STUDI PENGARUH PENAMBAHAN POLIOL TERHADAP STABILITAS TERMAL ENZIM α- AMILASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

(1)

ABSTRAK

STUDI PENGARUH PENAMBAHAN POLIOL

TERHADAP STABILITAS TERMAL ENZIM α- AMILASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148

Oleh

EVILIA ARIYANTI

Penggunaan enzim dalam bidang industri telah banyak dilakukan karena enzim memiliki tenaga katalitik yang luar biasa, yang umumnya jauh lebih besar daripada katalisator sintetik. Namun sebagian besar enzim mempunyai beberapa kendala, salah satunya adalah stabilitasnya yang rendah. Kendala ini dapat diatasi dengan penambahan poliol yang dapat meningkatkan stabilitas termal enzim.

Penelitian ini bertujuan untuk meningkatkan stabilitas termal enzim α -amilase dari Bacillus subtilis ITBCCB148 dengan senyawa aditif yaitu sorbitol dan gliserol. Untuk mencapai tujuan tersebut pertama dilakukan produksi, isolasi dan pemurnian enzim. Pemurnian enzim α-amilase dilakukan melalui tiga tahap yaitu fraksinasi dengan amonium sulfat, dialisis, dan kromatografi kolom penukar ion dengan menggunakan CMC. Enzim hasil pemurnian dikarakterisasi dengan menggunakan sorbitol dan gliserol. Pengujian aktivitas α-amilase dilakukan dengan metode Fuwa dan metode Mandels, sedangkan pengukuran kadar protein dengan metode Lowry.

Hasil penelitian menunjukkan enzim hasil pemurnian memiliki pH optimum 6 suhu optimum 600C, dengan nilai KM dan Vmaks berturut-turut adalah 3,99 mg mL-1 substrat dan 3,8λ mol mL-1 menit-1. Proses pemurnian meningkatkan aktivitas spesifik enzim dari 393 U/mg untuk ekstrak kasar menjadi 12.000 U/mg untuk kromatografi kolom dengan tingkat kemurnian 30 kali.

Penambahan sorbitol tidak mengalami perubahan pH dan suhu optimum. Stabilitas termal enzim dengan penambahan sorbitol 0,5M mempunyai nilai KM = 1,98 mg mL-1 substrat, Vmaks = 1,19 mol mL-1 menit-1, t1/2 = 28,39 menit; ki = 0,02λ, ΔGi = 103,010 kJ mol-1 ; sorbitol 1M, KM = 1,86 mg mL-1 substrat, Vmaks = 1,44 mol mL-1 menit-1, t1/2 = 38,50 menit; ki = 0,018, ΔGi = 104,330 kJ mol-1; sorbitol 1,5M, KM = 1,35 mg mL-1 substrat, Vmaks = 3,93 mol mL-1 menit-1, t1/2 = 43,31 menit; ki = 0,016, ΔGi = 104,657 kJ mol-1. Enzim dengan penambahan sorbitol 0,5M; 1M; 1,5M memiliki aktivitas sisa berturut-turut adalah 16,96%; 33,22%; dan 41,69% setelah penyimpanan selama 60 menit pada suhu 600C.

Enzim dengan penambahan gliserol 0,5M; 1M; 1,5M tidak menyebabkan perubahan suhu optimum tetapi mengalami perubahan pH optimum dari 6 menjadi 6,5. Enzim dengan penambahan gliserol 0,5M mempunyai nilai KM = 1,82 mg mL-1 substrat, Vmaks = 1,34 mol mL-1 menit-1, t1/2 = 21,00 menit, ki = 0,033, ΔGi = 102,652 kJ mol-1

; gliserol 1M, KM = 1,75 mg mL-1 substrat, Vmaks = 3,44 mol mL-1

menit-1 gliserol t1/2 = 21,00 menit, ki = 0,033, ΔGi = 102,652 kJ mol-1; gliserol 1,5M, KM = 2,15 mg mL-1, Vmaks = 1,71 mol mL-1 menit-1, t1/2 = 27,72 menit, ki = 0,025, ΔGi = 103,421 kJ mol-1. Enzim setelah penambahan gliserol 0,5M; 1M; 1,5M memiliki aktivitas sisa berturut-turut adalah 14,16%; 14,16%; 24,79% selama penyimpanan 60 menit pada suhu 600C.

(2)

enzim sebelum penambahan poliol.

(3)

BAB. II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Enzim

Enzim merupakan unit fungsional dari metabolisme sel, bekerja dengan urutan- urutan yang teratur, mengkatalisis ratusan reaksi bertahap yang menyimpan dan mentransformasikan energi kimiawi dan membuat makromolekul sel dari prekusor sederhana (Lehninger, 1982).

Sifat enzim yang sangat penting adalah tingginya efisiensi dan derajat katalitiknya terhadap substrat. Efisiensi katalitik enzim berkaitan dengan orientasi optimum gugus aktif enzim dan substrat. Orientasi keduanya sangat mendukung sehingga saat terjadi reaksi tidak memerlukan energi yang besar untuk mengatur posisi. Spesifitas enzim berkaitan dengan reaksi enzim yang sangat spesifik, satu enzim hanya akan bereaksi dengan satu substrat atau setiap enzim menyebabkan perubahan satu langkah pada substratnya (Toha, 2001).

Fungsi yang terpenting dari suatu enzim adalah kemampuannya dalam menurunkan energi aktivasi pada suatu reaksi kimiawi. Kemampuan enzim dalam mendegradasi substrat dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain konsentrasi enzim, konsentrasi substrat, pH serta suhu. Pada umumnya terdapat hubungan

(4)

antara konsentrasi enzim dan substrat bagi aktivitas maksimumnya, begitu juga setiap enzim berfungsi secara optimal pada pH dan suhu tertentu (Lehninger, 1982).

B. Enzim Amilase

Enzim amilase merupakan enzim yang mempunyai aktivitas memecah molekul pati dan glikogen (Judoamidjojo et al., 1989). Menurut Winarno (1986), enzim amilase dapat dikelompokkan menjadi tiga golongan enzim yaitu :

1. α-amilase (α- 1,4 glukan – 4 – glukanhidrolase), yang memecah pati secara acak dari tengah atau dari bagian dalam molekul, karenanya disebut endoamilase.

2. β-amilase (β- 1,4 glukan maltohidrolase), yang menghidrolisis unit- unit gula dari ujung molekul pati, karenanya disebut eksoamilase.

3. Glukoamilase, yang dapat memisahkan glukosa dari terminal gula non- pereduksi substrat pati.

Berdasarkan cara kerja ketiga enzim diatas, enzim α-amilase memiliki kemampuan tercepat dalam menghidrolisis molekul karbohidrat menjadi molekul yang lebih kecil. Enzim α-amilase, akan menyerang ikatan kedua dari ujung nonreduksi suatu polisakarida yang akan menghasilkan suatu disakarida yang disebut maltosa, kemudian amiloglukosidase akan menyerang ikatan terakhir pada ujung nonreduksi. Amilase dan amiloglukosidase dapat digunakan secara

(5)

bersamaan untuk memecah suatu molekul polisakarida menjadi gula sederhana. Salah satu contoh aplikasinya yaitu pada pembuatan sirup jagung.

Enzim α-amilase (3.2.1.1), dapat menghidrolisis suatu substrat polisakarida yang memiliki ikatan α – 1,4 glukan - glukanhidrolase. Histidin, dithiothreitol dan mercaptoetanol berperan sebagai kofaktor enzim ini. Selain itu ada beberapa logam yang juga dapat berperan sebagai kofaktor antara lain Ca2+, Ba2+, Mn2+, Ag+, dan Fe2+. Sedangkan Hg2+, Ca2+, Mg2+, Fe2+, Al3+, Cd2+, dan Ni2+ berperan sebagai inhibitor (Schomburg dan Salzmann, 1991).

C. Isolasi dan Pemurnian Enzim 1. Homogenisasi

Homogenisasi digunakan untuk memecah sel dan mengekstraksi enzim agar didapatkan suspensi homogen. Alat yang digunakan disebut homogenisator seperti waring blender yang dapat diputar dengan motor dan diatur kecepatannya. Dalam pengerjaannya perlu dijaga jangan sampai berbusa karena enzim yang terekstrak akan terdenaturasi, proses ini dilakukan pada suhu 2-40C (Judoamidjojo et al., 1989).

2. Sentrifugasi

Sentrifugasi digunakan untuk memisahkan enzim ekstraseluler dari sisa-sisa sel. Sentrifugasi akan menghasilkan supernatan yang jernih dan endapan yang terikat kuat pada dasar tabung, yang kemudian dipisahkan secara manual.

(6)

Sel-sel mikroba biasanya mengalami sedimentasi pada kecepatan 5000 g Sel-selama 15 menit (Scopes, 1984 dalam Walsh dan Headon, 1994).

3. Fraksinasi dengan amonium sulfat

Sebagian besar enzim berada dalam bentuk cairan sel sebagai protein terlarut. Kelarutan enzim tersebut merupakan interaksi polar dengan pelarut dan gaya tolak-menolak antara molekul yang bermuatan sama (Scopes, 1984).

Pada konsentrasi rendah, ion-ion akan melingkupi molekul protein dan mencegah bersatunya molekul-molekul protein tersebut (salting in), sehingga protein melarut (Suhartono, 1989). Semakin tinggi konsentrasi garam, maka kelarutan protein enzim akan semakin rendah (kelarutan protein enzim dalam air lebih rendah daripada kelarutan garam dalam air) yang dikenal dengan istilah salting out). Garam yang sering digunakan untuk mengendapkan protein dan enzim adalah amonium sulfat. Kelebihan amonium sulfat dibandingkan garam-garam yang lain yaitu mempunyai kelarutan yang tinggi, tidak mempengaruhi aktivitas enzim, mempunyai daya pengendap yang efektif, mempunyai efek penstabil terhadap kebanyakan enzim, dapat digunakan pada berbagai pH, dan harganya murah (Scopes, 1984).

(7)

4. Dialisis

Dialisis merupakan metode yang biasa digunakan untuk memisahkan garam dari larutan protein. Proses yang terjadi karena adanya perbedaan tekanan osmosis antara cairan yang ada di dalam membran dan yang di luar. Prosesnya, molekul protein atau enzim yang berukuran besar akan tertahan dalam kantung dialisis sedangkan molekul-molekul kecil seperti garam anorganik akan keluar melalui pori-pori membran. Keluarnya molekul menyebabkan distribusi ion-ion yang ada di dalam dan di luar kantong dialisis tidak seimbang. Untuk memperkecil pengaruh ini digunakan larutan buffer dengan konsentrasi rendah di luar kantong dialisis. Membran yang digunakan adalah selofan (Lehninger, 1982).

5. Kromatografi penukar ion

Kromatografi penukar ion adalah metode kromatografi yang paling umum digunakan untuk pemurnian protein (Bollag et al., 1996).

Prinsip dasar teknik penukar ion adalah memisahkan biomolekul berdasarkan muatan ioniknya. Penukar ion terdiri atas matriks yang tidak larut dan gugus bermuatan yang terikat secara kovalen pada matriks. Gugus-gugus bermuatan berasosiasi dengan counter ion. Counter ion dapat digantikan secara reversibel oleh ion-ion lain yang bermuatan sama. Penukar ion yang bermuatan positif mempunyai counter ion yang bermuatan negatif, sehingga disebut penukar anion. Sedangkan penukar kation bermuatan negatif, mempunyai counter ion yang bermuatan positif. Protein yang terikat

(8)

pada penukar dapat dielusi dari kolom dengan mengubah pH atau konsentrasi garam, misalnya NaCl. Penukar ion dengan matriks selulosa yang banyak digunakan dalam pemisahan adalah DEAE-selulosa dan CM-selulosa. Gugus DEAE, -OC2H5NH(C2H5)2 bermuatan positif pada pH 6,0-8,0 sehingga dapat digunakan untuk protein yang bermuatan negatif pada rentang pH tersebut. Sedangkan CM-selulosa (selulosa-OCH2COO-) dapat digunakan untuk pemisahan protein yang bermuatan positif pada pH 4,5 (Palmer, 1991 dalam Sariningsih, 2000).

Kelebihan metode ini dibandingkan dengan metode filtrasi gel adalah apabila menggunakan sampel yang banyak tidak terlalu dipengaruhi oleh tinggi kolom, sehingga efisiensi diameter kolom dapat ditingkatkan (Suhartono, 1989)

D. Kinetika Reaksi Enzim

Kinetika reaksi enzim adalah suatu cabang enzimologi yang membahas faktor-faktor yang mempengaruhi kecepatan reaksi enzimatis. Salah satu faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim adalah konsentrasi substrat, dengan mengubah-ubah konsentrasi substrat, dapat dipelajari mekanisme reaksi enzim, yakni bagaimana tahap-tahap terjadinya pengikatan substrat oleh enzim, maupun pelepasan produknya (Suhartono, 1989).

(9)

Reaksi enzim :

k1 k3

E + S ES E + P ...(1) k2

E = Enzim ; S = Substrat ; ES = Keadaan transisi dari komplek E dengan S ; P = hasil reaksi (produk).

Untuk mempermudah menghitung konsentrasi substrat yang diperlukan dalam mencapai kecepatan maksimumnya, digunakan tetapan Michaelis-Menten. Nilai Vmaks dan KM (konstanta Michaelis–Menten) didapat dengan mengadakan percobaan penentuan kecepatan reaksi V pada perbedaan konsentrasi substrat, sehingga diperoleh :

V= ...(2) } [ ] [ S Km S Vmaks 

Persamaan diatas dapat diubah menjadi :

 

S Vmaks Km Vmaks v 1 1 1 

 ... (3)

Dengan demikian terlihat bahwa bila dibuat grafik yang menunjukkan hubungan antara 1/ V dan 1/ [S], akan terjadi garis lurus ( Gambar 1.). Metode penentuan harga KM dan VMaks dengan cara ini disebut metode grafik Lineweaver-Burk (Poedjiadi, 1994).

(10)

Gambar 1. Kurva Lineweaver-Burk.

E. Stabilitas Enzim

Stabilitas enzim dapat diartikan sebagai kestabilan enzim selama penyimpanan dan penggunaan enzim tersebut, serta kestabilan terhadap senyawa yang bersifat merusak seperti pelarut tertentu (asam atau basa) oleh pengaruh suhu dan pH ekstrim (Wiseman, 1978 dalam Seriaty, 1991).

Stabilitas enzim dipengaruhi oleh banyak faktor seperti suhu, pH, pelarut, kofaktor, dan adanya surfaktan (Eijnsink et al., 2005). Dari faktor–faktor tersebut suhu dan pH memegang peranan penting dan sangat tepat untuk dipelajari. Pada suhu tinggi kebanyakan enzim akan membuka atau inaktif, yang berarti tidak fungsional lagi. Proses inaktivasi enzim pada suhu tinggi berlangsung melalui dua tahap, pertama adanya pembukaan parsial struktur sekunder, tersier dan kuartener molekul enzim, dan adanya perubahan struktur primer enzim karena adanya kerusakan asam amino tertentu oleh panas (Ahern dan Klibanov, 1987).

(11)

Enzim memiliki konstanta disosiasi pada gugus asam maupun basa, terutama pada gugus residu terminal karboksil dan terminal aminonya. Perubahan keaktifan enzim akibat perubahan pH lingkungan disebabkan terjadinya perubahan ionisasi enzim, substrat atau kompleks enzim-substrat (Winarno, 1986).

F. Bacillus subtilis

Bacillus subtilis adalah bakteri gram positif berbentuk batang yang dapat membentuk endospora, anaerobik fakultatif, ditemukan pada permukaan tanah, air, lingkungan akuatik, saluran pencernaan manusia dan hewan.

Sel Bacillus subtilis mempunyai ukuran panjang 2,0-8,0 µ dengan lebar 0,3-0.7 µ (Suriawiria, 1986). Bakteri ini tersusun dalam bentuk rantai dan bergerak dan berwarna keruh (Gupte, 1990).

Bakteri ini dapat tumbuh pada suhu 12 - 480C dan pH 6,5 – 10,8. Suhu optimum untuk pertumbuhan adalah 27 – 350C dengan pH 7,0 – 7,5.

Dalam taksonomi mikrobiologi, kedudukan Bacillus subtilis adalah sebagai berikut :

(12)

Divisio : Protophyta Kelas : Schizomycetes Ordo : Eubacteriales Famili : Bacillaceae Genus : Bacillus

Bakteri ini mampu menghasilkan enzim amilase, protease, kaseinase dan antibiotik bacitrasin. Bacillus subtilis juga mampu memfermentasikan glukosa menghasilkan 2,3-butanadiol dan gas CO2 (Brock, 1979).

G. Senyawa Aditif Enzim

Senyawa aditif merupakan senyawa yang ditambahkan pada larutan enzim sehingga dapat meningkatkan stabilitas struktur protein enzim tanpa mempengaruhi interaksi kovalen pada enzim. Penggunaan senyawa aditif terbukti dapat mempertahankan konformasi enzim (Suhartono, 1989).

Salah satu senyawa aditif yang sering digunakan adalah poliol (polihidroksi alkohol), poliol yang diketahui reaktif adalah yang mengandung tiga karbon atau lebih.

(13)

Beberapa jenis poliol yang digunakan dalam penelitian ini adalah: 1. Gliserol

Gliserol atau dikenal juga dengan gliserin atau glisil alkohol, memiliki berat molekul sebesar 92,094 g/mol, densitas 1.261 g/ cm3, titik didih 290 oC dan titik leleh 18 oC. Gliserol adalah gula alkohol yang memiliki tiga gugus hiroksil (- OH) yang bersifat hidrofilik, oleh karenanya gliserol dapat larut dalam air.

Gliserol merupakan komponen penting dalam trigliserida dan fosfolipid. Dalam keadaan murni merupakan senyawa yang tidak berbau, tidak berwarna, higroskopis, dan berupa cairan kental yang berasa manis. Struktur gliserol dapat dilihat pada Gambar 2.

Gambar 2. Struktur gliserol

2. Sorbitol

Sorbitol juga dikenal dengan glusitol. Sorbitol memiliki berat molekul 182, 17 g/mol, densitas sebesar 0,68 g/cm3, titik didih 296 oC dan titik leleh 95 oC. Sorbitol banyak ditemukan pada buah-buahan dan biji-bijian dari genus Sorbus. Sorbitol digunakan sebagai bahan campuran sirup obat batuk, selain itu sorbitol juga digunakan sebagai gula pengganti pada

(14)

makanan dan minuman rendah kalori. Struktur dari sorbitol dapat dilihat pada Gambar 3 :

Gambar 3. Struktur Sorbitol

(15)

III. METODE PENELITIAN

A. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Biokimia dan Laboratorium Instrumentasi Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung, pada bulan September 2009 sampai dengan April 2010.

B. Alat dan Bahan

Alat- alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain inkubator, laminar air flow, autoklaf (speed clave) model S-90N, shaker (orbit environ shaker), jarum ose, sentrifuse dingin (cold plate), tabung sentrifuga, pH meter, penangas air, lemari pendingin, termometer, neraca analitik, kolom kromatografi, spektrofotometer UV-Vis, dan peralatan umum laboratorium lainnya.

Bahan-bahan yang digunakan adalah medium NA (Nutrient Agar), yeast ekstrak, pati, pereaksi DNS (dinitrosalisilic acid), pereaksi Iodin, amonium sulfat, buffer pospat, BSA(Bovine Serum Albumin), Na2CO3, MgSO4.7H2O, CaCl2, KH2PO4, Ba(OH)2, kapas, kasa, Na(K) tartarat, reagen Folin-Ciocelteau, kantung selofan, CMC (karboksil metil selulose), akuades, gliserol dan sorbitol.

(16)

Mikroorganisme yang digunakan pada penelitian ini adalah jenis bakteri, yaitu Bacillus subtilis ITBCCB148 yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi dan Teknologi Fermentasi ITB.

C. Prosedur Penelitian 1. Pembuatan Pereaksi

a. Pembuatan Peraksi Untuk Pengukuran Aktivitas α-amilase Metode Fuwa

(1.) Larutan KI : Kedalam labu takar 100 mL, sebanyak 2 gram KI dilarutkan dalam 10 mL aquades, ditambahkan 0,2 gram I2, lalu ditambahkan aquades hingga tanda batas.

(2.) Larutan pati : Kedalam labu takar 100 mL,sebanyak 0,1 gr pati dilarutkan dalam 100 mL aquades, dipanaskan hingga larut.

b. Pembuatan Pereaksi Untuk Pengukuran Aktivitas α-amilase Metode Mandels

Ke dalam labu takar 100 mL, dimasukkan 1% NaOH, 40% garam Na(k) tartarat, 1% DNS (dinitrosalisilic acid), 0,2% fenol dan 0,05% Na2SO3 kemudian dilarutkan dengan 100 mL aquades hingga tanda batas (Mandels et al., 1976).

(17)

c. Pembuatan Pereaksi Untuk Pengukuran Kadar Protein Metode Lowry

1.) Pereaksi A : 2 gram Na2CO3 dilarutkan dalam 100 ml NaOH 0,1 N

(2.) Pereaksi B : 5 ml larutan CuSO4.5H2O 0,1 % ditambahkan ke dalam 5 ml larutan Na(K)tartarat 1%

(3.) Pereaksi C : 100 ml pereaksi A dan 2 ml pereaksi B (4.) Pereaksi D : reagen Folin-Ciocelteau diencerkan dengan aquades dengan perbandingan 1:1

(5.) Larutan standar : larutan BSA (Bovine Serum Albumin) diencerkan hingga mengandung 0.100 – 0.250 mg/ml.

2. Produksi enzim α-amilase

Media inokulum dan media fermentasi yang digunakan adalah media yang mengandung yeast ekstrak 0,5%, pati 0,5%, KH2PO4 0,05%, MgSO4.7H2O 0,02%, dan CaCl2.2H2O 0,01% yang dilarutkan dalam akuades. Media disterilisasi pada suhu 1210C, tekanan 1 atm, selama ± 15 menit dalam autoklaf. Bacillus subtilis ITBCCB148 dari media agar miring dipindahkan ke dalam media inokulum secara aseptis, lalu dikocok dalam shaker incubator dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 320C selama 24 jam. Selanjutnya media inokulum

(18)

dipindahkan ke media fermentasi dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 320C selama 72 jam (Yandri et al., 2000).

3. Isolasi dan Pemurnian Enzim α –amilase

A. Isolasi Enzim α-amilase

1. Sentrifugasi

Sentrifugasi merupakan tahap awal pemurnian enzim. Metode ini digunakan untuk memisahkan enzim ekstraseluler dari sisa-sisa sel. Sentrifugasi akan menghasilkan filtrat yang jernih dan endapan yang terikat kuat pada dasar tabung, yang kemudian dipisahkan secara manual.

Media fermentasi yang berisi Bacillus subtilis ITBCCB148 yang telah dikocok menggunakan shaker inkubator selama 72 jam disentrifugasi pada 5000 rpm, suhu 40C selama 20 menit. Filtrat yang diperoleh merupakan ekstrak kasar enzim yang selanjutnya dilakukan uji aktivitas amilase dengan metode Fuwa dan pengukuran kadar protein metode Lowry.

2. Pengujian aktivitas α-amilase dan kadar protein

Uji aktivitas dengan metode Fuwa dan penentuan kadar protein dengan metode Lowry dilakukan pada tahap isolasi, pemurnian dengan amonium sulfat, dialisis, kromatografi kolom, dan karakterisasi enzim baik sebelum maupun sesudah penambahan sorbitol dan gliserol.

(19)

a. Pengujian aktivitas α-amilase metode Fuwa

Aktivitas enzim α-amilase ditentukan oleh metode Fuwa (Fuwa, 1954). Sebanyak 250 µ L enzim ditambahkan 250 µL larutan pati 0,1%, dan diinkubasi pada suhu 600C selama 10 menit. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 250 µ L HCl 1 N dan kemudian ditambahkan 250 µ L larutan KI dan 4 mL aquades kedalam tabung reaksi. Uji ini positif bila menghasilkan larutan kompleks berwarna kuning, kemudian absorbansi diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 600 nm. Kontrol dibuat dengan cara yang sama tetapi menggunakan enzim yang sudah diinaktifkan.

b. Pengujian aktivitas α-amilase Metode Mandels

Pengujian aktivitas enzim α-amilase dengan metode Mandels dilakukan berdasarkan glukosa yang terbentuk. Uji ini dilakukan pada tahap karakterisasi enzim hasil isolasi dan penentuan KM dan VMaks, yaitu dengan cara sebanyak 0,5 mL enzim ditambah 0,5 mL larutan pati 0,1%, lalu diinkubasi selama 30 menit pada suhu 60 oC. Setelah itu ditambahlkan 2 mL pereaksi DNS, dididihkan selama 10 menit pada penangas air kemudian didinginkan. Setelah dingin serapan diukur pada panjang gelombang 550 nm. Kadar glukosa yang terbentuk ditentukan dengan menggunakan kurva standar glukosa.

(20)

c. Penentuan kadar protein metode Lowry

Kadar protein enzim ditentukan dengan metode Lowry et al (1951). Sebanyak 0,1 mL enzim ditambahkan 0,9 mL akuades lalu direaksikan dengan 5 mL pereaksi C, lalu campuran diaduk secara merata dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu kamar. Setelah itu ditambahkan dengan cepat 0,5 mL pereaksi D dan diaduk dengan sempurna, didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar. Untuk kontrol, enzim diganti dengan 1 mL akuades, selanjutnya perlakuannya sama seperti sampel. Serapan diukur menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada 750 nm. Untuk menentukan konsentrasi protein enzim digunakan kurva standar BSA (Bovine Serum Albumin)

4. Pemurnian Enzim

a. Fraksinasi dengan Amonium Sulfat [(NH4)2SO4]

Ekstrak kasar enzim yang diperoleh, diendapkan dengan garam amonium sulfat. Skema proses pengendapan dengan penambahan amonium sulfat dapat dilihat pada Gambar 8. Secara terfraksi endapan protein enzim yang didapatkan, dipisahkan dari cairannya dengan cara sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 20 menit dengan suhu 4oC. Kemudian endapan yang diperoleh dilarutkan dalam buffer pospat pH 6; 0,1 M. Hasil fraksinasi

(21)

dengan amonium sulfat ini, kemudian diuji aktivitasnya dengan metode Fuwa dan kadar proteinnya dengan metode Lowry.

Skema proses fraksinasi dengan penambahan garam amonium sulfat dijelaskan pada Gambar 4.

Ekstrak kasar enzim α-amilase

+ (NH4)2SO4 (0 – 20%)

Filtrat Endapan (F1) + (NH4)2SO4 (20 – 40%)

Endapan (F2) Filtrat

+ (NH4)2SO4 (40 - 60%)

Endapan (F3) Filtrat

+ (NH4)2SO 4 (60 – 80%)

Endapan (F4) Filtrat

+ (NH4)2SO4 (80 – 100%)

Endapan (F5) Filtrat

(22)

b. Dialisis

Endapan enzim yang telah dilarutkan dari tiap fraksi amonium sulfat yang mempunyai aktivitas yang tinggi, dimasukkan dalam kantung selofan dan didialisis dengan bufer pospat pH 6; 0,01 M selama  40 jam dengan menggunakan stirer dalam suhu dingin. Kemudian hasil dialisis diuji aktivitas enzim dengan menggunakan metode Fuwa dan kadar proteinnya ditentukan dengan menggunakan metode Lowry.

c. Kromatografi Kolom

Proses kromatografi yang dilakukan adalah kromatografi penukar ion dengan menggunakan CMC. Proses pengerjaannya

sebagai berikut :

a. Pengembangan gel

CMC disuspensikan dalam akuades dan dibiarkan mengembang pada suhu kamar. Partikel halus dibuang dengan cara dekantasi. Setelah itu ditambahkan NaOH 0,5 M dan HCl 0,5 M kemudian distabilkan dengan buffer awal.

b. Penentuan buffer awal

CMC yang sudah siap, distabilkan menggunakan buffer pospat 0,1 M dengan variasi pH yaitu 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; dan 8,0. Kemudian ke dalam matriks ditambahkan 0,5 mL enzim hasil dialisis dan dielusi dengan

(23)

buffer yang sesuai, diaduk 5-10 menit. Campuran selanjutnya di dekantasi dan diuji aktivitas enzimnya.

c. Penentuan buffer elusi

Penentuan buffer elusi dilakukan sama seperti di atas. Setelah CMC distabilkan menggunakan buffer pospat 0,1 M dan kemudian ke dalam masing – masing tabung ditambah 0,5 mL enzim, kemudian masing-masing tabung dielusi dengan buffer pospat dengan pH yang divariasikan, di aduk 5-10 menit. Campuran tersebut selanjutnya dibiarkan hingga CMC mengendap dan supernatan didekantasi dan diuji aktivitas enzimnya.

d. Pembuatan kolom gel

Pembuatan kolom gel dilakukan dengan membubuhi wool glass dibagian bawah. Kolom dipasang tegak lurus, kemudian gel yang telah disetimbangkan dimasukkan ke dalam kolom dengan bantuan batang pengaduk dan diusahakan jangan sampai ada gelembung udara di dalam kolom. Kran pengatur tetesan dibuka sedemikian rupa sehingga kecepatan tetes 15-20 mL/jam.

e. Penempatan cuplikan ke dalam kolom

Cuplikan (larutan enzim) diteteskan ke permukaan kolom secara perlahan-lahan.

f. Penampungan eluen

(24)

g. Pengukuran eluen

Pengukuran eluen dilakukan dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 280 nm, selanjutnya absorbansi setiap fraksi diplotkan terhadap nomor fraksi.

h. Pengukuran aktivitas enzim

Setiap fraksi pada pola protein yang diperoleh dari pengukuran eluen di atas ditentukan aktivitasnya. Semua fraksi yang menunjukkan aktivitas enzim dikumpulkan menjadi satu, lalu ditentukan aktivitas unit dan aktivitas spesifiknya.

5. Karakterisasi Enzim

a. Penentuan Suhu Optimum Sebelum Penambahan Poliol

Untuk mengetahui temperatur optimum kerja enzim dilakukan dengan variasi suhu antara 55, 60, 65, 70, 75, dan 80oC, kemudian dilakukan pengukuran aktivitas enzim dengan metode Fuwa.

b. Penentuan pH Optimum Sebelum Penambahan Poliol

Untuk mengetahui pH optimum dari enzim hasil pemurnian digunakan buffer pospat 0,01 M dengan variasi pH yaitu 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8,0; dan 8,5 . Kemudian dilakukan pengukuran aktivitas enzim dengan metode Fuwa.

(25)

c. Penentuan Nilai KM dan VMaks Enzim Sebelum penambahan Poliol

Nilai KM dan VMaks enzim yang telah dimurnikan ditentukan dengan memvariasikan konsentrasi substrat yaitu 0,1; 0,2; dan 0,4, 0,6, 0,8

dan 1%. Dengan menggunakan data hasil penentuan pH dan suhu optimum, dilakukan pengukuran aktivitas enzim dengan metode Mandels. Kemudian data diplotkan kedalam kurva Lineweaver-Burk untuk penentuan nilai KM dan VMaks.

d. Penentuan pH optimum setelah penambahan poliol

Larutan poliol ditambahkan pada enzim hasil pemurnian dengan perbandingan (1 : 1), (enzim : poliol) untuk konsentrasi poliol masing-masing 0,5; 1,0; dan 1,5 M. Selanjutnya enzim dikondisikan pada variasi pH 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; dan 8,5. Kemudian dilakukan pengukuran aktivitas unit enzim dengan metode Fuwa. Kontrol dibuat dengan perlakuan yang sama, yaitu diinkubasi pada waktu dan pH yang sama tetapi menggunakan enzim yang telah diinaktifkan. Enzim kontrol ini digunakan untuk mengetahui ada tidaknya pengaruh penambahan poliol terhadap aktivitas sisa enzim.

(26)

e. Penentuan Suhu Optimum Setelah Penambahan Poliol

Larutan poliol ditambahkan pada enzim hasil pemurnian dengan perbandingan 1 : 1, ( enzim : poliol) untuk konsentrasi poliol masing–masing 0,5M; 1M; 1,5 M. Selanjutnya sebanyak 250 µL campuran enzim–poliol, kemudian di inkubasi selama 10 menit pada suhu 55, 60, 65, 70, 75 dan 800C dalam waterbath. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 250 µL HCl 1 N dan ditambahkan 250 µL larutan KI dan 4 ml aquades. Sebagai kontrol, enzim yang telah diinaktifkan diinkubasi pada suhu dan waktu yang sama.

f. Penentuan Km dan Vmaks Setelah Penambahan Poliol

Nilai KM dan VMaks enzim setelah penambahan poliol ditentukan dengan memvariasikan substrat yaitu 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; dan 1% . Dengan menggunakan data hasil penentuan pH dan suhu optimum enzim setelah penambahan poliol, aktivitas enzim ditentukan dengan metode Mandels. Kemudian data diplotkan ke dalam kurva Lineweaver – Burk untuk penentuan nilai KM dan VMaks.

g. Uji stabilitas termal enzim (Yang et al., 1996)

Penentuan stabilitas termal enzim dilakukan dengan mengukur aktivitas sisa enzim setelah diinkubasi selama suhu dan pH tertentu (suhu dan pH optimum). Caranya adalah dengan mengukur aktivitas enzim setelah proses pemanasan selama waktu tertentu sesuai dengan pengukuran aktivitas enzim.

(27)

Aktivitas awal enzim (tanpa perlakuan) di beri nilai 100%.

Aktivitas sisa = Aktivitas enzim setelah perlakuan x 100%

Aktivitas enzim awal (tanpa perlakuan)

(Virdianingsih, 2002)

(28)

Gambar 5. Diagram alir Penelitian Pemurnian Enzim 1. Fraksinasi dengan amonium sulfat 2. Dialisis 3. Kromatografi

Uji aktivitas enzim Metode Fuwa dan kadar protein Metode Lowry

Karakterisasi enzim

Mempelajari pengaruh poliol

KM dan VMaks

Suhu optimum Suhu optimum enzim setelah penambahan poliol Produksi enzim Ekstrak kasar pH Optimum pH optimum enzim setelah penambahan poliol

Km dan Vmaks setelah penambahan

poliol

Metode Mandels

Metode Mandels Stabiltas

(29)

V. SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan

Dari hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa:

1. Enzim -amilase hasil pemurnian memiliki pH optimum 6 dan suhu optimum 60 oC. Nilai Km enzim hasil pemurnian adalah 3,99 mg/mL substrat dan harga Vmaks sebesar 3,89mol/mL menit.

2. Aktivitas spesifik enzim α-amilase hasil pemurnian 12.000 U/mg, meningkat 30 kali dibandingkan dengan ekstrak kasar yang memiliki aktivitas spesifik sebesar 393 U/mg.

3. Penambahan sorbitol pada enzim hasil pemurnian tidak menyebabkan perubahan pH dan suhu optimum. Enzim setelah penambahan sorbitol 0,5M mempunyai nilai KM = 1,98 mg mL-1 substrat, Vmaks = 1,19 mol mL-1 menit -1

, sorbitol 1M, KM = 1,86 mg mL-1 substrat, Vmaks = 1,44 mol mL-1 menit-1, sorbitol 1,5M, KM = 1,35 mg mL-1, Vmaks = 3,93 mol mL-1 menit-1.

4. Penambahan gliserol pada enzim hasil pemurnian tidak menyebabkan perubahan suhu optimum tetapi mengalami perubahan pH optimum dari 6 menjadi 6,5. Enzim setelah penambahan gliserol 0,5M mempunyai nilai KM = 1,82 mg mL-1 substrat, Vmaks = 1,34 mol mL-1 menit-1, gliserol 1M, KM =

(30)

1,75 mg mL-1 substrat, Vmaks = 1,41 mol mL-1 menit-1, gliserol 1,5M, KM = 2,15 mg mL-1 substrat, Vmaks = 1,71 mol mL-1menit -1.

5. Uji stabilitas termal enzim setelah penambahan sorbitol 0,5M; 1M; 1,5M pada pH 6 dan suhu 600C selama 60 menit masih memiliki aktivitas sisa berturut-turut adalah 16,96%; 33,22%; dan 41,69%. Enzim dengan penambahan sorbitol 0,5 M mempunyai t1/2 = 28,39 menit; ki = 0,02λ, ΔGi = 103,010 kJ mol-1; sorbitol 1M mempunyai t1/2 = 38,50 menit; ki = 0,018, ΔGi = 104,330 kJ mol-1, sorbitol 1,5M mempunyai t1/2 = 43,31 menit; ki = 0,016, ΔGi = 104,657 kJ mol-1.

6. Uji stabilitas termal enzim setelah penambahan gliserol 0,5M; 1M; 1,5M pada pH 6 dan suhu 600C selama 60 menit memiliki aktivitas sisa berturut-turut adalah 14,16%; 14,16%; 24,79%. Enzim dengan penambahan gliserol 0,5M dan 1M mempunyai t1/2 = 21,00 menit, ki = 0,033, ΔGi = 102,652 kJ mol-1, gliserol 1,5M mempunyai t1/2 = 27,72 menit, ki = 0,025, ΔGi = 103,421 kJ mol-1.

7. Penambahan poliol untuk enzim α-amilase dari Bacillus subtilis dapat meningkatkan stabilitas termal. Penurunan nilai ki, peningkatan waktu paruh dan ΔGi menunjukkan bahwa enzim dengan penambahan poliol lebih stabil dibandingkan enzim sebelum penambahan poliol.

(31)

B. Saran

Dari hasil penelitian yang diperoleh, disarankan untuk menggunakan poliol jenis lain selain sorbitol dan gliserol atau dengan metode peningkatan stabilitas yang lain.

(32)

Oleh

EVILIA ARIYANTI

Skripsi

Sebagai Salah Satu Syarat untuk Mencapai Gelar SARJANA SAINS Pada

Jurusan Kimia

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG 2010

(33)

Judul : STUDI PENGARUH PENAMBAHAN POLIOL

TERHADAP STABILITAS ENZIM α-AMILASE DARI Bacillus subtilis

Nama : Evilia Ariyanti NPM : 0317011042 Jurusan : Kimia

Fakultas : Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

MENYETUJUI 1. Komisi pembimbing

Pembimbing I Pembimbing II

Dr. Ir. Yandri A.S., M.S Nurhasanah, M.Si

NIP 195609051992031001 NIP

2. Ketua Jurusan

Andi setiawan Ph.D NIP 195809221988111001

(34)

STUDI PENGARUH PENAMBAHAN POLIOL TERHADAP

STABILITAS

TERMAL ENZIM α

-AMILASE DARI

Bacillus subtilis ITBCCB148

(Skripsi)

Oleh Evilia Ariyanti

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG

2010

(35)

PENDIDIKAN FORMAL (SD s.d S1)

PENGALAMAN ORGANISASI

BEASISWA YANG PERNAH DIDAPAT

PENGALAMAN KERJA

CURRICULUM VITAE

Tahun 1991 – 1997 : SD Negeri 1 Sukamenanti

Tahun 1997 – 2000 : SLTP Negeri 3 Bukit kemuningpung Tahun 2000 – 2003 : SMA Negeri 1 Bukit Kemuning

Tahun 2003 – 2010 : Jurusan Kimia FMIPA, Universitas Lampung

Periode 2005-2006 : Anggota Biro Usaha Mandiri HIMAKI UNILA

NAMA

_{: Evilia Ariyanti}

Tempat, Tanggal Lahir : Bukit kemuning, 9 Januari 1986 Jenis Kelamin : Perempuan

Agama : Islam

Status Penikahan : Belum menikah Tinggi / Berat Badan : 167 cm/ 65 Kg Kewarganegaraan : Indonesia Alamat Rumah

Telp.

: Jl. Lintas sumatera No.77 Bukit kemuning Lampung Utara 34556

Alamat Saat Ini Telp.

: Jl. Sutan Jamil No 12 kedaton Bandar Lampung 35144.

No. HP : 081957127271

(36)

ASISTEN PRAKTIKUM YANG PERNAH DIJABAT

HOBI

PELATIHAN YANG PERNAH DIIKUTI

 Studi pengaruh penambahan poliol terhadap stabilitas termal enzim α-amilase dari Bacillus subtilis ITBCCB148

 Kimia Dasar I dan 2 untuk Fakultas Pertanian  Biokimia untuk Fakultas Pertanian

(37)

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bukit Kemuning pada tanggal 9 Januari 1986 yang merupakan anak kedua dari tiga bersaudara buah hati pasangan Bapak Drs. Suroso dan Ibu Siti Zubaidah S.Pd.

Penulis memulai pendidikannya di TK PGRI 1 Bukit Kemuning pada tahun 1990. Pendidikan Sekolah Dasar diselesaikan pada tahum 1997 di SD Negeri 1 Sukamenanti kecamatan Bukit Kemuning. Kemudian dilanjutkan ke jenjang Sekolah Lanjutan Tingkat Pertama di SLTP Negeri 3 Bukit Kemuning dan lulus pada tahun 2000. Penulis menamatkan Sekolah Menengah Umum di SMU Negeri 1 Bukit Kemuning pada tahun 2003.

Pada tahun 2003 penulis diterima di Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung melalui jalur SPMB. Selama menjadi mahasiswa, penulis pernah menjadi asisten Kimia Dasar 1 dan Kimia Dasar II serta Biokimia I untuk Fakultas Pertanian Universitas Lampung.

Di organisasi internal kampus penulis pernah menjabat sebagai anggota Biro Usaha Mandiri Himpunan Mahasiswa Kimia FMIPA periode 2005 – 2006.

(38)

“

Dia mengetahui apa yang ada di

langit dan di bumi, dan mengetahui apa yang kamu rahasiakan

dan apa yang kamu nyatakan. Dan Allah Maha Mengetahui

segala isi hati

”

(QS. At-Tagabun 4)

“

Every adversity, every failure, every heartache,

carries with it the seed on

equal or gerater benefit

”

(Anonim)

“orang yang berani menghadapi kegagalan adalah

orang yang pernah mencapai kebesaran

”

(39)

Dengan Rahmat Allah Yang Maha Kuasa Kupersembahkan Karya Kecilku ini Kepada:

Mama Terhebat dan Papa Terhormat, sebagai tanda bakti, kasih sayang dan tanggung jawabku atas segala Doa dan pengorbanan yang telah diberikan.

Mbak Yulis Tiana Evayanti dan Adek Dimash Septian Adi Putra tersayang Seluruh keluarga besarku

Yang selalu mendoakanmu keberhasilanku, Almamater

(40)

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL……….. v

DAFTAR GAMBAR ... vi

PENDAHULUAN Latar Belakang ... 1

Tujuan Penelitian ... 4

Manfaat Penelitian ... 4

TINJAUAN PUSTAKA Enzim ... 5

Enzim Amilase ... 6

Isolasi dan Pemurnian Enzim ... 7

Kinetika Reaksi Enzim ... 10

Stabilitas Enzim ... 12

Bacillus Subtilis ... 13

Senyawa aditif enzim... 14

METODE PENELITIAN Tempat dan Waktu Penelitian ... 17

Alat dan Bahan ... 17

Prosedur Penelitian ... 18

Pembuatan Pereaksi ... 18

Pembuatan Pereaksi untuk Pengukuran Aktivitas α – Amilase Metode Fuwa ... 18

(41)

Pembuatan Pereaksi untuk Pengukuran Aktivitas α – Amilase

Metode Mandels ... 18

Pembuatan Pereaksi untuk Pengukuran Kadar Protein Metode Lowry ... 19

Produksi enzim α-amilase... 19

Isolasi dan Pemurnian Enzim ... 20

Isolasi enzim α-amilase ... 20

Sentrifugasi……….. 20

Pengujian aktivitas α-amilase dan kadar protein ... 20

Pengujian aktivitas α-amilase metode Fuwa……… 21

Pengujian aktivitas α-amilase metode Mandels………. 21

Penentuan kadar protein metode Lowry……… 22

Pemurnian enzim ... 22

Fraksinasi dengan amonium sulfat ... 22

Dialisis ... 24

Kromatografi kolom ... 24

Karakterisasi enzim ... 26

Penentuan suhu optimum sebelum penambahan poliol ... 26

Penentuan pH optimum sebelum penambahan poliol………... 26

Penentuan nilai KM dan Vmaks sebelum penambahan poliol ... 27

Penentuan pH Optimum Enzim Setelah Penambahan Poliol ... 27

(42)

Penentuan Km dan Vmaks Enzim Setelah Penambahan

Poliol ... 28

Uji stabilitas termal dan pH enzim α –amilase ... 28

HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi enzim α-amilase ... 31

Pemurnian enzim ... 31

Fraksinasi dengan ammonium sulfat ... 32

Dialisis ... 33

Kromatografi kolom penukar ion dengan menggunakan CMC ... 34

Karakterisasi enzim α-amilase sebelum dan sesudah Penambahan poliol ... 36

Penentuan pH optimum enzim hasil pemurnian... 36

Penentuan suhu optimum enzim hasil pemurnian ... 37

Penentuan KM dan Vmaks enzim hasil pemurnian ... 39

Penentuan pH optimum setelah penambahan sorbitol dan gliserol ... 40

Penentuan suhu optimum setelah penambahan sorbitol dan gliserol ... 42

Penentuan KM dan Vmaks setelah penambahan sorbitol dan gliserol ... 43

Stabilitas termal enzim hasil pemurnian dan enzim setelah Penambahan sorbitol dan gliserol ... 46

Konstanta laju inaktivasi termal (ki), waktu paruh (t1/2), dan perubahn energi akibat denaturasi (ΔGi) enzim hasil pemurnian dan enzim setelah penambahan sorbitol dan gliserol ... 48

(43)

Waktu paruh (t1/2) ... 49

Perubahan energi akibat denaturasi (ΔGi) ... 49

KESIMPULAN DAN SARAN Simpulan ... 51

Saran ... 53

DAFTAR PUSTAKA ... 54

LAMPIRAN ... 56

(44)

Halaman Tabel

1. Pemurnian enzim α-amilase dari Bacillus subtilis ... 36 2. Nilai konstanta laju inaktivasi termal (nilai ki), waktu paruh (t1/2),

dan perubahan energi akibat denaturasi (ΔGi) enzim hasil pemurnian

dan sesudah penambahan poliol (0,5M; 1M; 1,5M) ... 48 3. Hubungan antara kejenuhan amonium sulfat dengan aktivitas

spesifik α-amilase……… 57

4. Pola Protein (A280nm) dan aktivitas unit (U/mL) enzim α-amilase dari Bacillus subtilis ITBCCB148 terhadap nomor fraksi pada

hasil kromatografi kolom penukar ion CMC……….. 57

5. Hubungan antara pH dengan aktivitas enzim α-amilase

hasil pemurnian……… 58

6. Hubungan antara suhu dengan aktivitas enzim α-amilase

hasil pemurnian……… 58

7. Hubungan antara aktivitas (U mL-1) enzim α-amilase hasil

pemurnian dengan konsentrasi substrat……….. 59 8. Penentuan pH optimum enzim α-amilase setelah penambahan

sorbitol 0,5 M; 1M; 1,5M……… 5λ

9. Penentuan pH optimum enzim α-amilase setelah penambahan

gliserol 0,5M; 1M; 1,5M………. 60 10. Penentuan suhu optimum enzim hasil pemurnian setelah

penambahan sorbitol 0,5M; 1M; 1,5M……….. 60 11. Penentuan suhu optimum enzim hasil pemurnian setelah

penambahan gliserol 0,5M; 1M; 1,5M……….. 61 12. Hubungan antara aktivitas (U mL-1) enzim α-amilase setelah

penambahan sorbitol 0,5M; 1M; 1,5M dengan

(45)

13. Hubungan antara aktivitas (U mL-1) enzim α-amilase setelah penambahan gliserol 0,5M; 1M; 1,5M dengan

konsentrasi substrat……….. 61 14. Hubungan antara aktivitas unit (U mL-1) enzim α-amilase

hasil pemurnian dan setelah penambahan sorbitol 0,5M; 1M; 1,5M

terhadap stabilitas termal ………. 62 15. Hubungan antara aktivitas sisa (%) enzim hasil pemurnian

dan setelah penambahan sorbitol 0,5M; 1M; dan 1,5M

terhadap stabilitas termal ……….. 63 16. Hubungan antara aktivitas unit (U mL-1) enzim hasil

pemurnian dan setelah penambahan gliserol 0,5M; 1M; dan 1,5M

terhadap stabilitas termal ………. 63 17. Hubungan antara aktivitas sisa (%) enzim hasil pemurnian

dan setelah penambahan gliserol 0,5M; 1M dan 1,5M

terhadap stabilits termal ……….. 64 18. Penentuan nilai ki ( konstanta laju inaktivasi termal) enzim

hasil pemurnian pada suhu 600C ………. 64 19. Penentuan nilai ki (konstanta laju inaktivasi termal) enzim

setelah penambahan sorbitol 0,5M pada suhu 600C ……… 65 20. Penentuan nilai ki (konstanta laju inaktivasi termal) enzim

setelah penambahan sorbitol 1M pada suhu 600C ………... 65 21. Penentuan nilai ki (konstanta laju inaktivasi termal) enzim

setelah penambahan sorbitol 1,5M pada suhu 600C ……… 65 22. Penentuan nilai ki (konstanta laju inaktivasi termal) enzim

setelah penambahan gliserol 0,5M pada suhu 600C ……… 65 23. Penentuan nilai ki (konstanta laju inaktivasi termal) enzim

setelah penambahan gliserol 1M pada suhu 600C ……… 66 24. Penentuan nilai ki (konstanta laju inaktivasi termal) enzim

setelah penambahan gliserol 1,5M pada suhu 600C ……… 66 25. Absorbansi glukosa pada berbagai konsentrasi untuk

penentuan kurva standar glukosa ………. 69 26. Absorbansi serum albumin sapi (BSA) pada berbagai

konsentrasi untuk penentuan kurva standar protein ……… 70 .

(46)

DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar

1. Kurva Lineweaver – Burk ... 12 2. Struktur Gliserol ... 15 3. Struktur Sorbitol ... 16 4. Skema Proses Fraksinasi Enzim dengan Penambahan

AmoniumSulfat ... 23 5. Diagram Alir Penelitian ... 30 6. Hubungan antara kejenuhan ammonium sulfat dengan

aktivitas spesifik enzim α-amilase

7. Kromatogram enzim α-amilase dari Bacillus subtilis

ITBCCB148 pada kolom CMC... 34 8. Hubungan antara pH dengan aktivitas enzim α-amilase

hasil pemurnian ………. 36 9. Hubungan antara suhu dengan aktivitas enzim α-amilase

hasil pemurnian ………... 38 10. Kurva Lineweaver-Burk enzim α-amilase hasil pemurnian …………... 39 11. pH optimum enzim hasil pemurnian dan enzim setelah

penambahan Sorbitol 0,5M; 1M dan 1,5M ………... 40 12. pH optimum enzim hasil pemurnian dan enzim setelah

penambahan Gliserol 0,5M; 1M; dan 1,5M ……….. 41

13. Suhu optimum enzim hasil pemurnian dan setelah

penambahan sorbitol 0,5M; 1M dan 1,5M ……… 42 14. Suhu optimum enzim hasil pemurnian dengan enzim

(47)

15. Kurva Lineweaver-Burk enzim setelah penambahan

sorbitol 0,5M; 1M; 1,5M ………... 44 16. Grafik Lineweaver-Burk enzim setelah penambahan

gliserol 0,5M; 1M; 1,5M ………. 45 17. Stabilitas enzim hasil pemurnian dan enzim setelah

penambahan sorbitol (0,5M; 1M; 1,5M) ………. 46 18. Stabilitas termal enzim hasil pemurnian dan enzim

setelah penambahan gliserol (0,5M; 1M; 1,5M) ……….... 47 19. ln (Ei/E0) terhadap waktu enzim hasil pemurnian

dengan enzim setelah penambahan gliserol 0,5M; 1M; 1,5M…………. 67 20. Kurva standar glukosa ………. 69 21. Kurva standar serum albumin sapi ……….. 70

(48)

DAFTAR PUSTAKA

Ahern T. J,, and A. M. Klibanov. 1987. Why Do Enzym Irreversibly Inactive at Hight Temperature. Biotec. I. Microbial Genetic Engineering and Enzyme Technology. Gustav Fischer. Stutgart. New York. PP. 131 – 136.

Bollag, D. M., Rozycki, M. D., and Edelstein, S. J. 1996. Protein Methods. 2nded. John Wiley and Sons, Inc., Publiction, New York.

Brock, T. D. 1979. Biology of Mycroorganism. 3rd Edition. Pentice Hall inc. New Jersey. Eijnsink, G. H., Sigrit, G., Torben, V. and Bertus van de Burg. 2005. Directed Evolution of

Enzyme Stability. Biomolecular Engineering. Elsevier Science Inc. New York. Fuwa, H. 1954. A New Method For Microdetermination of Amylase Activity by The Use of

amylase As The Subsratre. J. Biochem. Tokyo.

Girindra, Aisjah. 1993. Biokimia 1. Gramedia pustaka utama. Jakarta.

Gupte, S. 1990. Mikrobiologi Dasar. Alih Bahasa oleh Dr. Julius E. S. Binarupa Aksara. Jakarta.

Illanes, A. 1999. Stability of Biocatalysts. EJB Electronic Journal of Biotechnology. Universuaded Catolica de Valparaiso. Chille. Volume 2 (1).

Judoamidjojo, R. M,. Gumbira, S, E,, Hartoto, L. 1989. Biokonversi. Depdikbud Dirjen Dikti. PAU Bioteknologi IPB. Bogor.

Kazan, D., Haluk, dan E., Altan, E. 1996. Stabilization of Penicilin G Aclyase Againts pH by Chemical Cross- Linking. Process Biochemistry Vol. 31. No. 2. pp. 135 – 140. Larone, D. H. 2002. Medically Important Fungi. 4th ed. P 166. ASM Press. Washington Dc. Lehninger, A. L. 1982. Dasar – Dasar Biokimia. Alih Bahasa Oleh Maggy Thenawijaya.

Erlangga. Jakarta. 369 halaman.

Lowry, O.H., N.J., Rosebrough, A.L., Farr, R.J. Randall. 1951. Protein Measurement With the Folin Phenol Reagent, J. Biol. Chem. 193-265.

Mandels, M., A. Raymond, R. Charles. 1976. Measurement of Saccharifiying Cellulase. Biotech & Bioeng. Symp. No6. John Wiley & Sons Inc.

(49)

Sariningsih, R. 2000. Produksi Enzim Protease oleh Bacillus subtilis BAC-4. Skripsi. ITB. Bandung.

Schomburg, D dan Salzmann, M. 1991. Enzyme Handbook 4. Springer. Verlag Berlin Heidelberg. Germany.

Scopes, R.K. 1984. Protein Purification Principles and Practice. Springer- Verlag. New York. 282 hlm.

Seriaty, J. 1991. Pengaruh Penggunaan Aditif Terhadap Kestabilan Protease Bacillus Stearothermophilus Selama Penyimpanan. Skripsi IPB. Bogor.

Smith, J. E. 1990. Prinsip Bioteknologi. Diterjemahkan oleh U. F. Sumo, B. Sumantri, dan Subono. Penerbit gramedia. Jakarta.

Suhartono, M. T. 1989. Enzim dan Bioteknologi. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Dirjen DIKTI, PAU Bioteknolodi IPB. Bogor. 322 halaman

Suriawira, U. 1986. Pengantar Mikrobiologi Umum. Penerbit Angkasa. Bandung. Tarigan, P. 1988. Teknologi Fermentasi. PAU Bioteknologi ITB. Bandung. Toha, Abdul Hamid. 2001. Biokimia : Metabolisme Molekul. Alfabeta. Bandung.

Virdianingsih, R. 2002. Mempelajari Stabilitas Termal Enzim dari Bacillus pumilus yl dalam Pelarut Heksana, Toluena, dan Benzena. Skripsi IPB. Bogor.

Walsh, G., and D.R. Headon. 1994. Protein Biotechnology. John Wiley and Sons. New York

Winarno, F.G.1986. Enzim Pangan. PT. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.

Wirahadikusumah, M. 1997. Biokimia Protein, Enzim, dan Asam Nukleat. ITB Press. Bandung. 91 halaman.

Wulandari, P. 2008. Studi Pengaruh Penambahan Poliol Terhadap Stabilitas Termal Enzim α-amilase dari Rhizopus oryzae. Skripsi. Universitas Lampung. Bandar Lampung. Yandri, A.S., M. Sindumarta, S. Soemitro dan Kosasih. 2000. Isolasi, pemurnian dan

karakterisasi enzim α-amilase termostabil dari bakteri local Bacillus sp. B. 148, Prosiding Kimia Bersama ITB-UKM keempat, Bandung.

Yandri, A.S., 2004. Karakterisasi dan Modifikasi Kimia α-Amilase dari Bakteri Isolat Lokal Bacillus subtilis ITBCCB148. Disertasi. Institut Teknologi Bandung. Bandung.

www.wikipedia.org. Diakses pada tanggal 5 Desember 2007

(50)

Judul Skripsi : STUDI PENGARUH PENAMBAHAN POLIOL TERHADAP STABILITAS

ENZIM α-AMILASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148 Nama Mahasiswa : Evilia Ariyanti

Nomor Pokok Mahasiswa : 0317011042

Jurusan : Kimia

Fakultas : Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

MENYETUJUI 1. Komisi Pembimbing

Dr.Ir. Yandri A.S., M.S Nurhasanah, M.Si

NIP. 131996794 NIP. 131804068

2. Ketua Jurusan

Andi Setiawan Ph.D NIP. 131688477

(51)

SANWACANA

Segala puji bagi Allah SWT yang telah menjadikan ilmu sebagai sifat kesempurnaan yang paling tinggi. Alhamdullillah, atas rahmat dan hidayah-Nya lah penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul :

STUDI PENGARUH PENAMBAHAN POLIOL TERHADAP STABILITAS TERMAL ENZIM ά- AMILASE DARI Bacillus Subtilis ITBCCB148

Dalam menyelesaikan skripsi ini penulis tidak luput dari bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak. Dalam kesempatan ini, penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada :

1. Bapak Dr. Ir Yandri A.S, M.S, selaku pembimbing I atas kesediaan dan kesabarannya meluangkan waktu dan memberikan bimbingan,nasehat, saran dan kritik dalam proses penyelesaian skripsi.

2. Ibu Nurhasanah, M.Si, selaku pembimbing II yang telah meluangkan waktu, memberikan bimbingan, motivasi dan saran selama penelitian.

3. Ibu Dian Herasari M.Si selaku pembahas atas saran dan kritik untuk kesempurnaan penulisan skrpsi ini.

4. Bapak Rudy TM Situmeang, M.Sc, selaku pembimbing akademik atas saran dan dukungan dalam membimbing penulis selama ini.

5. Bapak Andi Setiawan Ph.D, selaku Ketua Jurusan Kimia FMIPA, beserta Bapak dan Ibu dosen, staf pengajar dan karyawan di lingkungan FMIPA Universitas Lampung.

(52)

7. Mama “Terhebat” dan Papa “Terhormat” atas segala doa, kasih sayang, nasehat, materi, kesabaran serta cinta kasih yang tiada henti yang diberikan untuk keberhasilanku. Terima kasih dan maaf yang tak terhingga Aku ucapkan.

8. Mba Yulis Tiana Evayanti S.ST (terima kasih buat semuanya mbak) dan kak Dede, dek Dimash Septian Adi Putra serta keponakanku yang lucu Keysha yang selalu memberikan keceriaan, semangat, doa yang tiada henti untuk keberhasilanku. 9. Sahabat-sahabatku Indah Shofa Marwa S.Si, Pretty Wulandari S.Si, dan Beta

Ruziyani S.Si yang telah banyak membantu selama penelitian, terima kasih atas waktu, cerita, dukungan, kebersamaan, motivasi dan keceriaan yang mampu menghilangkan kepenatanku.

10. Teman-teman seperjuangan di Biokimia, Apriyanti S.Si, Devi, Endah Ratna Sari S.Si, Nina, Ferali, Nurdiana S.Si, Arsepti Wulandari S.Si terima kasih atas semua bantuan, dukungan dan kebersamaannya.

11. Teman-teman 2003 yang tersisa Ria urian, Misbahudinur S.Si , Rido Mirfan S.Si, Ronald, Yan Ricki, dan Septian Eri Sadewo S.Si. Terima kasih untuk semua bantuan dan kebersamaannya.

12. Yeni Anggraini S.Si, Selpi S.Si, Liya S.Si, Fera S.Si, Kiki, Chartika, Mertiana S.Si, Yoanita S.Si, Peni, Karlina A.Md, Oki Osaka, serta teman-teman 2003-2006 Jurusan Kimia FMIPA UNILA terima kasih untuk semua bantuan dan dukungannya.

(53)

13. Teman- teman Kostan “Srikandi”, Reta, Tina, mbak Lupi, terima kasih atas kebersamaan, keceriaan, semangat yang diberikan selama ini.

14. Semua pihak tidak dapat disebutkan satu persatu, terimakasih atas segala bantuan dan dukungannya selama ini.

Semoga Allah SWT membalas segala kebaikan yang telah diberikan. Penulis menyadari tulisan ini jauh dari sempurna, untuk itu masukan-masukan positif sangat diharapkan untuk kemajuan di masa mendatang. Penulis berharap skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua. Amin.

Bandar Lampung, Agustus 2010 Penulis

Evilia Ariyanti