Purification and Characterization of Cellulase Enzyme from Bacteria Isolated from Seaweed Waste

PEMURNIAN DAN KARAKTERISASI ENZIM SELULASE DARI
BAKTERI YANG DIISOLASI DARI LIMBAH RUMPUT LAUT

ISNA RAHMADINI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012

© Hak Cipta milik IPB, tahun 2012
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan
pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan,
penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tidak
merugikan kepentingan yang wajar IPB.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya
tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN

SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa Tesis Pemurnian dan Karakterisasi
Enzim Selulase dari Bakteri yang Diisolasi dari Limbah Rumput Laut adalah
karya saya sendiri yang merupakan bagian dari penelitian kelompok peneliti
Bioteknologi BBP4BKP tahun anggaran 2010/2011 dan belum diajukan dalam
bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau kutipan dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir tesis ini.

Bogor, Mei 2012
Isna Rahmadini
NIM P051090191

ABSTRACT
ISNA RAHMADINI. Purification and Characterization of Cellulase Enzyme from
Bacteria Isolated from Seaweed Waste. Under direction of NISA RACHMANIA
MUBARIK and EKOWATI CHASANAH.
Seaweedwasteis a sourceof bacteria thatcanproduce cellulaseenzyme.

PMP0126yisolateis one collection isolateof the Research and Development Center
for Marine and Fisheries Product Proecessing and Biotechnology Agency for
Marine and Fisheries Research and Development Ministry of Marine Affairs and
Fisheries obtainedfromseaweed wastefrom Pameungpeukarea, Garut, West Java.
The aims this research were to purify, characterize the cellulase enzyme, and
identify the bacteria producing the enzyme using 16S-rRNA. PMP
0126yisolatewasa
Gram-negativeshortrodshape
bacteria.
Based
on
thesequencingof the 16S-rRNA genfrom 1282base pairPMP0126y isolate
had96%similaritywith Chryseobacteriumindologenesstrain McR-1. Theisolate had
1.9 cellulolytic index onCarboxymethyl Cellulose(CMC) agar medium. The
highestcellulaseactivityobtained onthe thirdday offermentation timewith
acellulaseactivityof0.108U/mLandspecificactivityof0.120U/mg.
Initialpurificationof
cellulasebyultrafiltrationproducedactivityof0.112U/mL.
Purificationthe
enzyme

byanionexchange
chromatographyproducedthe
highestpeak of proteininthefraction no. 48withcellulaseactivityof0.154U/mLat
37.3mMNaCl.Optimumactivity ofthe cellulaseenzymeafterultrafiltrationwaspH
5and300C,while optimumactivity ofthe cellulaseenzymebyanionexchange
chromatographywaspH 5and400C. At 300C, the enzymeremainedstableup
to4hourincubation.Theactivity ofthe cellulasewasincreasedbyaddition ofCaCl2ions
by 53%anddecreased bythe additionof ZnCl2 ions by 78%. Thecellulase showed
the highest activity i.e. 0.149U/mL using treated seaweed wasteGlacilariasp. as
substrate. Using SDS-PAGE and zimogram analysis, the molecular weight of the
cellulase was estimated to be 39 kDa, 30 kDa, and 14 kDa.
Keywords:cellulase,characterization,purification, seaweedwaste.

RINGKASAN
ISNA RAHMADINI. Pemurnian dan Karakterisasi Enzim Selulase dari Bakteri
yang Diisolasi dari Limbah Rumput Laut. Dibimbing oleh Nisa Rachmania
Mubarik dan Ekowati Chasanah.
Limbah pengolahan rumput laut merupakan salah satu sumber bakteri
yang dapat menghasilkan enzim selulase. Industri pengolahan agar-agar dari
rumput laut Glacilaria sp. di daerah Pemeungpeuk Garut, Jawa Barat merupakan

sumber isolat PMP 0126y yang mampu menghasilkan enzim selulase. Isolat ini
merupakan koleksi BBP4BKP yang dapat tumbuh baik pada suhu 37 0C. Hasil
pewarnaan Gram isolat PMP 0126y bersifat Gram negatif dengan bentuk batang
pendek. Berdasarkan hasil sekuensing gen penyandi16S-rRNA dari 1282 pasang
basa, isolat PMP 0126y memiliki kemiripan sebesar 96% dengan bakteri
Chryseobacterium indologenes galur McR-1.
Uji kualitatif dilakukan dengan mengukur indeks selulolitik yang
dihasilkan oleh bakteri pada media agar-agar yang mengandung Carboxymethyl
Cellulose (CMC). Indeks selulolitik yang dihasilkan oleh isolat PMP 0126y pada
media agar-agar CMC 1% sebesar 1,9 pada hari kelima dengan suhu inkubasi
37 0C. Uji kuantitatif yang dilakukan terhadap selulase yang dihasilkan oleh isolat
PMP 0126y menghasilkan aktivitas selulase tertinggi pada hari ketiga produksi
dengan aktivitas selulase sebesar 0,108 U/ml dan aktivitas spesifik sebesar
0,120 U/ml.
Enzim selulase dipekatkan dengan melakukan pengendapan amonium
sulfat dan ultrafiltrasi. Persentase amonium sulfat yang terbaik dihasilkan pada
50% amonium sulfat dengan aktivitas selulase yang diperoleh sebesar 0,072 U/ml
dan aktvitas spesifik 0,128 U/mg pada endapan. Pemekatan dengan ultrafiltasi
menghasilkan aktivitas selulase sebesar 0,112 U/ml dan aktivitas spesifik
0,136 U/mg. Pemurnian selanjutnya dilakukan dengan kromatografi penukar

anion (KPA) yang menghasilkan puncak tertinggi pada fraksi ke-48 dengan
aktivitas selulase sebesar 0,154 U/ml ketika dielusi dengan NaCl sebesar
37,3 mM. Pra pemurnian enzim selulase dengan ultrafiltrasi menghasilkan
rendemen sebesar 17,5% dengan tingkat kemurnian 15,82 kali. Enzim hasil
pemurnian dengan KPA menghasilkan rendemen sebesar 19,6% dengan tingkat
kemurnian sebesar 15,08 kali. Hasil SDS-PAGE dan zimogram menunjukkan ada
tiga protein enzim selulase dari isolat PMP 0126y pada berat molekul yaitu
39 kDa, 30 kDa, dan 14 kDa.
Aktivitas optimum enzim selulase PMP 0126y hasil ultrafiltrasi tertinggi
pada bufer sitrat fosfat pH 5 dan suhu 30 0C. Enzim tetap stabil selama 4 jam
inkubasi pada suhu 30 0C. Aktivitas relatif tertinggi enzim selulase meningkat
dengan penambahan logam CaCl2 sebesar 53% dan menurun pada penambahan
logam ZnCl2 sebesar 78%. Aktivitas enzim selulase tertinggi pada substrat limbah
pengolahan rumput laut Pameungpeuk yang telah didelignifikasi dengan
NaOH 6% sebesar 0,149 U/ml.

PEMURNIAN DAN KARAKTERISASI ENZIM SELULASE DARI
BAKTERI YANG DIISOLASI DARI LIMBAH RUMPUT LAUT

ISNA RAHMADINI

Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program StudiBioteknologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Prof. Dr. Anja Meryandini, M.S.

Judul Penelitian : Pemurnian dan Karakterisasi Enzim Selulase dari Bakteri
yang Diisolasi dari Limbah Rumput Laut
Nama
: Isna Rahmadini
NIM
: P051090191

Disetujui
Komisi Pembimbing

Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si.
Ketua

Dr. Ekowati Chasanah, M.Sc.
Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi
Bioteknologi

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA.

Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.

Tanggal Ujian : 16 April 2012

Tanggal Lulus:

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Lahat pada tanggal 19 April 1988 dari Ayah H. Hardi
Bustanuddin dan Ibu Hj. Muchlisa. Penulis merupakan anak kelima dari lima
bersaudara.
Tahun 2005 penulis lulus dari SMA Negeri 2 Lahat dan masuk seleksi
PBUD di Universitas Riau pada Program Studi Teknologi Hasil Perikanan (THP)
dan berhasil menyelesaikan kuliah pada tahun 2009. Pada tahun yang sama,
penulis melanjutkan sekolah dan masuk ke dalam Mayor Multidisiplin, Program
Studi Bioteknologi, IPB.
Penulis melaksanakan penelitian di Balai Besar Penelitian dan
Pengembangan Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan
(BBP4BKP) dan berhasil menyelesaikan penelitian dengan judul tesis Pemurnian
dan Karakterisasi Enzim Selulase dari Bakteri yang Diisolasi dari Limbah Rumput
Laut.

PRAKATA

Puji syukur Alhamdulillah penulis panjatkan kepada Allah SWT atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Februari 2011 ini ialah
enzim selulase, dengan judul Pemurnian dan Karakterisasi Enzim Selulase dari
Bakteri yang Diisolasi dari Limbah Rumput Laut.
Penulis mengucapkan terima kasih dan penghargaan yang tinggi kepada
Ibu Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si. selaku ketua komisi pembimbing yang
telah memberikan bimbingan dan perhatian penuh dalam penulisan tesis. Ucapan
terima kasih dan penghargaan yang tinggi juga kepada Ibu Dr. Ekowati Chasanah,
M.Sc. selaku anggota komisi pembimbing yang telah memberikan kesempatan
kepada penulis untuk melakukan penelitian dan bimbingan selama penelitian,
serta kepada Ibu Ir. Yusro Nuri Fawzya, M.Si. yang telah banyak memberikan
saran dan bimbingan selama penelitian. Tidak lupa penulis mengucapkan terima
kasih banyak kepada Ibu Prof. Dr. Anja Meryandini, M.S. sebagai penguji ujian
tesis dan Bapak Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA. sebagai ketua Program Studi
Bioteknologi yang telah memberikan saran dan masukan terhadap penulisan demi
kesempurnaan tesis ini. Di samping itu, penulis menyampaikan terima kasih
kepada Balai Besar Penelitian Pengembangan Pengolahan Produk dan

Bioteknologi Kelautan dan Perikanan (BBP4BKP) yang telah membiayai dan
memberikan segala fasilitas kepada penulis untuk melakukan penelitian di
Laboratorium Bioteknologi dan Mikrobiologi BBP4BKP Petamburan, Jakarta
Pusat.
Ucapan terima kasih yang sangat mendalam kepada Papa tersayang H.
Hardi Bustanuddin dan Mama tersayang Hj. Muchlisa atas doa dan kasih sayang
tulus yang tidak hentinya kepada penulis. Kepada saudaraku Uni Neci, Uni Neva,
Uni Nani, Kakak Aden, dan semua kakak ipar serta seluruh keponakanku yang
telah memberikan semangat dan doa kepada penulis selama kuliah sehingga dapat
menyelesaikan sekolah di Institut Pertanian Bogor. Rasa terima kasih kepada
rekan-rekan di Laboratorium Bioteknologi BBP4BKP (Mbak Asri, Mbak Maya,
Mbak Ayu, Mbak Dewi, Mas Gintung, Bu Ifah, Bu Devi, Bu Dewi) yang telah

membantu selama penelitian di BBP4BKP. Teman-teman seperjuangan di
Program Studi Bioteknologi Angkatan 2009 dan Jurusan THP, serta semua alumni
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Riau yang sedang sekolah di
IPB atas persahabatan, dorongan, semangat, dan bantuan dalam penyelesaian tesis
ini. Semoga Allah SWT membalas semua kebaikan yang telah diberikan dengan
balasan yang sempurna. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Mei 2012

Isna Rahmadini

DAFTAR ISI

Halaman
DAFTAR TABEL ..........................................................................................

xv

DAFTAR GAMBAR .....................................................................................

xvi

DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................

xvii

PENDAHULUAN
Latar belakang. .......................................................................................
Tujuan Penelitian ....................................................................................
Manfaat Penelitian ..................................................................................

1
3
3

TINJAUAN PUSTAKA
Selulosa ...................................................................................................
Rumput Laut ...........................................................................................
Enzim Selulase........................................................................................
Mikroorganisme Penghasil Enzim Selulase ...........................................
Pemekatan Enzim ...................................................................................
Kromatografi Kolom...............................................................................
Elektroforesis ..........................................................................................
Identifikasi Mikroorganisme dengan 16S-rRNA ....................................

5
6
7
12
13
15
19
20

BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat ..................................................................................
Bahan dan Alat Penelitian.......................................................................
Peremajaan Isolat PMP 0126y ................................................................
Pengamatan Morfologi Isolat PMP 0126y..............................................
Identifikasi Bakteri secara Molekuler .....................................................
Uji Kualitatif Enzim Selulase .................................................................
Penentuan Waktu Optimum Produksi Enzim Selulase ...........................
Produksi Enzim Kasar Selulase ..............................................................
Pemurnian Enzim Selulase .....................................................................
Analisis Elektroforesis SDS-PAGE dan Zimogram ...............................
Pengukuran Kadar Protein ......................................................................
Karakterisasi Enzim Selulase..................................................................

23
23
24
24
24
26
27
28
29
30
32
32

HASIL
Identifikasi Isolat PMP 0126y ................................................................
Pertumbuhan dan Produksi Enzim Selulase ...........................................
Pemurnian Enzim Selulase .....................................................................
Analisis Berat Molekul Enzim Selulase Menggunakan SDSPAGE dan Zimogram .............................................................................
Karakterisasi Enzim Selulase .................................................................

35
37
40
42
44

PEMBAHASAN
Identifikasi Isolat PMP 0126y ................................................................
Pertumbuhan dan Produksi Enzim Selulase ...........................................
Pemurnian dan Karakterisasi Enzim Selulase ........................................

49
50
51

SIMPULAN .....................................................................................................

59

DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................

61

LAMPIRAN .....................................................................................................

71

DAFTAR TABEL

Halaman
1

Komposisi kimia rumput laut ...................................................................

7

2

Hidrolisis berbagai substrat oleh enzim selulase ......................................

9

3

Substrat selulosa berdasarkan kelarutan air dan jenis enzim selulase ......

10

4

Metode kromatografi untuk fraksinasi protein .........................................

15

5

Teknik kromatografi yang digunakan pada pemurnian selulase ..............

16

6 Komposisi gel pemisah dan gel penahan untuk sepasang gel ...................

30

7 Aktivitas selulase hasil ultrafiltrasi ...........................................................

41

8 Hasil uji aktivitas selulase PMP 0126y pada beberapa tahap
pemurnian ..................................................................................................

42

9 Pemurnian dan karakterisasi selulase dari berbagai jenis bakteri ...............

54

DAFTAR GAMBAR

Halaman
1

Struktur serat selulosa ...........................................................................

5

2

Struktur selulosa teratur (kristalin) dan kurang teratur (amorphous) ...

6

3

Pemecahan selulosa menjadi glukosa oleh enzim selulase ..................

8

4

Klasifikasi enzim selulase....................................................................

9

5

Mekanisme degradasi selulosa ............................................................

11

6

Pemurnian enzim dengan kromatografi penukar ion ...........................

17

7

Isolat PMP 0126y ................................................................................

35

8

Pewarnaan Gram isolat PMP 0126y dengan perbesaran 1000 x .........

35

9

Hasil amplifikasi dari gen penyandi 16S-rRNA isolat PMP 0126y .

36

10

Sebagian sekuen DNA penyandi 16S-rRNA isolat PMP 0126y
dari(arah 5’-3’).....................................................................................

36

11

Pohon filogenetik isolat PMP 0126y ...................................................

37

12

Zona bening isolat PMP 0126y ...........................................................

38

13

Kurva pertumbuhan isolat PMP 0126y................................................

38

14

Kurva aktivitas selulase, aktivitas spesifik, dan jumlah sel
bakteri PMP 0126y ..............................................................................

39

Kurva aktivitas selulase, aktivitas spesifik, dan jumlah sel
bakteri PMP 0126y pada media glukosa 0,1% ....................................

39

Aktivitas spesifik dari pengendapan amonium selulase
dengan amonium sulfat .......................................................................

40

Profil elusi enzim selulase pada kromatografi DEAE penukar
ionmenggunakan matriks Sepharose ...................................................

41

Hasil elektroforesis SDS-PAGE enzim ultrafiltrasi dan
fraksi pemurnian kromatografi penukar anion dan ilustrasi
pita-pita protein selulase PMP 0126y ..................................................

43

15

16

17

18

19

Hasil zimogram PMP 0126y pada gel akrilamida yang
mengandung CMC 0,1% dan ilustrasi pita yang terbentuk dalam
zimogram .............................................................................................

44

Pengaruh pH terhadap aktivitas selulase PMP 0126y hasil
ultrafiltrasi............................................................................................

45

Pengaruh pH terhadap aktivitas selulase PMP 0126y hasil
kromatografi penukar anion .................................................................

45

Suhu optimum aktivitas selulase PMP 0126y hasil ultrafiltrasi
dan kromatografi penukar anion ..........................................................

46

Pengaruh suhu
dan waktu inkubasi terhadap aktivitas
selulase PMP 0126y.............................................................................

46

24

Substrat spesifik enzim selulase PMP 0126y hasil ultrafiltrasi ...........

47

25

Aktivitas relatif selulase PMP 0126y hasil ultrafiltrasi pada
penambahan logam 5 mM dan 10 mM ..............................................

48

20

21

22

23

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman
1

Prosedur pembuatan media dan reagen yang digunakan dalam
penelitian ..............................................................................................

73

2

Kurva standar glukosa ..........................................................................

77

3

Kurva standar bovin serum albumin (BSA) .........................................

78

4

Kurva hubungan log sel dan kerapatan optis dan jumlah sel isolat
PMP 0126y selama 27 jam pengamatan ...............................................

79

5

Hasil uji aktivitas selulase isolat PMP 0126y .......................................

80

6

Prosedur delignifikasi limbah rumput laut dengan NaOH dan H2SO4
oleh BBP4BKP .............................................................................................................................

82

7

Gambar metafile hasil sekuensing isolat PMP 0126y (primer f) ..........

83

8

Gambar metafile hasil sekuensing isolat PMP 0126y (primer r) ..........

85

1

PENDAHULUAN

Latar Belakang
Perkembangan industri berbasis hayati termasuk hayati laut dengan
memanfaatkan senyawa biologi seperti enzim yang berasal dari mikroorganisme
seperti bakteri dan kapang saat ini terus ditingkatkan di berbagai negara. Telah
banyak peneliti yang mengisolasi bakteri baru dan memanfaatkan senyawa
metabolit bakteri tersebut. Salah satu sumber yang dapat dimanfaatkan pada
sektor Kelautan dan Perikanan yaitu limbah hasil pengolahan rumput laut.
Mengingat bahwa 75% wilayah Indonesia terdiri atas perairan laut, maka berbagai
jenis rumput laut telah banyak dimanfaatkan untuk produk pangan seperti agaragar maupun karagenan. Pengolahan agar-agar memanfaatkan rumput laut jenis
Glacilaria sp., sedangkan karagenan menggunakan rumput laut jenis Eucheuma
sp. Berbagai industri rumput laut akan menghasilkan limbah sekitar 65-70% dari
bahan baku segar yang masuk dan diolah (Kim et al. 2008).
Peningkatan pengolahan rumput laut Glacilaria sp. untuk diolah menjadi
agar-agar tentu saja akan meningkatkan jumlah limbah rumput laut sehingga akan
menjadi masalah pencemaran karena limbah tersebut mengandung selulosa yang
sulit larut dalam air. Limbah rumput laut Glacilaria sp. mengandung selulosa
sebanyak 15-25% (Kim et al. 2008). Salah satu alternatif pemanfaatan yang dapat
dilakukan ialah dengan memanfaatkan bakteri asal limbah rumput laut tersebut.
Bakteri yang hidup pada limbah ini diduga dapat menghasilkan enzim yang dapat
menguraikan limbah selulosa menjadi sumber nutrisi untuk pertumbuhannya.
Enzim yang dihasilkan oleh bakteri tersebut dapat menghidrolisis limbah selulosa
menjadi glukosa, yang selanjutnya dapat digunakan sebagai bahan untuk
fermentasi dalam memproduksi bioetanol. Pemanfaatan limbah selulosa dan
bakteri penghasil enzim penghidrolisis selulosa dapat memberikan peluang pada
pengembangan bioenergi dari bahan hayati laut.
Enzim selulase adalah suatu sistem enzim yang terdiri atas tiga tipe enzim
utama yaitu kompleks endo-β-1,4-glukanase (CMCase, Cx selulase endoselulase,
atau carboxymethyl cellulase), kompleks ekso-β-1,4-glukanase (aviselase,
selobiohidrolase, C1 selulase), dan β-1,4-glukosidase atau selobiase (Crueger &

2

Crueger 1984). Ketiga enzim ini bekerja secara sinergis mendegradasi selulosa
dan melepaskan gula reduksi (selobiosa dan glukosa) sebagai produk akhirnya
(Deng & Tabatabai 1994). Enzim selulase akan memutuskan ikatan glikosidik β1,4 di dalam selulosa yang memiliki ikatan β-1,4-glikosidik pada polimer
glukosanya (Jeong et al. 2004) sehingga menjadi gula sederhana turunannya.
Proses hidrolisis selulosa dapat dilakukan dengan menggunakan asam dan
suhu tinggi. Proses ini relatif mahal karena kebutuhan energi yang besar serta
dapat mengakibatkan degradasi produk monosakarida yang dihasilkan sehingga
produk yang akan dihasilkan rendah. Riyanti (2008) juga melaporkan efisiensi
proses hidrolisis dengan asam masih rendah karena proses yang dilakukan cukup
panjang dan membutuhkan banyak tahap. Kekurangan lain dari proses ini antara
lain penanganan limbah asam yang tidak mudah. Baru pada tahun 1980-an, mulai
dikembangkan hidrolisis selulosa dengan menggunakan enzim selulase (Coral et
al. 2002). Hidrolisis secara enzimatik akan berjalan spesifik dan efisien sehingga
produk yang akan dihasilkan lebih tinggi dan menghasilkan produk monosakarida
dengan biaya produksi rendah.
Pemanfaatan mikrob dalam menghasilkan enzim selulase akan menjadi
alternatif yang akan terus dikembangkan karena produksi enzim dari mikrob
memiliki beberapa keuntungan. Jika dibandingkan dengan sel hewan maupun
tumbuhan, sel mikrob relatif mudah ditumbuhkan, relatif lebih singkat kecepatan
pertumbuhannya, skala produksi sel besar dan lebih mudah ditingkatkan, biaya
produksi relatif rendah disebabkan waktu yang dibutuhkan untuk produksi enzim
lebih singkat, dan kondisi selama produksi tidak tergantung musim (Poernomo &
Djoko 2003). Beberapa contoh bakteri penghasil enzim selulase, yaitu Bacillus
amyoliquefaciens DL-3 (Jung et al. 2008), B. pumilus EB3 (Arifin 2006), B.
flexus (Trivedi et al. 2011), B.

licheniformis C108 (Aygan et al. 2011),

Cellulomonas biazotea (Rajoka & Malik 1997), C. flavigena (Ponce & Torre
2001), Streptomyces sp. galur J2 (Jaradat et al. 2008), S. ruber (El-Sersy et al.
2010), Pseudomonas sp (Gautam et al. 2010), P. fluorescens sub sp. cellulosa
(Shimada et al. 1994). Beberapa isolat bakteri penghasil enzim selulase untuk
bioetanol yaitu Escherichia coli KO11 (Jong et al. 2011), Zymomonas mobilis

3

NRRL-B-14023 (Ruanglek et al. 2006), Z. mobilis ATCC 10988 (Tanaka et al.
1999).
Selain dalam bidang industri, pemanfaatan enzim selulase dari bakteri
dapat memberikan solusi dalam masalah pencemaran yakni mengurangi jumlah
limbah selulosa, salah satunya dari industri pengolahan agar-agar dan karagenan,
dan mendapatkan produk bernilai tambah dari pemanfaatan limbah rumput laut
tersebut. Balai Besar Penelitian Pengembangan Pengolahan Produk dan
Bioteknologi Kelautan Perikanan (BBP4BKP) telah melakukan eksplorasi mikrob
dari rumput laut termasuk limbah pengolahan rumput laut. Beberapa isolat bakteri
yang memiliki aktivitas selulase ekstraseluler yaitu isolat PMP 0126y berhasil
diisolasi dari limbah pengolahan agar-agar rumput laut Glacilaria sp. dari daerah
Pameungpeuk, Garut Jawa Barat (Munifah et al. 2011).
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk memproduksi, melakukan pemurnian
parsial, dan mengkarakterisasi enzim selulase yang dihasilkan oleh isolat PMP
0126y penghasil enzim selulase dari limbah pengolahan rumput laut Glacilaria
sp., serta melakukan identifikasi secara molekuler bakteri tersebut.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan tambahan informasi mengenai
bakteri penghasil enzim selulase dari limbah rumput laut dan enzim yang
dihasilkan nantinya diharapkan dapat diaplikasikan dalam proses produksi
bioetanol berbahan dasar limbah rumput laut.

4

TINJAUAN PUSTAKA

Selulosa
Selulosa merupakan polimer karbohidrat terbanyak yang terdapat di alam
(Han & Chen 2007). Selulosa merupakan komponen utama penyusun dinding sel
tumbuhan bersama-sama dengan hemiselulosa dan pektin. Komposisi selulosa
dalam tumbuhan dapat mencapai 40-50% dari massa tumbuhan sehingga selulosa
merupakan biopolimer terbarukan yang paling berlimpah di alam (Milala et al.
2005). Classen (1999) menambahkan bahwa diperkirakan 50% dari biomassa
tumbuhan berupa selulosa dan jumlahnya sekitar 50 milyar ton. Selulosa
merupakan polimer glukosa yang dihubungkan dengan ikatan β-1,4-D-glukosidik
(Gambar 1).

Gambar 1 Struktur serat selulosa (Beguin & Aubert 1994).

Polimer glukosa tersusun secara paralel dan berikatan silang membentuk
struktur kristalin yang disebut mikrofibril. Panjang mikrofibril ini bervariasi dari
2.000-15.000 unit glukosa, tergantung organismenya. Bentuk mikrofibril selulosa
ditentukan oleh kompleks geometri sintase dan lingkungan lokal. Pada tumbuhan,
unit mikrofibril mempunyai jumlah sekitar 3-4 unit dan terdiri atas sekitar 36
rantai selulosa dan seringkali dikemas dalam bentuk lebih besar (Doblin et al.
2002).
Mikrofibril pada selulosa memiliki orientasi beragam, tersusun secara
pararel, dan setiap molekul glukosa dapat berotasi hingga 1800 (Beguin & Aubert
1994; Brown 1996). Mikrofibril ini pada tempat-tempat tertentu memiliki struktur
yang teratur (crystalin) dan pada tempat-tempat tertentu memiliki struktur yang

5

kurang teratur (amorphous). Struktur amorphous terjadi karena proses kristalisasi
yang berlangsung secara tidak sempurna pada mikrofibril yang terbentuk (Gambar
2). Dimensi serat selulosa dan proporsi dari bagian kristalin dan amorf sangat
tergantung pada keadaan alaminya (Linder & Teeri 1997). Setiap serat selulosa
tersusun oleh kira-kira 3.000 molekul glukosa dan berat molekulnya diperkirakan
mencapai 500.000 (Hardjo et al. 1984).

Gambar 2 Struktur selulosa teratur (kristalin) dan kurang teratur (amorphous)
(Beguin & Aubert 1994).
Secara alamiah molekul selulosa tersusun dalam fibril yang terdiri atas
beberapa molekul glukosa yang dihubungkan dengan ikatan hidrogen yang kuat
mengakibatkan dapat tahan terhadap tarikan tinggi. Fibril-fibril ini membentuk
struktur kristal yang dibungkus oleh lignin, oleh karena itu sumber selulosa dari
tumbuh-tumbuhan sulit sekali dihidrolisis secara langsung oleh katalis asam.
Molekul selulosa berbentuk lurus dan tidak pernah bercabang, serta gugus
hidroksilnya bebas membentuk ikatan hidrogen dengan gugus hidroksil molekul
selulosa lainnya yang terletak sejajar (paralel) dengannya (Beguin & Aubert
1994).
Rumput Laut
Selulosa juga diproduksi oleh tanaman laut yaitu rumput laut (Linder &
Teeri 1997). Rumput laut merupakan makroalga laut yang dapat digolongkan ke
dalam alga merah, alga hijau, dan alga coklat. Rumput laut tidak memiliki daun,
batang, dan akar sejati. Akan tetapi, bagian tubuhnya disebut dengan talus, dapat
berupa filamen, lembaran tipis berdaun banyak, persegi dengan kulit keras, dan
lumut raksasa. Uji proksimat yang dilakukan pada ampas rumput laut kering

6

didapatkan presentase masing-masing komponen kadar air sebesar 11.28%, kadar
abu 36,05%, kadar lemak 0,42%, kadar protein 1,86%, kadar serat kasar 8,96%
dan karbohidrat 41,43% (Harvey 2009).
Jenis rumput laut yang telah banyak dimanfaatkan berasal dari marga
Euchema, Gelidium, Gracilaria, Hypnea, dan Sargassum. Selain itu, terdapat
jenis lainnya seperti Caulerpa dan Dictosphaeria masih dimanfaatkan dalam skala
kecil untuk konsumsi lokal (Atmadja et al. 1996). Beberapa jenis rumput laut
memiliki komposisi kandungan selulosa maupun kandungan senyawa kimia
lainnya yang berbeda. Berikut ini komposisi kimia dari beberapa jenis rumput laut
(Tabel 1).
Tabel 1 Komposisi kimia rumput laut (Kim et al. 2008)
Jenis alga
Alga merah
Gelidium
amansii,
marocco
Gelidium amansii, joju
Glacilaria
E. cottonii
Alga hijau
Codium fragile
Alga coklat
Undaria pinattinda
Laminaria japonica

Selulosa
(%)

Galaktan (%)

Karbohidrat (%)

Protein
(%)

Lipid
(%)

16,8

55,2

72,0

21,1

6,9

23
19,7
7,1

56,4
54,4
43,4

79,4
74,1
50,5

11,8
11
4,9

8,8
14,9
44,6

10,9

47,8

58,7

34,7

6,6

2,4
6,7

38,7
40,0

41,1
46,7

24,2
12,2

34,7
38,1

Rumput laut Glacilaria sp. banyak dimanfaatkan dalam industri
pengolahan agar-agar. Limbah industri agar-agar yang dihasilkan mengandung
selulosa sebesar 15-25% (Kim et al. 2008). Selain itu, limbah agar-agar Glacilaria
sp. merupakan salah satu sumber bakteri yang berpotensi menghasilkan enzim
selulase. Pemanfaatan limbah agar-agar dan enzim selulase dari bakteri tersebut
memegang peranaan yang sangat penting dalam pengembangan bioenergi.
Enzim Selulase
Enzim selulase atau enzim yang dikenal dengan nama sistematik β-1,4
glukan-4-glukano hidrolase adalah enzim yang dapat menghidrolisis selulosa
dengan memutus ikatan glikosidik β-1,4 dalam selulosa, selodektrin, selobiosa,
dan turunan selulosa lainnya menjadi gula sederhana atau glukosa. Sistem

7

pemecahan selulosa menjadi glukosa terdiri atas tiga jenis enzim selulase yaitu
endo-β-1,4-glukanase, ekso-β-1,4-glukanase, dan β-glukosidase. Endo-β-1,4glukanase menyerang bagian tengah rantai secara random, ekso-β-1,4-glukanase
(selobiohidrolase) memecah unit-unit disakarida (selobiosa) dari ujung rantai, dan
β-glukosidase memecah selobiosa menjadi glukosa (Da silva et al. 2005) (Gambar
3).

Gambar 3 Pemecahan selulosa menjadi glukosa oleh enzim selulase.
Menurut Enari (1983) (Tabel 2) demikian pula Prescott dan Dunns (1981)
(Gambar 4) mengelompokkan enzim utama selulase berdasarkan kespesifikan
substrat masing-masing enzim yaitu :
1. Endo-β-1,4-glukanase (β-1,4-D-glukan-4-glukanohidrolase, EC 3.2.1.4)
menghidrolisis ikatan glikosidik β-1,4 secara acak. Enzim ini dapat
bereaksi dengan selulosa kristal tetapi kurang aktif. Enzim ini secara
umum dikenal sebagai CMC-ase atau selulase Cx.
2. β -1,4-D-glukan selobiohidrolase (EC.3.2.1.91) atau secara umum dikenal
dengan selulase C1, menyerang ujung rantai selulosa non pereduksi dan
membebaskan selobiosa.

8

3. β-1,4-D-glukan glukohidrolase (EC.3.2.1.74) menyerang ujung rantai
selulosa non pereduksi dan membebaskan glukosa. Enzim ini
menghidrolisis selulosa yang telah dilunakkan dengan asam fosfat, selooligosakarida dan CMC.
4. β-1,4-glikosidase

(β-1,4-D-glukosida

glukohidrolase,

EC

3.2.1.21)

menghidrolisis selobiosa dan rantai pendek selo-oligosakarida yang
menghasilkan glukosa. Enzim ini tidak dapat memecah selulosa dan
selodekstrin.

Endo-β-1,4-glukanase
(=Cx-selulase)
β-1,4
glukanase

β-1,4-glukan
selobiohidrolase
(=C1 selulase)

Ekso-β1,4,
glukanase

β-1,4-glukan
glukohidrolase

Enzim
selulase

β-1,4 glukosidase

Gambar 4 Klasifikasi enzim selulase (Prescott & Dunns 1981).
Tabel 2 Hidrolisis berbagai substrat oleh enzim selulase (Enari 1983)
Jenis Enzim
selulolitik
Endoglukanase

Substrat
Selulosa
kristalin
-

CMC
+

Selulosa
amorf
+

Selotetraosa Selobiosa
+

-

Selobiohidrolase

+

-

+

+

-

β- Glukosidase

-

-

-

+

+

Berdasarkan kelarutannya, selulosa dapat dibagi menjadi dua katagori
yaitu substrat yang larut dalam air dan substrat yang tidak dapat larut dalam air
beserta enzim selulase yang menghidrolisis substrat tersebut (Tabel 3).

9

Tabel 3 Substrat selulosa berdasarkan kelarutan air dan jenis enzim selulase
(Zhang et al. 2006)
Substrat Selulosa
Enzim Selulase
Larut dalam air
- Rantai pendek (derajat polimerisasi rendah)
Endo, ekso, BG
Silodekstrin
Endo, ekso, BG
Radio-labeled selodekstrin
- Turunan silodekstrin
Endo, ekso, BG
β-methyllumberlliferil oligosakarida
Endo, ekso, BG
p-nitrofenol oligosakarida
- Turunan selulosa dengan rantai panjang
Endo
Carboxymethylecellulose (CMC)
Endo
Dye CMC
Tidak larut dalam air
- Selulosa kristalin
Katun, selulosa mikrokristalin (Avisel), Total,endo, ekso
selulosa bakteri
- Selulosa Amorf – PASC
Total, endo.ekso
- Dyed Selulosa
Total, endo
- Kromogenik dan turunan fluoreforik
Trinitrofenil-karboksimetilselulase
Endo
(TNP-CMC)
- Flurant Selulosa
Endo, total
- α-selulosa
Total
Endo ; endoglukanase, Ekso ; eksoglukanase, BG ; glukosidase, Total ; ketiga tipe
enzim selulase.
Perbedaan antara masing-masing enzim selulase terletak pada kespesifikan
struktur di sekeliling substrat. Perbedaan kespesifikan dari enzim endoglukanase
dan selobiohidrolase bersifat tidak mutlak karena kedua enzim tersebut dapat
menghidrolisis ikatan β-1,4 glukosida dari selulosa amorf. Penentuan aktivitas
enzim selulase akan sulit apabila filtrat yang akan diukur aktivitas enzimnya
merupakan campuran dari berbagai enzim selulase. Enzim-enzim ini tidak hanya
dapat menghidrolisis substrat yang sama tetapi juga dapat bekerja secara sinergis
memecah substrat yang sama, sehingga menyebabkan aktivitas yang diukur
dipengaruhi oleh proporsi dari masing-masing enzim yang ada (Enari 1983).
Aktivitas enzim endoglukanase pada umumnya dapat diuji dengan substrat
CMC (Carboxymethyl cellulose) sehingga enzim endoglukanase juga disebut
dengan istilah CMCase, sedangkan aktivitas enzim selobiohidrolase atau

10

eksoglukanase

seringkali

diuji

dengan

substrat

avisel

sehingga

enzim

eksoglukanase disebut dengan aviselase (Zhang et al. 2006).
Tahapan hidrolisis selulosa tergantung kepada struktur selulosa, interaksi
antara enzim selulase dengan serat selulosa, mekanisme hidrolisis enzim tersebut
di alam dan inhibitor yang terbentuk. Fase adsorbsi dan pembentukan kompleks
enzim substrat adalah fase kritis di dalam hidrolisis selulosa. Glukosa dan
selobiosa adalah inhibitor enzim dalam menghidrolisis selulosa. Selobiosa
menghambat

enzim

selobiohidrolase

dan

glukosa

menghambat

enzim

penghidrolisis selobiosa yaitu β-glukosidase pada kompleks enzim selulase.
Selobiosa mempunyai potensi lebih kuat menjadi inhibitor dibandingkan dengan
glukosa (Coughlan 1985). Laju hidrolisis enzim selulase ditentukan oleh struktur
substrat (Mandels 1985). Struktur kristal lebih sulit dihidrolisis dibandingkan
dengan struktur amorf maka hidrolisis dilakukan oleh enzim endoselulase atau
endoglukanase (Coughlan 1985) (Gambar 5).

Gambar 5 Mekanisme degradasi selulosa (Beguin & Aubert 1994).
Aktivitas enzim selulase dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain
derajat keasaman (pH), suhu, dan senyawa penghambat. Aktivitas enzim
dipengaruhi oleh pH karena sifat ionik gugus karboksil dan gugus amino mudah
dipengaruhi oleh pH sehingga apabila terjadi perubahan pH maka akan
menyebabkan denaturasi enzim dan menghilangkan aktivitas enzim. Suhu
memiliki peranan yang sangat penting dalam reaksi enzimatik. Ketika suhu

11

bertambah sampai suhu optimum, kecepatan reaksi enzim naik karena energi
kinetik bertambah. Bertambahnya energi kinetik enzim akan mempercepat gerak
vibrasi, translasi, dan rotasi baik enzim maupun substrat. Hal ini akan
memperbesar peluang enzim dan substrat bereaksi. Ketika suhu lebih tinggi dari
suhu optimum, protein enzim berubah konformasi sehingga gugus reaktif
terhambat. Perubahan konformasi ini dapat menyebabkan enzim terdenaturasi.
Substrat juga dapat berubah konformasinya pada suhu yang tidak sesuai, sehingga
substrat tidak dapat masuk ke dalam sisi aktif enzim (Ottaway 1984).
Selain pH dan suhu, faktor lain yang mempengaruhi aktivitas selulase
yaitu adanya senyawa penghambat berupa ion logam. Penghambatan tersebut
dapat dinetralkan dengan menambahkan sistein sehingga aktivitas enzim dapat
berlangsung kembali (Kulp 1975). Beberapa senyawa logam dan senyawa lainnya
yang dapat menghambat aktivitas selulase ialah Hg2+, Ag2+, dan Cu2+ (Deng &
Tabatai 1994; Oikawa et al. 1994), glukanolakton (Kulp 1975), surfaktan,
senyawa pengkelat khususnya Sodium Dodecyl Sulphate (SDS), Ethylene
Diamine Tetraacetyc Acid (EDTA) (Oikawa et al. 1994), laktat dalam konsentrasi
agak rendah (Chesson 1987), dan etanol serta alkohol lainnya (Ooshima et al.
1985). Senyawa penghambat tersebut dapat menekan seluruh kecepatan hidrolisis
dengan menghambat adsorbsi eksoglukanase dan endoglukanase pada selulosa,
dan menghambat aksi sinergis eksoglukanase dan endoglukanase yang bekerja
pada permukaan selulosa.

Mikroorganisme Penghasil Enzim Selulase
Mikroorganisme didefinisikan sebagai organisme yang berukuran sangat
kecil (biasanya kurang dari 1 milimeter) sehingga untuk mengamatinya
diperlukan bantuan mikroskop atau alat pembesar. Mikroorganisme dapat berupa
sel tunggal atau kelompok sel yang mempunyai kemampuan untuk mengatur
proses hidupnya tanpa bergantung sel lainnya. Mikroorganisme terdiri atas
bakteri, virus, dan cendawan (fungi) yang masing-masing memiliki perbedaan
karakteristik secara morfologi, ekologi, dan fisiologi. Bakteri merupakan sel
prokariot dengan rRNA bakteri yang dihubungkan oleh ikatan ester dan membran
lipid yang merupakan diasil gliserol dieter (Madigan et al. 2000).

12

Beberapa contoh genus bakteri yang diketahui mempunyai aktivitas
selulolitik ialah Acetobacter, Bacillus, Clostridium, Cellulomonas, Pseudomonas,
Cytophaga, Sarcina, dan Vibrio, sedangkan contoh genus cendawan yang
mempunyai aktivitas selulolitik ialah Bulgaria, Chaetomium, Helotium, Coriolus,
Phanerochaete, Poria, Schizophyllum, Serpula, Aspergillus, Cladosporium,
Fusarium,

Geotrichum,

Myrothecium,

Paecilomyces,

Penicillium,

dan

Trichoderma (Rao 1994). Beberapa jenis organisme juga dapat menghasilkan
enzim selulase seperti rayap (Watanabe & Tokuda 2001), remis (Xu et al. 2000),
dan arabidopsis.
Di alam, degradasi selulosa kebanyakan dilakukan oleh mikroorganisme
aerobik. Mikroorganisme aerobik menghasilkan enzim selulase nonkompleks
yang terdiri atas endoglukanase, eksoglukanase, dan glukosidase yang bekerja
secara sinergis untuk menghidrolisis selulosa. Mikroorganisme anaerobik
menghasilkan enzim selulase kompleks yang disebut selulosom (Doi et al. 2003;
Bayer et al. 2004). Meskipun mikroorganisme anaerobik hanya menyumbang
sekitar 5-10% dari biodegradasi total selulosa di alam, namun peranannya sangat
penting karena bertanggung jawab terhadap degradasi daerah anoksik pada danau,
laut, dan saluran pencernaan hewan pemamah biak maupun rayap, yang tidak
dapat dilakukan oleh mikroorganisme aerobik (Zhang et al. 2006).
Pemekatan Enzim
Pada tahap awal pemurnian enzim biasanya dilakukan klarifikasi dan
pengendapan protein enzim. Klarifikasi berfungsi memisahkan larutan enzim dari
partikel-partikel yang tidak larut, misalnya debris sel dan partikel substrat.
Klarifikasi dapat dilakukan dengan penyaringan atau sentrifugasi. Pemekatan
protein enzim merupakan tahap awal dari prosedur pemurnian enzim sebelum
tahap pemurnian berikutnya atau dapat pula digunakan untuk keperluan analisis
enzim. Pemekatan protein enzim berfungsi untuk meningkatkan konsentrasi
protein enzim, mereduksi volume larutan enzim, dan memisahkan protein enzim
dengan protein pengotor yang lain (Harris 1989).
Pemekatan protein dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu analitik dan
preparatif (penyiapan). Metode analitik menggunakan pengendapan asam
(misalnya asam trikloroasetat), pengendapan organik (misalnya aseton atau

13

etanol), dan imunopresipitasi yang dapat menyebabkan denaturasi protein.
Pemekatan protein dengan metode preparatif tetap mempertahankan aktivitas
protein misalnya dengan menggunakan pengendapan garam, pengendapan dengan
pelarut organik, pengendapan dengan polimer organik, ultrafiltrasi, liofilisasi, dan
dialisis (Harris 1989).
Metode pengendapan protein yang biasa dilakukan dalam pengendapan
selulase ialah dengan menggunakan amonium sulfat (Jung et al. 2008) dan
ultrafiltrasi (Arifin 2006). Amonium sulfat merupakan garam yang paling sering
digunakan untuk mengendapkan protein karena memiliki daya larut tinggi di
dalam air, relatif tidak mahal, dan kestabilan protein di dalam larutan amonium
sulfat (2M- 3M) tahan bertahun-tahun (Scopes 1987).
Prinsip pengendapan dengan garam berdasarkan pada kelarutan protein
yang berinteraksi polar dengan molekul air, interaksi ionik protein dengan garam,
dan daya tolak menolak protein yang bermuatan sama. Kelarutan protein (pada pH
dan suhu tertentu) meningkat pada kenaikan konsentrasi garam (salting in).
Kenaikan kelarutan protein akan meningkatkan kekuatan ion larutan. Pada
penambahan garam dengan konsentrasi tertentu menyebabkan kelarutan protein
menurun (salting out). Molekul air yang berikatan dengan ion-ion garam semakin
banyak yang menyebabkan penarikan selubung air yang mengelilingi permukaan
protein. Peristiwa ini mengakibatkan protein saling berinteraksi, beragregasi, dan
kemudian mengendap (Harris 1989; Scopes 1987).
Garam berlebih yang terdapat di dalam larutan enzim setelah tahap
fraksinasi dapat dihilangkan dengan cara dialisis. Pada tahap dialisis, protein
ditempatkan di dalam kantung (membran) semipermeabel yang direndam di
dalam larutan bufer tertentu. Molekul yang berukuran kecil akan ke luar melalui
membran, dan molekul yang berukuran besar akan tertahan di dalam membran
dialisis. Ukuran pori kantung dialisis yang terbuat dari bahan selulosa asetat
berdiameter 1-20 nm. Ukuran ini menunjukkan berat molekul minimum yang
dapat tertahan di dalam membran. Selain dengan dialisis, penghilangan garam
dapat dilakukan dengan filtrasi gel. Metode ini biasanya diterapkan untuk sampel
yang sedikit, yaitu tidak melampaui 25-30% volume kolom untuk mendapatkan
resolusi yang memadai antara protein dan garam. Matriks filtrasi gel memiliki

14

pori yang berukuran kecil, misalnya Sephadex G-25 buatan Phamacia.
Kekurangan metode ini adalah terjadi pengenceran sampel protein (Harris 1989).
Ultrafiltrasi merupakan suatu metode untuk mengkonsentrasikan protein
dengan menekan cairan larutan protein enzim supaya tertahan di dalam membran.
Ukuran cairan yang akan ditahan (retentat) dan yang dikeluarkan (permeat) sesuai
dengan ukuran membran yang digunakan. Prinsip pemisahan dengan ultrafiltrasi
adalah pemisahan komponen berdasarkan berat molekul (Bollag & Edelstein
1991). Pemisahan komponen ini terjadi karena adanya membran ultrafiltrasi.
Membran ultrafiltrasi berfungsi sebagai penghalang (barrier) tipis yang sangat
selektif di antara dua fasa, hanya dapat melewatkan komponen tertentu dan
menahan komponen lain dari suatu aliran fluida yang dilewatkan melalui
membran (Mulder 1996). Proses membran ultrafiltrasi merupakan upaya
pemisahan dengan membran yang menggunakan gaya dorong beda tekanan yang
dipengaruhi oleh ukuran dan distribusi pori membran (Malleviale 1996).
Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom pada prinsipnya yaitu pengaliran suatu cairan melalui
kolom yang mengandung bahan pengisi dan substanta yang ingin dipisahkan
menjadi beberapa komponen dengan adanya perbedaan terhadap daya ikat bahan
pengisi (Tabel 4).
Tabel 4 Metode kromatografi untuk fraksinasi protein (Ersson et al. 1998)
Sifat Protein
Ukuran dan bentuk
Muatan neto dan distribusi grup
bermuatan
Titik isoelektris
Hidrofobisitas
Pengikatan logam
Kandungan tiol yang terbuka
Afinitas biospesifik terhadap ligan,
inhibitor, reseptor, antibodi, dsb

Jenis Kromatografi
Filtrasi gel
Penukar ion
Kromatofokusing
Interaksi hidrofobik dan fase balik
Afinitas ion logam terimobilisasi
Kovalen
Afinitas

Teknik kromatografi kolom banyak digunakan dalam bioteknologi untuk
mengamati tingkat kemurnian dan stabilitas protein (Neville 1998). Beberapa
peneliti melakukan pemurnian enzim selulase yang dihasilkan oleh bakteri dengan
berbagai teknik kromatografi kolom (Tabel 5).

15

Tabel 5 Teknik kromatografi yang digunakan pada pemurnian selulase
Selulase
Endoglukanase dari
Sinorhizobium fredii
Endoglukanase dari
Mucor circinelloides
Endoglukanase dari
Bacillus sp
Endoglukanase dari
Bacillus sp
Endoglukanase dari
Pseudomonas fluorescens
Endoglukanase dari
Bacillus sp
Endoglukanase dari
Bacillus pumilus

Metode Kromatografi
Sumber
Penukar ion, interaksi Po et al. (2004)
hidrofobisitas
Gel filtrasi
Saha (2003)
Penukar ion, gel filtrasi

Mawadza et al. (2000)

Penukar ion

Singh et al. (2004)

Penukar ion, gel filtrasi

Bakare et al. (2005)

Penukar ion

Ji et al. (2005)

Gel filtrasi, penukar ion

Christakopoulus
(1999)

et

al.

Kromatografi penukar ion memanfaatkan perbedaan afinitas antara
molekul bermuatan di dalam larutan dengan senyawa yang tidak reaktif yang
bermuatan berlawanan sebagai pengisi kolom (Scopes 1987). Kromatografi
penukar ion memisahkan protein berdasarkan muatan bersih protein dan kekuatan
relatif dari muatan bersih protein tersebut. Kromatografi penukar ion memerlukan
fase diam yang biasanya merupakan polimer terhidratasi yang bersifat tidak larut
seperti selulosa, dekstran dan agarosa. Gugus penukar ion diimobilisasikan pada
matriks. Beberapa gugus penukar anion yaitu aminoetil (AE-), kuaternari
aminoetil (QAE-), dan dietilaminoetil (DEAE-). Gugus penukar kation yaitu
sulfopropil (SP-), metil sulfonat dan karboksimetil (CM-). Penukar ion lemah
seperti DEAE- (penukar anion lemah) dan CM- (penukar kation lemah) hanya
dapat mempertahankan kondisi terionisasi pada rentang pH sempit dan kehilangan
muatannya pada pH tertentu. Gugus penukar anion lemah DEAE- terionisasi
sempurna di bawah pH 6,0 dan akan kehilangan muatannya pada pH 9,0,
sedangkan gugus penukar kation lemah CM- akan kehilangan muatannya di
bawah pH 4,5. Penukar ion kuat dapat mempertahankan kondisi terionisasi pada
rentang pH yang luas. Gugus penukar ion QAE- (penukar anion kuat) dan SP(penukar kation kuat) dapat mempertahankan kondisi terionisasi pada rentang pH
1-10 (Coligan et al. 2003).

16

Kolom untuk kromatografi penukar ion biasanya tidak panjang dan
memiliki diameter lebih besar dari pada kolom untuk filtrasi gel. Banyaknya
sampel yang dimasukkan umumnya sekitar 10-20% dari kapasitas kolom.
Pembilasan dengan gradien konsentrasi NaCl yang linier baik digunakan untuk
memisahkan molekul-molekul yang memiliki perbedaan muatan bersih yang tidak
terlalu besar sedangkan gradien NaCl bertahap baik digunakan untuk memisahkan
molekul-molekul yang memiliki perbedaan muatan bersih yang besar.
Pada dasarnya prinsip kromatografi penukar ion adalah ion bermuatan
bebas dipertukarkan dengan ion yang memiliki tipe muatan yang sama. Protein
yang bermuatan negatif dapat ditukar dengan ion klorida. Awalnya gugus
fungsional matriks yang bermuatan negatif mengikat ion dari bufer (misalnya
Na+). Pada saat sampel dimasukkan ke dalam kolom, maka protein yang
bermuatan positif akan menggantikan ion Na+ sedangkan protein yang bermuatan
negatif atau netral tidak akan terikat. Protein yang tidak terikat dibilas dengan
menggunakan bufer (biasanya dengan konsentrasi 10-50 mM). Selanjutnya ikatan
protein yang terikat gugus fungsional matriks akan terlepas setelah dibilas dengan
bufer yang mengandung NaCl atau KCl secara linier atau bertahap sehingga
protein yang memiliki ikatan lemah dengan matriks akan lepas terlebih dahulu
dan diikuti oleh protein yang memiliki ikatan lebih kuat (Gambar 6).

Gambar 6 Pemurnian enzim dengan kromatografi pertukar ion
(http://voh.chem.ucla.edu/vohtar/winter99/153L/lec1.html).

17

Pemilihan penukar ion tergantung pada muatan protein target. Muatan
bersih protein tergantung pada pH yaitu protein akan bermuatan positif dengan
menurunkan pH dan bermuatan negatif dengan menaikkan pH. Pada saat
menentukan pH untuk kromatografi, kestabilan protein target pada pH yang
dipilih perlu dijaga. Apabila protein stabil pada pH di atas titik isoelektriknya (pI)
maka digunakan penukar anion (positif), tetapi bila protein stabil pada pH di
bawah pI nya maka digunakan penukar kation (negatif). Jika protein stabil pada
rentang 1 unit di atas dan di bawah pI maka kedua penukar ion dapat digunakan.
Matriks yang mengikat gugus fungsional menentukan sifat aliran, ion yang dapat
diikat, kestabilan mekanik dan kimia. Ada 3 kelompok matriks yang biasanya
digunakan, yaitu: 1) polistiren, poliakrilik atau polifenol; 2) selulosa; dan 3)
dekstran (Sephadex) atau agarosa (Sepharose). Matriks polistiren dan polifenolik
lebih sering digunakan untuk memisahkan molekul-molekul kecil seperti asamasam amino, peptida kecil, nukleotida, nukleotida siklik, asam-asam organik.
Matriks selulosa biasanya digunakan untuk memisahkan protein (termasuk
enzim), polisakarida dan asam nukleat. Matriks DEAE-selulosa, CM-selulosa dan
fosfoselulosa paling sering digunakan. Matriks polidekstran dan agarosa
(misalnya DEAE-Sephadex, CM-Sephadex) digunakan untuk memisahkan
protein, hormon, tRNA dan polisakarida (Scopes 1987).
Pemilihan penukar ion kuat atau lemah tergantung pada pH molekul
target. Molekul yang memerlukan pH sangat rendah atau sangat tinggi untuk
dapat berionisasi atau apabila molekul stabil pada pH ekstrem maka penukar ion
kuat harus digunakan. Penukar ion lemah akan memberikan hasil pemisahan yang
lebih baik untuk protein-protein yang memiliki muatan bersih yang berdekatan.
Keuntungan kromatografi penukar ion diantaranya adalah tidak merusak protein
yang dimu