Development of serotype 2 simian betaretrovirus reverse transcriptase recombinant enzyme isolated from indonesian cynomolgus monkey

PENGEMBANGAN ENZIM REKOMBINAN REVERSE
TRANSCRIPTASE SIMIAN BETARETROVIRUS SEROTIPE-2
ISOLAT INDONESIA ASAL MONYET EKOR PANJANG

UUS SAEPULOH

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul “Pengembangan
Enzim Rekombinan Reverse Transcriptase Simian Betaretrovirus Serotipe-2
Isolat Indonesia Asal Monyet Ekor Panjang” adalah benar karya saya dengan
arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2013

Uus Saepuloh
NIM P063100011

RINGKASAN
UUS SAEPULOH. Pengembangan Enzim Rekombinan Reverse
Transcriptase Simian Betaretrovirus Serotipe-2 Isolat Indonesia Asal Monyet
Ekor Panjang. Dibimbing oleh DONDIN SAJUTHI, DIAH ISKANDRIATI,
dan DEDY DURYADI SOLIHIN.
Reverse transcriptase (RT) retrovirus merupakan suatu enzim multifungsi
yang mengkatalisis pembentukan DNA utas ganda dari RNA utas tunggal genom
retrovirus. Proses yang kompleks ini disebut dengan transkripsi balik (reverse
transcription) yaitu suatu tahapan yang sangat penting dalam siklus hidup
retrovirus dan bertanggung jawab terhadap replikasi genomnya. Di bidang
bioteknologi, enzim RT retrovirus telah dimanfaatkan sebagai salah satu
perangkat yang sangat penting dalam bidang biologi molekuler yaitu untuk
menyintesis DNA komplementer (cDNA) dari mRNA. Aplikasi dari enzim RT
ini telah memberikan pemahaman yang luas mengenai sejumlah mekanisme

regulator seluler. Selain itu, kombinasi antara aktivitas RT dengan amplifikasi
PCR telah menjadi suatu gold standard dalam proses pengklonaan daerah
penyandi gen (coding region) dari berbagai sasaran gen yang diinginkan. Di
bidang biomedis, enzim RT asal virus HIV-1 (human immunodeficiency virus)
merupakan enzim yang paling banyak dipelajari sebagai sasaran utama dalam
pengembangan senyawa obat antiretrovirus untuk terapi penyakit AIDS (acquired
immunodeficiency syndrome).
Simian betaretrovirus serotipe-2 (SRV-2) merupakan agen penyebab
terjadinya sindroma penurunan kekebalan tubuh dan bertanggung jawab terhadap
terjadinya morbiditas dan mortalitas pada satwa primata monyet Asia genus
Macaca. Infeksi SRV-2 pada Macaca juga dapat menjadi faktor pengganggu
(confounding variable) dalam penelitian biomedis yang menggunakan satwa
primata ini sebagai hewan model penelitian. Namun demikian, terdapat potensi
menguntungkan yang dapat dieksplorasi dengan mempelajari virus SRV-2 ini.
Virus ini dapat dijadikan sebagai model untuk mempelajari retrovirus lainnya
terutama terhadap HIV/AIDS melalui pemahaman mekanisme interaksi dengan
inangnya dan efek imunosupresi, mekanisme infeksi, struktur virus, serta
pengembangan antiretrovirus dan vaksinnya. Sebagaimana karakteristik yang
dimiliki oleh semua retrovirus, SRV-2 mempunyai kemampuan untuk
mentranskripsi balik genom RNA-nya menjadi DNA utas ganda melalui aksi dari

enzim reverse transcriptase. Adanya gen penyandi enzim RT pada SRV-2 sangat
potensial untuk dipelajari dan dimanfaatkan sebagai model enzim RT untuk
pengembangan kandidat senyawa obat anti-RT terhadap retrovirus. Selain itu,
dapat dimanfaatkan juga melalui pengembangan enzim rekombinan RT SRV-2
untuk diaplikasikan dalam bidang biologi molekuler.
Tujuan dari penelitian ini yaitu untuk menghasilkan enzim rekombinan RT
SRV-2 isolat Indonesia asal monyet ekor panjang (Macaca fascicularis) melalui
tahapan penelitian: Isolasi, pemodelan struktur 3D dan karakterisasi molekuler,
ekspresi gen menggunakan sistem ekspresi Escherichia coli, pemurnian, analisis
hasil ekspresi dan uji aktivitas enzim rekombinan RT SRV-2.
Isolasi gen penyandi enzim RT SRV-2 dilakukan menggunakan teknik PCR
yang dilanjutkan dengan perunutan nukleotida dengan teknik sekuensing.

Pemodelan struktur 3D dilakukan menggunakan program I-TASSER (Iterative
Threading ASSEmbly Refinement) yang divisualisasi dengan program PyMol.
Ekspresi gen target RT SRV-2 dilakukan dalam sistem ekspresi E.coli dengan
metode Gateway technology menggunakan vektor entry pENTR/SD/TOPO dan
vektor destinasi pDEST17 yang diekspresikan dalam E.coli BL21AI. Pemurnian
enzim rekombinan dilakukan menggunakan kromatografi afinitas Ni2+-NTA yang
dilanjutkan dengan analisis ekspresi dengan teknik SDS-PAGE dan Western blot.

Aktivitas enzim dianalisis menggunakan RT colorimetric assay dan diaplikasikan
pada teknik reverse transcription PCR (RT-PCR).
Gen penyandi enzim RT SRV-2 isolat Indonesia asal monyet ekor panjang
telah berhasil diisolasi. Runutan nukleotida gen RT SRV-2 berada di daerah pol
posisi 3284-4925 menyandikan 547 asam amino yang meliputi domain polimerase
dan RNase H. Program komputasi I-TASSER berhasil memprediksi struktur tiga
dimensi RT SRV-2 yang terdiri atas domain palm/finger, thumb, connection dan
RNase H. Situs aktif polimerase mengandung tiga residu aspartat pada sisi
katalitiknya yaitu Asp90, Asp165, Asp166 dan mempunyai motif sangat lestari
(conserved region) YMDD yaitu Tyr163, Met164, Asp165, dan Asp166. Model
struktur ini memiliki homologi tertinggi dengan RT HIV-1 (2B6A). Domain
RNase H juga berhasil ditentukan struktur molekulnya secara parsial yang
mempunyai homologi dengan RNase H E.coli (1GOA) dan RNase H HIV-1
(3HYF). Situs katalitik RNase H SRV-2 mengandung tiga asam amino dengan
residu karboksilat yaitu Asp436, Glu465 dan Asp486.
Gen RT SRV-2 berhasil diekspresikan melalui tahapan pengklonaan pada
vektor pENTR/SD/TOPO dan disubklonakan pada vektor pDEST17. Analisis
hasil ekspresi menggunakan teknik SDS PAGE dan Western blot menunjukkan
adanya pita protein spesifik berukuran 64.9 kDa yang diperkirakan sebagai enzim
rekombinan RT SRV-2. Pemurnian terhadap enzim rekombinan RT SRV-2

menghasilkan 312 µg mL-1 protein yang memiliki aktivitas enzim sebesar 7.1 Unit
(U) µL-1. Aplikasi enzim rekombinan SRV-2 RT pada teknik RT-PCR terhadap
target gen -globin dan -aktin menunjukkan bahwa enzim ini mampu
mentranskripsi balik mRNA menjadi cDNA. Hal ini ditunjukkan dengan adanya
pita DNA berukuran 206 base pairs (bp) dan 350 bp yang spesifik untuk gen globin dan -aktin. Dengan demikian, enzim rekombinan RT SRV-2 memiliki
aktivitas yang mirip dengan enzim komersial sejenis, meskipun aktivitasnya
masih rendah.
Kata kunci:

reverse transcriptase, enzim rekombinan RT SRV-2, I-TASSER,
sistem ekspresi Escherichia coli

SUMMARY
UUS SAEPULOH. Development of Serotype-2 Simian Betaretrovirus
Reverse Transcriptase Recombinant Enzyme Isolated from Indonesian
Cynomolgus Monkey.
Supervised by DONDIN SAJUTHI, DIAH
ISKANDRIATI, and DEDY DURYADI SOLIHIN.
Reverse transcriptase (RT) is a multifunctional enzyme that catalyzes the
formation of double-stranded DNA from single-stranded RNA viral genomes.

Reverse transcription is an essential and critical step in life cycle of all
retroviruses replication. RT has become an important enzyme in molecular
biology, genetics and medicine for the synthesis of complementary DNA (cDNA)
from messenger RNA (mRNA). The application of this enzyme combining with
PCR amplification technique (RT-PCR) has expanded our knowledge of
numerous cellular regulatory mechanisms and has become a gold standard to
facilitate the coding region cloning of any gene of interest. The development of
biotechnology has been relying on the availability of this efficient RT. In
biomedical fields, RT of human immunodeficiency virus (HIV), the virus causing
acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) has been the most studied enzyme
due to the prime target for the development of antiretroviral drug therapy of
HIV/AIDS.
Simian betaretrovirus serotype-2 (SRV-2) is the causative agent of simian
acquired immunodeficiency syndrome (SAIDS) in Asian macaques with varying
severity. While SRV is an important pathogen in Asian macaque and causes a
potential confounding variable in biomedical research, SRV also provides a
valuable viral model to compare with other retrovirals for a better understanding
of aspects of retroviral–host interactions, infection mechanism, retroviral structure,
antiretroviral and vaccine development. As is characteristic of all retroviruses,
SRV-2 can transcribe its own RNA genome into a double-stranded DNA by the

action of reverse transcriptase enzyme. The presence of gene encoding RT
enzyme in SRV-2 genome potentially be studied and utilized further as RT
enzyme model for developing the anti RT drug of others retrovirus. On the other
hands, the gene encoding SRV-2 RT can be isolated and cloned to produce RT
recombinant enzyme and applied in molecular biology techniques.
In this study, we isolated the gene encoding RT enzyme of SRV-2 that
infected Indonesian cynomolgus monkey and predicted the three dimensional
(3D) structure model using I-TASSER (Iterative Threading ASSEmbly
Refinement) computational program and visualized with PyMol program. Gene
expression was constructed in Escherichia coli expression system with Gateway
technology methods using pENTR/SD/TOPO entry vector and pDEST17
destination vector.
Purification was performed using Ni2+-NTA affinity
chromatography. Expression was analyzed using SDS-PAGE and Western blot
techniques; meanwhile enzyme activity was measured using RT colorimetric
assay and RT-PCR technique.
We isolated the gene encoding RT enzyme of SRV-2 Indonesian isolate at
nucleotide position 3284-4925 consisted of 547 amino acids. The I-TASSER
program has predicted the three dimensional structure model of RT SRV-2
enzyme that consisted of palm/finger, thumb, connection and RNase H domain.

The polymerase active site located in the finger/palm subdomain characterized by
three conserved catalytic aspartates (Asp90, Asp165, Asp166), and has a highly
conserved YMDD motif as Tyr163, Met164, Asp165, and Asp166. This SRV-2
RT structure model has the highest homology to HIV-1 RT (2B6A.pdb).
Meanwhile, the structure of SRV-2 RNase H closely related to its ortologs such as
Escherichia coli RNase H (1GOA) and HIV-1 RNase H (3QIO, 3HYF). The
catalytic active site of SRV-2 RNase H contains three amino acid carboxylateresidues as Asp436, Glu465 and Asp486.
Analysis of expression using SDS PAGE and Western blot techniques
showed a specific band of 64.9 kDa, indicating SRV-2 RT recombinant enzyme.
Purification of SRV-2 RT recombinant enzyme produced 312 µg mL-1 protein
with 7.1 Unit (U) µL-1 enzyme activities. Application of this recombinant enzyme
in reverse transcription-PCR (RT-PCR) of -globin and -actin genes produced
DNA fragments of 206 base pairs (bp) and 350 bp, indicating amplification of globin and -actin genes, respectively. Therefore, the expressed SRV-2 RT
enzyme was proven to be functional, although the activity was low.
Keywords: reverse transcriptase, recombinant enzyme, SRV-2 RT, Escherichia
coli expression system, I-TASSER

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2013
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

PENGEMBANGAN ENZIM REKOMBINAN REVERSE
TRANSCRIPTASE SIMIAN BETARETROVIRUS SEROTIPE-2
ISOLAT INDONESIA ASAL MONYET EKOR PANJANG

UUS SAEPULOH

Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor
pada
Program Studi Primatologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

Penguji pada Ujian Tertutup: Prof Dr Ir Maggy Thenawidjaja
Dr drh Joko Pamungkas, MSc

Penguji pada Ujian Terbuka: Prof Ir Antonius Suwanto, PhD
Prof dr Mohamad Sadikin, DSc

Judul Disertasi: Pengembangan Enzim Rekombinan Reverse Transcriptase
Simian Betaretrovirus Serotipe-2 Isolat Indonesia Asal Monyet
Ekor Panjang
Nama
: Uus Saepuloh
NIM
: P063100011
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

Prof drh Dondin Sajuthi, MST, PhD
Ketua

Dr drh Diah Iskandriati
Anggota

Dr Ir Dedy Duryadi Solihin, DEA
Anggota
Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Primatologi

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof drh Dondin Sajuthi, MST, PhD

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian:
26 Agustus 2013

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Segala puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT, karena atas
berkah, rahmat, dan hidayah-Nya penulis dapat menyelesaikan disertasi dengan
judul “Pengembangan Enzim Rekombinan Reverse Transcriptase Simian
Betaretrovirus Serotipe-2 Isolat Indonesia Asal Monyet Ekor Panjang”. Disertasi
ini diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor dari
Program Studi Primatologi Sekolah Pascasarjana IPB.
Pada kesempatan ini, penulis mengucapkan terimakasih kepada Prof drh
Dondin Sajuthi, MST, PhD selaku ketua komisi pembimbing, Dr drh Diah
Iskandriati dan Dr Ir Dedy Duryadi Solihin, DEA selaku anggota komisi
pembimbing atas bimbingan, arahan, dan waktu yang diluangkannya kepada
penulis sehingga penelitian ini dapat terselesaikan. Ucapan terimakasih juga
disampaikan kepada penguji luar komisi ujian tertutup yaitu Prof Dr Ir Maggy
Thenawidjaja dan Dr drh Joko Pamungkas, MSc; serta penguji luar komisi ujian
terbuka yaitu Prof Ir Antonius Suwanto, PhD dan Prof dr Mohamad Sadikin, DSc;
atas berbagai masukan demi perbaikan disertasi ini.
Terimakasih kepada ketua Program Studi Primatologi Bapak Prof drh
Dondin Sajuthi, MST, PhD beserta seluruh staf pengajar atas kesempatan studi di
Sekolah Pascasarjana IPB. Penghargaan dan terimakasih penulis sampaikan
kepada Dr drh Joko Pamungkas, MSc selaku Kepala Pusat Studi Satwa Primata
Lembaga Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat Institut Pertanian Bogor
(PSSP LPPM IPB), Dr drh Diah Iskandriati selaku Kepala UPT Laboratorium
PSSP LPPM IPB, atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk
melanjutkan sekolah S3 di Sekolah Pascasarjana IPB dan penggunaan segala
fasilitas yang diberikan untuk terlaksananya penelitian ini.
Kepada Direktorat Perguruan Tinggi Kementrian Pendidikan dan
Kebudayaan Republik Indonesia, penulis mengucapkan terimakasih atas sebagian
dana penelitian yang diberikan melalui Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi
Tahun 2012 dan kepada SEAMEO BIOTROP melalui program Thesis Research
Grants for Indonesian PhD Students tahun 2012.
Penulis juga menyampaikan terimakasih dan penghargaan kepada temanteman di Laboratorium Bioteknologi PSSP LPPM IPB yaitu: Sela Septima Mariya,
SSi; Elis Dwi Ayuningsih, Amd; dan Mad Ramdan; kepada rekan-rekan di
Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi PSSP LPPM IPB : Silmi Mariya, SSi,
MSi; Maryati Surya, SSi, MS; Rachmitasari Noviana, SKH, MSi; Isti Kartikasari,
SSi, MSi; Iin Indriawati, SSi dan Tri Faujiani, SSi serta semua staf dan karyawan
PSSP LPPM IPB atas bantuannya selama penelitian.
Terimakasih yang tulus disampaikan kepada kedua Orang tua dan Mertua,
Kakak-Kakak dan Adik-Adik atas segala doa untuk kesuksesannya. Kepada Isteri
tercinta Dewi Ratnaningsih, SPdi; dan putera kami tercinta Azka Razaqy
Saepuloh, atas segala doa, kasih sayang dan motivasi yang diberikan kepada
penulis.
Semoga Allah SWT senantiasa memberikan jalan kemudahan dalam
mengungkap dan mempelajari ayat-ayat-Nya. Amiin
Bogor, Agustus 2013
Uus Saepuloh

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

xii

DAFTAR GAMBAR

xii

DAFTAR LAMPIRAN

xiv

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Tempat dan Waktu Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
Kebaruan Penelitian

1
1
5
5
5
5
6

2 ISOLASI DAN MODEL STRUKTUR TIGA DIMENSI GEN PENYANDI
ENZIM REVERSE TRANSCRIPTASE SIMIAN BETARETROVIRUS
SEROTIPE-2 (SRV-2) ASAL MONYET EKOR PANJANG INDONESIA 9
Pendahuluan
9
Bahan dan Metode
11
Hasil dan Pembahasan
13
Simpulan
20
3 ISOLASI DAN MODEL STRUKTUR TIGA DIMENSI ENZIM RNASE H
ASAL SIMIAN BETARETROVIRUS SEROTIPE-2 (SRV-2) YANG
DIISOLASI DARI MONYET EKOR PANJANG INDONESIA
21
Pendahuluan
21
Bahan dan Metode
23
Hasil dan Pembahasan
24
Simpulan
30
4 PENGKLONAAN DAN EKSPRESI GEN PENYANDI REVERSE
TRANSCRIPTASE SIMIAN BETARETROVIRUS SEROTIPE-2 (SRV-2)
ASAL MONYET EKOR PANJANG INDONESIA MENGGUNAKAN
SISTEM EKSPRESI ESCHERICHIA COLI
Pendahuluan
Bahan dan Metode
Hasil dan Pembahasan
Simpulan

31
31
33
35
43

5 PEMBAHASAN UMUM

43

6 SIMPULAN DAN SARAN

49

DAFTAR PUSTAKA

50

LAMPIRAN

56

RIWAYAT HIDUP

59

DAFTAR TABEL
2.1 Perbandingan asam amino yang berperan dalam pembentukan motif
dari RT SRV-2 Indo terhadap RT HIV-1
3.1 Perbandingan asam amino yang berperan dalam situs aktif RNase H
SRV-2 dan HIV-1
4.1 Pengukuran secara kuantitatif konsentrasi protein dan aktivitas
enzim. Konsentrasi protein ditentukan dengan Pierce BCA Protein
Assay Kit (Thermo Scientific) dan aktivitas enzim diukur dengan
Reverse Transcriptase Assay colorimetric Kit (Roche)

17
30

41

DAFTAR GAMBAR
1.1 Skema proses reverse transcriptase pada Retrovirus. Garis hitam
(RNA), garis jingga muda (utas negatif DNA), garis jingga tua (utas
positif DNA) (Coffin et al. 1997)
1.2 Peta organisasi genom lengkap virus SRV-2 yang disusun oleh gen
gag, pol dan env berukuran sekitar 8,000 bp (Coffin et al. 1997)
1.3 Kerangka pemikiran Pengembangan Enzim Rekombinan Reverse
Transcriptase Simian Betaretrovirus Serotipe-2 (SRV-2) isolat
Indonesia Asal Monyet Ekor Panjang (Macaca fascicularis)
1.4 Bagan alir rencana penelitian pengembangan enzim rekombinan
reverse transcriptase simian betaretrovirus serotipe-2 (SRV-2)
isolat Indonesia asal monyet ekor panjang (Macaca fascicularis)
2.1 Hasil amplifikasi PCR terhadap gen RT SRV-2 isolat indonesia, M)
1kb DNA ladder (Invitrogen), 1-2) produk PCR dari RT SRV-2
menghasilkan 1641 bp, 3) kontrol pereaksi
2.2 Pohon filogenetik dari runutan asam amino RT SRV-2 terhadap
retrovirus lainnya. RT SRV-2 isolat Indonesia ditandai dengan
warna merah
2.3 Penyejajaran runutan asam amino dan prediksi motif struktur
sekunder RT SRV-2 Indo dan RT HIV-1. Runutan asam amino RT
SV-2 Indo pada posisi 1-547 dan RT HIV-1 pada posisi 18-553.
Motif dicirikan oleh heliks- (H) lembaran- (S), dan coils (C).
Asam amino yang berperan dalam situs aktif ditandai huruf merah
dan bayangan merah, huruf hijau untuk runutan yang berikatan
dengan DNA, huruf biru untuk berikatan dengan dNTPs, dan huruf
ungu/bayangan ungu adalah hibrid RNA-DNA (RNase H)
2.4 Model struktur tiga dimensi dari enzim RT SRV-2 Indo
menggunakan program I-TASSER yang divisualisasi dengan
program PyMol. Nilai estimasi akurasinya yaitu 0.90±0.06 (TMscore), 4.7±3.1Å (RMSD) dan C-score = 1.33.
Subdomain
fingers/palm, thumb, connection, dan RNaseH ditandai dengan
warna merah tua, ungu, biru tua, dan hijau secara berurutan. Bulatan
biru muda menggambarkan residu situs aktif polimerase dan situs

2
4
7
8
13
14

16

pengikatan dNTPs, sedangkan motif YXDD digambarkan oleh
bulatan warna kuning
2.5 Model superposisi antara RT SRV-2 Indo dengan RT HIV-1
(2B6A.pdb), nilai estimasi akurasinya yaitu 0.911 (TM-score), 1.85
Å (RMSD), dan 0.953 (coverage).
2.6 Diagram pita dari dari RT SRV-2 Indo yang terikat pada model stick
substrat dupleks oligonukleotida RNA/DNA 18-19-basa. Berbagai
variasi domain enzim diwarnai seperti pada Gambar 2.4. Situs aktif
asam amino dari DNA polimerase dan RNase H digambarkan dalam
bulatan warna kuning
2.7 Interaksi antara asam amino yang berperan penting dalam situs aktif
polimerase pada RT SRV-2 Indo dengan bagian terminal dari
dupleks RNA/DNA. DNA diindikasikan dengan model stick
berwarna merah dan biru, sedangkan RNA dicirikan dengan stick
warna merah, putih dan biru dan ditandai dengan -1, -2, dan -3
sebagai dupleks, sedangkan RNA yang menggantung ditandai
dengan +1. A) situs RT SRV-2 digambarkan dalam permukaan
berwarna hijau dengan asam amino lestari berupa Asp165, Gln131,
Gly132, dan Arg58 (ditunjukkan dalam stick warna hijau). (B)
Interaksi situs aktif asam amino RT SRV-2 yang digambarkan dalam
model stick warna hijau
3.1 Hasil amplifikasi PCR terhadap gen RNase H SRV-2, M) 100 bp
DNA ladder (Invitrogen), 1) produk PCR RNase H SRV-2
menghasilkan 354 bp 2) Kontrol reagen
3.2 Pohon filogenetik runutan asam amino RNase H dari berbagai
retrovirus
3.3 Hasil penyejajaran majemuk (multiple alignment) domain RNase H
berbagai retrovirus beserta keterangan prediksi struktur dua dimensi
dan daerah lestarinya
3.4 Model struktur tiga dimensi RNase H SRV-2 (Panel A)
dibandingkan dengan RNase H HIV-1 (Panel B) dan superposisi
diantara keduanya (Panel C). Model bola menggambarkan residu
motif DED dari sisi aktif RNase H. Struktur heliks digambarkan
dengan huruf kapital (A- E) dan lembaran dengan nomor (1-5)
3.5 Sisi aktif katalitik residu asam amino yang berinteraksi dengan
kation Mg2+ (ditunjukkan dengan bulat kuning) pada RNase H SRV2 (A) dan RNase H HIV-1 (B)
3.6 Interaksi sisi aktif RNase H SRV-2 (A) dan HIV-1 (B) dengan
substrat nukleotida RNA. Residu asam amino yang berinteraksi
dengan nukleotida digambarkan dengan model bola dan nukleotida
RNA digambarkan dengan model tongkat
4.1 Amplifikasi gen RT SRV-2 menggunakan primer spesifik RT SRV2 RT 3284F dan 4925R. M) 100 bp DNA ladder (Invitrogen), 1-2)
Produk PCR RT SRV-2 berukuran 1641bp
4.2 A) Amplifikasi PCR terhadap plasmid pENTR/SD/TOPO RT SRV-2
menggunakan primer M13 F dan M13 R, M) 1kb DNA ladder
(Invitrogen); 1-2) Produk PCR berukuran 1991 bp mengandung RT

17
18

19

20
25
25
27

28
29

29
35

SRV-2. B) Ilustrai peta genetik vektor pENTR/SD/TOPO- RT SRV2
4.3 Runutan nukleotida RT SRV-2 isolat Indonesia pada posisi
nukleotida 3284-4925 yang disisipkan ke dalam vektor
pENTR/SD/TOPO. Situs-situs spesifik dari vektor ditandai dengan
huruf tebal dan posisi primer dicirikan dengan huruf warna merah
4.4 A) Amplifikasi PCR terhadap plasmid pDEST17 RT SRV-2
menggunakan primer T7 forward dan SRV-2 RT4925R, M) 1 kb
DNA ladder (Invitrogen), 1-2) Produk PCR berukuran 1829 bp. B)
ilustrasi peta genetik vektor pDEST17- RT SRV-2
4.5 Runutan nukleotida RT SRV-2 isolat Indonesia pada posisi
nukleotida 3284-4925 yang disisipkan ke dalam vektor pDEST17.
Situs-situs spesifik dari vektor ditandai dengan huruf tebal dan posisi
primer dicirikan dengan huruf warna merah
4.6 Panel A: Hasil elektroforesis SDS PAGE terhadap sampel protein
rekombinan RT SRV-2. M) Broad low prestained marker (BioRad)
1) pra-purifikasi, 2) bufer pengikat, 3) bufer pencuci, 4) bufer elusi.
Panel B: Analisis hasil ekspresi RT SRV-2 dengan teknik Western
blot terhadap antibodi spesifik anti-6xHis. M) Kaleidoskop
prestained marker (BioRad), 1) pra-pemurnian, 2) bufer elusi, 3)
bufer pencuci, 4) bufer pengikat
4.7 Hasil uji two step RT PCR menggunakan enzim RT SRV-2
dibandingkan dengan enzim RT komersial Superscript III RT
(SSTIII, Invitrogen®). M) 100 bp DNA ladder (Invitrogen), 1-4)
ulangan sampel, 5) kontrol reagensia
5.1 A). Skema kloning gen dan transfer melalui kloning rekombinasi.
Segitiga menunjukkan sisi rekombinasi. Gene yang berupa produk
PCR diklonkan ke dalam vektor entry yang mengandung situs attL,
KmR dan disubklonakan dengan reaksi LR clonase ke dalam vektor
destinasi yang mengandung situs attR, ApR dan ccdB. B). Sekuens
dari sisi attB1 dan attB2 yang menempel pada gene dalam klona
ekspresi (Hartley et al. 2000)

36

37

38

39

40

42

48

DAFTAR LAMPIRAN
1 Hasil pengukuran konsentrasi protein enzim rekombinan RT SRV-2
dengan teknik BCA Assay
2 Hasil pengukuran konsentrasi enzim rekombinan RT SRV-2 dengan
teknik RT colorimetric assay

57
58

1

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Selama beberapa dekade terakhir, enzim reverse transcriptase (RT) menjadi salah
satu perangkat yang sangat penting dalam bidang biologi molekuler yaitu untuk
menyintesis DNA komplementer (cDNA) dari mRNA. Aplikasi dari enzim RT ini
telah memberikan pemahaman yang luas mengenai sejumlah mekanisme regulator
seluler. Selain itu, kombinasi antara aktivitas enzim RT dengan amplifikasi PCR telah
menjadi suatu gold standard dalam proses pengklonaan daerah penyandi gen (coding
region) dari berbagai sasaran gen yan diinginkan. Enzim RT telah menjadi bagian
penting dalam perkembangan biologi molekuler, genetik, dan biomedis. Sampai saat
ini, kemajuan bioteknologi sangat tergantung salah satunya terhadap keberadaan enzim
RT yang efisien misalnya diaplikasikan dalam teknik microarray untuk mentranskripsi
balik mRNA menjadi cDNA dalam menganalisis berbagai ekspresi gen (Hizi dan
Herschhorn 2008).
Penemuan enzim RT oleh Temin dan Baltimore pada tahun 1970 telah
memberikan pengaruh yang besar dalam kemajuan penelitian bidang biologi molekuler.
Identifikasi terhadap enzim ini yang pertama kali ditemukan pada virus RNA penyebab
tumor merupakan enzim yang bersifat RNA-dependent DNA polymerase. Identifikasi
ini telah memberikan tambahan dalam dogma pusat aliran informasi genetik, yaitu dari
RNA ke DNA melalui proses transkripsi balik (reverse transcription). Enzim RT
memiliki aktivitas antara lain yaitu sebagai RNA-dependent DNA polymerase (RDDP),
DNA-dependent DNA polymerase (DDDP), dan ribonuklease H (RNase H) yang akan
memecah utas RNA dari heterodupleks RNA-DNA (Herschhorn dan Hizi 2010; Goff
2001; Coffin et al. 1997).
Proses reverse transkripsi diinisiasi setelah terjadinya penggabungan antara enzim
RT dengan RNA genomik virus dan primer. Primer diperlukan oleh semua RT untuk
inisiasi proses sintesis DNA. Transfer RNA (tRNA) asal sel inang bertindak sebagai
primer tersebut yang berbeda-beda tergantung virusnya. tRNAlys3 digunakan oleh
lentivirus dan betaretrovirus, tRNApro digunakan gamaretrovirus, dan tRNAtrp oleh
alfaretrovirus. tRNA mengandung 18 nukleotida pada ujung 3’ yang bersifat
komplementer terhadap primer binding site (PBS) yang berlokasi dekat dengan ujung
5’ dari genom RNA virus (pada HIV-1, PBS berlokasi di 180 nukleotida dari ujung)
sehingga memungkinkan terjadinya hibridisasi diantara keduanya (Flint et al. 2009;
Coffin et al. 1997; Herschhorn dan Hizi 2010).
Proses reverse transkripsi diinisiasi dengan menyintesis utas DNA (-) pertama
yang bersifat komplementer terhadap utas (+) RNA genom virus. Sintesis ini dimulai
dengan memperpanjang terminal 3’-OH dari primer tRNA yang mengopi ujung 5’ dari
genom RNA virus yang mengandung sekuens unique 5’ (U5) dan daerah repeat (R).
Terbentuknya utas DNA yang baru disintesis dengan utas RNA virus menghasilkan
suatu hibrid RNA-DNA dimana utas RNA selanjutnya dihidrolisis oleh aktivitas RNase
H yang berasosiasi dengan RT. Aktivitas ini menggunakan model pemecahan langsung
pada ujung 3’ DNA untuk menghidrolisis RNA dan meninggalkan utas tunggal DNA
bermuatan (-) sebagai utas (-) strong stop DNA (sssDNA). Pembentukan segmen (-)
sssDNA mengandung sekuens yang bersifat komplementer terhadap sekuens identik
repeat (R) yang berlokasi baik pada ujung 5’ maupun 3’ dari genom virus. Panjang

2
daerah R bervariasi pada berb
erbagai retrovirus pada kisaran 12 nukleotida pad
ada MMTV
(mouse mammary tumor viru
irus) sampai 235 nukleotida pada BLV (bovine
ne leukemia
virus). Akibat dari dulpikasi
si daerah R, (-) sssDNA dapat mengalami transf
nsfer utas (-)
(strand transfer(-)) dan berhib
ibridisasi terhadap sekuens R yang berlokasi pad
ada ujung 3’
molekul virus. Setelah utas DNA
D
asal berhibridisasi dengan utas (-) daerah R ujung 3’,
sintesis DNA berlanjut sepanjang
sep
RNA virus, sedangkan RNase H langsung
mendegradasi RNA yang tela
elah dikopi (Herschhorn dan Hizi 2010; Flint et al. 2009;
Coffin et al.1997).

Gambar 1.1

Skema pros
oses reverse transcriptase pada Retrovirus. G
Garis hitam
(RNA), garis
ris jingga muda (utas negatif DNA), garis jingga
gga tua (utas
positif DNA
A) (Coffin et al. 1997).

Pemotongan dengan RN
Nase H tidak bersifat sekuens spesifik, tetapi sek
ekuens yang
kaya akan purin (polypurine
ne tracks, PPTs) mempunyai ketahanan terhadap
ap hidrolisis
RNase H (Coffin et al. 1997
97; Goff 2001). PPT berlokasi dekat dengan uju
jung 3’ dari
RNA virus (3’-PPT) yang sed
edikit berbeda pada retrovirus yang berbeda. PPT
PT bertindak
sebagai primer utama untuk sintesis
s
DNA utas (+) setelah penghilangan sek
ekuens RNA
lainnya. Segmen RNA lainn
innya yang tertinggal setelah degradasi RNA parsial
pa
juga
dapat bertindak sebagai primeer minor untuk sintesis DNA utas (+). Dengan
an demikian,
walaupun semua retrovirus menginisiasi
m
sintesis utas (+) menggunakan PPT
PT ujung 3’

3
sebagai primer, namun beberapa retrovirus seperti HIV-1, equine infectious anemia
virus (EIAV), feline immunodeficiency virus (FIV) dan avian sarcoma and leukosis
virus (ASLV), memulai sintesis DNA utas (+) dari sisi dimulainya penambahan RNA
(Herschhorn dan Hizi 2010). Proses sintesis DNA utas (+) ini akan terhenti pada ujung
primer tRNA yang sudah mengalami transkripsi balik menghasilkan utas DNA yang
disebut plus-strand strong-stop DNA (+sssDNA). RNase H akan mendegradasi primer
tRNA menghasilkan sekuens (+)sssDNA yang berkomplemen dengan sekuens pada
ujung 3’ dari DNA utas (-). Adanya komplemen segmen PBS pada (+)sssDNA dengan
pada DNA utas (-) memungkinkan terjadinya transfer utas kedua (second strands
transfer). Terjadinya sintesis DNA utas (+) dan (-) secara komplit menghasilkan utas
ganda DNA yang akan dijadikan cetakan untuk utas berikutnya (Herschhorn dan Hizi
2010; Flint et al. 2009; Coffin et al. 1997 ). Tahapan proses RT retrovirus terdapat pada
Gambar 1.1.
Gencarnya penelitian mengenai enzim RT dipicu oleh penemuan retrovirus
manusia yaitu human immunodeficiency virus (HIV) pada dekade 1980-an yang
merupakan agen patogen penyebab terjadinya acquired immunodeficiency syndrome
(AIDS) pada manusia. Telah tersedianya informasi mengenai retrovirus dan enzim RT
sangat membantu dalam identifikasi dan penelitian mengenai agen patogen ini.
Tingginya morbiditas dan mortalitas pada penderita HIV/AIDS mengharuskan
ditemukannya agen antiretrovirus untuk tujuan terapi (Hizi dan Herschhorn 2007).
Sehubungan dengan peran sentral enzim RT dalam replikasi virus HIV, maka enzim ini
menjadi target utama untuk pengembangan senyawa antivirusnya. Hampir setengah
dari obat anti HIV/AIDS yang tersedia saat ini mempunyai target penghambatan pada
aktivitas polimerase enzim RT (Sarafianos et al. 2009; Ilina et al. 2012).
Obat anti-RT HIV yang direkomendasikan saat ini dibagi ke dalam dua kategori
yaitu sebagai nucleoside RT inhibitors (NRTIs) dan non-nucleoside RT inhibitors
(NNRTIs). Mekanisme kerja senyawa NRTIs adalah sebagai substrat analog nukleosida
alami yang tidak memiliki gugus 3’-OH yang akan berikatan dengan situs aktif DNA
polimerase sewaktu proses polimerisasi DNA. Masuknya senyawa NRTIs ke dalam
rantai perpanjangan DNA yang berkompetisi dengan nukleosida alami akan
menghentikan proses polimerisasi tersebut sehingga proses replikasi virus juga terhenti
(Huang et al. 1998; Kohlstaedt et al. 1992). Senyawa NNRTIs akan berikatan dengan
NNRTI-binding pocket merupakan daerah hidrofobik yang berbatasan dengan situs aktif
polimerase RT (∼10 Å). Senyawa NNRTI merupakan senyawa anti-RT HIV yang
bersifat non kompetitif dan tidak berinterferensi dengan pengikatan dNTP atau substrat
nukleotida RT (Sarafianos et al. 2009; Roth et al. 1997). Data struktural menunjukkan
bahwa pengikatan senyawa NNRTI akan mendistorsi posisi primer grip sehingga
mempengaruhi keselarasan dari terminal primer dengan situs aktif polimerase yang
dapat mempengaruhi tahapan sintesis DNA virus (Sarafianos et al. 2009; Herschhorn
dan Hizi 2010). Kebanyakan regimen tiga jenis obat anti-HIV standar yang biasa
diberikan untuk tujuan terapi mengandung kombinasi dua senyawa NRTIs dan satu
senyawa NNRTI atau inhibitor protease HIV. Senyawa NRTIs HIV yang telah
mendapat ijin dari Food and Drug Administration (FDA) Amerika Serikat adalah: AZT
(azidovudine), 3TC-(lamivudine), FTC (emtricitabine), ddI (didanosine), dan ABC
(abacavir); sedangkan senyawa NNRTIs adalah nevirapine, delavirdine, efavirenz, dan
etravirine (Sarafianos et al. 2009; Ilina et al. 2012)
Terapi anti-RT HIV ternyata memunculkan masalah baru yaitu terjadinya
resistensi terhadap obat anti-RT akibat adanya mutasi pada situs aktif polimerase RT

4
HIV sehingga dilakukan penca
carian target senyawa obat lainnya. Domain RNa
Nase H yang
berasosiasi dengan enzim RT
T yang penting dalam proses replikasi virus juga
jug menjadi
target pengembangan senyawa
wa anti-HIV baru (Su et al. 2010; Kirby et al. 201
012; Ilina et
al. 2012). Beberapa senyawaa anti-RNase
a
H HIV telah dikembangkan dan sud
udah melalui
uji pra-klinis. Hal ini membuk
uktikan bahwa sampai saat ini enzim RT menjadi
di salah satu
enzim yang paling banyak dipelajari
d
dalam bidang biomedis (Herschhorn
rn dan Hizi
2010).
Penelitian enzim RT terus
te
berkembang tidak hanya terhadap virus H
HIV namun
juga dari berbagai jenis virus
us lainnya dari famili Retroviridae. Tujuan dari
ri penelitian
tersebut selain untuk pencaria
rian model virus dalam pengembangan anti RT
T HIV, juga
untuk pemenuhan enzim rek
ekombinan RT yang mempunyai aktivitas enz
nzim tinggi.
Berbagai jenis enzim RT yang
y
telah dipelajari karakteristik biokimiany
nya melalui
pengembangan enzim rekomb
mbinannya antara lain berasal dari Molony murine
ine leukemia
virus (MMLV) (Chen et al. 2009),
2
MMTV (Taube et al. 1998), ASLV, FIV,
V, Human T
lymphotropic virus (HTLV),
), dan Simian immunodefieciency virus (SIV) ((Flint et al.
2009; Coffin et al. 1997; Hers
rschhorn dan Hizi 2010). Enzim RT MMLV bah
ahkan sudah
ditentukan struktur tiga dimen
ensinya melalui teknik kristalografi sinar-X sepe
eperti halnya
pada RT HIV (Cote et al. 2008
08).

Gambar 1.2

Peta organisasi
si genom lengkap virus SRV-2 yang disusun ole
leh gen gag,
pol dan env ber
erukuran sekitar 8,000 bp (Coffin et al. 1997).

s
(SRV-2) tergolong dalam famili Re
Retroviridae
Simian betaretrovirus serotipe-2
dan genus betaretrovirus. Viru
irus ini umumnya secara alami menyerang popula
ulasi monyet
Asia genus Macaca khususny
nya asal Indonesia (Iskandriati et al. 2010; Iskand
ndriati et al.
1998; Pamungkas et al. 1991
91; Marx et al. 1985). SRV-2 merupakan pat
atogen yang
berbahaya yang dapat meny
nyebabkan infeksi endemik bagi populasi satw
twa primata
(Philipp-Staheli et al. 2006;; Lerche 2010). Virus ini dapat menyebabkan
an penyakit
Simian acquired immunodefic
ficiency syndrome (SAIDS) yang menyerupai A
AIDS pada
manusia (Fujimoto et al. 201
010; Gardner et al. 1998; Marx et al. 1984).. Penelitian
terdahulu tentang SRV-2 tela
lah berhasil mengidentifikasi genom SRV-2 dan
an diketahui
memiliki empat gen utama yaitu
y
gag (group specific antigen), env (enve
velope), prt
(protease), dan pol (polymera
erase) (Gambar 1.2) (Marraci et al. 1995; Mar
arraci et al.
1999; Thayer et al. 1987 ).
Gen pol pada SRV-2 memiliki
me
panjang sekitar 867 asam amino dan me
menyandikan
pol polyprotein, yang terbag
agi menjadi dua enzim yaitu RT/RNase-H dan
an integrase.
Enzim RT berperan untuk menyintesis
me
utas DNA dari RNA virus, sedangkan
an integrase
berperan untuk menggabungka
kan DNA yang baru terbentuk dengan kromosom
m inangnya.
Hingga kini belum ada pene
nelitian mengenai RT asal SRV-2 khususnya un
untuk isolat
Indonesia. Adanya gen RT
T pada SRV-2 memungkinkan untuk dikemb
mbangkannya
menjadi enzim rekombinan RT
R asal SRV-2 isolat Indonesia yang dapat dia
diaplikasikan

5
baik dalam bidang biologi molekuler misalnya pada teknik RT-PCR maupun sebagai
model enzim RT untuk pencarian senyawa anti RT retrovirus.

Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini yaitu untuk menghasilkan enzim rekombinan RT SRV-2
isolat Indonesia asal monyet ekor panjang (Macaca fascicularis), melalui tahapan
penelitian sebagai berikut:
Isolasi, pemodelan struktur tiga dimensi, dan karakterisasi molekuler secara in
silico enzim RT dan RNase H SRV-2 isolat Indonesia
Ekspresi gen penyandi RT SRV-2 isolat Indonesia menggunakan sistem
ekspresi Escherichia coli
Pemurnian, analisis hasil ekspresi dan uji aktivitas enzim rekombinan RT
SRV-2 isolat Indonesia

Manfaat Penelitian
Tersedianya enzim rekombinan reverse transcriptase produk lokal asal SRV-2
isolat Indonesia yang mempunyai aktivitas enzim optimal diharapkan akan dapat
diaplikasikan dalam bidang biologi molekuler khususnya dalam teknik RT-PCR dan
dapat dijadikan model enzim dalam pengembangan senyawa antiretrovirus.
Diharapkan, hal ini akan memberikan kontribusi dalam mendukung kemajuan bidang
biologi molekuler di Indonesia dan mengurangi ketergantungan terhadap enzim sejenis
yang masih didatangkan dari produsen di luar negeri. Teknologi untuk menghasilkan
produk enzim reverse transcriptase SRV-2 isolat Indonesia ini merupakan salah satu
contoh potensi yang dapat dikembangkan dalam memanfaatkan keanekaragaman
biodiversitas Indonesia.

Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi dan
Laboratorium Bioteknologi Pusat Studi Satwa Primata, Lembaga Penelitian dan
Pengabdian Kepada Masyarakat, Institut Pertanian Bogor (PSSP LPPM IPB), jalan
Lodaya II/5 Bogor 16151. Penelitian dilaksanakan pada bulan Januari 2012 sampai
dengan bulan Desember 2012.

Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini difokuskan pada pengembangan enzim rekombinan reverse
transcriptase Simian betaretrovirus serotipe-2 isolat Indonesia asal monyet ekor
panjang. Untuk mencapai tujuan tersebut, dilakukan melalui dua tahap penelitian.
Tahap pertama yang terdapat pada Bab 2 dan Bab 3 menjelaskan tentang isolasi gen
penyandi RT dan RNase H pada SRV-2 isolat Indonesia yang dilanjutkan dengan
pengurutan nukleotida dengan teknik sekuensing. Translasi asam amino dilakukan

6
menggunakan program komputasi on line EMBOSS Transeq dan ORF finder dan
selanjutnya asam amino yang diperoleh dikonstruksi struktur molekulnya dengan
program I-TASSER yang divisualisasi dengan program PyMol. Informasi yang
diperoleh yaitu model struktur sekunder, struktur tersier (3D), asam amino yang
berperan dalam situs aktif, dan situs katalitik enzim. Tahap pertama ini dilakukan
karena belum adanya informasi-informasi terkait yang diperoleh dari penelitian
sebelumnya terutama penelitian tentang struktur molekul RT SRV-2.
Berbekal informasi dari Bab 2 dan Bab 3 tersebut, selanjutnya dilakukan tahap
kedua yaitu konstruksi gen untuk proses pengklonaan dalam sistem ekspresi
Escherichia coli dalam upaya menghasilkan enzim rekombinan RT SRV-2 yang
dijelaskan dalam Bab 4. Digunakan metode Gateway technology (Invitrogen, USA)
dalam mengekspresikan gen target RT SRV-2 menggunakan vektor entry
pENTR/SD/TOPO yang disubklonakan pada vektor destinasi pDEST17 untuk
diekspresikan dalam E. coli BL21AI. Pemurnian protein rekombinan dilakukan
menggunakan kromatografi afinitas Ni2+-NTA. Hasil ekspresi dianalisis dengan teknik
SDS-PAGE dan Western blot yang menghasilkan protein berukuran sekitar 64.9 kDa
dan diuji aktivitasnya dengan RT colorimetric assay serta RT-PCR. Dihasilkannya
enzim rekombinan RT SRV-2 isolat Indonesia yang mempunyai aktivitas enzim optimal
diharapkan akan dapat diaplikasikan di bidang biologi molekuler khususnya dalam
teknik RT-PCR dan dapat dijadikan model enzim dalam pengembangan senyawa
antiretrovirus.

Kebaruan Penelitian (Novelty)
Selama ini, SRV-2 dianggap sebagai agen patogen penyebab terjadinya SAIDS
pada monyet Asia genus Macaca. Infeksi SRV-2 dapat menyebabkan morbiditas dan
mortalitas yang menjadi masalah dalam penangkaran satwa primata. Infeksi SRV-2
juga menjadi faktor pengganggu (confounding variable) pada penelitian yang
menggunakan satwa primata sebagai hewan model penelitiannya. Penelitian ini
mencoba untuk mengeksplorasi virus SRV-2 dengan harapan dapat diperoleh nilai
positif yang bermanfaat. Adanya gen penyandi enzim RT pada SRV-2 berpotensi untuk
dipelajari dalam upaya pengembangan enzim rekombinan RT mengingat enzim ini
sangat potensial dalam bidang biomedis. Sampai saat ini, enzim RT SRV-2 belum
banyak diteliti sehingga informasi terkait struktur molekul, sifat-sifat biokimia dan
pengembangan enzim rekombinannya belum ada terutama asal isolat Indonesia.
Kebaruan dari penelitian ini adalah:
Gen penyandi enzim RT asal SRV-2 isolat Indonesia berhasil diisolasi dan
dikarakterisasi.
Pemodelan struktur tiga dimensi menggunakan program komputasi I-TASSER
berhasil memprediksi gambaran tiga dimensi enzim RT SRV-2 baik domaindomainnya, interaksi dengan substratnya maupun situs-situs aktifnya pada domain
polimerase dan RNase H.
Enzim rekombinan RT SRV-2 berhasil dikembangkan dengan menggunakan
sistem ekspresi Escherichia coli berbasis sistem pengklonaan Gateway
technology. Enzim rekombinan tersebut berhasil dimurnikan, diuji aktivitasnya
dan diaplikasikan secara terbatas pada teknik RT-PCR.

7

Kerangka Pemikiran
Simian betaretrovirus Serotipe-2
(SRV-2)

Potensi yang merugikan

Potensi yang menguntungkan

Secara alami menyerang populasi
monyet Asia genus Macaca
khususnya di Indonesia

SRV isolat Indonesia asal Macaca
fascicularis telah berhasil diisolasi
dan diidentifikasi

Merupakan patogen yang
berbahaya yang dapat
menyebabkan infeksi endemik
bagi populasi primata

Memiliki empat gen utama yaitu
gag (group specific antigen), env
(envelope), prt (protease), dan pol
(polymerase)

Dapat menyebabkan penyakit
Simian acquired
immunodeficiency syndrome
(SAIDS) pada beberapa satwa
primata genus Macaca

Agen patogen utama yang harus
dieliminasi dalam penangkaran
satwa primata program SPF
(Specific Pathogen Free)

Gen pol merupakan gen penyandi
enzim reverse transcriptase
Memungkinkan untuk
dikembangkannya menjadi enzim
rekombinan reverse transcriptase
asal SRV-2 isolat Indonesia

Isolasi dan
karakterisasi model
struktur 3D enzim
RT dan RNaseH
SRV-2

Ekspresi pada
sistem ekspresi
Eschericia coli
dengan Gateway
technology

Enzim rekombinan reverse
transcriptase SRV-2

Dapat
diaplikasikan
dalam teknik RTPCR

Model enzim
untuk
pengembangan
senyawa
antiretrovirus

Gambar 1.3 Kerangka pemikiran Pengembangan Enzim Rekombinan Reverse
Transcriptase Simian Betaretrovirus Serotipe-2 (SRV-2) isolat Indonesia
Asal Monyet Ekor Panjang (Macaca fascicularis)

8
SRV-2 Isolat Indonesia

Amplifikasi PCR gen pol
SRV-2

Penentuan gen target
RT/RNaseH SRV-2 dengan
teknik PCR

Sekuensing

Analisis Bioinformatika
Bioedit
ClustalW
Emboss Transeq/
ORF Finder

Konstruksi Pohon Filogenetik
dengan MEGA5
Prediksi Struktur Tiga Dimensi
• I-TASSER
• PyMol

Pengklonaan terhadap
pENTR/SD/TOPO

Sub klonaan terhadap
pDEST17

Ekspresi di dalam Escherichia
coli BL21AI

Perbanyakan dan Pemurnian
isolat protein rekombinan RT
SRV-2

• Analisis ekspresi protein:
SDS PAGE/Western blot
• Uji aktivitas enzim RT:
RT colorimetric Assay
• Aplikasi pada teknik RT PCR

Produk protein rekombinan
RT SRV-2

Gambar 1.4 Bagan alir rencana penelitian pengembangan enzim rekombinan reverse
transcriptase simian betaretrovirus serotipe-2 (SRV-2) isolat Indonesia
asal monyet ekor panjang (Macaca fascicularis).

9

2 ISOLASI DAN MODEL STRUKTUR TIGA DIMENSI GEN
PENYANDI ENZIM REVERSE TRANSCRIPTASE SIMIAN
BETARETROVIRUS SEROTIPE-2 (SRV-2) ASAL MONYET EKOR
PANJANG INDONESIA
Isolation and Three-Dimensional Structure Model of Gene Encoding Reverse
Transcriptase of Simian Betaretrovirus Serotype-2 (SRV-2) Isolated from Indonesia
Cynomolgus Monkey

Abstract
In this study, we isolated the gene encoding reverse transcriptase enzyme of SRV-2 that
infected Indonesian Cynomolgus monkey (SRV-2 RT Indo) and predicted the three
dimensional structure model using I-TASSER computational program. The SRV-2 RT
Indo consisted of 547 amino acids at nucleotide position 3284-4925 that has 25.5%
similarity compared to HIV-1 RT. The polymerase active site located in the finger/palm
subdomain characterized by three conserved catalytic aspartates (Asp90, Asp165,
Asp166), and has a highly conserved YMDD motif as Tyr163, Met164, Asp165, and
Asp166. We estimated the SRV-2 RT Indo structure that has the accuracy of TM-score
0.90±0.06 and RMSD 4.7±3.1Å, indicating this model can be trusted and the accuracy
can be seen from the appearance of protein folding in tertiary structure. The
superpositionings between SRV-2 RT Indo and HIV-1 RT were performed to predict
the structural in details and to optimize the best fits for illustrations. This SRV-2 RT
Indo structure model has the highest homology to HIV-1 RT (2B6A.pdb) with estimated
accuracy at TM-score 0.911, RMSD 1.85 Å, and coverage of 0.953. This preliminary
study of SRV-2 RT Indo structure modeling is intriguing, given some information to
explore the molecular characteristic and biochemical mechanism of this enzyme.

Keywords: reverse transcriptase, SRV-2 Indo, I-TASSER, 3D structure model

Pendahuluan
Reverse transcriptase (RT) retrovirus merupakan suatu enzim multifungsi yang
mengkatalisis pembentukan DNA utas ganda dari RNA utas tunggal genom retrovirus.
Proses yang kompleks ini disebut dengan transkripsi balik (reverse transcription) yaitu
suatu tahapan yang sangat penting dalam siklus hidup retrovirus dan bertanggung jawab
terhadap replikasi genomnya. DNA yang baru disintesis selanjutnya akan berintegrasi
ke dalam genom inangnya dengan bantuan enzim integrase retrovirus (Telesnitsky dan
Goff 1997; Goff 2001; Coffin et al. 1997). Enzim retrovirus RT memiliki beberapa
fungsi yaitu sebagai RNA-dependent DNA polymerase, DNA dependent DNA
polymerase, pemecahan hibrid DNA-RNA (DNA-directed RNA cleavage), strand
transfer, dan strand displacement synthesis (Herschhorn dan Hizi 2010; Coffin et al.
1997). Enzim RT memiliki dua aktivitas enzimatik yaitu sebagai polimerase DNA dan
RNase H yang masing-masing berlokasi pada dua domain yang terpisah. Polimerase
DNA mempunyai kemampuan untuk menggunakan DNA maupun RNA sebagai
cetakannya sedangkan RNase H berfungsi untuk menghidrolisis utas RNA dari hibrid

10
RNA-DNA. Aktivitas polimerase dan RNase H keduanya berperan sangat penting
dalam proses replikasi virus (Coté dan Roth 2008; Telesnitsky dan Goff 1997). Genom
retrovirus mengandung gen penyandi domain gag, pol dan env, dimana gen pol
mengkodekan prekursor protein Pol yang mengandung enzim RT/RNase H dan
integrase (Telesnitsky dan Goff 1997; Goff 2001; Coffin et al. 1997). Enzim RT dari
berbagai kelompok retrovirus yang berbeda memiliki kesamaan aktivitas fungsi
katalitik. Namun demikian, terdapat beberapa perbedaan dalam hal struktur dan
komposisi subunit, berat molekul, sifat-sifat katalitik, karakteristik biofisika dan
biokimia serta sensitivitas terhadap inhibitor (Herschhorn dan Hizi 2010).
Enzim RT asal virus HIV-1 (human immunodeficiency virus) merupakan enzim
yang paling banyak dipelajari dalam bidang biomedis pada beberapa dekade ini
(Herschhorn dan Hizi 2010). Enzim RT HIV-1 menjadi sasaran utama dalam
pengembangan senyawa obat antiretrovirus untuk terapi akibat infeksi HIV-1 yang
dapat menyebabkan terjadinya sindroma penurunan kekebalan tubuh (acquired
immunodeficiency syndrome, AIDS). Lebih dari setengah obat anti HIV-1 yang
disetujui FDA (food and drug administration) mempunyai target kerja untuk
menghambat aktivitas enzim RT virus HIV tersebut (Ilina et al. 2012; Sarafianos et al.
2009). Enzim RT HIV-1 menjadi obyek penelitian yang dilakukan secara intensif
melalui penentuan struktur kristal tiga dimensi dan uji-uji biokimia (Sarafianos et al.
2009). Penelitian yang telah dilakukan terkait karakteristik struktur enzim RT HIV-1
adalah antara lain penentuan kompleks struktur enzim RT dengan DNA utas ganda
(Ding et al. 1998); interaksi dengan nukleotida (Huang et al. 1998) dan interaksi dengan
hibrid RNA-DNA (Sarafianos et al. 2001).
Simian betaretrovirus serotipe-2 (SRV-2) merupakan agen penyebab terjadinya
sindroma penurunan kekebalan tubuh dan bertanggung jawab terhadap terjadinya
morbiditas dan mortalitas pada satwa primata monyet Asia genus Macaca baik di
fasilitas penelitian maupun di penangkaran (Marx et al. 1984; Gardner et al. 1988;
Lerche 2010). Infeksi SRV-2 pada Macaca dapat menjadi faktor pengganggu
(confounding) dalam penelitian biomedis yang menggunakan satwa-satwa ini sebagai
subyek penelitian (Lerche dan Osborn 2003). Mengingat potensi infeksi aktif atau laten
dan abnormalitas kekebalan yang terkait pada infeksi ini, maka SRV-2 merupakan
salah satu target agen patogen yang harus dieliminasi dalam program penangkaran
satwa primata genus Macaca bebas patogen tertentu (specific pathogen free, SPF)
(Morton et al. 2008). Namun demikian, terdapat potensi menguntungkan yang dapat
dieksplorasi dengan mempelajari retrovirus lainnya terutama terhadap HIV/AIDS
melalui pemahaman mekanisme interaksi dengan inangnya dan efek imunosupresi,
mekanisme infeksi, struktur virus, serta pengembangan antiretrovirus dan vaksinnya
(Montiel et al. 2010; Lerche dan Osborn 2003).
Genom SRV-2 mengandung empat gen utama yang tersusun dengan urutan 5’gag-prt-pol-env-3’ dan mempunyai ukuran provirus sebesar 8105-bp (Marracci et al.
1995; Marracci et al. 1999, Thayer et al. 1987). Sebagaimana karakteristik yang
dimiliki oleh semua retrovirus, SRV-2 mempunyai kemampuan untuk mentranskripsi
balik genom RNA-nya menjadi DNA utas ganda melalui aksi dari enzim RT. DNA utas
ganda yang dihasilkan disisipkan ke dalam genom kromosom inangnya secara random
yang selanjutnya akan diekspresikan sebagai informasi genetik dari retrovirus (Marracci
et al. 1999). Adanya gen penyandi enzim RT pada SRV-2 sangat potensial untuk
dipelajari dan dimanfaatkan lebih lanjut sebagai model enzim RT untuk pengembangan
kandidat senyawa obat anti-RT terhadap retrovirus terutama HIV/AIDS.

11
Pada penelitian ini, dilakukan isolasi gen penyandi enzim RT asal SRV-2 yang
menginfeksi monyet ekor panjang (Macaca fascicularis) Indonesia dan dilakukan
prediksi model struktur tiga dimensinya (3D) menggunakan program komputer ITASSER (Iterative Threading ASSEmbly Refinement). I-TASSER merupakan metode
komputasi yang telah berhasil secara akurat dalam melakukan pemodelan struktur
protein (Zha