Gambar 9. Proses maserasi Gambar 10. Proses perkolasi
Gambar 11.V accum Rotavapor
3.5.3.2 Pengenceran Bahan Coba
Ekstrakdaun Afrika Vernonia amygdalinadalam etanol ditimbang
menggunakan electronic balance dan massanya disesuaikan dengan konsentrasi yang diinginkan dengan cara dilarutkan dengan media Trypticase Soy Broth TSB.
Disediakan 6 buah tabung, pada masing-masing tabung diisi 1 ml TSB. Pada tabung pertama diisi 1 gram ekstrak kental daun Afrikakemudian divorteks sehingga
diperoleh ekstrak daun Afrika dengan konsentrasi 100. Kemudian dilakukan pengenceran dengan cara pengambilan ½ dari ekstrak daun Afrika konsentrasi 100
menggunakan mikropipet dan diletakkan pada tabung ke-2 untuk mendapatkan ekstrak daun Afrika konsentrasi 50 pengenceran ganda. Demikian seterusnya
Universitas Sumatera Utara
sampai tabung ke-6 sehingga dihasilkan konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25, dan 3,125. Beri label pada setiap label sesuai konsentrasinya.
3.5.3.3. Pembuatan Media Bakteri
Sebelum spesimen dibiakkan, terlebih dahulu dibuat media Trypticase Soy Agar, sebanyak 12 gram TSA dilarutkan dalam 250 ml akuades kemudian
dituangkan ke dalam petri 20mlpetri lalu media disterilkan dalam autoklaf selama 15 menit dengan tekanan 2 atm dan suhu 121
o
C. kemudian media dimasukkan ke dalam inkubator selama 24 jam untuk melihat apakah ada kontaminasi bakteri atau
tidak. Jika steril, media sudah dapat digunakan untuk membiakkan specimen.
3.5.3.4 Pembuatan Suspensi Bakteri
Fusobacterium nucleatum yang digunakan adalah spesimen stem sel Fusobacterium nucleatum ATCC 25586 yang dibiakkan secara murni pada media
TSA dalam suasana anaerob hingga didapatkan pertumbuhan yang sehat yang berarti bahwa bakteri tumbuh subur. Ambil beberapa koloni bakteri dengan ose steril lalu
diencerkan dengan larutan NaCl 0,9 hingga konsentrasi 10
8
CFUml atau setara dengan 0.5 Mc Farland.
3.5.3.5 Penentuan KHM Bahan Coba
Bahan coba ekstrak daun Afrika Vernonia amygdalina yang digunakan terdiri dari konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25, dan 3,125. Dari masing-
masing konsentrasi tersebut, diambil 1 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu tambahkan 1 ml suspensi bakteri dengan menggunakan mikropipet ke dalam
masing-masing tabung bahan coba tersebut kemudian dicampur dengan vortex, lalu diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam pada inkubator CO
2
. Kemudian amati perubahan kekeruhan yang terjadi dengan membandingkan tabung-tabung tersebut
dengan kontrol Mc Farland untuk menentukan nilai KHM dari masing-masing bahan
Universitas Sumatera Utara
coba. Tabung dengan kekeruhan yang mulai tampak jernih untuk setiap kelompok perlakuan merupakan konsentrasi minimal ekstrak yang mampu menghambat
pertumbuhanFusobacterium nucleatum dalam media pembenihan setelah diinkubasi 24 jam dan diamati secara visual.
3.5.3.6Penentuan KBM Bahan Coba
Hasil prosedur penentuan nilai KHM tidak terlihat larutan yang mulai tampak jernih sehingga semua kelompok larutan dilanjutkan dengan penghitungan jumlah
koloni bakteri yaitu pada konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25, dan 3,125 dengan metode Drop Plates Miles Mesra. Setelah itu, bahan coba dengan konsentrasi
tersebut masing-masing divorteks dan diambil 50 µl untuk tiap konsentrasi lalu
diteteskan ke dalam media padat TSA Trypticase Soy Agar, direplikasi sebanyak 4 petri, didiamkan selama 15-20 menit sampai mengering dan diinkubasi dalam
inkubator CO
2
dengan suhu 37
o
C selama 24 jam dan media padat akan tumbuh menjadi 1 koloni bakteri. Dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri untuk
mendapatkan nilai KBM dengan bantuan kaca pembesar. Perhitungannya adalah bila bentuk koloni melebar dianggap berasal dari 1 koloni, bila bentuknya 2 koloni
bersinggungan dianggap sebagai 2 koloni. Setelah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, kemudian
dibuat jumlah rata-ratanya dan dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali. Oleh karena itu konsentrasi yang dilakukan perhitungan jumlah koloni
bakteri merupakan konsentrasi awal sebelum dilakukan dilusi maka faktor pengenceran x 1. Selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri
pada media padat sebanyak 50 µl, maka hasil perhitungan harus dikali dengan faktor
pengali 20 untuk mendapatkan hasil standar CFUml.
Universitas Sumatera Utara
3.6Pengolahan dan Analisis Data
Data dari setiap pemeriksaan dianalisis dengan memakai uji statistik yaitu uji analisis varians satu arah ANOVA untuk mengetahui daya antibakteri ekstrak etanol
daun Afrika Vernonia amygdalina terhadap pertumbuhan Fusobacterium nucleatum.Namun, pada penelitian ini data dari setiap pemeriksaan tidak dapat
dilakukan uji statistik oleh karena hasil yang diperoleh adalah 0 dan TBUD.
Universitas Sumatera Utara
BAB 4 HASIL PENELITIAN
4.1 Ekstrak Etanol Daun Afrika Vernonia amygdalina
