of respiratory burst, lysozime, and phagosythosis index is done by taking blood sample
with three times repeat for each group treatment and done at day before injection, days 1, 3, 5 dan 7 after
injection.Results of this study indicate that CpG 2003 represent optimal sequence of tiger grouper fish. The highest
phagosythosis index result is indicated of fish with CpG-ODN 1668 (0,1 µg/ml) at first day that is 76%. For highest
lisozyme result is indicated for fish with CpG-ODN 2003 with dose (0,1 µg/ml) at first day, while the highest
respiratory burst result is obtained for fish with CpG-ODN 2003 with 0,1 µg/ml.
Keyword : tiger grouper, immunostimulant, CpG-ODN 2003.
PENDAHULUAN
Salah satu komoditi ikan laut yang potensial dan sudah dapat dibudidayakan adalah ikan
Kerapu. Dari hasil penelitian ternyata komoditi Kerapu mempunyai nilai yang menguntungkan
antara lain (a) Ikan Kerapu merupakan makanan yang enak dan gurih dan disukai banyak orang
sehingga pemasaran ikan ini cukup baik, (b) Dari segi ekonomi, sangat menguntungkan karena
harga ikan kerapu macan di pasaran cukup tinggi; dan (c) Pertumbuhan ikan kerapu cepat dan
dapat di produksi massal untuk memenuhi permintaan pasar ikan kerapu dalam keadaan hidup
dan lain-lain
Pada awalnya para pembudidaya kerapu memperoleh bibit dari alam, namun sejak tahun
1993, ikan kerapu macan (Epinephelus fuscoguttatus) sudah dapat dibenihkan. Balai Budidaya
Laut Lampung sebagai unit Pelaksana tekhnik pembenihan ikan kerapu macan, telah melakukan
upaya untuk menghasilkan benih melalui pembenihan buatan manipulasi lingkungan dan
penggunaan hormon (Dirjen Bina Pembenihan, 2011)
Namun sebagaimana usaha budidaya lainnya, budidaya ikan Kerapu juga tidak luput dari
serangan penyakit seperti penyakit yang disebabkan oleh bakteri, virus, parasit, dan lain-lain.
Para pembudidaya harus mengeluarkan biaya ekstra yang cukup besar untuk membeli obatobatan kimia sebagai langkah mengatasi serangan penyakit. Untuk mengobati penyakit dari
kultivan khususnya yang disebabkan oleh mikroorganisme, biasanya para pembudidaya
menggunakan berbagai jenis antibiotik seperti ampisilin, neosin, gentamisin, penisilin G, dan
lain-lain. Fakta belakangan terungkap bahwa antibiotik yang umum digunakan para pembudidaya
ikan untuk menyembuhkan penyakit bakterial ternyata menimbulkan strain baru bakteri yang
resisten, sehingga tidak efektif dalam penanggulangan penyakit (Rantetondok, 2002).
Penggunaan imunostimulan bisa dijadikan alternatif sebagai upaya perlindungan terhadap
serangan penyakit, karena dapat meningkatkan sistem kekebalan natural dan adaptif pada ikan.
Salah satu jenis imunostimulan yang sangat potensial dan efektif meningkatkan kekebalan tubuh
mamalia, ikan, dan udang adalah sekuens nukleotida spesifik yang disebut motif unmethylated
cytosin phosphate guanin (CpG) (Tassakka, 2004). Setelah penemuan imunostimulan DNA
bakteri yang mengandung CpG (Tokunaga et al., 1984; Yamamoto et al., 1994), selanjutnya
ditemukan imunostimulan DNA sintetik yang sekuennya menyerupai CpG DNA bakteri yang
disebut CpG oligodeoxynucleotides atau CpG-ODN.
CpG-ODN ini berfungsi sebagai agen
pertahanan terhadap penyakit pada vertebrata (Kreig, 2002).
Pada ikan, selain terjadi
peningkatan respon imun, penelitian menunjukkan bahwa pemberian CpG-ODN pada ikan
Atlantik salmon (Salmo salar) juga dapat meningkatkan resistensi terhadap penyakit seperti
amoebic gill disease (Bridle et al., 2003).
Jørgensen et al. (2003) memperlihatkan adanya
peningkatan ketahanan tubuh ikan Atlantic salmon terhadap infeksi pancreatic necrosis virus
setelah diberi CpG-ODN.
CpG-ODN juga dapat berfungsi sebagai adjuvan pada goldfish
(Kanellos et al., 1999). Meskipun demikian, penelitian mengenai peranan CpG-ODN pada sistem
pertahanan tubuh ikan maupun hewan akuatik lainnya masih sangat sedikit dibandingkan pada
mamalia. Oleh karena itu, penelitian mengenai pengaruh CpG-ODN pada ikan ekonomis penting
seperti pada ikan kerapu macan sangat penting untuk mencegah perluasan penyakit, sekaligus
memberikan informasi baru mengenai efek CpG-ODN pada ikan yang nantinya dapat memberi
kontribusi bagi perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi di bidang vaksin DNA.
METODE PENELITIAN
Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Politani Pangkep. Untuk pengujian respon imun dilakukan di
Laboratorium Parasit dan Penyakit Ikan Fak. Ilmu Kelautan dan Perikanan Jurusan Perikanan
Universitas Hasanuddin dan Laboratorium Penyakit Politani Pangkep
Alat dan Bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah ikan kerapu macan yang berukuran 8
sampai 10cm dengan berat berkisar antara 7 sampai 10gr yang berasal dari Balai Besar Riset
Perikanan Budidaya Laut Bali, Aquades, Air Laut, Bakteri Staphyloccocus sp, Larutan Metanol,
Larutan Pbs, Imunostimulan berupa CpG ODN. Bahan imunostimulan yang digunakan pada
penelitian ini adalah CpG ODN dengan dua sekuen spesifik yang berbeda yang diperoleh dari PT
Genetika Science Indonesia. CpG oligodeoxynucleotides (CpG-ODN) yang digunakan adalah
CpG-ODN 1668 (TCCATGACGTTCCTGATGCT) (Tassakka dan Sakai, 2004) dan CpG-ODN
2003 (TCGTCGTTGGTTGTCTTTTGGT) (Krieg, 2000) dan bahan-bahan lainnya.
Prosedur Penelitian
Rancangan percobaan yang digunakan untuk menguji pengaruh CpG-ODN dalam
meningkatkan respon imun adalah rancangan acak lengkap dengan 6 perlakuan, tiga ulangan dan
kontrol. Kontrol yang digunakan dalam penelitian ini adalah kontrol positif dengan larutan
Phospat Buffer Solution (PBS). Parameter imun yang diuji adalah Indeks pagositosis
Teknik Analisis Data
Pengambilan data Indeks Pagositosis, aktivitas lisosim dan Respiratory burst dilakukan
pada hari ke-1, hari ke-3, hari ke-5 dan hari ke-7 setelah penyuntikan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Indeks Pagositosis
Dari hasil penghitungan Indeks Pagositosis pada ikan kerapu macan yang disuntikkan
CpG 1668 dan CpG 2003, datanya dapat dilihat pada Tabel 2 berikut:
Tabel 3. Rata-rata Persentasi Indeks Pagositosis dari Ikan Kerapu Macan
Perlakuan
Rata-rata ±SD
H1
H3
H5
H7
CpG 1668 (0,1µg/ml)
76d±3
45,1b±15
91,5d±2,5
76,5d±4
CpG 1668 (1µg/ml)
35c±6
29b±9,1
88,5d±3,5
98e±1
CpG 1668 (10µg/ml
3a±0
10a±3
89d±3
89e±1,1
CpG 2003 (0,1µg/ml)
11b±1
77,5c±3,5
72,5c±4
57c±6
CpG 2003 (1µg/ml)
5,5a±0,5
26ab±5
54b±5
87,3d±3,5
CpG 2003 (10µg/ml
4,8a±1
73c±1
19a±3
39,8b±9,3
Kontrol
10a±2
10a±2
10a±2
10a±2
Ket: Huruf yang sama dibelakang angka dalam satu kolom menyatakan tidak berbeda nyata
(P>0,05)
Hasil analisis ragam dari indeks pagositosis ikan kerapu macan menunjukkan bahwa
CpG-ODN yang diberikan memberikan pengaruh nyata (P