Jhon Franta Pelawi : Isolasi Senyawa Alkaloida Dari Biji Buah Pala Myristica fragrans Houtt, 2010.
31
BAB III ALAT, BAHAN, DAN PROSEDUR PERCOBAAN
3.1. Alat- alat
- Neraca analitik - Rotary evaporator vakum
- Corong - Beaker glass
- Gelas ukur - Kromatografi kolom
- Labu Erlenmeyer - Oven
- Melting Point Apparatus - Lampu UV
- Tabung reaksi - Rak tabung reaksi
- Plat KLT - Penangas air
- Indikator universal - Labu alas
- Tabung maserasi - Corong pisah
- Spatula - Spektroskopi Infra Merah
- Spektroskopi
1
H-NMR
3.2. Bahan-bahan
- Biji buah pala - Etanol
p.a.E.Merck - Asam Asetat glacial
- Amoniak p.a.E.Merck
- Aquadest - Kloroform
p.a.E.Merck - Pereaski Meyer
- Pereaksi Wagner - Pereaksi Bouchardat
- Pereaksi Dragendorf - Silika Gel 60 G
E.Merk Art. 7734 - Ethyl Acetat
p.a.E.Merck
Jhon Franta Pelawi : Isolasi Senyawa Alkaloida Dari Biji Buah Pala Myristica fragrans Houtt, 2010.
32
3.3. Prosedur Penelitian 3.3.1. Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah biji buah pala Myristica Fragrans Houtt . Biji buah
pala dibersihkan dari pengotor kemudian dihaluskan sampai diperoleh serbuk biji buah pala sebanyak 2000 gram.
3.3.2. Uji Pendahuluan 3.3.2.1. Uji Skrining fitokimia
Pengujian pendahuluan terhadap biji buah pala Myristica Fragrans Houtt .
Apakah mengandung suatu senyawa alkaloida dilakukan dengan uji skrining fitokimia yaitu serbuk biji buah pala ditimbang sebanyak 100 gram, dimaserasi
dengan 200 ml etanol, disaring dan filtrate yang diperoleh dibagi menjadi 4 bagian, yaitu :
Filtrat I : Ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer ternyata terbentuk endapan
warna putih kekuningan, hal ini menunjukkan adanya senyawa alkaloid.
Filtrat II : Ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorf ternyata terbentuk
endapan warna jingga, hal ini menunjukkan adanya senyawa alkaloida.
Filtrat III : Ditambahkan 2 tetes pereaksi Wagner ternyata terbentuk endapan
warna coklat, hal ini menunjukkan adanya senyawa alkaloida. Filtrat IV
: Ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat ternyata terbentuk endapan warna coklat, hal ini menunjukkan adanya senyawa
alkaloida.
3.3.2.2. Uji Pendahuluan Kromatografi Lapis Tipis KLT
Pengujian pendahuluan terhadap biji buah pala apakah mengandung suatu senyawa alkaloid dilakukan melalui analisa kromatografi lapis tipis, yaitu serbuk biji buah
pala ditimbang sebanyak100 gram dimaserasi dengan etanol 200 ml selama 48 jam, disaring dan filtratnya dianalisis secara kromatografi lapis tipis dengan menggunakan
silika gel 60 G dan fasa gerak yang digunakan adalah kloroform 100 dan campuran
Jhon Franta Pelawi : Isolasi Senyawa Alkaloida Dari Biji Buah Pala Myristica fragrans Houtt, 2010.
33 Kloroform : Etil Asetat dengan perbandingan 9:1 vv, 8:2 vv, 7:3 vv, 6:4vv ,
Kemudian diamati dibawah lampu UV.
Prosedur :
Kedalam bejana kromatografi dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak Kloroform 100. Ekstrak pekat etanol biji buah pala ditotolkan pada plat KLT. Plat dimasukkan
kedalam bejana yang berisi pelarut-pelarut yang telah dijenuhkan, kemudian ditutup rapat dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan.
Warna bercak yang timbul diamati dibawah lampu UV dan harga Rf-nya dihitung. Perlakuan yang sama dilakukan terhadap ampuran Kloroform-Etil Asetat dengan
perbandingan 9:1 vv, 8:2 vv, 7:3 vv, 6:4vv . Kemudian diamati dibawah lampu UV dan hasil yang lebih baik diberikan pada fase gerak Kloroform:Etil Asetat 7:3
vv.
3.3.3. Prosedur Untuk Memperoleh Senyawa Kimia Ekstrak Biji Buah Pala Isolasi senyawa alkaloida yang terkandung pada biji buah pala Myristica
fragrans Houtt dilakukan dengan tehnik maserasi dengan pelarut etanol. Ekstrak
etanol yang dihasilkan dipekatkan dengan rotary evaporator lalu diekstraksi partisi dengan n-heksana kemudian diasamkan dengan asam asetat glasial sampai pH 4.
Dibasakan dengan amoniak pekat sampai pH 10-12. kemudian diekstraksi partisi dengan kloroform. Lapisan kloroform dipekatkan dengan rotary evaporator.
Ekstrak kloroform pekat mengandung alkaloida yang dihasilkan dianalisa dengan kromatografi lapis tipis kemudian dipisahkan dengan kromatografi kolom
dengan silika gel 60 G. dielusi dengan Kloroform : Etil Asetat 70:30 vv yang menghasilkan kristal berwarna kuning sebanyak 73 mg.
3.3.4. Pemisahan Senyawa Alkaloida Dengan Menggunakan Komatografi Kolom
Terhadap 73 mg ekstrak alkaloid kasar dilakukan isolasi senyawa alkaloida dengan kromatografi kolom. Fasa diamnya silika gel 60 G E.Merk Art. 7734 dan fasa
geraknya adalah Kloroform : Etil Asetat 70:30 vv .
Prosedur :
Peralatan untuk kromatografi kolom dirangkai, kemudian silika gel 60 G E.Merk Art. 7734 sebanyak 70 gram dibuburkan dengan kloroform, diaduk sampai homogen
Jhon Franta Pelawi : Isolasi Senyawa Alkaloida Dari Biji Buah Pala Myristica fragrans Houtt, 2010.
34 dan dimasukkan kedalam kromatografi kolom, lalu dielusi dengan Kloroform 100
hingga bubur silika gel padat dan homogen. Ekstrak alkaloid kasar biji buah pala sebanyak 73 mg dibuburkan dengan silika gel sebanyak 10 gram dan dimasukkan
kedalam kromatografi kolom yang telah berisi silika gel. Sampel dibiarkan turun dan terserap dengan baik pada silika gel dipuncak kolom. Kemudian fasa gerak
Kloroform 100 ditambahkan secara berlahan-lahan. Eluan ditampung dengan botol vial lalu diuapkan. Selanjutnya fasa gerak dinaikkan kepolarannya dengan fasa gerak
Kloroform : Etil Asetat 70:30 vv. Hasil yang diperoleh, pelarutnya diuapkan sampai terbentuk Kristal alkaloida.
3.3.5. Pemurnian Kristal
Kristal yang diperoleh dari hasil 3.3.4. direkristalisasi sebagai berikut : Kristal yang diperoleh dilarutkan dalam pelarut Kloroform dan dipanaskan sampai
kristal tersebut larut dan pekat. Diamkan selama 1 malam. Dari hasil pendiaman 1 malam ini sebagian pelarut menguap dan terbentuk kristal jarum berwarna kuning.
3.3.6. Analisis Kristal Hasil Isolasi 3.3.6.1. Analisis Kromatografi Lapis Tipis KLT
Terhadap Kristal yang diperoleh dilakukan analisis secara kromatografi lapis tipis dengan menggunakan plat kromatografi lapis tipis dan fasa gerak yang digunakan
adalah Kloroform 100 dan campuran Kloroform : Etil Asetat 70:30 vv .
Prosedur :
Kedalam bejana kromatografi dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak Kloroform 100. Kristal yang telah dilarutkan dengan etanol ditotolkan pada plat KLT. Plat
dimasukkan kedalam bejana yang berisi pelarut-pelarut yang telah dijenuhkan, kemudian ditutup rapat dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana
dan dikeringkan. Warna bercak yang timbul diamati dibawah lampu UV dan harga Rf-nya dihitung.
3.3.6.2. Uji Reaksi Warna Terhadap Kristal Hasil Isolasi Pereaksi Alkaloida
Larutan Kristal dari percobaan 3.3.6.1. dibagi dalam 4 tabung reaksi :
Jhon Franta Pelawi : Isolasi Senyawa Alkaloida Dari Biji Buah Pala Myristica fragrans Houtt, 2010.
35 Filtrat I
: Ditambahkan 2 tetes pereaksi mayer ternyata terbentuk endapan warna putih kekuningan, hal ini menunjukkan adanya senyawa
alkaloid. Filtrat II
: Ditambahkan 2 tetes pereaksi dragendorf ternyata terbentuk endapan warna jingga, hal ini menunjukkan adanya senyawa
alkaloida. Filtrat III
: Ditambahkan 2 tetes pereaksi wagner ternyata terbentuk endapan warna coklat, hal ini menunjukkan adanya senyawa alkaloida.
Filtrat IV : Ditambahkan 2 tetes pereaksi bouchardat ternyata terbentuk
endapan warna coklat, hal ini menunjukkan adanya senyawa alkaloida.
3.3.6.3. Penentuan Titik Lebur
Kristal hasil isolasi yang telah murni diletakkan diatas plat melting point apparatus, dihidupkan dan diatur temperaturnya. Lalu diamati temperature sampai Kristal
melebur. Titik lebur Kristal yang diperoleh 80-82
o
C.
3.3.6.4. Analisis Spektroskopi Kristal Hasil Isolasi
Analisis Kristal hasil isolasi dengan alat spektrofotometer FT-IR di badan pengujian sampel Bea cukai Belawan dan spektrofotometer
1
H-NMR diperoleh dari laboratorium Dasar Bersama FMIPA UNAIR Surabaya dengan menggunakan pelarut
CDCl
3
.
Jhon Franta Pelawi : Isolasi Senyawa Alkaloida Dari Biji Buah Pala Myristica fragrans Houtt, 2010.
36
3.4. Bagan Penelitian
diskrining fitokimia dimaserasi dengan Etanol selama 48 jam
disaring
dipekatkan dengan rotary evaporator
diekstraksi partisi dengan n-Heksana
diasamkan dengan Asam Asetat glasial sampai pH 2
dibasakan dengan Amoniak pekat Sampai pH 10-12
diekstraksi dengan Kloroform didiamkan selama 1 malam
dipekatkan dengan rotary evaporator
dianalisis dengan KLT fasa gerak Kloroform 100 , CHCl
3
: Ethyl Asetat 9:1vv,8:2 vv,7:3 vv,6:4 vv
Pemisahan dengan kromatografi kolom dengan fasa diam silika gel dielusi dengan CHCl
3
: Ethyl Asetat 70:30 vv ditampung setiap fraksi kedalam botol vial sebanyak 5 ml
dianalisis KLT digabung franksi dengan Rf yang sama
diskrining dihitung harga Rf
diskrining fitokimia
diuapkan fitokimia direkristalisasi
diukur titik lebur dianalisis KLT
dianalisis spektroskopi FT-IR,
1
H-NMR 2 kg Serbuk kering biji buah pala
Ekstrak Kasar Etanol
Ekstrak pekat Etanol
Ekstrak Etanol-Asam pH 2 Lapisan n-Heksana
Lapisan ekstrak Etanol
Ekstrak Basa pH 10-12
Lapisan Basa Lapisan Kloroform
Ekstrak pekat Kloroform
Fraksi I 1 - 86
Hasil Analisis - Fraksi II
87-104
Kristal kuning
Hasil Analisis
Fraksi III 105-200
Hasil Analisa - Residu
Jhon Franta Pelawi : Isolasi Senyawa Alkaloida Dari Biji Buah Pala Myristica fragrans Houtt, 2010.
37
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil
Hasil skrining fitokimia terhadap ekstrak etanol dari biji buah pala dengan menggunakan pereaksi-pereaksi alkaloida, menunjukkan bahwa dalam biji buah pala
mengandung senyawa alkaloida. Hasil analisa kromatografi Lapis Tipis dengan menggunakan silika gel 60 G sebagai
absorben, dapat diketahui bahwa fasa gerak yang baik untuk mengisolasi senyawa alkaloida dari biji buah pala adalah pada perbandingan Kloroform : Etil Asetat
70:30 vv. Hasil isolasi biji buah pala dengan pengasaman untuk menggaramkan senyawa
alkaloid kemudian membasakannya untuk membebaskan kembali senyawa alkaloida yang kemudian dipisahkan dengan kloroform, diperoleh Kristal kuning berbentuk
jarum sebanyak 73 mg dengan titik lebur 80 – 82
o
C. Tabel 4.1. Hasil analisa dengan menggunakan spektrofotometer FT-IR pada Kristal
hasil isolasi menghasilkan pita-pita serapan pada daerah bilangan gelombang sebagai berikut :
Frekwensi pita absorbsi cm
-1
dan intensitas Keterangan dari gugus fungsi
3479,55 cm
-1
pita serapan sedang NH
3077,30 cm
-1
dan 1590,77 cm
-1
pita serapan tajam
CH pada H-C-N
+
2925,04 cm
-1
dan 2853,86 cm
-1
pita serapan tajam
CH
3
pada -C-CH
3
1633,44 cm
-1
pita serapan tajam H-C-COO-
1463,61 cm
-1
dan 1429 cm
-1
pita serapan sedang CH pada -CH-CH-
1376,28 cm
-1
pita serapan sedang OH pada C-OH
823,99 cm
-1
pita serapan tajam CH aromatis
720,86 cm
-1
pita serapan sedang CH aromatis
Spektrum infra merah komponen senyawa hasil isolasi dapat dilihat pada lampiran E
Kategori