Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah [Piper crocatum Ruiz & Pav] terhadap kultur sel mieloma - USD Repository

  UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOLIK DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav.) TERHADAP KULTUR SEL MIELOMA

  SKRIPSI Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

  Program Studi Ilmu Farmasi Oleh:

  Meri NIM : 048114141

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2008

  i  

  UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOLIK DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav.) TERHADAP KULTUR SEL MIELOMA

  SKRIPSI Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

  Program Studi Ilmu Farmasi Oleh:

  Meri NIM : 048114141

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2008

  

ii   iii  

iv  

HALAMAN PERSEMBAHAN

  Untuk berguna bagi orang lain, pikiran harus terwujud

dalam tindakan.. Tidak ada tempat bagi kemalasan, yang ada

hanyalah karya yang baik tanpa henti

(At The Feet of Master)

  Kupersembahkan karya ini untuk Papa dan mamaku tercinta, atas kasih sayang, doa dan dukungan yang terus menyertaiku. Kakak-kakakku terkasih, Edy, Lina dan Hendry Teman-teman dan Almamaterku

v

 

  

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN

PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

  Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma : Nama : Meri Nomor Mahasiswa : 048114141

  Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :

  

“Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper Crocatum Ruiz &

Pav) terhadap Kultur Sel Mieloma”

  beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, me- ngalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis. Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.

  Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal : 21 Juli 2008 Yang menyatakan, ( Meri)

  

vi

 

  

vii

 

PRAKATA

  Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala anugerah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) terhadap Kultur Sel Mieloma”. Skripsi ini dibuat untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) pada Program Studi Farmasi di Universitas Sanata Dharma.

  Penulisan skripsi ini tidak mungkin terselesaikan tanpa adanya bimbingan, bantuan dan dukungan dari berbagai pihak, maka pada kesempatan ini, penulis mengucapkan terima kasih kepada:

  1. Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah banyak meluangkan waktu, tenaga dan atas segala masukan serta sarannya dalam penyusunan skripsi ini.

  2. Drs. A. Yuswanto S.U., Ph.D., Apt., selaku dosen pembimbing yang telah banyak meluangkan waktu, tenaga dan atas segala masukan serta sarannya dalam penyusunan skripsi ini.

  3. Drs. Mulyono, Apt., selaku dosen penguji yang telah berkenan menguji dan memberikan banyak masukan dan saran.

  4. Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku dosen penguji yang telah berkenan menguji dan memberikan banyak masukan dan saran.

  5. Ign. Y Kristyo B, M.Si., yang telah memberikan banyak masukan dalam identifikasi dan determinasi tumbuhan.

  

viii

 

  6. Drs. P. Sunu Hardiyanta, S.J., M.Sc., yang telah memberikan masukan dan saran dalam pengolahan statistik.

  7. Jeffry Julianus, M.Si., yang telah memberikan banyak masukan dalam uji sitotoksisitas.

  8. Segenap dosen dan karyawan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, terima kasih atas bantuannya selama ini.

  9. Mbak Yuli dan segenap karyawan Laboratorium Hayati UGM yang telah banyak membantu dalam penelitian skripsi ini.

  10. Orang tua dan kakak-kakakku tercinta, atas segala dukungan dan doa yang selalu menyertaiku.

  11. Chong, kekasihku tercinta, atas segala dukungan dan kasih sayang yang diberikan selama penyusunan skripsi ini.

  12. Siska, Nur’aniyah, Ririt dan Eva, atas kerjasama, canda tawa, dan keluh kesah selama penyusunan skripsi ini.

  13. Limdrawati, Fenny Octarina dan semua teman-teman angkatan 2004, terima kasih atas segala semangat dan kebersamaan kita yang indah.

  14. Semua pihak yang telah banyak membantu penyusunan skripsi ini.

  Atas segala bantuan yang telah diberikan selama ini, penulis mengucapkan banyak terima kasih. Penulis juga menyadari bahwa penulisan skripsi ini tidak terlepas dari kekurangan-kekurangan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat konstruktif demi penyempurnaan skripsi ini. Skripsi ini diharapkan dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan.

  Penulis

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

  Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

  Yogyakarta, 09 Mei 2008 Penulis,

  Meri

  

ix

 

  

INTISARI

Penggunaan obat tradisional di masyarakat telah berkembang semakin pesat.

  Daun sirih merah secara empiris memiliki banyak khasiat, salah satunya sebagai antikanker. Akan tetapi, belum ada penelitian yang membuktikan bahwa daun sirih merah memiliki aktivitas sebagai antikanker. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki efek sitotoksik terhadap kultur sel mieloma.

  Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola searah. Uji sitotoksisitas dilakukan dengan menghitung jumlah kultur sel mieloma pada kelompok kontrol dan kelompok perlakuan yang diberi ekstrak etanolik daun sirih merah. Metode uji sitotoksisitas yang digunakan adalah metode perhitungan langsung dengan pewarna trypan blue. Data yang diperoleh berupa persen kematian kultur sel mieloma. Efek sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel mieloma dianalisis secara statistik dengan Anova satu arah dan harga LC

  50 dihitung dengan analisis probit.

  Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki efek sitotoksik terhadap kultur sel mieloma dengan harga LC

  50 sebesar

  434,1 μg/ml.

  Kata kunci : daun sirih merah, kultur sel mieloma, sitotoksisitas, harga LC ₅₀

x

 

  

ABSTRACT

Nowadays, the use of traditional drugs in society has expanded rapidly.

  Empirically, celebes pepper leaves has a lot of medicinal actions, one of them is anticancer. However, there are still no research that claim celebes pepper leaves have an anticancer activity. This study aims to determine whether extract ethanolic had cytotoxic effect or not.

  The study was pure experimental research with random complete and one way design. Myeloma cell cultures in control group and group with ethanolic extract of celebes pepper leaves is counted. The cytotoxicity effect was determined by using direct counting method with trypan blue stain. Data were collected by counting the percentage of death cells. Cyotoxicity effect of the ethanolic extract of celebes pepper leaves were analyzed using one way Anova and the LC

  50 value were analyzed using probit statistic.

  The result showed that ethanolic extract of celebes pepper leaves had cytotoxic effect to myeloma cell cultures with LC value of 434.1

  50 μg/ml. keywords : celebes pepper leaves, myeloma cell cultures, cytotoxicity, LC value ₅₀

xi

 

  DAFTAR ISI

  Halaman HALAMAN JUDUL ..................................................................................... ii

  HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .......................................... . iii HALAMAN PENGESAHAN ...................................................................... iv

  HALAMAN PERSEMBAHAN .................................................................. v PRAKATA ................................................................................................... vi PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ....................................................... viii

  INTISARI ..................................................................................................... ix

  

ABSTRACT ................................................................................................... x

  DAFTAR ISI ................................................................................................ xi DAFTAR TABEL ........................................................................................ xv DAFTAR GAMBAR ................................................................................... xvi

  DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................ xvii

  BAB I PENGANTAR ................................................................................. 1 A. Latar Belakang ........................................................................................ 1

  1. Rumusan masalah ......................................................................... 2

  2. Keaslian penelitian ........................................................................ 3

  3. Manfaat penelitian ......................................................................... 3

  B. Tujuan .................................................................................................... 3

  1. Tujuan umum ............... ................................................................. 3

  2. Tujuan khusus ........... ................................................................... 4

  xii  

  xiii  

  C. Ekstraksi ……………. ............................................................................ 10

  3. Variabel pengacau terkendali ........................................................ 14

  2. Variabel tergantung ....................................................................... 14

  1. Variabel bebas ............................................................................... 14

  BAB III METODOLOGI PENELITIAN ................................................... 14 A. Jenis dan Rancangan Penelitian ............................................................. 14 B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ........................................ 14

  F. Hipotesis ................................................................................................. 13

  E. Landasan Teori ....................................................................................... 12

  D. Uji Sitotoksisitas ..................................................................................... 11

  3. Sel mieloma ................................................................................... 9

  BAB II PENELAAHAN PUSTAKA .......................................................... 5 A. Tanaman Sirih Merah .............................................................................. 5

  2. Kanker sel plasma ......................................................................... 9

  1. Karsinogenesis ............................................................................... 8

  B. Kanker ................................................................................................. 7

  5. Penelitian ....................................................................................... 7

  4. Khasiat dan penggunaan ............................................................... 6

  3. Kandungan kimia .......................................................................... 6

  2. Uraian tanaman ............................................................................. 5

  1. Keterangan botani ......................................................................... 5

  4. Definisi operasional ...................................................................... 15

  C. Alat dan Bahan .................................................................................... 15

  1. Alat .... ............................................................................................ 15

  2. Bahan .. .......................................................................................... 16

  D. Tata Cara Penelitian ............................................................................. 16

  1. Determinasi tanaman ................................................................... 16

  2. Pengumpulan daun sirih merah ................................................... 17

  3. Preparasi ekstrak etanolik daun sirih merah ............................... 17

  4. Pembuatan larutan uji ................................................................. 18

  5. Pembuatan medium pencuci ....................................................... 18

  6. Pembuatan medium penumbuh ................................................... 18

  7. Propagasi sel mieloma ............................................................... 18

  8. Panen sel mieloma ..................................................................... 19

  7. Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah .................. 20

  E. Analisis Hasil ....................................................................................... 20

  BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................... 22 A. Determinasi Tanaman ............................................................................. 22 B. Pengumpulan Daun Sirih Merah ............................................................ 22 C. Preparasi Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah ........................................ 24 D. Pembuatan Medium Pencuci dan Medium Penumbuh .......................... 25 E. Propagasi dan Panen Sel Mieloma ......................................................... 26 F. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah ............................ 27

  xiv  

  BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ....................................................... 36 A. Kesimpulan .......................................................................................... 36 B. Saran ..................................................................................................... 36 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................... 37 LAMPIRAN .................................................................................................. 41 BIOGRAFI PENULIS .................................................................................. 57

  xv  

  DAFTAR TABEL

  Halaman Tabel I. Data perhitungan jumlah kultur sel mieloma dengan perhitungan langsung ....................................................................................... 44 Tabel II. Data persentase kematian kultur sel mieloma .............................. 29 Tabel III. Data log konsentrasi, % kematian dan harga probit pada replikasi I ..................................................................................... 51 Tabel IV. Data log konsentrasi, % kematian dan harga probit pada replikasi II .................................................................................... 51 Tabel V. Data log konsentrasi, % kematian dan harga probit pada replikasi III .................................................................................. 52 Tabel VI. Nilai r (koefisien korelasi) pada level signifikansi 5% dan 1%... 53 Tabel VII. Tabel probit.................................................................................. 55

  

xvi

 

  DAFTAR GAMBAR

  Halaman Gambar 1. Foto kultur sel mieloma di sumuran kontrol .................................. 27 Gambar 2. Kultur sel mieloma di haemocytometer ...................................... 28 Gambar 3. Grafik konsentrasi (µg/ml) terhadap persen kematian kultur sel mieloma ..................................................................................... … 29 Gambar 4. Kultur sel mieloma di sumuran perlakuan ...................................... 31 Gambar 5. Grafik log konsentrasi terhadap harga probit pada replikasi I …... 33 Gambar 6. Grafik log konsentrasi terhadap harga probit pada replikasi II ..... 33 Gambar 7. Grafik log konsentrasi terhadap harga probit pada replikasi III … 34 Gambar 8. Tanaman sirih merah …………………………………................. 41 Gambar 9. Daun sirih merah ……………………………….......................... 42 Gambar 10. Medium pencuci dan medium penumbuh .................................. 42 Gambar 11. Sentrifuge ................................................................................... 42 Gambar 12. Mikroskop .................................................................................. 42 Gambar 13. Haemocytometer dan cell count ................................................ 42 Gambar 14. Tabung conical steril dan 96-well plate .................................... 42 Gambar 15. Kultur sel mieloma dalam tissue culture flask ......................... 42

  

xvii

 

  

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

  Lampiran 1. Foto tanaman sirih merah ………………………………......... 41 Lampiran 2. Foto medium dan peralatan uji sitotoksisitas............................ 42 Lampiran 3. Perhitungan jumlah kultur sel mieloma tiap sumuran .............. 43 Lampiran 4. Perhitungan jumlah kultur sel mieloma yang hidup................. 44 Lampiran 5. Perhitungan persentase kematian kultur sel mieloma.............. 48 Lampiran 6. Perhitungan LC

  50 dengan analisis probit dan uji

  linearitas ………………………………................................... 51 Lampiran 7. Analisis statistik dengan Anova satu arah ............................... 54 Lampiran 8. Tabel probit .............................................................................. 55 Lampiran 9. Hasil determinasi tanaman sirih merah ................................... 56

   

xviii

 

BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Kanker merupakan salah satu penyakit yang menyebabkan kematian di

  seluruh dunia. Data Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) yang diterbitkan pada tahun 2007 menyebutkan, sebanyak 7,6 juta jiwa meninggal pada tahun 2005 dan 84 juta orang lainnya akan mati dalam jangka waktu 10 tahun ke depan, jika tidak ada tindakan nyata untuk menanggulangi penyakit ini. Di Indonesia, kanker menduduki peringkat keenam sebagai penyebab kematian utama. Sekitar 800.000 orang Indonesia terserang kanker tiap tahunnya (Anonim, 2007a).

  Pada kasus kanker sel plasma, American Cancer Society memperkirakan 19.900 kasus baru akan terjadi pada tahun 2007. Jumlah kematian akibat penyakit ini sekitar 10.790 jiwa, terdiri dari 5.550 pria dan 5.240 wanita. Dari 10,5 miliar pasien kanker diperkirakan jumlah pasien multiple myeloma sebanyak 63.000 jiwa (Rados, 2007).

  Pengobatan kanker sangat bervariasi dan tergantung pada faktor jenis, lokasi, kuantitas penyakit serta status kesehatan pasien. Beberapa jenis pengobatan kanker yang dapat dilakukan adalah pembedahan, radiasi, kemoterapi, terapi hormon, inhibitor spesifik, antibodi, dan vaksin (Anonim, 2002). Akan tetapi, berbagai pengobatan tersebut memiliki banyak efek yang merugikan pasien dan membutuhkan biaya yang mahal.

    Penggunaan obat tradisional di masyarakat telah berkembang semakin pesat. Obat tradisional merupakan obat dari bahan-bahan alam yang memiliki khasiat untuk menyembuhkan penyakit. Pada umumnya, harga obat tradisional lebih murah dibandingkan dengan obat modern. Oleh karena itu, masyarakat mulai beralih menggunakan obat tradisional yang memiliki efek terapi sama dengan obat modern.

  Sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) merupakan salah satu tanaman yang memiliki berbagai khasiat. Secara empiris, daun sirih merah digunakan untuk mengobati kanker, kencing manis, ambeien, peradangan, asam urat, hepatitis, maag, peradangan akut pada organ tubuh tertentu, luka yang sulit sembuh, TBC, lemah sahwat, jantung koroner, darah tinggi, dan asam urat (Sudewo, 2005).

  Untuk membuktikan klaim antikanker yang beredar di masyarakat, maka diperlukan penelitian terhadap daun sirih merah. Dalam penelitian ini, digunakan kultur sel mieloma untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat sitotoksik terhadap sel kanker. Hasil penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai dasar pengembangan senyawa antikanker dari tanaman sirih merah untuk pengobatan kanker sel plasma.

1. Rumusan masalah

  Berdasarkan latar belakang yang telah dipaparkan, maka dapat dirumuskan permasalahan sebagai berikut: a. apakah ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat sitotoksik ?

   

  50 dari ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur

  b. seberapa besar harga LC sel mieloma?

  2. Keaslian penelitian

  Sejauh yang diketahui penulis, penelitian mengenai uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel mieloma belum pernah dilakukan.

  3. Manfaat penelitian

  Penelitian mengenai uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah ini diharapkan memiliki beberapa manfaat, antara lain: a. manfaat teoritis yang dapat diperoleh ialah untuk melengkapi dan memperkaya teori yang telah ada mengenai khasiat daun sirih merah serta memberikan informasi tentang efek sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel mieloma.

  b. manfaat praktis yang dapat diperoleh ialah sebagai bukti ilmiah mengenai klaim khasiat daun sirih merah sebagai antikanker.

B. Tujuan

1. Tujuan umum

  Untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat sitotoksik.

   

2. Tujuan khusus :

  a. untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat sitotoksik terhadap kultur sel mieloma.

  b. untuk mengetahui seberapa besar harga LC ekstrak etanolik daun sirih merah

  50 terhadap kultur sel mieloma.

       

   

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Tanaman Sirih Merah

  1. Keterangan botani

  Tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) termasuk dalam famili : Piperaceae (Anonim, 2007b), memiliki sinonim Piper ornatum N.E. Br. (Anonim, 2006a). Di daerah Sulawesi, tanaman ini dikenal dengan nama Celebes pepper (Anonim, 2007c).

  2. Uraian tanaman

  Menurut Sudewo (2005), tanaman sirih merah tumbuh menjalar seperti halnya sirih hijau. Batangnya bulat berwarna hijau keunguan dan tidak berbunga.

  Daunnya bertangkai membentuk jantung dengan bagian atas meruncing, bertepi rata, dan permukaannya mengkilap atau tidak berbulu. Panjang daunnya bisa mencapai 15-20 cm. Warna daun bagian atas hijau bercorak warna putih keabu-abuan. Bagian bawah daun berwarna merah hati cerah. Daunnya berlendir, berasa sangat pahit, dan beraroma wangi khas sirih. Batangnya beruas dengan jarak buku 5-10 cm dan di setiap buku tumbuh bakal akar.

  3. Kandungan kimia

  Kandungan kimia tanaman ini belum diteliti secara detil. Dari hasil kromatogram diketahui daun sirih merah mengandung flavonoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tanin, dan minyak atsiri (Sudewo, 2005).

  Beberapa penelitian menunjukkan adanya efek sitotoksisitas dari senyawa flavonoid dan alkaloid. Menurut Devie (2007), kematian 50% sel mieloma terjadi akibat pemberian fraksi alkaloid daun jarong (Achyrantes aspera Linn) terjadi pada dosis 1 µg/ml. Kematian sel mieloma diduga akibat proses degenerasi, nekrosis, dan apoptosis. Kunci pepet (Kaempferia rotunda Linn) mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, dan polifenol memberikan efek sitotoksitas pada sel mieloma dengan LC

  50

  sebesar 7,36 g/ml (Wahyuningsih, 2004). Suatu penelitian menunjukkan efek sitotoksisitas ekstrak etanol kalus mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl.) terhadap sel mieloma dengan LC

  50 sebesar 12,53 µg/ml. Hasil analisis

  menunjukkan bahwa ekstrak etanol kalus mahkota dewa mengandung senyawa golongan alkaloid, terpenoid, dan flavonoid (Setyaningsih, 2005).

  4. Khasiat dan penggunaan

  Secara empiris, ekstrak daun sirih merah dalam pemakaian secara tunggal atau diformulasikan dengan tanaman obat lainnya mampu membasmi aneka penyakit, seperti kanker payudara, kanker rahim, leukemia, diabetes melitus, peradangan akut pada organ tubuh tertentu, luka yang sulit sembuh, TBC, radang pada lever, lemah sahwat, ambeien, jantung koroner, darah tinggi, dan asam urat (Sudewo, 2005).

5. Penelitian

  Sepengetahuan penulis, belum ada penelitian mengenai uji sitotoksisitas daun sirih merah terhadap kultur sel mieloma. Beberapa penelitian yang pernah dilakukan pada daun sirih merah adalah :

  a. Toksisitas ekstrak air daun sirih merah dan kemampuannya dalam menurunkan kadar glukosa darah tikus. Hasil penelitian menunjukkan ekstrak daun sirih merah dosis 20 g/kg BB dapat menurunkan glukosa darah tikus sebesar 34,3 %. Penurunan lebih tinggi dibandingkan dengan obat anti DM komersial Daonil 3,22 ml/kg yang hanya menurunkan 27 % glukosa darah tikus (Diek, 2005).

  b. Skrining fitokimia daun sirih merah. Hasil penelitian menunjukkan sirih merah mengandung flavonoid, senyawa polifenolat, alkaloid, tanin dan minyak atsiri (Sudewo, 2005).

B. Kanker

  Kanker merupakan penyakit yang ditandai dengan proliferasi sel yang tidak terkontrol dan mengarah pada invasi jaringan di sekitarnya serta menyebar ke bagian lain dalam tubuh (metastasis) (King, 2000).

  Kanker disebabkan oleh mutagen, yaitu substansi yang dapat menyebabkan mutasi DNA. Mutagen yang menyebabkan kanker adalah karsinogen. Berdasarkan jenisnya, karsinogen terbagi menjadi 3 yaitu: karsinogen kimia, fisik dan biologi. Karsinogen kimia berasal dari zat-zat kimia seperti nitrosamina, kadmium, dan aflatoksin. Karsinogen fisik berasal dari pemaparan sinar X dan ultraviolet, sedangkan karsinogen biologi berasal dari berbagai mikroorganisme, seperti virus papiloma, virus hepatitis B, dan bakteri helikobakter pylori (Yuswanto dan Sinardi, 2000).

  Menurut jaringan asal pertumbuhannya, kanker dapat diklasifikasikan menjadi 3 kelompok, yaitu (1) karsinoma, merupakan kanker yang tumbuh dari jaringan epitel, meliputi membran mukosa dan kelenjar (seperti kanker payudara, paru-paru dan ovarium); (2) sarkoma, merupakan kanker yang berasal dari jaringan mesodermal yang terdiri dari jaringan ikat, tulang atau sel otot; dan (3) blastoma, berasal dari hemopoetik dan jaringan darah, meliputi jaringan limfosit yang berasal dari leukosit dan mungkin juga berasal dari limfatik atau monositik (Bosman, 1999).

1. Karsinogenesis

  Karsinogenesis merupakan proses transformasi sel normal menjadi sel kanker. Karsinogenesis disebabkan oleh mutasi sel normal yang merusak keseimbangan antara proliferasi dan kematian sel normal. Hal ini menghasilkan pembelahan sel yang tidak terkontrol dan pembentukan tumor. Proliferasi sel yang tidak terkontrol dan cepat, mempermudah terbentuknya tumor jinak, beberapa tipe tumor tersebut dapat berubah menjadi tumor ganas (kanker). Tumor jinak tidak dapat menyebar ke bagian lain dalam tubuh atau menyerang jaringan lain, dan jarang mengancam jiwa kecuali mereka menekan struktur utama atau fisiologi aktif seperti produksi hormon. Tumor ganas dapat menyerang organ lain, menyebar ke lokasi yang jauh (metastasis) dan mengancam jiwa (Anonim, 2008a).

  2. Kanker sel plasma

  Kanker sel plasma merupakan tipe kanker yang berkembang dari sel dalam sumsum tulang yang disebut sel plasma. Kanker ini dapat berkembang di tempat- tempat yang terdapat sumsum tulang, termasuk tulang pinggul, tulang belakang dan tulang rusuk (Anonim, 2007d). Penyebab kanker sel plasma tidak diketahui secara pasti (Anonim, 2006b). Akan tetapi, penelitian menunjukkan bahwa terjadi perubahan DNA pada sel mieloma. Kebanyakan sel mieloma kehilangan semua atau satu bagian pada kromosom 13. Sel yang kehilangan kromosom 13 cenderung lebih agresif dibandingkan sel yang memiliki kromosom 13 normal (Fronseca, 2008).

  Dalam keadaan normal, ketika antigen masuk ke dalam tubuh, limfosit B akan berkembang menjadi sel plasma dan menghasilkan antibodi untuk melawan antigen tersebut. Pada kanker sel plasma, limfosit B mengalami kerusakan secara genetik sehingga terjadi peningkatan jumlah sel plasma dan antibodi yang berlebihan (Lonial, 2005).

  Ketika sel plasma tumbuh tak terkontrol, mereka dapat menghasilkan tumor. Tumor ini umumnya berkembang di dalam sumsum tulang. Apabila, hanya terdapat satu tumor, maka disebut plasmacytoma. Biasanya, tumor sel plasma menyebar melewati sumsum tulang dan terdapat di beberapa tempat, yang disebut sebagai multiple myeloma (Anonim, 2006c).

  3. Sel mieloma

  Sel mieloma pertama kali diambil dari Marwin Plasma Cell Tumour-11 (MPC-11) yang diisolasi dari mencit Balb/c koleksi Fahei (1967) oleh Laskov dan Scharff. Sel tumor ini diadaptasi ke dalam kultur secara terus menerus sampai 6 kali dan dipelihara dalam erlenmeyer yang berisi media Dulbecco’s-Eagle’s dengan asam amino essensial dan 20% serum kuda yang inaktif. Sel mieloma menyerupai sel tumor induk yang dapat memproduksi gamaglobulin (IgG2b), 5-6ug IgG2b per sel per menit. Waktu pembelahan sel kurang lebih 17 jam. Kultur sel mieloma memiliki karakteristik yaitu bentuk selnya hampir bulat sempurna, bergerombol, melekat di dasar flask dan akan terlepas dari dasar flask dengan agitasi ringan (Irawati, 2005).

C. Ekstraksi

  Ekstraksi merupakan kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak larut dengan pelarut cair. Simplisia yang diekstrak mengandung senyawa aktif yang dapat larut dan senyyawa tidak dapat larut seperti serat, karbohidrat, protein dan lain-lain. Senyawa aktif yang dapat larut digolongkan ke dalam golongan minyak atsiri, alkaloid, flavonoid dan lain-lain (Anonim, 2000).

  Bahan baku tumbuhan yang diekstraksi akan menghasilkan produk, yakni ekstrak tumbuhan obat. Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian pelarut diuapkan dari massa atau serbuk yang memenuhi baku tertentu yang telah ditetapkan (Anonim, 2000).

  Salah satu cara ekstraksi yang sering dilakukan adalah metode maserasi. Maserasi merupakan proses perendaman sampel dengan pelarut organik yang digunakan pada temperatur ruangan. Proses ini sangat menguntungkan dalam isolasi senyawa bahan alam karena dengan perendaman sampel tumbuhan akan terjadi pemecahan dinding dan membran sel akibat perbedaan tekanan antara di dalam dan di luar sel sehingga metabolit sekunder yang ada dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik dan ekstraksi senyawa akan sempurna karena dapat diatur lama perendaman yang dilakukan. Pemilihan pelarut untuk proses maserasi akan memberikan efektifitas yang tinggi dengan memperhatikan kelarutan senyawa bahan alam pelarut tersebut (Lenny, 2006). Keuntungan metode maserasi adalah cara pengerjaan dan alat yang digunakan sederhana dan mudah diusahakan. Akan tetapi, metode ini memiliki kelemahan, yakni waktu pengerjaannya lama (Mustofa, 2007).

  Pelarut cair yang sering digunakan pada pembuatan ekstrak adalah air dan campuran etanol air. Bila digunakan cairan penyari air maka untuk mencegah tumbuhnya jamur dapat ditambahkan bahan pengawet yang diberikan pada awal penyarian (Anonim, 2000).

D. Uji Sitotoksisitas

  Sitotoksisitas adalah sifat toksis atau beracun suatu senyawa terhadap sel yang hidup. Uji sitotoksisitas adalah uji in vitro dengan menggunakan kultur sel yang digunakan dalam evaluasi keamanan obat, kosmetika, zat tambahan makanan, pestisida, dan digunakan juga untuk mendeteksi adanya aktivitas sitotoksik dari suatu senyawa. Sistem ini merupakan uji kualitatif dan kuantitatif dengan cara menetapkan kematian sel (Freshney, 2000).

  Salah metode uji sitotoksisitas yang sering digunakan adalah metode perhitungan langsung menggunakan haemocytometer. Metode yang banyak digunakan untuk menghitung sel secara efisien dan akurat adalah menggunakan

  

haemocytometer. Alat ini berupa counting chamber yang memiliki ketebalan 0,1 mm

  dan squared graduation untuk memudahkan perhitungan. Ketika suspensi sel diisikan ke dalam chamber, sel dapat diamati di bawah mikroskop dan dihitung dalam ruled square yang dipilih. Dari perhitungan ini, jumlah sel per ml suspensi dapat dihitung secara langsung (Doyle and Griffiths, 2000).

  Trypan blue biasa digunakan untuk membedakan sel hidup dari sel mati. Sel hidup tidak terwarnai, bulat dan relatif kecil dibandingkan dengan sel mati.

  Sedangkan sel mati membengkak dan berwarna biru (Doyle and Griffiths, 2000). Dalam beberapa hal, penggunaan trypan blue dihindari karena menyebabkan lapangan pandang berwarna gelap sehingga sulit membedakan sel hidup dan sel mati (Elly, 2002). Pemaparan trypan blue yang lebih dari 15 menit juga akan mewarnai sel hidup (Anonim, 1999).

E. Landasan Teori

  Saat ini banyak bahan-bahan alam yang digunakan dalam pengobatan kanker, seperti daun sirih merah. Akan tetapi, belum ada penelitian yang mendukung klaim khasiat daun sirih merah sebagai antikanker. Dari hasil skrining fitokimia, diketahui bahwa daun sirih merah mengandung flavonoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tanin, dan minyak atsiri.

  Flavonoid terbagi menjadi 6 subkelas, yaitu : flavon (apigenin, luteolin), flavonol (kuersetin, mirisetin), flavanon (naringenin dan hesperidin), flavanol (epikatekin dan galokatekin), antosianidin (sianidin dan pelargonidin), dan isoflavon

  (genistein dan daidezin) (Ross and Kasum, 2002). Beberapa jenis flavonoid yang memiliki efek antikanker adalah kuersetin, genistein, daidezin, dan antosianin (Grotewold, 2006). Kebanyakan senyawa golongan ini larut dalam air dan pelarut organik lainnya seperti metanol, etanol dan aseton. Flavonoid berperan sebagai inhibitor enzim DNA topoisomerase sel kanker. Enzim tersebut merupakan enzim yang berperan dalam proses replikasi, transkripsi dan rekombinasi DNA serta proses proliferasi dan diferensiasi sel kanker (Sukardiman, 1999).

  Alkaloid merupakan salah satu senyawa organik terbanyak di alam dan tersebar pada tumbuhan. Alkaloid terdiri dari golongan piridin, pirolidin, tropan, kuinolin, isokuinolin, penetilamin, indol, purin, terpenoid, dan vinka. Senyawa golongan ini tidak larut dalam air, tetapi larut dalam pelarut organik, seperti etanol, metanol, kloroform dan eter. Golongan alkaloid vinka telah diketahui memiliki aktivitas sebagai antikanker, misalnya vinkristin dan vinblastin yang dapat menghambat pembelahan sel kanker (Anonim, 2008b).

  Penelitian dari beberapa tanaman menujukkan bahwa senyawa alkaloid dan flavonoid memiliki efek sitotoksisitas terhadap sel mieloma. Hal tersebut mendasari penelitian uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel mieloma ini, untuk melihat apakah ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat sitotoksik terhadap kultur sel mieloma.

F. Hipotesis

  Ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat sitotoksik terhadap kultur sel mieloma.

BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur

  sel mieloma ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola satu arah.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

1. Variabel utama

  a. Variabel bebas Kadar ekstrak etanolik daun sirih merah, yaitu : 250 µg/ml, 500 µg/ml, 750 µg/ml, 1000 µg/ml, 1250 µg/ml, 1500 µg/ml, 1750 µg/ml, dan 2000 µg/ml.

  b. Variabel tergantung Persentase kematian kultur sel mieloma.

2. Variabel pengacau terkendali

a. Medium tumbuh sel dikendalikan dengan menggunakan medium RPMI-1640 serum.

  b. Tempat tumbuh dan waktu pemanenan daun sirih merah dikendalikan dengan memanen daun pada tempat dan waktu yang sama

c. Kematian alami sel mieloma dikendalikan dengan adanya kontrol kultur sel mieloma.

3. Definisi operasional

  a. Sitotoksisitas ialah sifat toksik atau beracun dari ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel mieloma.

  b. Ekstrak etanolik ialah ekstrak yang diperoleh dengan cara mengekstraksi daun sirih merah secara maserasi menggunakan larutan penyari etanol 70%.

  50 ialah konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah yang mampu membunuh

  c. LC atau menyebabkan kematian sejumlah 50% kultur sel mieloma dan dinyatakan dalam µg/ml.

C. Alat dan Bahan

1. Alat

  Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri atas : alat-alat gelas, oven, blender, ayakan, kertas saring, filter polietilensulfon, timbangan analitik (Mettler Toledo), alumunium foil, autoklaf, tissue culture flask (Nunc), tabung

  

conical (Nunc), swing rotor sentrifuge (Centrifuge), inkubator (Memmer),

  mikropipet, lemari pendingin (Sharp), cell counter (Rogoshiseiki), 96-well plate

  TM R

  (Nunclon ), laminar air flow (Labconco ), mikroskop (Olympus), haemocytometer (Neubauer Improved), yellowtip, bluetip, tabung effendrof, tisu, sarung tangan dan masker.

2. Bahan

  Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah :

  a. Daun sirih merah segar

  b. Kultur sel mieloma yang diambil dari stok di Laboratorium Hayati Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

  c. Larutan penyari yang digunakan dalam preparasi ekstrak etanolik daun sirih merah, yakni etanol 70% d. Medium pencuci : RPMI-1640, Natrium bikarbonat, Hepes

  e. Medium penumbuh : RPMI-1640, FBS (Foetal Bovine Serum) 10%, Penisilin- Streptomisin 1%, dan Fungison 0,5%.

  f. Reagen pewarna : Trypan Blue

  g. Aquabidest

  h. Dimethyl Sulfoxide (DMSO)

D. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi tanaman

  Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian, yaitu daun sirih merah, dideterminasi terlebih dahulu di laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta dan dipastikan juga kebenarannya menggunakan kunci determinasi.

  2. Pengumpulan daun sirih merah

  Daun sirih merah yang digunakan diambil dari tanaman daun sirih merah yang tumbuh di desa Mantenan, kecamatan Mertoyudan, kabupaten Magelang, Jawa Tengah, pada bulan September 2007.

  3. Preparasi ekstrak etanolik daun sirih merah Daun sirih merah dipetik, disortir, dicuci dengan air mengalir dan ditiriskan.

  Setelah itu, daun sirih merah dikeringkan dengan menggunakan oven pada suhu 60-

  70 C dan diserbuk dengan blender sampai halus serta diayak dengan menggunakan ayakan 0,75 mm.

  Selanjutnya, dilakukan ekstraksi daun sirih merah dengan metode maserasi. Serbuk daun sirih merah ditimbang dan diekstraksi dengan larutan penyari etanol 70%. Untuk tiap 10 bagian (100 g) serbuk digunakan 75 bagian (750 ml) etanol 70%, ditutup dan dibiarkan selama 24 jam terlindung dari cahaya matahari. Setelah 24 jam sari diserkai, disaring, ampas diperas, ampas ditambah cairan penyari secukupnya, diaduk dan diserkai sehingga diperoleh seluruh sari sebanyak 100 bagian. Bejana ditutup, dibiarkan di tempat sejuk, terlindung dari cahaya, selama 2 hari kemudian endapan dipisahkan. Rendaman harus dikocok berulang-ulang (kira- kira 3 kali sehari). Setelah 2 hari maserat disaring dengan kertas saring, kemudian ditampung. Maserat yang terkumpul kemudian dipekatkan di atas waterbath dengan

  o

  suhu 60-65 C, dibantu dengan kipas angin sampai kental.

  4. Pembuatan larutan uji

  Ekstrak etanolik daun sirih merah ditimbang sebanyak 0,1 g, dilarutkan dengan DMSO dan diaduk sampai homogen untuk mendapatkan sediaan ekstrak induk dengan konsentrasi 100 mg/ml. Dari sediaan ekstrak induk tersebut, dibuat sediaan uji, dengan konsentrasi sebesar 250 µg/ml, 500 µg/ml, 750 µg/ml, 1000 µg/ml, 1250 µg/ml, 1500 µg/ml, 1750 µg/ml, dan 2000 µg/ml.

  5. Pembuatan medium pencuci

  RPMI-1640 dilarutkan dalam aquabidest kurang lebih 80 ml, ditambah 2,3 g natrium bikarbonat, 2 g Hepes, diencerkan sampai 100 ml, pH dibuat 7,2, lalu disterilkan dengan filter polietilensulfon yang berdiameter 0,22 μm secara aseptis.

  o

  Medium disimpan dalam lemari pendingin pada suhu 4 C (Freshney, 1986; Jacoby and Pastan, 1979; Sambrook, Fritsch and Maniatis, 1989).

  6. Pembuatan medium penumbuh

  Untuk medium RPMI-1640 serum, ditambahkan FBS (Foetal Bovine

  

Serum) 10%, penisilin-streptomisin 1% dan fungison 0,5% dalam medium RPMI-

  1640 dan disterilkan dengan filter polietilensulfon yang berdiameter 0,22 μm secara

  o

  aseptis. Medium disimpan dalam lemari pendingin pada suhu 4 C (Freshney, 1986; Jacoby and Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989).

  7. Propagasi sel mieloma

  Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam

  o

  penangas air 37

  C, kemudian ampul disemprot dengan etanol 70%. Ampul dibuka dan sel mieloma dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi medium RPMI- 1640. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti dengan medium RPMI-1640 yang baru, kemudian disuspensikan perlahan. Suspensi sel lalu disentrifugasi kembali selama 5 menit kemudian dicuci ulang sekali lagi. Supernatan dibuang, pelet ditambahkan 1 ml medium penumbuh yang mengandung 10% FBS.

  Resuspensikan secara perlahan sampai homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam

  o

tissue culture flask kecil dan diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37 C dan

  aliran 5% CO

  2 . Setelah 24 jam, medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan

  hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian (Freshney, 1986; Jacoby and Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989).

8. Panen sel mieloma

  Setelah jumlah sel cukup (kurang lebih setelah berumur 7 hari), medium diganti dengan RPMI-1640 baru sebanyak 5 ml kemudian sel dilepaskan dari dinding

  

flask dengan cara diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel dipindahkan

  dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI-1640 sampai volum 10 ml dan disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet sel diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian dihitung menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium

  4

  sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 2x10 /100 μl dan siap dipakai untuk penelitian (Freshney, 1986; Jacoby and Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989).

9. Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah

  4 Suspensi kultur sel mieloma dengan kepadatan 2 x 10 sel / 100

  μl medium diambil sebanyak 100 μl dan dimasukkan ke dalam sumuran 96-well plate bersama dengan ekstrak uji sesuai seri konsentrasi yang dibuat, yaitu 250 µg/ml, 500 µg/ml,

  750 µg/ml, 1000 μg/ml, 1250 μg/ml, 1500 μg/ml, 1750 μg/ml, dan 2000 μg/ml. Untuk kontrol, digunakan 100

  μl suspensi sel dan ditambahkan medium. Setelah itu,