KARAKTERISASI BERDASARKAN UJI ASPEK MORFOLOGI DAN BIOKIMIA SERTA PENGARUH AERASI TERHADAP PERTUMBUHAN Zymomonas mobilis GALUR LIAR (ZM JPG)
KARAKTERISASI BER SI BERDASARKAN UJI ASPEK MOR ORFOLOGI DAN
BIOKIMIA SER A SERTA PENGARUH AERASI TER TERHADAP
PERTUMBUHA HAN Zymomonas mobilis GALUR LIAR LIAR (ZM JPG)
1) 1)
1 1) Teta M ta Mumtaz Kurniasari. , Surya Rosa Putra Laboratorium Biokim imia, Jurusan Kimia, Institut Teknologi Sepuluh Nop opember Surabaya.
ABSTRAK Zymomonas mobilis merupakan bakteri anaerob fakultatif yang mem emiliki karakteristik gram
negatif berbentuk batang, uji ji oksidase negatif, uji katalase positif, tidak mem embentuk indol dan tidak
menghidrolisis gelatin. Beber berapa karakteristik lain diantaranya seperti motili otilitas, pembentukan H 2 S,serta kadar toleransi terhadap ap oksigen bervariasi hasilnya antar galur Z. mobi obilis . Z. mobilis ZM JPG
koleksi laboratorium kimia ITITS diuji aspek morfologi serta aspek biokimiany nya. Hasil uji menyatakan
bahwa ZM JPG memiliki ka karakteristik gram negatif berbentuk batang, bers bersifat anaerob fakultatif,
bentuk koloni bundar, tepi kol koloni utuh, convek dan berwarna putih. ZM JPG be bersifat motil, tidak dapat
tumbuh pada laktosa dan manni annitol, dapat menfermentasi glukosa dan sukrosa, osa, uji oksidase negatif, uji
katalase positif, tidak membe bentuk H 2 S dan tidak membentuk indol. ZM JPG JPG mampu tumbuh padamedia dengan konsentrasi gluk glukosa sebesar 100 g/l . Fase lag berlangsung s selama 5 jam baik pada
media yang diaerasi maupun upun yang tidak diaerasi. Fase pertumbuhan diperla rlambat pada media yang
diaerasi lebih singkat yakni 3 ni 3 jam sedangkan pada media yang tidak diaeras rasi berlangsung selama 8
jam. Pertumbuhan optimum m dicapai pada inkubasi selama 34 jam baik pada pada media yang diaerasi
maupun yang tidak diaerasi.Kata kunci : Zymomonas mobil obilis , ZM JPG, uji morfologi, uji biokimia, efek aer aerasi PENDAHULUAN
Zymomonas mobilis obilis merupakan bakteri gram negatif berbentuk ntuk batang dan bersifat
anaerob fakultatif. Z. mobil obilis menempuh jalur Etner-Doudoroff dan me menfermentasi glukosa, fruktosa, dan sukrosa menja njadi etanol sebagai produk utamanya. Z. mobi obilis memiliki beberapa kelebihan dibandingkan de dengan Saccharomyces cerivisiae antara lain in lebih tahan terhadap konsentrasi etanol kadar tingg tinggi juga dapat tumbuh pada konsentrasi gula k ula kadar tinggi.
Z. mobilis yang tel telah diteliti ada sebanyak 74 galur yang di diisolasi dari berbagai
sumber. Z. mobilis dikarakt rakterisasi sebagai bakteri gram negatif berb rbentuk batang dengan panjang 2-6 µm dan lebar bar 1-1,4 µm. Jika Z. mobilis bersifat motil otil, maka mereka akan memiliki 1-4 flagela polar. ar. Koloni dalam medium standard akan meng engkilat, berwarna putih
o
atau krem dan berdiameter er 1-2 mm setelah 2 hari pada suhu 30
C. Selur luruh galur yang diteliti memiliki hasil uji oksidas dase negatif, uji katalase positif, tidak meng nghasilkan indol, tidak menghidrolisis gelatin serta rta tidak mereduksi nitrat. Sedangkan terdapat b t beberapa karakteristik yang hasilnya bervariasi i antar galur Z. mobilis beberapa diantara aranya yakni motilitas, pembentukan H
2 S, morfolog ologi koloni yang dapat berbentuk convek atau au umbonate, dan kadar toleransi terhadap oksigen ( n (Swings dan De Ley, 1977).
Beberapa galur Z. m . mobilis yang telah diteliti menghasilkan etanol anol dengan kadar yang berbeda meskipun kondisi f si fermentasinya sama (Gunasekaran, dkk., 1986 1986). Hal ini disebabkan oleh karakteristik dari tiap iap Z. mobilis yang bersifat anaerob fakulta kultatif akan tetapi kadar toleransinya terhadap oksi ksigen berbeda satu dengan yang lain. Bahk ahkan galur Z. mobilis anaerobia justru pertumbuha buhannya terhambat apabila diaerasi (Swings da dan De Ley, 1977).
Laboratorium biokim kimia ITS memiliki beberapa koleksi galur r Z. mobilis, salah satu diantaranya adalah Z. mobi obilis galur liar ZM JPG yang belum diteliti iti aspek morfologi dan biokimianya serta kadar tol toleransinya terhadap oksigen. Penelitian ini da dapat melengkapi profil ZM JPG secara detil dan an nantinya dapat digunakan untuk eksplora rasi lebih lanjut akan potensinya bukan hanya se sebagai produsen etanol tetapi juga potensin nsinya sebagai produsen sorbitol.
METODOLOGI PENELI LITIAN Bahan
Bahan-bahan yang ng digunakan dalam penelitian ini adalah h kultur murni bakteri
Zymomonas mobilis jpg ya yang diperoleh dari laboratorium Biokimia FM FMIPA ITS, Surabaya,
Media nutrient agar (N (NA), glukosa, sukrosa, yeast ekstrak, ( (NH
4 )
2 SO 4 , KH
2 PO 4 ,
MgSO
4 .7H
2 O, larutan NaO aOH, larutan H
2 SO 4 , aquabides, aquademiner neralisasi, reagen DNS. methylen blu
e, minyak k imersi, kristal violet, larutan iodin, eti etil alkohol, safranin,
thioglycollate, agar dan m media semi padat Sulfide Indol Motility (SIM SIM), glukosa, laktosa,
sukrosa, mannitol, pepton w on water , bromtimol blue, MRVP broth dan mala alakit hijau.Identifikasi Morfologi Zym ymomonas mobilis secara Makroskopik
Pengamatan makros kroskopik dan mikroskopik merupakan n salah satu langkah karakterisasi isolat bakteri, ri, selain dengan uji biokimia. Pengamatan mikr ikroskopik adalah untuk mengetahui bentuk sel is isolat bakteri secara mikroskopis dengan pe n pewarnaan sederhana menggunakan metilen blue blue. Sedang pengamatan makroskopik adalah lah pengamatan bentuk pertumbuhan koloni yang b bakteri yang tumbuh di permukaan media pada padat NA-HgCl 2 10 ppm. Paramater karakter koloni m i meliputi :
a. Bentuk koloni (dilihat hat dari atas): berupa titik-titik, bulat, berbenan nang, tak teratur, serupa akar, serupa kumparan.
b. Permukaan koloni (dil dilihat dari samping): rata, timbul-datar, me elengkung, membukit, serupa kawah.
c. Tepi koloni (dilihat dari dari atas): utuh, berombak, berbelah, bergerigi, be i, berbenang, keriting.
d. Warna koloni: keput putih-putihan, kelabu, kekuning-kuningan a n atau hampir bening (Dwijoseputro, 2003). .
Uji Aspek Biokimia Zymo momonas mobilis
Uji biokimia yang di dilakukan merupakan hasil modifikasi metode ode dari dari Lay (1994), Cappucino dan Sherman (2001) n (2001), Harley dan Prescott (2002), dan Col ollins and Lyne (1985). Uji biokimia terdiri dari pe i pewarnaan Gram dan endospora, kebutuhan uhan oksigen, fermentasi karbohidrat, IMVIC(Indol- -Metyl Red-Voges Proskauer-Citrat) dan uji pe i pembentukan hidrogen sulfida, oksidase dan kata atalase. Sebelum melakukan pengujian, isola olat bakteri sebelumnya diremajakan dalam media pa a padat NA-HgCl 10 ppm hingga diperoleh is h isolat yang berumur 24
2 jam.
Pewarnaan Gram
Preparat ulas ditetes tesi larutan kristal violet sebanyak 2-3 tetes d dan didiamkan selama 20 detik, selanjutnya dicuci uci di bawah air mengalir dan dikeringanginka nkan. Selanjutnya larutan iodin (Merck, Jerman) dit diteteskan sebanyak 2-3 tetes di atas perm rmukaan preparat dan didiamkan selama 1 menit, nit, kemudian dicuci di bawah air mengalir da dan dikering anginkan. Larutan etil alkohol (Merck, rck, Jerman) 95% diteteskan setetes demi setet tetes di atas permukaan lapisan preparat sampai kris kristal violet tercuci dan kemudian dicuci di ba bawah air mengalir dan dikeringanginkan. Larutan s n safranin diteteskan di atas permukaan kaca ob a obyek dan didiamkan selama 20 detik, dicuci di ba i bawah air mengalir dan dikeringanginkan. Se n. Setelah preparat ditutup dengan gelap penutup, kem emudian diamati dibawah mikroskop pada perb perbesaran 1000X dengan bantuan minyak imersi (Lay ay, 1994).
Pewarnaan Endospora
Preparat ulas ditem mpatkan pada rak pewarnaan. Preparat ulas di s ditutup penuh dengan kertas saring. Kemudian n zat warna hijau malakit diteteskan denga ngan pipet Pasteur ke permukaan kertas saring se g secara merata dan selanjutnya dipanaskan selama 5 menit dan didinginkan. Setelah prepar parat dingin, kertas saring dibuang dan prepa parat dibilas dengan air yang mengalir dan dikering ringanginkan. Kemudian preparat diwarnai den dengan safranin selama 1 menit dan dibilas dengan n air yang mengalir dan dikeringanginkan. S n. Setelah ditutup dengan gelas penutup, preparat diam diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 100 n 1000X dengan minyak imersi (Lay, 1994).
Kebutuhan Oksigen
Sebanyak 3 gram ag agar dan 29.5 gram media thioglycollate (Oxoi xoid, CMO173, Inggris) dilarutkan ke dalam 1 liter er akuadest dan dipanaskan diatas pemanas (G (Gerhard, EVI, Jerman) sampai agar larut dan hom homogen. Kemudian media didistribusikan ke ke dalam tabung reaksi sebanyak sebanyak 7 ml da dan disterilisasi dalam autoklaf (Hirayama, H , HL 42A, Jepang) pada suhu 121°C dan tekanan 1 n 1 atm selama 15 menit. Setelah dikeluarkan an dari autoklaf, tabung reaksi yang berisi media lang langsung dimasukkan ke dalam bak yang beris risi air yang telah diatur suhunya setinggi 50°C untuk ntuk mencegah pemadatan agar. Setelah suhu m uhu media teradaptasi pada suhu 50°C yang ditandai de i dengan media terasa hangat-hangat kuku, kem kemudian satu ose isolat bakteri berumur 24 jam di inokul di inokulasikan ke dalam media tersebut secara a ra aseptis. Tabung reaksi kemudian diputar dengan n telapak tangan, agar bakteri terdistribusi m merata di dalam agar. Setelah diinkubasi selama 48 a 48 jam pada suhu 37°C pola pertumbuhan i n isolat bakteri diamati. Apabila isolat bakteri hany nya tumbuh di permukaan media, maka isolat olat tersebut adalah aerob obligat. Apabila isolat bakt akteri tumbuh sepanjang kolom tabung reaksi ksi, tetapi pertumbuhan terpekat pada permukaan a n agar, maka isolat adalah anaerob fakultatif. A
f. Apabila isolat bakteri tumbuh merata sepanjang ng kolom tabung reaksi, maka isolat adalah ah anaerob aerotoleran. Apabila isolat bakteri hanya nya tumbuh dibawah permukaan agar, tetapi tida tidak sampai sepanjang kolom tabung reaksi, mak aka isolat adalah mikroaeroflik. Sedangkan a n apabila hanya tumbuh pada dasar tabung reaksi, m i, maka isolat adalah anaerob obligat (Harley ley dan Prescott, 2002, Cappuccino dan Sherman, 2001) n, 2001).
Fermentasi Karbohidrat
Karbohidrat yang di digunakan adalah glukosa, laktosa dan mani anitol. Media fermentasi adalah 1% glukosa (Difco, U o, USA), 0.5% laktosa (Difco, USA) dan 0.5% % manitol (Difco, USA) yang masing-masing dilarut arutkan ke dalam 100 ml media cair pepton w on water (Oxoid, Inggris) yang mengandung 1 ml br bromthymol blue 0,1% (EG-Kennzeichnung, g, Jerman). Selanjutnya media fermentasi tersebut di t dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak yak 3 ml. Satu ose isolat bakteri diinokulasikan ke da dalam media fermentasi tersebut secara asept eptis dan diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37°C 37°C (Collins and Lyne, 1985).
Uji Katalase
Satu ose isolat bakt akteri digoreskan secara aseptis ke kaca objek objek dan kemudian pada permukaannya ditetesi seba banyak satu tetes H
2 O
2 3%. Hasil positif ditanda tandai dengan timbulnya gas atau gelembung udara di a di sekitar goresan bakteri tersebut (Harley dan P dan Prescott, 2002).Uji Pembentukan Hidroge ogen Sulfida (H S)
2 Jarum inokulasi yan ang ujung tajamnya mengandung isolat bakteri kteri ditusukkan ke dalam
media semi padat Sulfide Indol Indol Motility (SIM) (Difco, USA) secara asept eptis dan diinkubasikan selama 24 jam pada tempe peratur 37°C (Cappuccino & Sherman, 2001) 2001). Tes positif ditandai dengan terbentuknya endapa dapan hitam di dalam media sebagai indikator ator terbentuknya H S.
2 Hasil tes ini juga digunaka akan untuk tes motilitas. Apabila bakteri terse ersebut motil maka dari
permukaan media, pertumbuha buhan bakteri terlihat melebar dan menyempi pit ke arah dasar tabung reaksi mengikuti arah tusuka usukan jarum. Apabila bakteri non motil, pertum tumbuhan bakteri hanya terlihat pada daerah tusukan j kan jarum saja.
Uji Oksidase
Uji oksidase dilakuka lakukan dengan mengoleskan biakan bakter kteri umur 24 jam ke permukaan kertas oksidase se (Oxoid, Inggris) secara aseptis dengan tusuk usuk gigi steril. Apabila hasil positif, maka setelah ah 5 detik terbentuklah warna ungu pada ker kertas oksidase tersebut (Harley dan Prescott, 2002) 2).
Uji Pembentukan Indol
Satu ose isolat bakt bakteri diinokulasikan secara aseptis ke 3 ml m l media cair Trptic Soy
Broth (TSB)(Difco, USA) da dalam tabung reaksi. Kemudian diinkubasika ikan selama 24 jam pada
suhu 37 C dan setelahnya nya ditambahkan 0,5 ml Kovac’s reagent (B Bioanalitika, surabaya) (Cappuccino & Sherman, 2001) n, 2001). Tes positif ditandai dengan terbentukny uknya warna merah.
Uji Metil Merah
Satu ose biakan bakt bakteri diinokulasikan secara aseptis pada 3 ml m l media cair Methyl Red
Voges-Proskauer broth (MR MR-VP)(Difco, USA) di tabung reaksi dan diinkuba diinkubasikan pada suhu
37 C selama 3 hari. Sete etelah itu ditambahkan 2 tetes indikator Methy ethyl Red (Bioanalitika, Surabaya). Hasil positif dita ditandai dengan perubahan warna merah pada m da media (Cappuccino & Sherman, 2001).
Uji Voges Proskauer
Satu jarum ose biaka akan bakteri diinokulasikan secara aseptis pada da 3 ml media cair MR-
VP broth , lalu diinkubasi si pada suhu 37 C selama 3 hari. Setelah it h itu ditetesi KOH 40%
(Merck, Jerman) sebanyak ak 5 tetes dan 10 tetes α-naftol 5% (Merck, J k, Jerman). Apabila hasil positif maka setelah 15 meni enit media berubah warna menjadi merah (pink pinkish red ) (Cappuccino & Sherman, 2001).
Penentuan Efek Aerasi pad pada Pertumbuhan Zymomonas mobilis
Satu ose Zymomona onas mobilis diinokulasikan ke dalam 200 mL mL medium steril yang terdiri atas 100 g/l glukosa osa, 5 g/l (NH
4 )
2 SO 4 , 0,5 g/l MgSO 4 .7H
2 O, 1 g 1 g/l KH
2 PO 4 dan 5 g/l yeast ekstrak lalu medium i ini dibagi ke dalam dua Erlenmeyer 250 mL L masing-masing berisi 100 mL medium dan diinkuba iinkubasi dengan perlakuan yang berbeda. Me edia I diinkubasi pada
o
kondisi fermentasi temperat ratur 30 C dan dishaker pada kecepatan 120 r 120 rpm sedangkan media
II diinkubasi pada temperat ratur yang sama hanya saja tidak di shaker. Me Media kemudian diukur absorbansinya menggunaka kan spektrofotometer tiap jam pada λ 500 nm nm hingga fasa kematian terjadi. Blanko yang diguna gunakan adalah medium fermentasi steril ya yang tidak diinokulasi dengan Zymomonas mobilis obilis .
HASIL DAN PEMBAHAS ASAN HASIL Uji Aspek Morfologi
Aspek morfologi pa pada media cawan petri maupun pada agar ar miring dapat diamati secara makroskopis. Bentuk tuk koloni Z. mobilis ZM JPG berbentuk bulat bulat (circular) dengan tepi utuh (regular), berwarna put putih dan kenaikan permukaannya berbentuk ntuk convek (Gambar 1). Diameter koloni setelah 2 ha 2 hari sebesar 1 mm. Pertumbuhan Z. mobilis pa pada media agar miring ada yang berbentuk filiform orm atau beaded. Pertumbuhan ZM JPG pada m media agar miring lebih mengarah pada bentuk beade beaded . Sedangkan hasil pewarnaan gram ZM ZM JPG sesuai dengan karakteristik Z. mobilis yakni akni gram negatif (Gambar 2).
Gambar 1. Bentuk kol uk koloni Gambar 2. ZM JPG kultur 24 jam
Gambar 3. Sel ZM JPG kultur 48 jam Gambar 4. Pewarnaan spora (hasil negatif) G
Bentuk dan ukuran s n sel Z. mobilis merupakan ciri yang mencolok ok dikarenakan lebar sel yang tidak biasa pada bakt bakteri yakni antara panjang dan lebarnya pe perbandingannya tidak terlalu jauh dan apabila um umur kultur lebih tua maka bentuknya akan lebi ebih panjang akan tetapi hasil pewarnaan gramnya ya tidak terlalu bagus (Gambar 3). Hasil il uji pewarnaan spora menunjukkan bahwa ZM JP JPG tidak membentuk spora sesuai dengan ka n karakteristik Z. mobilis. Sel seluruhnya berwarna m merah seperti halnya hasil pewarnaan gram, m, kalau terdapat spora seharusnya terdapat bagian be an berwarna hijau pada sel dengan letak tertentu. ( ntu. (Gambar 4).
Uji kebutuhan oksigen
Gambar 5. Uji kebutuhan oksigen
Z. mobilis merupaka upakan bakteri anaerob fakultatif. ZM JPG mem emiliki hasil uji positif
bakteri anaerob fakultatif, tif, hal ini ditunjukkan oleh pertumbuhan n bakteri pada media Thioglycollate agar yang te terdapat di sepanjang tabung reaksi (Gamba bar 5), dimana medium yang berwarna pink merupa rupakan daerah yang memiliki oksigen sedan angkan daerah medium yang berwarna kuning tida tidak terdapat oksigen. Perbedaan warna terse rsebut disebabkan oleh adanya resazurin yang akan kan berwarna pink dengan adanya oksigen dan dan akan tidak berwarna dalam keadaan tereduksiny inya. Z. mobilis merupakan bakteri anaerob ob fakultatif yang dapat hidup dengan atau tanpa ada adanya oksigen.
Uji Oksidase
Molekul organik be k bertindak sebagai akseptor elektron pada me metabolisme fermentatif sedangkan molekul anorga organik bertindak sebagai akseptor elektron on dalam metabolisme oksidatif (respirasi). Dalam lam bakteri aerobik, sitokrom membawa elekt lektron kepada oksigen sebagai akseptor elektron n terakhir. Uji oksidase digunakan untuk me menentukan keberadaan salah satu dari empat kelom ompok sitokrom, yakni sitokrom c (Johnson dan C on dan Case, 2004).
Gambar 6. Uji oksidase Uji oksidase merupa upakan sifat khas pada Z. mobilis. Hasil uji oks oksidase pada ZM JPG negatif (tidak terjadi peruba ubahan warna) berarti sesuai dengan karakteris ristik Z. mobilis.. Dalam proses anaerob, senyawa orga organik selain oksigen bertindak sebagai aksept eptor elektron terakhir.
Uji Katalase
Selama respirasi aer aerobik, atom hidrogen dapat bergabung dengan gan oksigen membentuk hidrogen peroksida (H
2 O 2 ) ) yang bersifat mematikan bagi sel. Kebanya yakan organisme aerob
menghasilkan enzim katal talase yang dapat memecah hidrogen peroks oksida menjadi air dan oksigen.
Z. mobilis sebagai ai bakteri anaerob fakultatif, yang tentunya ya dapat hidup dengan adanya oksigen, memiliki ki enzim katalase (Swings dan De Ley, 1977). 1977). Uji katalase pada Z.
mobilis ZM JPG menunjukka ukkan hasil positif dengan terbentuk buih gas oks s oksigen pada preparat ulas yang ditetesi hidrogen pe n peroksida 3% (Gambar 7).
Gambar 7. Uji Katalase
Uji Fermentasi Karbohidrat
Z. mobilis menferme mentasi glukosa, fruktosa dan sukrosa melalui ui jalur Etner Doudoroff
menghasilkan etanol, CO
2 2 , dan sejumlah kecil produk lainnya sepert perti, asam asetat, asam
laktat, dan gliserol serta jeja jejak dari asetaldehid dan acetoin. Z. mobilis ti tidak tumbuh dan tidak menfermentasi pati, dekst kstrin, raffinose, D-trehalose, maltose, laktos ktosa, D-cellobiosa, D- galaktosa, D-mannosa, L-s sorbose, salicin, L-rhamnose, D dan L-ara rabinosa, D-xylose, D- ribosa, D-sorbitol, D-duls ulsitol, D-mannitol, adonitol, eritritol, glise liserol, etanol, Na D- galakturonat, Na D-L-malat late, Na suksinat, Na piruvat, Na DL-Laktat, N , Na tartrat atau Na sitrat (Swings dan De Ley, 1977) 7).
Uji fermentasi karbohi rbohidrat dalam penelitian ini dilakukan pada e da empat macam substrat yakni glukosa, sukrosa, lakt aktosa dan mannitol. Uji fermentasi karbohidra drat positif pada substrat glukosa dan sukrosa Gamba bar 8). Warna medium fermentasi perlahan be berubah menjadi kuning (Gambar 8 a dan b) hal ini ini disebabkan oleh turunnya pH medium akib kibat asam organik yang dihasilkan oleh Z. mobilis. K . Keasaman ini disebabkan oleh sejumlah kecil cil produk fermentasi Z.
mobilis seperti, asam aseta etat, asam laktat, jejak dari asetaldehid dan ga n gas CO 2 (Swings dan
De Ley, 1977). Per Perubahan warna menjadi kuning lebih cepat at terjadi pada medium sukrosa. Produksi etanol ol nol oleh sukrosa menurun hingga 70% dan pr n produk samping yang dihasilkan lebih besar.
Gambar 8.Ujifermentasi karbohidrat
Z. mobilis menghasi hasilkan banyak sekali gas. Tutup medium ferm rmentasi pada botol 500
mL yang berisi 500 ml me edium cair sampai terlempar ke udara ketika ika diinkubasi selama 5 hari pada suhu ruang (gam gambar 9). Hasil uji karbohidrat negatif pada a substrat laktosa dan mannitol, ZM JPG tidak ak dapat tumbuh pada laktosa maupun manni annitol sesuai dengan karakteristik Z. mobilis.
Gambar 9. M 9. Medium fermentasi hasil inkubasi selama 5 ha 5 hari.
Uji Motilitas
Motilitas bukan me merupakan ciri spesifik yang dimiliki oleh Z. Z. mobilis . Tiga puluh persen Z. mobilis yang ada da bersifat non motil (Swings dan De Ley, 1977 1977). Hasil uji motilitas pada ZM JPG positif. Hal al ini diindikasikan oleh pertumbuhan bakte kteri yang melebar dan terpekat pada permukaan an media (Gambar 10), sedangkan bila ha hasilnya negatif maka pertumbuhan hanya akan te terdapat pada daerah tusukan jarum inokulasi.
Gam ambar 10. Uji pembentukan H
2 S dan motilitas Uji Pembentukan H
2 S
Uji pembentukan H n H
2 S pada ZM JPG negatif, ini ditandai denga ngan tidak terbentuknya
endapan hitam pada media dia SIM (Sulfide Indole Motility) (gambar 10 10). Beberapa peneliti menyatakan bahwa pembent entukan H
2 S oleh Z. mobilis dapat hilang akiba kibat proses pengkulturan
ulang dalam laboratorium. m. Akan tetapi, produksi H
2 S merupakan si n sifat yang stabil pada
beberapa galur, contohnya p a pada Z. mobilis NCIB 8227 dan NCIB 8938, 8938, Zymomonas tersebut telah dikulturkan selama be bertahun-tahun dan masih menghasilkan H
2 S ketika dites (Milis,
2
1956 dan Dadds, dkk., 1973) 973). Empat puluh dua dari empat puluh lima Z Z. mobilis yang diteliti tidak membentuk H
2 S (Swing wings dan De Ley, 1976).
Sumber sulfur yang ng biasa digunakan dalam medium sintetik a k antara lain: Metionin, tiamin, sulfit, sulfat dan sis n sistein. Sumber utama H S yang dihasilkan ol n oleh Z. mobilis dalam
2 minuman fermentasi Bir dan dan Wort berasal dari sulfat.
Peningkatan konsentrasi s i sulfat antara 0-500 mg/l dapat meningka ngkatkan produksi H 2 S. Penambahan ion Zink jug juga dapat menstimulasi produksi H
2 S. Akan kan tetapi, penambahan
panthotenat memiliki efek ek yang sebaliknya, peningkatan konsentrasi p si pantotenate dari 0-40 µg/l menurunkan produksi si H S (Anderson dan Howard, 1974). Berdas dasarkan hasil penelitian
2
terdahulu dapat disimpulka pulkan bahwa pembentukan H
2 S bukan merupaka upakan karakteristik yang khas bagi Z. mobilis.
Uji Pembentukan Indol
Gambar 11. Reaksi terbentuknya indol Uji pembentukan indol n indol adalah untuk menentukan apakah bakt bakteri tersebut memiliki enzim triptopanase yang da dapat melepas indol dari triptopan (Gambar 11) 11). Indol yang terlepas akan bereaksi dengan reag eagen kovac membentuk warna kemerahmuda udaan (pinkish red). Z.
mobilis tidak memiliki enz nzim triptopanase sehingga hasil uji pembentuka ntukan indolnya negatif
sesuai dengan karakteristik tik Z. mobilis ditandai dengan tidak terbentukn uknya cincin merah pada lapisan atas media. Lapisan an atas media terbentuk cincin yang berwarna be na bening agak kehijauan (gambar 12).
Gambar 12. Hasil uji indol
Uji Metil Merah-Voges Pr Proskauer
Uji Metil Red-Voges Pros oskauer (MRVP) digunakan untuk membedak dakan antara organisme yang memproduksi sejum umlah besar asam organik dari glukosa da dan organisme yang memproduksi produk netral ral acetoin. Jika ZM JPG memproduksi sejumla umlah besar asam organik dari glukosa maka medium um akan tetap berwarna merah ketika ditamba mbah metil merah yang mengindikasikan hasil uji uji MR positif dengan pH dibawah 4,4. Jika ika produk netral yang dihasilkan, metil merah aka akan berubah warna menjadi kuning, mengindi ndikasikan bahwa pH di atas 6,0. pH medium sebel belum ditambah metil merah dicek menggunak unakan strip pH indikator hasilnya pH=5. Warna medi edium setelah ditambah metil merah ditunjukk ukkan dalam gambar 13. Meskipun terdapat perubaha ahan warna tapi tidak sampai merah pekat, kea easaman ini disebabkan oleh sejumlah kecil produk uk fermentasi Z. mobilis seperti, asam asetat, a t, asam laktat, jejak dari asetaldehid dan gas CO
2 (S (Swings dan De Ley, 1977). Hasil uji MR pa pada ZM JPG negatif sesuai dengan karakteristik Z ik Z. mobilis yang terdapat dalam bergeys manual anual determinology.
Gambar 13. Uji Metil Merah Produksi acetoin dideteksi si dengan penambahan kalium hidroksida dan α n α-naftol. Jika terdapat
acetoin , bagian atas medi edium akan berwarna merah (pinkish red); ); uji VP negatif akan
mengubah medium menjadi jadi berwarna coklat muda. Uji VP pada ZM ZM JPG positif lemah ditunjukkan oleh adanya w warna kemerahmudaan yang tipis pada lapisa pisan atas (gambar 14.a). Gambar 14.b adalah medium dium mrvp yang tidak diinokulasi dan diperla rlakukan sama. Bergeys
manual determinology men enyebutkan hasil uji Z. mobilis negatif pada uji uji MR dan hasil uji VP
positif tapi sangat lemah ( h (weakly positive). Hal ini disebabkan acetoi acetoin dalam Z. mobilis diproduksi dalam jumlah ke h kecil saja (trace) tanpa adanya aerasi. Ace dipengaruhi oleh
cetoin
aerasi dimana semakin ba n banyak kadar oksigen maka acetoin yang ng dihasilkan semakin meningkat. Peningkatan pr produksi acetoin juga bisa dilakukan de dengan menambahkan asetaldehid dalam medium m fermentasi glukosa atau sukrosa. Dua puluh puluh hingga 35% substrat akan diubah menjadi acet cetoin . Empat puluh dua koleksi Z. mobilis obilis yang diteliti semua menghasilkan jejak asetilm ilmetilkarbinol (acetoin). (Swings dan De L Ley, 1977). Shimwell (1937) dan Milis (1956) me memberikan hasil negatif pada uji VP kemung ungkinan karena kondisi tes yang berbeda, sensivitas tas atau karena keduanya.
Gambar 14. Uji Voges-Proskauer
Efek aerasi terhadap pertu rtumbuhan Z. mobilis ZM JPG Zymomonas Mobili obilis merupakan bakteri fakultatif anaerob y ob yang memiliki kadar
toleransi terhadap oksigen n yang berbeda-beda antar galur. Pengaruh ae uh aerasi diteliti pada ZM JPG dan dihasilkan kurva pe pertumbuhan seperti pada gambar 12.
ZM JPG mengalami mi fasa lag selama 5 jam baik pada medium y yang diaerasi maupun yang tidak diaerasi (Gamba bar 15). Fase lag disebabkan oleh tingginya te tekanan osmosis akibat ditumbuhkan pada medium dium gula dengan konsentrasi tinggi sehingg hingga pertumbuhan sel terhambat. Z. mobilis mam ampu tumbuh dalam lingkungan dengan kada kadar gula tinggi akibat memproduksi sorbitol. Sor Sorbitol memiliki fungsi fisiologis yang pent penting yakni memberi osmoproteksi terhadap Z. m . mobilis (Loos, dkk., 1994). Sorbitol dihasilkan kan oleh enzim Glukosa- Fruktosa Oksireduktase (G (GFOR), enzim ini terikat kuat dengan kof kofaktor NADP. Enzim GFOR merupakan enzim y yang unik dan saat ini baru ditemukan ha hanya terdapat pada Z.
mobilis . Enzim GFOR term rmasuk enzim konstitutif (Zachariou dan Scopes opes, 1986).
3,000
Kurva Pertumbuhan Zymomonas mobilis ATCC10988
2,500 i s
2,000 Shaker an b r o
1,500 s tidak dishaker ab
1,000 0,500 0,000
1
3
5
7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 35 37 39
Gambar 15. Ku
15. Kurva pertumbuhan dengan efek aerasi dan tanpa n tanpa aerasi Fase pertumbuhan di n diperlambat pada media yang diaerasi lebih bih singkat yakni hanya selama 3 jam sedangkan n pada media yang tidak diaerasi fase pertum rtumbuhan diperlambat berlangsung lebih lama yakni yakni selama 8 jam. Aerasi membuat pertumbuha umbuhan sel lebih cepat. Organisme aerotoleran sepe eperti Z. mobilis memiliki mekanisme penyingki ngkiran turunan oksigen yang berbahaya seperti H
2 O O 2 . Hal ini dapat dilakukan oleh Z. mobilis karena terdapat enzim
katalase yang dapat meme ecah H
2 O 2 menjadi oksigen dan air (Swings gs dan De Ley, 1977).
Aktivitas dari enzim katala alase Z. mobilis tidak terpengaruh oleh aerasi asi (Belaich dan Senez, 1965). Z. mobilis juga menunj enunjukkan aktivitas superoksida dismutase l e lima kali lebih tinggi dalam sel pada kultur aerobi obik (aerasi) daripada kultur anaerobik (tidak di diaerasi). Pertumbuhan sel yang lebih cepat ketika ka diaerasi juga dapat disebabkan oleh kadar e r etanol yang dihasilkan lebih rendah pada kultur r yang diaerasi sehingga hambatannya untuk untuk tumbuh lebih kecil (Bringer, dkk., 1984). Per Pertumbuhan Z. mobilis mulai menurun ket ketika mencapai waktu inkubasi 48 jam (data tida dak ditunjukkan). Fase kematian Z. mobilis y s yang memakan waktu lama disebabkan oleh adan anya hopanoid yang dihasilkan oleh Z. mobili obilis sehingga Z. mobilis lebih tahan terhadap kondis disi lingkungan yang ekstrem.
ZM JPG dapat die dieksplorasi lebih lanjut menggunakan data ata kurva pertumbuhan tersebut. Pengaturan metabol tabolisme dapat dilakukan lewat pengaturan an substrat dan kondisi fermentasi serta waktu pem manenan.
KESIMPULAN
Z. mobilis galur liar ZM JP JPG koleksi laboratorium biokimia ITS memili iliki karakteristik utama sesuai dengan karakteristik tik Z. mobilis, karakteristik lain yang tidak sem semua Z. mobilis miliki akan tetapi terdapat pada Z ZM JPG adalah motilitas. ZM JPG termasuk uk Z. mobilis yang tidak membentuk H
2 S. Aerasi m i membuat pertumbuhan ZM JPG meningka ngkat dengan cepat dan
membuat fase penyesuaian an Z. mobilis lebih singkat. Hasil kurva pertum umbuhan yang diperoleh dapat dieksplorasi lebih lanj lanjut. Penelitian ini merupakan langkah awa wal dari eksplorasi pola fermentasi sukrosa oleh Z. Z. mobilis ZM JPG bukan hanya mengarah pada ada potensi etanol yang dihasilkan akan tetapi juga ga potensi produksi sorbitol. Sorbitol dihasilka ilkan oleh enzim GFOR dimana enzim ini paling ba banyak dihasilkan apabila ditumbuhkan dal dalam glukosa sehingga perlu diketahui waktu pema manenan biomassa pada akhir fasa eksponensi nsial. Waktu pemanenan inokulum ZM JPG dalam am medium glukosa biomassa paling besar ar terdapat pada waktu inkubasi 34 jam.
DAFTAR PUSTAKA Anderson, R. J. dan G. A.
A. Howard, (1974), “The production of hydroge drogen sulphide by yeast and by Zymomonas anae anaerobia ”, Journal Inst. Brewery, London, no. 80, ha ondon, no. 80, hal. 245-21. Belaich, J. P. dan J. C. Sene nez, (1965), “Influence of aeration and Panthot hotenate on growth yield of Zymomonas mobili obilis ”, Journal Bcteriology, no. 95, hal. 1750-1757. 1757. Bringer, S., R. K. Finn da dan H. Sahm, (1984), “Effect of Oxygen on n on the metabolism of Zymomonas mobilis” is”, Archives of Microbiology, No. 139, hal. 376 . 376-381. Cappuccino, J.G. dan Sherm erman, N., (2001), “Microbiology A Laborator tory Manual”, Benjamin Cummings, San Frans ansisco. Collins, C. H, dan Lyne, P. P. M, (1985), ”Microbiological Methods”, Edis disi kelima, Butterworth and Co. Daads, M. J. S dkk., (1973) 1973), “The doubtful status of the spesies Zymomon omonas anaerobia dan Z.
mobilis ”, Journal App. B pp. Bacteriology, no. 36, hal. 531-539.
De Ley dan Swings J., (1976) 1976), “ Phenotype description, numerical analy alysis and a proposal for an improved taxonom onomy and nomenclature of the genus Zymomona onas Kluvyer dan Van Niel”, International Sy l Sys. Bacteriology, no. 26, hal. 146-157. Dwijoseputro, (2005), ”Das asar-Dasar Mikrobiologi”, Djambatan, Malang ng. Gunasekaran, P., T. Karuna runakaran dan M. Kasthuribai, (1986), “ fer fermentation Pattern of
Zymomonas mobilis Strains on Different Substrate-a Compara parative Study”, Journal Bioscience, no. 2 hal. 18 , no. 2 hal. 181-186.
Harley dan Prescott, (2002) (2002), “Laboratory Exercises in Microbiol obiology”, McGraw-Hill Company. Johnson, T.R. dan Case, C , C.L, (2004), “Laboratory Experiments in M n Microbiology”, seventh edition, Pearson Educ ducation inc., San Francisco. Lay, B., (1994), “Analisis M s Mikroba di Laboratorium”, Raja Grafindo Per ersada, Jakarta.
Milis, N. F., (1956), “ A S Study of the Cider Sickness Bacillus-a new va variety of Zymomonas
anaerobia ”, J. Gen. M n. Microbiology, no. 15, halaman 521-528. Sw Swings J and Deley J, (1977), “The biology of y of Zymomonas mobilis”, Bacteriol Rev 1977. v 1977.
Loos, H., Kramer, R., Sahm ahm, H. dan Sprenger, G.A. (1994), “Sorbitol tol Promotes Growth of
Zymomonas mobilis in in Environments with High Consentration of of Sugar: Evidence for a
Physiological Function tion of Glucose-Fructose Oxireductase in Osm smoprotection”, Journal of Bacteriology, Vol.176 ol.176, No.24, hal 7688-7693. Shimwell, J. L. (1937), “ “ Study of a new type of beer disease bacter terium (Achromobacter anaerobium sp.nov) pr p.nov) producing alcoholic fermentation of glucose” ose”, Journal Inst. Brew.
London, no. 43, hal 507 l 507-509. Zachariou, M. dan Scopes opes, R.K. (1986), “Glucose-Fructose Oxireduc ductase, a New Enzyme
Isolated from Zymomona omonas mobilis That Is Responsible for Sorbitol bitol Production” Journal of Bacteriology, hal 863 l 863-869.
Prosiding Seminar Nasional Kimia 20 ia 2011
ISBN : 978-602-19755-0-3
90