3.6.2. Diagram Alur Penelitian
Gambar 6. Alur Penelitian
Uji Identifikasi Bakteri
Pembiakan bakteri pada masing-masing agar
Perlakuan terhadap bakteri uji
K1
Bakteri diberikan
aquades steril
Kontrol -
K4
Bakteri diberikan
ekstrak daun sirih
dengan konsentra
si 60
K6
Bakteri diberikan
ekstrak daun sirih
dengan konsentra
si 100
K5
Bakteri diberikan
ekstrak daun sirih
dengan konsentra
si 80
K2
Bakteri diberikan
ekstrak daun
sirih dengan
konsentra si 20
K3
Bakteri diberikan
ekstrak daun
sirih dengan
konsentra si 40
K7
Bakteri diberikan
drug of choice
untuk terapi
masing- masing
Kontrol + Staphylococcus aureus
Salmonella typhi
Pengukuran zona hambat pertumbuhan bakteri
Analisis
3.7. Prosedur Penelitian
Penelitian yang dilakukan ini bersifat analitik laboratorik. Dalam penelitian ini, ekstrak daun sirih hijau diencerkan untuk membuat berbagai macam
konsentrasi yang diinginkan didalam tabung reaksi. Setelah terbentuk konsentrasi yang diinginkan, ekstrak daun sirih hijau Piper betle L.
dimasukan kedalam sumuran yang telah dibuat, lalu kemudian diamati zona hambat dari pertumbuhan bakteri Salmonella typhi dan Staphylococcus
aureus. Penelitian ini akan dilakukan pengulangan sebanyak 4 kali.
3.7.1. Persiapan 3.7.1.1. Alat Penelitian
1. Rak dan tabung reaksi
2. Ose
3. Beker glass
4. Pipet
5. Kapas alkohol
6. Cawan Petri
7. Alat pengaduk
8. Autoclave
9. Inkubator
3.7.1.2. Bahan Penelitian
1. Ekstrak daun sirih hijau Piper betle L. yang
diperoleh dari ekstraksi daun sirih hijau. Proses pengekstrakan dilakukan di Laboratorium Kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam FMIPA Universitas Lampung.
2. Bakteri Staphylococcus aureus dan Salmonella typhi.
Bakteri diperoleh dari UPTD Balai Laboratorium Klinik Bandar Lampung.
3. Media agar nutrient agar, lempeng agar darah, Mac-
Conkey, dan MHA Muller Hinton Agar. 4.
Aquades steril.
3.7.2. Sterilisasi Alat
Mensterilisasi alat dan bahan penelitian, kecuali ekstrak temulawak dan suspensi kuman, agar bebas dari pengaruh mikroorganisme lain
yang mungkin
mempengaruhi hasil
penelitian. Sterilisasi
menggunakan autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15-20 menit. Alat- alat ditunggu sampai mencapai suhu kamar dan kering.
3.7.3. Pembuatan Ekstrak Daun Sirih Hijau
Daun sirih hijau dicuci bersih lalu diangin-anginkan, kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 50
o
C sampai kering, kemudian diremas dan dihaluskan sampai menjadi serbuk menggunakan
blender. Ekstrak daun sirih didapatkan dengan menghaluskan 200 gram daun sirih hijau muda, lalu dimaserasi dengan 2L etanol,
selanjutnya disaring untuk diambil filtratnya. Hasil penyaringan dimasukan kedalam rotary evaporator dengan suhu 40
o
C untuk menguapkan bahan pelarut ekstrak, sehingga didapatkan larutan aktif
yang pekat, berwarna coklat, dengan bau khas aromatik larutan stok. Larutan stok ini diencerkan dengan akuades untuk
mendapatkan konsentrasi yang diinginkan yaitu 20, 40, 60, 80, dan 100.
3.7.4. Identifikasi Bakteri Uji
Identifikasi bakteri uji dilakukan dengan pewarnaan dan tes biokimiawi sebagai berikut:
1. Pewarnaan Gram
2. Tes Biokimiawi Bakteri Gram Positif
a. Uji Katalase
Dilakukan tes katalase untuk membedakan Staphylococcus sp. dengan Streptococcus sp. Dengan cara meneteskan
H
2
O
2
pada koloni bakteri yang diambil menggunakan ose dan dipindahkan ke kaca objek. Hasil positif jika terbentuk
busa, menandakan Staphylococcus sp. Hasil negatif apabila tidak terdapat busa, menandakan Streptococcus sp.
b. Uji Koagulase
Dalam tes koagulase suspensi bakteri dicampur dengan plasma kelinci baik pada slide maupun pada tabung.
Fibrinogen pada plasma kelinci diubah menjadi fibrin oleh enzim koagulase. Reaksi positif ditandai dengan
terbentuknya gumpalan. Koagulase merupakan cara sederhana untuk mengidentifikasi Staphylococcus aureus
dilaboratorium klinis mikrobiologi. 3.
Tes Biokimiawi Bakteri Gram Negatif a.
Uji TSIA Triple Sugar Iron Agar Melihat kemampuan bakteri untuk memfermentasikan
gula, menghasilkan gas, dan menghasilkan sulfur. Agar ini mengandung 3 jenis gula, yaitu glukosa, laktosa,
sakarosa. Hasil positif yang menandakan bakteri
memfermentasikan gula adalah terjadi perubahan warna dasar menjadi kuning. Jika bakteri menghasilkan gas,
hasil positif berupa terbentuknya gelembung udara dibagian dasar. Hasil positif yang menandakan baktei
menghasilkan H
2
S adalah perubahan warna kehitaman pada goresan.
b. Uji Simmon’s Citrat Agar
Melihat kemampuan suatu bakteri menggunakan natrium sitrat
sebagai sumber
utama metabolisme
dan pertumbuhan. Positif bila warna berubah menjadi biru
yang artinya timbul warna asam. Hasil negatif bila tidak terjadi perubahan menjadi warna biru.
c. Uji SIM Sulfid Indol Motility
Tujuan uji ini untuk melihat pergerakan bakteri. Hasil positif jika ada pertumbuhan bakteri disekitar tusukan
dengan ose dan menyebar pada media SIM tersebut.
3.7.5. Teknik Pembuatan Suspensi Bakteri
Bakteri strain murni Staphylococcus aureus dan Salmonella typhi dibuat suspensi dengan memasukannya ke nutrient broth untuk
mendapatkan bakteri sebanyak 10
8
CFUml. Kemudian suspensi bakteri diinkubasi di dalam inkubator selama 24 jam.
3.7.6. Teknik Pembuatan Media Agar MHA Muller Hinton Agar
Menimbang 9,5 gram Muller Hinton Agar MHA 38 grl dengan komposisi medium Beef infusion 300 gram, Casamino acid 17,5
gram, Starch 1,5 gram, dan agar, kemudian melarutkan dalam 250 ml akuades lalu dipanaskan sampai mendidih, kemudian disterilkan
dalam autoklaf selama 20 menit dengan tekanan udara 1 atm suhu 121
o
C. Media MHA yang sudah steril, didiamkan sampai kisaran suhu 50-60
o
C, kemudian secara aseptis dicampurkan kultur bakteri Salmonella typhi Media I dan Staphylococcus aureus Media II uji
dengan perbandingan 1:10 bakteri : media. Media yang sudah bercampur bakteri uji dituang kedalam kedalam cawan petri steril
masing-masing 20 ml dan dibiarkan memadat. Media padat yang bercampur bakteri uji, dibuat sumuran dengan menggunakan sedotan
stertil dengan diameter 6 mm.
3.7.7. Uji Diameter Zona Hambat Staphylococcus aureus
dan Salmonella typhi dengan Metode Sumuran
1. Dimasukkan ekstrak daun sirih hijau Piper betle L dengan
konsentrasi 20, 40, 60, 80, dan 100 pada sumuran yang telah dibuat dengan diameter 6 mm pada media I dan II
dengan jarak ± 15 mm sebanyak masing-masing 50 µl. Ainurrochmah et al., 2013
2. Sebagai kontrol positif digunakan Seftriakson untuk bakteri
Salmonella typhi dan Penisilin G untuk bakteri Staphylococcus aureus sebanyak 50 µl.
3. Sebagai kontrol negatif, digunakan aquades steril yang
dimasukan kedalam sumuran sebanyak 50 µl. 4.
Kedua media lalu diinkubasi pada suhu kamar 37
o
C selama 24 jam.
5. Diukur zona hambat yang terbentuk disekitar sumuran dengan
menggunakan penggaris atau jangka sorong. 6.
Prosedur diatas dilakukan pengulangan sebanyak 4 kali.
3.8. Pengolahan dan Analisis Data 3.8.1. Pengolahan Data
Data yang diperoleh kemudian diubah ke dalam bentuk tabel, kemudian data diolah menggunakan program IBM SPSS Statistic 23
for Windows α = 0,05. Proses pengolahan data menggunakan program komputer terdiri dari beberapa langkah, diantaranya;
1. Editting, kegiatan ini berupa pengecekan dan perbaikan data
yang menunjang penelitian. 2.
Coding, mengkonversikan menerjemahkan data yang
dikumpulkan selama penelitian ke dalam simbol yang sesuai untuk keperluan analisis.
3. Data entry, memasukan data kedalam program komputer.
4. Cleaning, pengecekan ulang data dari setiap sumber data atau
responden untuk melihat kemungkinan adanya kesalahan kode, ketidaklengkapan, dan kemudian dilakukan koreksi.
3.8.2. Analisis Data 3.8.2.1. Analisis Univariat
Analisis univariat
bertujuan menjelaskan
atau mendeskripsikan karakteristik tiap variabel penelitian.
Untuk data numerik digunakan nilai mean atau rata-rata, median, dan standar deviasi. Pada umumnya dalam analisis
ini hanya menghasilkan distribusipersebaran dari data yang diperoleh.
3.8.2.2. Analisis Bivariat
Besar sampel penelitian ini 50, maka digunakan uji Shapiro-wilk untuk menguji normalitas data. Distribusi data
normal jika p 0,05 dan jika p 0,05 distribusi data tidak normal. Analisis ini digunakan untuk menganalisis variabel
independen dan dependen, yaitu untuk mengetahui ada tidaknya perbedaan luas zona daya hambat pemberian
ekstrak daun sirih hijau Piper betle L. terhadap pertumbuhan bakteri Salmonella typhi dan Staphylococcus
aureus. Uji statistik yang digunakan adalah Anova satu arah one way Anova dilanjutkan dengan Posthoc. Lalu untuk
membandingkan pengaruh zona hambat antara Salmonella typhi dan Staphylococcus aureus digunakan uji T-test tidak
berpasangan. Interpretasi uji satistik ini, yaitu; 1.
Bila p α 0,05 maka hasil bermaknasignifikan, artinya terdapat hubungan bermakna antara variabel
independen dan dependen, atau hipotesis penelitian diterima.
2. Bila p α 0,05 maka hal ini berarti dua sampel yang
diteliti tidak mendukung adanya perbedaan yang bermakna dan tidak ada pengaruh variabel independen
terhadap dependen, atau hipotesis penelitian ditolak. 3.
Namun jika data penelitian tidak normal, untuk One- way Anova digunakan uji alternatif Kruskal-Wallis
dilanjutkan dengan Mann-Whitney dan untuk T-tes tidak berpasangan digunakan uji alternatif Wilcoxon.
3.9. Ethical Clearance
Penelitian ini sudah diajukan dan disetujui oleh bagian Ethical Clearance dari
Fakultas Kedokteran
Universitas Lampung
dengan nomor
049UN26.8DL2016.
BAB V SIMPULAN DAN SARAN
5.1. Simpulan
Berikut ini adalah simpulan yang didapatkan dari penelitian ini: 1.
Ekstrak etanol daun sirih hijau Piper betle L. memiliki kemampuan menghambat
pertumbuhan bakteri
Salmonella typhi
dan Staphylococcus aureus.
2. Terdapat perbedaan tetapi tidak bermakna secara statistik antara
diameter zona hambat Salmonella typhi dan Staphylococcus aureus yang diberikan ekstrak etanol daun sirih hijau Piper betle L..
3. Zona hambat minimal bakteri Staphylococcus aureus dan Salmonella
typhi terbentuk pada konsentrasi 20 ekstrak etanol daun sirih hijau Piper betle L..
5.2. Saran
1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk menemukan Kadar
Hambat Minimum KHM dan Kadar Bunuh Minimum KBM ekstrak etanol daun sirih hijau Piper betle L. terhadap bakteri
Salmonella typhi dan Staphylococcus aureus dengan menggunakan metode lainnya.
2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap bakteri gram positif
dan negatif lainnya mengenai efek ekstrak etanol daun sirih hijau Piper betle L..
3. Untuk penelitian lebih lanjut dalam menghambat bakteri Salmonella
typhi atau Staphylococcus aureus lebih baik menggunakan ekstrak dari daun lain.
4. Perlu dilakukan penelitian selanjutnya terhadap bakteri Salmonella
typhi dan Staphylococcus aureus dengan menggunakan pelarut yang berbeda.
DAFTAR PUSTAKA
Ainurrochmah A, Ratnasari E, Lisdiana L, 2012. Efektivitas ekstrak daun binahong Anredera cordifolia terhadap Penghambatan Pertumbuhan
Bakteri Shigella flexneri dengan Metode Sumuran. Jurnal LenteraBio, 23: 233–237.
Ariyanti NK, Darmayasa IBG, Sudirga SK, 2012. Daya hambat ekstrak kulit daun lidah buaya Aloe barbadensis Miler terhadap pertumbuhan bakteri
Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Escherichia coli ATCC 25922.
Bennet P, Brown M, Sharma P, 2012. Clinical Pharmacology. London: Elsevier Brooks GF, Carroll KC, Butel JS, Morse SA, 2007. Jawetz, Melnick, Adelberg’s
Medical Microbiology. London: McGraw-Hill Medical. Cita, Y. P, 2011. Bakteri Salmonella typhi dan demam tifoid. Jurnal Kesehatan
Masyarakat September - Maret 2011. 61: 42–46. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2000. Parameter standar umum
ekstrak tumbuhan obat. Direktorat Jendral Pengawas Obat dan Makanan. Jakarta.
Dicky A, 2016. Perbandingan efek pemberian ekstrak temulawak Curcuma xanthorrhiza Roxb terhadap daya hambat pertumbuhan Staphylococcus
aureus dan Escherichia coli secara in vitro. Skripsi Fakultas Kedokteran Universitas Lampung.
Garzoni C, Kelley WL, 2009. Staphylococcus aureus: New evidence for
intracellular persistence. Trends in Microbiology. 217: 59-65 Gordon RJ, Lowy FD, 2008. Pathogenesis of methicillin-resistant Staphylococcus
aureus infection. Clinical Infectious Diseases. 465: 350–9. Harlis, Wahyuni I, 2008. Pengaruh ekstrak daun sirih Piper betle Linn terhadap
pertumbuhan bakteri Streptococcus viridans. Jurnal Ilmiah Pannmed. 11: 11-14.
Hermawan A, Eliyani H, Tyasningsih W, 2007. Pengaruh Ekstrak Daun Sirih Piper betle L Terhadap Pertumbuhan Staphylococcus aureus Dan
Escherichia coli Dengan Metode Difusi Disk. Skripsi. Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga.
Inayatullah S, 2012. Efek Ekstrak Daun Sirih Hijau Piper betle L. Terhadap Pertumbuhan Bakteri Staphylococcus aureus. Skripsi. Universitas Islam
Negeri Syarif Hidayatulah.
Iriano A, 2008. Pengaruh ekstrak tanaman lidah buaya, sirih, dan sereh terhadap perkembangan Porphyromonas gingivalis in vitro perbandingan metode
ekstraksi maserasi dan infundasi. Skripsi Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Indonesia.
Indang N, Guli MM, Alwi M, 2013. Uji Resistensi dan Sensitivitas Bakteri Salmonella thypi Pada Orang Yang Sudah Pernah Menderita Demam Tifoid
Terhadap Antibiotik. Jurrnal Biocelebes. 71: 27–34.
Jawetz, Melnick, Adelberg, 2012. Jawetz, Melnick, and Adelberg’s medical Microbiology Edisi 25. Jakarta.
Kusuma RBBE, 2010. Pengaruh daya antibakteri ekstrak daun sirih Piper betle L. terhadap
Streptococcus mutans. Skripsi. Fakultas Kedokteran
Universitas Sebelas Maret. Mickel AK, Sharma P, Chogle S, 2003. Effectiveness of stannous fluoride and
calcium hydroxide against Enterococcus faecalis. J. Endod. 294: 256-60. Miller LG, Kaplan SL,
2009. Staphylococcus aureus: A Community
Pathogen. Infectious Disease Clinics of North America. 123: 35-52. Moeljanto RD, 2003. Khasiat dan Manfaat Daun Sirih: Obat mujarab dari Masa
ke Masa. Jakarta: Agromedia Pustaka. Muhlisah F, 2007. Tanaman Obat Keluarga Toga. Penebar Swadaya: Jakarta
Mujahid R., Nita, S. 2008. Maserasi Sebagai Alternatif Ekstraksi Pada Penetapan Kadar Kurkuminoid Simplisia Temulawak Curcuma xanthorriza
Roxb, 18–23.
Diakses pada:
http:publikasiilmiah.unwahas.ac.id index.phpilmuFarmasidanklinikarticleview374479.
Ngaisah S, 2010. Identifikasi dan uji aktivitas antibakteri minyak atsiri daun sirih merah Piper crocatum Ruiz Pav. asal Magelang. Skripsi Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret.
Notoatmodjo S, 2010. Metode Penelitian Kesehatan. Rineka Cipta: Jakarta.