Aktivitas Ekstrak Etanol Umbi Uwi Ungu (Dioscorea alata L.) terhadap Sel B220
- + +
Aktivitas Ekstrak Etanol Umbi Uwi Ungu (Dioscorea alata L.) terhadap Sel B220 IgE
pada Mencit BALB/c Model Alergi Pencernaan
1)* 2) 1,2Yuyun Ika Christina , Muhaimin Rifa’I
Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya
nnyun91@gmail.com
ABSTRAK
Uwi ungu (Dioscorea alata L.) merupakan famili Dioscoreaceae yang mengandung diosgenin yangdiketahui bermanfaat sebagai agen imunomodulator. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui
+ +adanya perubahan kuantitas sel B220 IgE pada organ lymph node mencit BALB/c model alergi pencernaan
pasca pemberian ekstrak etanol umbi uwi ungu dan dosis optimum ekstrak etanol umbi uwi ungu. Pemberian
ekstrak etanol umbi uwi ungu dilakukan pada hari ke 1-28. Hari ke-15 dilakukan injeksi ovalbumin (OVA)
secara intraperitoneal. Kemudian 3 hari setelah injeksi OVA mencit dibedah. Hari ke-22 dilakukan challenge
OVA secara intraperitoneal. Hari ke-23 sampai 28 mencit dilakukan injeksi OVA kembali secara oral.
Kemudian dilakukan pembedahan pada hari ke-29. Limfosit diisolasi pada organ lymph node dan dilihat
+ + +profil sel B220 dan B220 IgE melalui analisis flow cytometry. Data dianalisis menggunakan One-way
- + +
ANOVA (p<0,05) dan uji Tukey menggunakan SPSS 16 for Windows. Jumlah sel B220 IgE menurun
signifikan pada dosis 0,167 g/kg BB dibandingkan pada dosis 2,008 g/kg BB dan 10,039 g/kg BB. Variasi dosis
ekstrak etanol umbi uwi ungu berbeda secara signifikan. Ekstrak etanol umbi uwi ungu (Dioscorea alata L.)
+ +mampu menurunkan jumlah relatif sel B220 IgE pada dosis 0,167 g/kg BB. Dosis optimum untuk
+ + menurunkan level B220 IgE adalah pada dosis rendah yaitu 0,167 g/kg BB. + +
Kata kunci : Alergi pencernaan, B220 IgE , Dioscorea alata L., immunomodulator
ABSTRACT
Purple yam tuber (Dioscorea alata L.) is a family Dioscoreaceae that contain diosgenin which is knownas an immunomodulatory agent. The purpose of this study is to understand about the quantitative changes of
+ + +B220 and B220 IgE cells in lymphnode BALB/c mice digestive allergy model after ethanol extract in purple
yam tuber oral treatment and the optimum dose of purple yam tuber ethanol extract. The ethanol extract of
purple yam tuber treatment conducted on 1st until 28th days. Then, on 15th day is conducted OVA injection
intraperitoneally. After 3 days injection of OVA, 3 mice for each treatment were sectioned. OVA challenge
injection intraperitoneally conducted on 22th days. OVA is injected orally on 23th until 28th days. Then, the
mice were sectioned on 29th day. Lymphocytes was isolated from lymphnode organs and the profiles of T
+ + +B220 and B220 IgE cells were observed through flowcytometry analysis. The hepar was isolated to make the
histopathology analysis. Data were analyzed using One-way ANOVA (p <0.05) and Tukey test using SPSS 16
+ +for Windows. Ethanol extract of purple yam tuber can reduced B220 IgE . The result indicated an decreasing
number of B220+IgE+ in dose 0.167 g/kg BW significantly compared with dose 2.008 g/kg BW and 10,039
g/kg BW. Dose variations in extract ethanol of purple yam tuber are significant and the optimum dose of
+ +
purple yam ethanol extract to reduce the level of B220 IgE is 0.167 g/kg BW. + +
Keywords : B220 IgE , Digestive allergy, Dioscorea alata L., , immunomodulatory PENDAHULUAN secara optimal adalah uwi ungu (Dioscorea alata
L.). Uwi ungu merupakan sumber hayati umbi- Indonesia memiliki kekayaaan tumbuh- umbian yang mengandung karbohidrat, senyawa tumbuhan yang berpotensi dijadikan sebagai fenol, dan antosianin [1]. D. alata juga tanaman herbal. Tanaman herbal pada saat ini telah mengandung diosgenin yang merupakan jenis menjadi alternatif untuk mengobati berbagai saponin yang mirip dengan kolesterol, progesteron penyakit. Salah satu tanaman yang berpotensi dan DHEA (dehidroepiandrosteron) [2]. sebagai tanaman herbal dan belum dimanfaatkan Berdasarkan beberapa penelitian, saponin ini bermanfaat bagi kesehatan antara lain aktivitas hipokolesterolemia, imunostimulatori, antitumoro- genik, antimutagenik, imunomodulatori dan antiinflamasi [3]. Hasil analisis menunjukkan kandungan dalam umbi uwi ungu terdiri dari air 89,73 %, abu 0,62 %, abu tak larut asam 0,55 %, kadar serat 0,67 %, pati 10,93 %, lemak 0,82 %, dan protein 1,36 % [4].
Salah satu peran dari umbi uwi ungu yang belum diketahui adalah aktivitasnya sebagai agen antialergi. Reaksi alergi terjadi jika seseorang terpapar alergen sehingga memproduksi antibodi IgE (Immunoglobulin E) kemudian terpapar kembali oleh antigen yang sama. Alergen memicu terjadinya aktivasi sel mast yang mengikat IgE pada jaringan. IgE merupakan antibodi yang sering terlihat pada reaksi melawan parasit, terutama untuk melawan cacing parasit yang umumnya mewabah pada negara yang masih terbelakang [5].
20,7 kg, dikuliti, dicuci bersih, dipotong tipis, kemudian dikeringkan di bawah sinar matahari dan ditutup dengan kain hitam hingga kering. Umbi yang kering dihaluskan dengan blender. Simplisia ditimbang kemudian dimaserasi berkali-kali dalam toples kaca dengan pelarut etanol 70 % dengan perbandingan simplisia : etanol 70 % = 1:10 pada suhu ruangan selama 5x24 jam dengan volume etanol 70 % adalah 75 % dari volume totalnya, sambil diaduk 3 kali sehari sampai semua komponen terekstrasi. Setelah 5x24 jam, ekstrak etanol disaring dengan kain saring dan ditampung pada toples kaca. Sisa bahan penyaringan direndam lagi dengan etanol 70 % (remaserasi) selama 2x24 jam dengan sisa 25 % volume etanol 70 %. Setelah remaserasi, bahan disaring lagi dan hasilnya digabung dengan bahan yang sebelumnya sudah disaring. Bahan yang sudah disaring kemudian diuapkan untuk menghilangkan kandungan etanol dalam bahan ekstrak pada suhu 50 o C dalam water bath menggunakan vacuum
Pembedahan dilakukan dengan cara dislokasi leher. Kemudian organ lymph node diisolasi dan dicuci dengan PBS 2 kali. Setelah itu organ dipencet searah jarum jam dengan menggunakan
Isolasi Sel Limfosit. Mencit dikorbankan setelah 24 jam dari pemaparan OVA yang terakhir.
menggunakan mencit BALB/c jantan sebanyak 30 ekor yang berumur 3 bulan dengan berat 25-27 g. Mencit dibagi dalam 5 kelompok perlakuan dengan masing-masing kelompok sebanyak 6 mencit. Perlakuan dibagi menjadi 5 yaitu kontrol negatif (K(-)), kontrol positif (OVA), uwi dosis 0,167 g/kg BB (U1), uwi dosis 2,008 g/kg BB (U1) dan uwi dosis 10,039 g/kg BB (U1).Mencit disensitisasi dan dichallenge secara intraperitoneal dengan ovalbumin (OVA) kecuali pada kelompok kontrol (K(-)). Mencit diimunisasi dengan cara injeksi intraperitoneal pada hari ke-15 dengan 0,15 ml OVA dalam Al(OH) 3 . Pada hari ke-22 injeksi intraperitoneal dengan 0,15 ml OVA dalam akuades. Pada hari ke-23 sampai dengan hari ke-28 mencit dibooster dengan OVA secara oral dengan 0,15 ml OVA dalam akuades.
Rancangan Penelitian. Penelitian ini
kental yang ditimbang dan dicatat berapa gram hasilnya.
pump evaporator . Hasil penguapan berupa ekstrak
Pembuatan Ekstrak Etanol Umbi Uwi Ungu. Umbi Dioscorea alata disiapkan sebanyak
Alergi atau hipersensitivitas merupakan sensitivitas yang terlalu tinggi terhadap antigen sehingga paparan antigen yang selanjutnya akan menimbulkan respon imun yang berlebihan. Dalam keadaan normal terjadi keseimbangan antara Th1 dan Th2, tetapi dalam keadaan alergi akan terjadi peningkatan Th2 dan penurunan Th. Reaksi alergi melibatkan antibodi spesifik IgE yang bertindak makanan, asma, rhinitis, dan lain-lain [6].
dilakukan pada Mei 2013 sampai Januari 2014 di laboratorium Fisiologi Hewan, Jurusan Biologi, Fakultas MIPA, Universitas Brawijaya , Malang.
Waktu dan Tempat. Penelitian ini
IgE + .
karena itu, penelitian ini penting untuk dilakukan untuk mengetahui pengaruh ekstrak etanol dalam umbi uwi ungu (Dioscorea alata) ini pada mencit BALB/c model alergi pencernaan berdasarkan perubahan kuantitas sel B220
- + dan B220 +
alata sampai sejauh ini belum dilakukan. Oleh
Berdasarkan penelitian sebelumnya diketahui bahwa kandungan diosgenin D. alata ini memiliki fungsi menangkap reaktif oksigen spesies (ROS), antioksidan, antidiabetik, antiklastogenik, antiosteoporotik. Pemberian diosgenin ini dapat mengurangi ekspresi IL-4 dan GATA-3 intestinal pada mencit Balb/C yang disensitisasi ovalbumin [2]. Penelitian tentang sifat antialergi Dioscorea
METODE PENELITIAN
pangkal spuit. Setelah itu disaring dengan wire. Homogenat yang bercampur PBS dimasukkan dalam tabung propilen 15 ml dan ditambahkan PBS sampai volumenya mencapai 10 ml. Kemudian dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 2500 rpm, 4 o C selama 5 menit. Supernatan dibuang sedangkan pellet diambil dan diresuspensi dengan PBS 1 ml lalu dihomogenasi.
Analisis Statistika. Data dianalisis dengan
Pemberian ekstrak etanol umbi uwi ungu dosis 0,167 g/kg BB mampu menurunkan jumlah sel B yang mengekspresikan IgE secara signifikan (p>0,05) sebesar 1,97 % dibandingkan mencit yang diberi ekstrak etanol dosis 2,008 g/kg bb sebesar 33,75 %. Dosis 10,039 g/kg bb menurunkan level B220
- + IgE +
Jumlah relatif B220 + IgE + setelah injeksi peroral 0,15 ml OVA dalam akuades pada hari ke 23-28 (p<0,05) (U1= dosis 0,167 g/kg BB, U2= dosis BB, K(-) = kontrol tanpa perlakuan, OVA= kontrol positif.
Gambar 1.
Hasil analisis jumlah relatif sel B220 + IgE + menunjukkan perbedaan yang signifikan dari masing-masing perlakuan. Kelompok mencit yang terkena alergi pencernaan (OVA) menunjukkan jumlah relatif sel B220 + IgE + terbesar sebesar 41,33 % dibandingkan dengan mencit normal sebesar 11,33 %. Peningkatan jumlah sel B220 + IgE + pada mencit alergi pencernaan dikarenakan meningkatnya jumlah subset sel T CD4 + yang menghasilkan sitokin IL-4. Akibat meningkatnya jumlah IL-4 maka akan mengaktifkan sel B220 untuk membentuk immunoglobulin E. IgE kemudian akan berikatan dengan sel mast dan akhirnya terbentuk respon imun terhadap alergi pencernaan.
pada organ Lymph Node.
HASIL DAN PEMBAHASAN Analisis Jumlah Relatif Sel B220
- + IgE +
menggunakan SPSS 16.0 for Windows. One Way ANOVA digunakan untuk mengetahui perbedaan pada antar perlakuan (p<0,05 secara statistik berbeda nyata). Apabila diperoleh hasil yang signifikan maka dilakukan uji Tukey.
jumlah sel total serta jumlah sel yang terdeteksi oleh label antibody, kemudian hasil yang diperoleh diolah dengan program BD cellquest Pro TM .
Perhitungan Sel Limfosit Menggunakan Haemocytometer . Suspensi pellet dari hasil isolasi
flow cytometer . Flow cytometer akan menghitung
ditambah 1 ml PBS dan ditempatkan pada kuvet
conjugated anti-B220. Sampel tersebut kemudian
sebanyak 50 µl ditambahkan 500 µl PBS. Suspensi selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 2500 rpm, 4 o C selama 5 menit. Pelet kemudian ditambah 500 µl PBS dan diambil masing-masing 50 µl ke dalam tabung eppendorf. 50 µl homogenate dimasukkan dalam tabung eppendorf dan ditambahkan 20 µl cytofix-cytoferm lalu dipipeting dan diinkubasi selama 20 menit pada suhu 4 o C. Lalu ditambahkan washsperm sebanyak 500 µl. Setelah itu, disentrifugasi dengan kecepatan 2500 rpm, suhu 4 o C selama 5 menit dan dilanjutkan dengan prosedur pewarnaan dengan antibodi PE-
Analisis Flow Cytometry. Suspensi pelet
haemocytometer dan hasil perhitungan digunakan untuk analisis flow cytometry.
limfosit pada lymphnode diambil sebanyak 5 µl untuk perhitungan sel limfosit. Suspensi pellet ditambahkan 95 µl Evans Blue kemudian dihomogenkan. Perhitungan sel hidup dilakukan dengan menggunakan kamar hitung dalam
sebesar 13,06 %. Hal ini menandakan bahwa pada dosis rendah, ekstrak etanol umbi uwi ungu dapat menurunkan jumlah sel B yang mengekspresikan IgE. Menurut Huang dkk. (2009), pemberian diosgenin pada mencit yang terkena alergi pencernaan dapat menurunkan jumlah total IgE yang terbentuk. Sebaliknya, level IgG2a mengalami kenaikan akibat pemberian diosgenin pada mencit yang disensitisasi OVA [2]. Hasil penelitian tersebut menujukkan bahwa secara in vivo, diosgenin pada umbi uwi ungu memiliki efek anti-alergi yang dibuktikan dengan adanya supresi produksi IgE.
Gambar
B220 + IgE + pada perlakuan setelah OVA hari ke 23-28
IgE diproduksi oleh s terletak pada lymph node d mengalami reaksi alergi, yaitu senter pada jaringan yang men IgE berbeda dengan antibodi ya lokasinya. IgE sebagian besar m dan berikatan dengan permukaan reseptornya yang disebut FcεR dengan IgE menyebabk penggabungan silang antar resept tersekresinya mediator kimia Mekanisme ini menyebab hipersensitif tipe I. Basofil da teraktivasi juga mengeksp sehinggadua macam sel terse mengikat IgE dan berkontribusi reaksi hipersensitif tipe I. Anti khusus dapat mempengaruh membelokkan sintesis antibod disebut alergen. Produksi memerlukan bantuan Th2 yang dan IL-13. Peran Th2 dapat di umlah relatif sel a masing-masing h injeksi per oral sel plasma yang dan daerah yang aitu pada germinal engalami inflamasi. yang lain dalam hal menempati jaringan aan sel mast dengan
ε RI. Ikatan antigen bkan terjadinya eptor yang berakibat ia dari sel mast. abkan terjadinya dan eosinofil yang kspresikan FcεR rsebut juga dapat si pada munculnya ntigen yang secara ruhi Th2 untuk bodi menjadi IgE antibodi IgE ng mensekresi IL-4 dihambat oleh Th1 yang memproduksi interfer antigen pada dosis yang memungkinkan terjadinya menyebabkan aktivasi TH1
Gambar 3. Perbedaan b
perlakuan selama 28 Berdasarkan grafik pada gambar 3 menunjukk memiliki berat badan pali dengan mencit yang dibe mencit alergi pencernaan berat badan karena adanya terhadap masuknya antige pada perlakuan ekstrak mengalami penurunan ber umum pada hari terakhir pencernaan yang diberi e ungu relative stabil dan tid dan penurunan. Diosgenin berat badan, berat limpa, d pada tikus betina putih dew selama 45 hari [7].
Reaksi alergi terja aktivasi sel-sel imunokom struktural, aktivasi sel-se basofil, reaksi mediator d tahap timbulnya gejala. masuk tubuh akan dipros alergen yang dipresen menginduksi aktivasi L Limfosit T oleh APC ya akan mengaktivasi l memproduksi sitokin-
- sitokinnya. Kontrol
specialized pattern recogn
yaitu Toll-like receptor dendritik (DCs) atas menentukan respons imun feron-γ (IFN-γ). Presentasi ang sangat rendah akan ya aktivasi Th2 dan tidak
1 [5]. berat badan mencit tiap 28 hari fik perbedaan berat badan ukkan bahwa mencit sehat aling tinggi dibandingkan iberi perlakuan. Perlakuan an mengalami penurunan ya reaksi pertahanan tubuh igen ke tubuh. Sedangkan k umbi uwi ungu jugan erat badan seiring dengan hir injeksi, mencit alergi ekstrak etanol umbi uwi tidak mengalami kenaikan nin juga dapat menaikkan , dan berat kelenjar adrenal ewasa yang diovariektomi erjadi melalui tahap-tahap ompeten, aktivasi sel-sel sel mast, eosinofil dan dengan target organ dan
2. Persentase jum
. Alergen yang berhasil roses oleh APC. Peptida sentasikan oleh APC
Limfosit T. Aktivasi yang memproses alergen limfosit Th2 untuk
ognition receptors (PRRs) tors (TLR) dari sel-sel
respons imun innate n adaptif Th1, Treg atau Th2. Limfosit Th1 memproduksi IL-2, IFN-γ dan TNF-α, sedangkan Limfosit Th2 memproduksi IL- 4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, dan GM-CSF [8].
Limfosit Th yang baru diaktifkan alergen akan berfenotip Th2. Produksi sitokin Th2 terutama IL-4 akan mensupresi perkembangan Th1 dan produksi sitokin Th1 terutama TNF akan mensupresi perkembangan Th2. Bila sitokin yang dihasilkan Limfosit Th2 berinteraksi dengan Limfosit B, maka Limfosit B akan berdiferensiasi menjadi sel plasma yang memproduksi IgE. Sitokin yang dihasilkan Th2 menstimulasi produksi sel mast, basofil dan eosinofil. Interaksi antara alergen, sel mast dan IgE menghasilkan degranulasi sel mast [9].
Degranulasi sel mast melepaskan mediator histamin. Histamin yang dilepaskan sel mast ditangkap reseptor histamin di target organ. Bila terjadi interaksi histamin dengan reseptornya pada target organ, maka reaksi alergi akan terjadi. Reseptor H1-histamin mempunyai peran yang lebih luas dalam proses radang daripada sekedar mediator yang menyebabkan alergi. Reseptor H2- histamin mempunyai peran dalam terjadinya rasa gatal dan nyeri pada kulit serta peningkatan permeabilitas dan vasodilatasi perifer. Sedangkan reseptor H3-histamin meningkatan pelepasan neurotransmitter seperti histamine, norepinephrine,
Role of Treg in immune regulation of allergic disease. J Immunol. 40:1232-1240. Akdis, M. 2004. T regulatory cells in allergy and health : a question of allergen specificity and balance. Int Arch Allergy and Immunol. 135 : 73-82.
[9] Palomares, O., Yaman, G., Azkur, A.K., Akkoc, T., Akdis, M., dan Akdis, C.A. 2010.
J Allergy Clin Immunol . 113 (5) : 805-819.
Hughes, J. 2003. The effects of sustained delivery of diosgenin on the adrenal gland of female rats. J Biomed Sci Instrum. 39 : 335- 340. [8] Sampson, H.A. 2004. Update on food allergy.
Blackwell Science Limited. Oxford. [7] Benghuzzi, H., Tucci, M., Eckie, R., dan
[6] Roitt, I.M. 2003. Essential Immunology.
Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu pengetahuan Alam. Universitas Brawijaya. Malang.
Diosgenin, a plant-derived sapogenin, enhances regulatory T-cell immunity in the intestine of mice with food allergy. J. Nat Prod . 73 : 1033-1037. [4] Lubag, A. 2008. Antioxidants of purple and greater yam (Dioscorea alata L.) varieties from the Philippinesmore. Philippine J of Sci . 137(1):61-67. [5] Rifa’i, M. 2011. Alergi dan Hipersensitif.
[3] Huang, C,H., Ku, C.Y. dan Jan, T.R. 2010.
Diosgenin attenuates allergen-induced intestinal inflammation and IgE production in a murine model of food allergy. Planta Med . 75 (2):1300-1305.
[2] Huang, C,H., Ku, C.Y. dan Jan, T.R. 2009.
Underexploited Holticultural Crops . Jai Bharat Printing Press. New Delhi.
[1] Peter, K.V. 2007. Underutilized and
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Muhaimin Rifa'i S.Si, Ph.D.Med.Sc. sebagai pembimbing penelitian ini dan Ibu Sri Nabawiyati Nurul Makkiyah yang mendanai penelitian ini.
B220 + IgE + pada dosis 0,167 g/kg BB. Dosis optimum untuk menurunkan level B220
- + IgE + adalah pada dosis rendah yaitu 0,167 g/kg BB.
alata L.) mampu menurunkan jumlah relatif sel
Ekstrak etanol umbi uwi ungu (Dioscorea
KESIMPULAN