BAB VI
KESIMPULAN DAN SARAN
6.1 Kesimpulan
1. Enzim selulase yang dihasillkan Bacillus sp. BPPT CC RK2 dapat
melakukan sakarifikasi limbah pengolahan kertas. Konsentrasi enzim dan substrat mempengaruhi persen sakarifikasi. Persen sakarifikasi tidak
berbanding lurus dengan peningkatan konsentrasi enzim dan substrat.
2. Berdasarkan analisa dengan kromatografi lapis tipis, jenis gula yang
dihasilkan dari proses sakarifikasi limbah pengolahan kertas dengan menggunakan enzim selulase dari Bacillus sp BPPT CC RK2 diperkirakan
adalah maltosa.
6.2 Saran
1. Perlu dilakukan optimasi konsentrasi enzim dan substrat untuk
menghasilkan persen sakarifikasi yang maksimum.
2. Perlu dilakukan optimasi waktu sakarifikasi untuk menghasilkan persen
sakarifikasi yang maksimum.
3. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengkarakterisasi produk
yang dihasilkan.
DAFTAR PUSTAKA
Abun. 2006. Bioproses Limbah Udang Windu Melalui Tahapan Deproteinasi Dan Demineralisasi Terhadap Protein Dan Mineral Terlarut. Fakultas Peternakan
Universitas Padjajaran: Bandung Adhiyanto,C. 2006. Pemanfaatan Tentang Enzim dan Manfaatnya dalam Bidang
Biomedik. UIN Jakarta Press : Jakarta hal 1, hal 115-120. Anindyawati, Trisanti. 2010. Potensi selulase dalam Mendegradasi Lignoselulosa
Limbah Pertanian untuk Pupuk Organik. Berita Selulosa, Vol. 45, No. 2, Desember : 70
– 77 Ariffin, H., Abdullah, N., Kalsom, M.S., Shirai,Y and Hassan, M.A. 2006.
Production and Characterisation of Cellulase by Bacillus Pumilus Eb3. International Journal of Engineering, 31, pp.47-53.
Bakti, C. P. 2011. Optimasi Produksi Enzim Selulase Dari Bacillus sp. BPPT CC RK2 dengan Variasi pH dan Suhu Menggunakan Response Surface Methodology.
Universitas Indonesia: Depok Begum S.F., Savitha, C., Jaison, J.P. 2012. Utilization of Banana Waste for
Effective Production of Cellulase by Rhizopus Sp. Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. Volume 3 issue 1.p 674-
683
Bradford, M. 1976. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye
Binding. Analytical Biochemistry 72, p 248-254 Brodeur, G., Yau, E., Badal, K., Collier, J., Ramachandran, K.B and
Ramakhrisnan, S. 2011. Chemical and Physicochemical Pretreatment of Lignocellulosic Biomass: A Review. SAGE - Hindawi Access to Research
Enzyme Research. p 1-17
Brown, R.M. Jr. 1996. The biosynthesis of cellulose. J. Macromol. Sci. Pure Appl. Chem. A33. P 1345-1373. In Saxena, I.M and Brown, R.M.Jr. 2008.
Biochemistry and Molecular Biology of Cellulose Biosynthesis in Plants: Prospects for Genetic Engineering. Advances in Plant Biochemistry and
molecular Biology, Volume 1. Elsevier
Chen, T and Ramos, J. 2010. Enzyme Kinetics [application of uv-vis spectrometry].
Cheng, C. Sung, C. Hsieh, P.H. 2010. On-line desalting and carbohydrate analysis for immobilized enzyme hydrolysis of waste cellulosic biomass by
column-switching high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A, 1217 2010 P. 2104
–2110 Chisti, Y. 1999. Fermentation Industrial Basic Consideration.p 663-674 dalam
Encyclopedia of Food Microbiology, Robinson, R, Batt dan Patal, P. Academic Press: London
Chojnacka, K. 2006. Fermentation Product. Chemical Engineering and Chemical Process Technology Vol V dalam Encyclopedia of Life Support Systems
EOLSS. Dashtban, M., Maki, M., Leung, Kam Tin., Mao, C., Qin, W.2010. Cellulase
Activities in Biomass Convertion: Measurement Methods and Comparison. Critical Reviews in Biotechnology.Informa Health Care. P 1-8
Demers, A., Doane, R., Guzman, S., Pagano, R. 2009. Enzymatic Hydrolysis of Cellulosic
Biomass for
the Production
of Second
Generation Biofuels.Worcester Polytechnic Institute. P 1-29
Bai, S. Kumar, M.R. Kumar, D.J. Mukesh. Balashanmugam, P. Balakumaran, M.D. Kalaichelvan, P.T. 2012. Cellulase Production by Bacillus subtilis
isolated from Cow Dung. Archives of Applied Science Research, 2012, 4 1:269-279
El-Safey. M. 2006. Introduction to Bacterial taxonomy.
Fengel, D. and G. Wegener. 1984. Wood: Chemistry, Ultrastructure, Reactions. Walter de Gruyter Co., Berlin dalam
Hermiati, E. 2010. Pemanfaatan biomassa lignoselulosa ampas tebu untuk produksi bioetanol. Jurnal Litbang
Pertanian, 294, Hal 121-130
Galbe, M and Zacchi, G. 2002. A Review of the Production of Ethanol from
Softwood. Appl Microbiol Biotechnol 2002 59:618 –628
Ghose, T.K. 1987. Measurement of Cellulase Activities. Pure Appl. Chem., Vol. 59, No. 2, P. 257
—268 Ghosh, B and Ray, R.R. 2010. Saccharification of Raw Native Starches by
Extracellular Isoamylase of Rhyzopus Oryzae. Biotechnology:9 2 P 224- 228.
Gusakov, A.V., Kondratyeva, E.G., Sinitsyn, A.P. 2011. Comparison of Two Methods for Assaying Reducing Sugars in the Determination of
Carbohydrase Activities. Hindawi Publishing Corporation International Journal of Analytical Chemistry. Volume 2011
Haldane, J.B.S. 1930. Enzymes. University College: London
Handbook of Pharmaceutical Excipients. –5th ed. 2006. edited by Raymond C.
Rowe, Paul J. Sheskey, Siaˆn C. Owen. Pharmaceutical Press. American Pharmacists Association. P 744
Hidayat, N dan Suhartini S. 2010. Mikrobiologi Industri. Jurusan Teknologi Industri Pertanian. Universitas Brawijaya Malang
Gandjar, I.G dan Rohman, A . 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar. Hal 378-388
Karmakar, M and Ray, R.R. 2011. Saccharification of agro wastes by the Endoglucanase of Rhizopus oryzae. Annals of Biological Research, 2011, 2
1 : P 201-208 Kondo T., Kasai, W., and Brown, R. M. Jr. 2004. Formation of Nematic Ordered
Cellulose and Chitin. Cellulose 11, P 463- 474 in Saxena, I.M and Brown, R.M.Jr. 2008. Biochemistry and Molecular Biology of Cellulose Biosynthesis
in Plants: Prospects for Genetic Engineering. Advances in Plant Biochemistry and molecular Biology, Volume 1. Elsevier
Kristensen, JB. 2009. Enzymatic hydrolysis of lignocellulose Substrate interactions and high solids loadings. Forest and Landscape Research
Kumar, P., Barret, D.M., Delwiche, M.J and Stroeve,P. 2009. Methods for Pretreatment of Lignocellulosic Biomass for Efficient Hydrolysis and Biofuel
Production. Ind. Eng. Chem. Res., Vol. xxx, No. xx, XXXX Laser, M., Schulman, D., Allen, S., Lichwa, J., Antal, M., and Lynd, L. 2002. A
Comparison of Liquid Hot Water and Steam Pretreatment of Sugarcane Bagasse for Bioconversion to Ethanol. Bioresource Technology, 81. 33-44. In
Thakur, I,S. and Nakagoshi, N. 2011. Production of Biofuels from Lignocellulosic Biomass in Pulp and Paper Mill Effluent for Low Carbon
Society. Journal of International Development and Cooperation, Vol 18,No. I.P 1-12
Lin,Y and Tanaka, S. 2006. Ethanol fermentation from biomass resources: current state and prospects. Applied Microbiology and Biotechnology.
696:627-642 in Abdel-Rahman, M.A. Tashiro, Y. Sonomoto, K. 2011. Lactic acid production from lignocellulose-derived sugars using lactic acid
bacteria: Overview and limits. Journal of Biotechnology 156 2011 pp 286 –
301 Lo, Yun-Chung., Saratale, G.D., Chen, Wen-Ming., Bai, Ming-Der., Chang, Jo-
Shu. 2009. Isolation of cellulose-hydrolytic bacteria and applications of the cellulolytic enzymes for cellulosic biohydrogen production. Enzyme and
Microbial Technology 44 2009 417 –425
Maki,M., Leung K,T., Qin, W. 2009. The prospects of cellulase-producing bacteria for the bioconversion of lignocellulosic biomass. International
Journal of Biological Sciences 2009; 55:500-516 Marssada, Agung. 2011. Optimasi Produksi Selulase Dari Bacillus sp. Bppt CC RK 2
Menggunakan Metode Respon Permukaan dengan Variasi Rasio CN Dan Waktu Fermentasi. Universitas Indonesia.
Miller, G.L., 1959. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Analytical Chemistry, 313, pp.426-428.
Mosier, N., Wyman, C., Dale, B., Elander, R., Lee, Y.Y., Holtzapple and Ladisch, M. 2005. Features of promising technologies for pretreatment of
lignocellulosic biomass. Bioresource Technology 96 2005 P 673 –686
Mrudula, S and Murugammal, R. 2011. Production of cellulase by Aspergillus niger under submerged and solid state fermentation using coir waste as a
substrate. Brazilian Journal of Microbiology.2011. 42. P 1119-1127 Mussatto, S.I. and Teixeira, J.A., 2010. Lignocellulose as raw material in
fermentation processes. Applied Microbiology and Microbial Biotechnology, P.897-907.
Nigam,P.S., Gupta, N., Anthwal, A. 2009. Pre-treatment of Agro-Industrial Residues in Biotechnology for Agro-Industrial Residues Utilisation. Springer.
P.16 Octavia, S. Soerawidjaja, T.H., Purwadi, R., Putrawan, I.D.G Arsa. 2011.
Pengolahan Awal Lignoselulosa Menggunakan Amoniak untuk Meningkatkan Perolehan Gula Fermentasi. Prosiding Seminar Nasional Teknik Kimia,
“Pengembangan Teknologi Kimia untuk Pengolahan Sumber Daya Alam Indonesia”. Yogyakarta. ISSN 1693-4393
OSullivan, A. C. 1997. Cellulose: The Structure Slowly Unravels. Cellulose ,4. 173-207. In Saxena, I.M and Brown, R.M. Jr. 2008. Biochemistry and
Molecular Biology of Cellulose Biosynthesis in Plants: Prospects for Genetic Engineering. Advances in Plant Biochemistry and molecular Biology,
Volume 1. Elsevier
Prasetyo, J., Kato, T., and Park Enoch.Y. 2010 Efficient Cellulase-Catalyzed Saccharification of Untreated Paper Sludge Targeting for Biorefinery.
Biomass and Bioenergy 34 2010. P 1906-1913 Ramanathan, T., Ahmad, A., Ahmad, A.S., Kalimutho, M. 2011. Taxonomical
Identity and Polysaccharide Produced by Bacillus Species Isolated From Old Aged Medicinal Decoctions. Journal of Sustainability Science and
Management Volume 6 Number 1, June 2011: P 2-9
Sadikin, Mohamad. 2002. Biokimia Enzim. Widya Medika: Jakarta Schallmey, M., Singh, A., Ward.O,P. 2004. Development in the Use of Bacillus
spesies for Industrial Production. Can. J. Microbiol. Vol 50 p 1-17 Scopes, Robert. 2002. Enzyme Activity and Assays. Encyclopedia of Life Sciences
Stahl, Egon. 1985. Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopis.
Terjemahan dari :Drug Analysis by Chromatography and Microscopy : a Practical Supplement to Pharmacopoias. Kosasih Padmawinata dan Iwang
Sudiro. Penerbit ITB Bandung
Sukumaran, R.K., Singhania, R.R. and Pandey, A. 2005. Microbial Cellulases - Production, Applications and Challenges. Journal Scientific Industrial
Research, 64 November, pp.832-844. Sun,Ye and Cheng, Jiayang. 2002. Hydrolysis of Lignocellulosic Materials for
Ethanol Production : a Review. Bioresource Technology 83 p 1-11 Tewari, Rupinder. 2007.
Food and Industrial Microbiology. Department of Biotechnology Panjab University
Thakur, I.S. and Nakagoshi, N. 2011. Production of Biofuels from Lignocellulosic Biomass in Pulp and Paper Mill Effluent for Low Carbon Society. Journal of
International Development and Cooperation, Vol 18,No. I.P 1-12 Toledo,V.D.A.A.D., Takasusuki, M.C.C.R., Oliveira, A.J.B.D., Chambo, E.D and
Lopes, S.M.S. 2012. Spectrophotometry as a Tool for Dosage Sugars in Nectar of Crops Pollinated by Honeybees. Dalam Macro To Nano
Spectroscopy Edited by Dr. Jamal Uddin. Intech. p 269-290
Vollhardt, P and Schore, N. 2009. Organic chemistry : structure and function ,6th ed. W. H. Freeman and Company: USA. P 1117
Vynios, D.H., Papaioannon, D.A., Filos,G., Karigiannis, G., Tziala, T., Lagios, G. 2009. Enzymatic Production of Glucose From Waste Paper. Bioresources 4
2 p 509-521 Yin, L.-J. et al., 2010. Purification and Characterization of a Cellulase from
Bacillus subtilis YJ1. Journal of Marine Science and Technology, Vol. 18, No. 3, pp. 466-471 2010
Zhang , P.Y.H., Himmel M.E., and Mielenz J.R. 2006. Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies. Biotechnology Advances
24 2006 452 –481
http: invivo.flocruz.brcelloficina.htm . Gambar bakteri Bacillus sp. Diunduh pada tanggal 15 September 2012
http:www.ncbi.nlm.nih.govbooksNBK7699bacillus
.
Turnbull, Peter CB. 1996. Medical Microbiology. 4th edition. Editor Baron S, Galveston TX:
University of Texas Medical Branch at Galveston diunduh pada tanggal 15 September 2012
LAMPIRAN
Lampiran 1
Cara pembuatan reagen No.
Nama Reagen dan buffer Cara pembuatan
1. Natrium Hidroksida 1 N
Sebanyak 4
gram natrium
hidroksida dilarutkan dalam aquades hingga tepat 100 mL
2. Natrium Hidroksida 5 N
Sebanyak 20 gram natrium hidroksida dilarutkan dalam aquades hingga tepat 100
mL.
3. Buffer Phosfat 0,1 M pH 7
Larutan A= Sebanyak 2,78 gram NaHPO
4
dilarutkan dalam aquades hingga tepat 100 mL.
Larutan B
= Sebanyak
3,56 gram
Na
2
HPO
4
.2H
2
O dilarutkan dalam aquades hingga tepat 100 mL.
19,5 ml Larutan A dicampurkan dengan 30,5 ml larutan B dilarutkan dalam aquades hingga
tepat 100 mL. pH 7
4. Buffer Phosfat 0,05 M pH
7 Sebanyak 50 ml Buffer Phosfat 0,1 M dipipet
kemudian ditambahkan aquadest hingga tepat 100 ml
5. CMC 1 dalam Buffer
Phosfat 0,05 M pH 7 Sebanyak 1 gram CMC dilarutkan dalam 10
ml Buffer Phosfat 0,05 M pH 7 6.
Pereaksi DNS Larutan A = Sebanyak 10 gram dinitrosalisilat
acid ditambah 10 gram natrium hidroksida dan 2 gram fenol kemudian dilarutkan dalam
MiliQ hingga tepat 250 mL. Larutan B= Sebanyak 200 g Natrium Kalium
Tartrat ditambahkan 0,5 gram natrium sulfit kemudian dilarutkan dalam MiliQ hingga
tepat 250 mL. Larutan A dicampurkan dengan larutan B
kemudian ditambahkan miliQ hingga tepat 1000 ml
7. Asam sulfat 0,005 N
Sebanyak 0,140 mL asam sulfat dicampurkan dalam aquades hingga tepat 1000 mL.
8. Asam sulfat 10 dalam
metanol Sebanyak 2 ml asam sulfat ditambahkan 18 ml
metanol hingga tepat 20 ml 9.
Pereaksi Bradford Sebanyak 100 mg Coomassie Blue G-250
dilarutkan dalam 50 ml ethanol 95. Larutan ini kemudian dicampurkan dengan 100 ml
asam fosfat 85 dan diencerkan sampai volume 1 L dengan aquadest. Konsentrasi
akhir reagent ini 0.01 Coomassie Brilliant Blue G-250, 4.7 ethanol, dan 8.5 asam
fosfat
Lampiran 2.
Pembuatan medium No.
Nama medium Cara Pembuatan
1. Medium Luria Bertani
Sebanyak 0,5 gram natrium klorida, 0,5 yeast extract dan 1 gram pepton dilarutkan
dalam volume tertentu aquades, diatur pH sampai 7,0, lalu dicukupkan hingga tepat
100 mL.
2. Medium
Luria Bertani
agar Sebanyak 0,5 gram natrium klorida, 0,5
yeast extract dan 1 gram pepton dilarutkan dalam volume tertentu aquades, diatur pH
sampai 7,0,ditambahkan 2 gram agar, diaduk hingga homogen, lalu dicukupkan
hingga tepat 100 mL.
3. Medium
Luria Bertani+Dedak Padi 40
+ Air kelapa 20 Sebanyak 2,5 gram natrium klorida, 100 ml
air kelapa, 5 gram pepton, dan 200 gram dedak padi dilarutkan dalam volume
tertentu aquades, diatur pH sampai 7,0, diaduk hingga homogen, lalu dicukupkan
hingga tepat 500 mL
Pembuatan Media Pembuatan Media Kultivasi Bakteri
Media kultivasi yang digunakan adalah Luria Bertani LB cair dengan komposisi per liter yaitu, 10g pepton, 5g ekstrak khamir, dan 5g NaCl. LB
ditambahkan dengan 1 Selulosa. Media dilarutkan dengan akuades. Kemudian media disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121
o
C dan tekanan 1,2 atm selama 15 menit.
Proses Penyiapan Stok Kultur
Isolat Bacillus sp. BPPT CC RK2 diinokulasikan sebanyak 1-2 ose ke dalam media LB agar dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Isolat ini digunakan sebagai stok kultur penelitian.
Pembuatan Media Produksi Enzim
Media produksi dibuat sebanyak 500 ml. Media produksi mengandung 40 dedak beras sebagai sumber karbon dan air kelapa 20 sebagai sumber
nitrogen. Media dilarutkan dengan volum tertentu akuades, diatur pH sampai 7,0. Ditambahkan hingga volume akuades tepat 500 mL. Kemudian media disterilisasi
dalam autoklaf pada suhu 121°C dan tekanan 1,2 atm selama 15 menit Marsadda, 2011.
Pembuatan Starter
Media starter dibuat dengan menginokulasikan sebanyak 1-2 ose isolat Bacillus sp.ke dalam media LB standar 10 media produksi, kemudian
diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 6 jam dengan agitasi 150 rpm. Produksi Enzim
Selulase
Produksi enzim selulase dilakukan dengan menginokulasikan media starter ke dalam media produksi, dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam dengan agitasi 150 rpm. Setelah 24 jam, enzim disentrifugasi pada agitasi 6000 rpm
selama 15 menit pada suhu 4
o
C. Kemudian diambil supernatannya sebagai fraksi enzim selulase kasar. Enzim selulase kasar tersebut kemudian dianalisis kadar
protein dan aktivitas enzimnya
Lampiran 3 Pembuatan Kurva Standar Glukosa dan Kurva Standar BSA
Pembuatan Kurva Standar Glukosa
Pembuatan kurva standar glukosa dilakukan dengan membuat variasi konsentrasi standar glukosa sebagai berikut: 0; 0,04; 0,08; 0,12; 0,16; 0,20; 0,20;
0,24; 0,28; 0,32 mgml Glukosa tersebut dilarutkan dalam larutan buffer fosfat 0,05 M, pH 7.0.
Kandungan glukosa dalam larutan tersebut diuji dengan metode DNS Miller,1959. Kurva standar glukosa adalah grafik hubungan konsentrasi glukosa
dengan nilai absorbansi pada panjang gelombang 540 nm.
Pembuatan Kurva Standar BSA
Pembuatan kurva standar BSA dilakukan dengan membuat variasi konsentrasi standar BSA sebagai berikut : 0; 0,03; 0,06; 0,09; 0,12; 0,15; 0,18;
0,21; 0,24 mgml. BSA dilarutkan dalam mili-Q-water ddH
2
O. Kandungan protein pada larutan yang dibuat diuji dengan metode Bradford. .Konsentrasi analit berfungsi
sebagai sumbu X pada grafik dan absorbansi sebagai sumbu Y, sehingga akan diperoleh suatu garis linear dengan gradien tertentu.
Bouvine Serum Albumin BSA mengandung 1mgmL protein dalam buffer phosfat 0,05 M pH 7.0.
Lampiran 4 Kurva Standar Glukosa
Cmgml Absorbansi 0,04
0,1465 0,08
0,297 0,12
0,4475 0,16
0,4965 0,2
0,6455 0,24
0,6775 0,28
0,808 0,32
0,951
y = 3,0178x R² = 0,9782
0,2 0,4
0,6 0,8
1 1,2
0,05 0,1
0,15 0,2
0,25 0,3
a bs
o rba
ns i
konsentrasi mgml
Kurva Standar Glukosa
Lampiran 5 Kurva Standar BSA
Cmgml Absorbansi 0,03
0,156 0,06
0,3185 0,09
0,37 0,12
0,5415 0,15
0,6505 0,18
0,728 0,21
0,8865 0,24
0,965
y = 4,1855x R² = 0,9886
0,2 0,4
0,6 0,8
1 1,2
0,05 0,1
0,15 0,2
Abs o
rba ns
i
Kadar protein mgml
Kurva Standar BSA
Lampiran 6 Metoda Pengujian Aktivitas Enzim Selulase dan Kadar Protein
Kategori