kira 3 x sehari. Setelah 2 hari maserat disaring dengan kertas saring, kemudian ditampung. Maserat yang terkumpul kemudian dipekatkan di atas waterbath dengan
suhu 60-65
o
C, dibantu dengan kipas angin sampai kental.
4. Sterilisasi alat dan bahan
Alat–alat gelas yang akan digunakan dalam keadaan steril, dicuci sampai bersih dan dikeringkan dalam oven. Setelah kering, alat-alat tersebut dibungkus
dengan kertas payung, kemudian di sterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121
o
C selama 20 menit dengan tekanan 2,05 abs bar Hagman, 2005. 5.
Pembuatan medium pencuci dan medium penumbuh
a. Pembuatan medium pencuci Media RPMI 1640 dilarutkan dalam aquabidest kurang lebih 80 ml,
ditambah 2,3 g natrium bikarbonat, 2 g Hepes, diencerkan sampai 100
ml. Larutan selanjutnya dihomogenkan dengan magnetic stirrer, kemudian di buffer dengan HCL
1 N hingga pH nya 7,2 sampai 7,4 dengan pH meter. Selanjutnya larutan disterilkan dengan penyaringan menggunakan membran filter polietilensulfon steril berdiameter
0,22 µm secara aseptis. Medium disimpan dalam almari es pada suhu 4
o
C Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979., Sambrook et al, 1989.
b. Pembuatan medium penumbuh Untuk medium RPMI 1640-serum, ditambahkan FBS Fetal Bovine Serum
10, penisilin-streptomisin 1 dan fungison 0,5 dalam medium RPMI 1640 dan disterilkan dengan filter polietilensulfon berdiameter 0,22 µm. Media disimpan dalam
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
almari es pada suhu 4
o
C Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook, Fritsch dan Maniatis, 1989.
6. Preparasi sel SiHa
a. Propagasi sel SiHa Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam
penangas air 37
o
C, kemudian ampul disemprotkan dengan etanol 70. Ampul dibuka dan sel SiHa dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi medium RPMI
1640. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti dengan medium RPMI yang baru, kemudian disuspensikan pelan-pelan. Suspensi sel
disentrifugasi kembali selama 5 menit. Supernatan dibuang, pelet sel ditambahkan 1 ml medium penumbuh yang mengandung 10 FBS. Resuspensikan secara perlahan
sampai homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37
o
C dengan aliran 5 CO
2
. Setelah 24 jam, medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya
cukup untuk penelitian lebih lanjut Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989.
b. Panen sel SiHa Setelah jumlah sel cukup kurang lebih setelah berumur 7 hari, media
diganti dengan RPMI 1640 baru sebanyak 5 ml kemudian sel dilepaskan dari dinding flask
dengan cara diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel dipindahkan dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI sampai volume 10 ml
dan disentrifugasi 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet sel
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian dihitung menggunakan haemocytometer
. Suspensi sel ditambah sejumlah medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 2,0x10
4
sel100 µl dan siap dipakai untuk penelitian lebih lanjut Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989.
7. Pembuatan larutan uji
