Mineral Addition to Enhance Activity and Stability of Phytase Bacillus coagulans E1.4.4.
Jurnal Mikrobiologi Indonesia, Februari 2001, hIm. 27-30
Vol. 6, No. I
ISSN 0853-358X
Penambahan Mineral untuk Meningkatkan Aktivitas dan
Stabilitas Fitase Bacillus coagulans E1.4.4.
Mineral Addition to Enhance Activity and Stability
ofPhytase Bacillus coagulans E1.4.4.
AHMAD THONTOWI', ENY IDA RIVANTI, SRI WIDOWATI & HETI'Y FIERAWATT
Balal Penelitlan Biotekno!ogl Tanwuan Pangan, Juian Tentara Pelajar No. 3A, Bogor 16111
TeL +62-251-337975,339793, Fax. +62-251-338820
Mineral addition can be used to enhance activity and stabilization of phytase. The aims of this study were to
investigate effect of minerals, by addition of some minerals LP, Mg2, Zn2, Fez, Cat', Mn2, Cu2', Ni2', and Nit' at
several concentrations 0, 0.5, 1.0, 2.0, 2.5, and 3.0 mM. Effect of mineral addition on enzyme stability during storage
0, I, 2, 3, 4. 5, and 6 weeks was also Investigated. The most effective concentration of mineral Li2' was 0.5 mM, givi.g
the highest activity I.e. 281.3%. MIneral Fe1' and Na2' were an effective activator at 1.0 mM concentration, giving tie
highest activity I.e. 350 and 144.1%, respectively. Minerals Mg2' and Zn2' were effective stabilizers at 1.5 mM concen
tration, that Increased the activity of 87.5 and 75%, respectively. On the other hand minerals Ca2' at 0.5 and 1.0 mM
concentration act as activator, whereas Mn2', Ni', and Cu2' minerals act as inhibitors. Furthermore 0.5 mM Liz', Nat',
Cu", Ni2', md Fe2' at 1.0 mM could minimize the rate of degradation of phytase activity during storage at 4C, wheress
other minerals accelererated of phytase degradation.
Key words: phytase, minerals, Bac11us coagulans E 1.4.4.
Fitase atau mio-inositol-heksakisfosfat fosfohidrolisa
EC.3. 1.3.8 pertama kali ditemukan oleh Suzuki eta!. dalam
penelitiannya tentang hidrolisis bekatul Nagai & Funahashi
1962. Pemanfaatan bekatul masih terbatas, meskipun bernilai
gizi tinggi. Salah satu kendala pemanfaatan bekatul sebagai
bahan pangan ialah adanya zat antigizi berupa asam fitat yang
mengikat beberapa mineral penting sehingga membentuk
senyawa kompleks dengan Ca2', Zn2', Mg" dan Fe"'. Hal
ml mengakibatkan berkurangnya nilai cerna dan
bioavailabilitasnya Hammond 1994.
Aplikasi fitase dalam mereduksi asam fitat akan
meningkatkan nilai nutrisi dan bahan pangan dan produk
produk pakan yang mengandung fitat. Bacillus coagulans
El .4.4 mampu menghasilkan fitase yang mampu menghidrolisis
fitat pada bekatul Rosmimik eta!. 1998. Isolat mi mempunyai
kondisi optimum untuk produksi fitase skala saw liter pada pH
6,8, agitasi 175 rpm, suhu 37°C serta mempunyal aktivitas
spesifik tertinggi padajam ke-20. Aplikasi fitase pada bekatul
mampu meningkatkan nilai cema protein bekatul dan 29 menjadi
53% Widowati eta!. 2000.
Walaupun aktivitas spesifik dan kultur mi relatifbesar, tetapi
setelah beberapa perlakuan sebelum aplikasi, seperti
pengendapan dengan amonium sulfat atau aseton,
pengeningbekuan, dan penyimpanan, enzim kasar mi sering
mengalami penurunan aktivitas. Selain itu konsentrasi enzim
kasar mi masih rendah, yaltu 1.6-3.6 mg/mI kultur setelah melalui
*
Penulis untuk korespondensi
tahapan perlakuan pengendapan dengan amonium sulfat, serta
dilanjutkan dengan dialisis dan pengeringbekuan.
Aktivitas enzim berhubungan langsung dengan perubahan
struktur tersier dan molekul protein enzim. Pada keadaan suhu,
pH, dan konsentrasi ion normal, struktur tersier distabilkan
oleh empatjenis reaksi. Interaksi tersebut ialah ikatan hidrogen,
gaya tank ion, interaksi hidirofobik, dan jembatan kovalen.
Berbagai cara dapat dilakukan untuk meningkatkan aktivitas
dan stabilitas enzim, salah satunya ialah penambahan aditif
berupa ion logam Vihinen & Manstala 1989, Satiawihardja et
a!. 1997.
Ion logam sebagai aditif umumnya ditambahkan dalam
bentuk garam, misalnya ion Ca" dalam bentuk garam kionida
Schwimmer 1981. Kation lain yang diketahui mengaktifkan
enzim ialah Na', K', Rb', Cs', Mg", Zn2', Cr", Cu", Fe",
Co", Ni", dan Al". Ion tersebut dapat mengaktitkan enzim
karena beberapaperubahan mekanis, antara lain: adanya bagian
yang utuh pada sisi aktif, bentuk ikatan rantai antara enzim
dan substrat, perubahan konstanta keseimbangan pada reaksi,
perubahan muatan permukaari pada protein enzim, digantinya
hambatan pada reaksi yang hilang, digantinya ion-ion logam
yang tidak efektifdari sisi aktifatau substrat, dan keseimbangan
konformasi dan kurang aktif diganti menjadi lebih aktif
Richardson & Hyslop 1985.
Pengaruh mineral terhadap fitase masih membingungkan
dan belum dapat diketahui mekanismenya, karena fitase yang
diisolasi dan spesies berbeda menunjukkan respons berbeda
pula. Sebagai contoh ion Mg" dan Mn"membenikan pengaruh
28
THONTOW1 FT AL.
schagai aktivator fitase Phaseolus vulgaris Lolas & Markakis
1977, namun bagi fitase Enterobacter sp4 memberikan hal
yang sebaliknya Yoon eta!. 1996. Berbagai mineral dilaporkan
dapat memberikan pengaruh sebagai aktivator seperti Mg2,
Mn2, dan Ca2 pada konsentrasi 1.0 mM, sedangkan mineral
Fe2 atau Fe tidak meningkatkan aktivitas fitase. Mineral Mg2
dan Mn2 pada konsentrasi 1.0 mM mainpu meningkatkan
aktivitas fitase sebesar 5.79% dibandingkan tanpa
penambahan mineral, sedangkan Ca2 meningkatkan aktivitas
sebesar 8.46% Syahbirin etal. 2000. Oleh sebab itu, penelitian
lanjut mengenai pengaruh berbagai macam konsentrasi min
eral lainnya terhadap aktivitas fitase perlu dilakukan.
BABAN DAN MEFODE
Mikroorganisme. Bakteri yang digunakan sebagai
penghasil fitase ialah Bacillus coagulans El .4.4. berasal dan
koleksi Balai Penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan, Bogor.
Produksi Fitase Skala 5 liter. Sebanyak lima ose B.
coagulans E 1.4.4. diinokulasikan ke dalam 500 ml media ekstrak
malt khamir pH 6.8 dengan komposisi per liter: 3 g ekstrak
malt Difco, 3 g ekstrak khamirDifco, 0.5 g pepton Sigma,
dan lOg glukosa Merck. Biakan dalam media diinkubasikan
pada inkubator bergoyang dengan suhu 37°C, kecepatan agitasi
175 rpm selama 24 jam.
Produksi enzim dilakukan dengan menginokulasikan
sehanyak 7.5% biakan mi ke dalam 5 I media cair fitase Yoon et
a!. 1996 yang telah dimodifikasi fitat dan bekatul 0.3%, 300
mgNH4S04, 5OmgMgSO4, lOingCaCl2, 1 mgMnSO4, 1000
mg Glukosa, dan 10 mgFeSO4. Produksi enzim dilakukan dalam
hioreaktor BIOSTATB B. Braun Biotech International
berkapasitas 5 L. Setelah fermentasi, larutan disentrifugasi path
23300 g 12 000 rpm dengan rotor RP 45T selama 15 menit,
suhu 4°C dan diambil supernatannya sebagai fraksi enzim kasar.
Pengaruh PenambahanMineral terhadap Aktivitas Fitase.
Sumber mineral yang digunakan ialah LiCI2, MgCI2, ZnCl2,
FeCI2, CaCI2, MnCI2, CuCI2, NiCI2, dan NaCI2. Mineral tersebut
ditambahkan pada enzim kasar sehingga konsentrasi akhir
masing-masing sebesar 0, 0.5, 1.0, 2.0, 2.5, dan 3.0mM dan
aktivitas fitasenya dianalisis.
Beberapa konsentrasi yang memberikan aktivitas tinggi
ditambahkan ke supernatan enzim kasar fitase hasil sentrifugasi
dan aktivitas fitasenya diukur pada minggu ke 0. 1,2, 3,4,5,
dan 6. Enzim kasar mi disimpan pada suhu 4°C.
Analisis Aktivitas Fitase. Analisis dilakukan berdasarkan
metode Young et a!. 1998 yang dimodifikasi. Pereaksi
molibdat-vanadat dibuat dengan mencainpurkan larutan
amonium heptamolibdat 20 g/400 ml dan larutan amonium
monovanadat 1 g/300 ml ke dalam 140 ml HNO3 pekat,
kemudian diencerkan menjadi satu liter.
Aktivitas enzim diukurdengan memasukkan 4.5 ml bufer
asetat 0.2 M pH 6.5, 4.5 ml standar fitat 0.5%, serta 1.0 ml
campuran enzim kasar dan mineral ke dalam erlenmeyer. Larutan
mi diinkubasi pada suhu 40°C selama 30 menit dalam penangas
J. Mikrobiol. Indon.
air sambil digoyang. Kontrol dibuat dengan mengmnkubasi 5.0
ml bufer asetat 0.2 M pH 6 dan 5.0 ml standar fitat 0.5 % pada
kondisi yang sama.
Ke dalam masing-masing tabung reaksi dimasukkan 2.0 ml
TCA 20% dan 2.5 ml akuades dan ditambah 0.5 ml campuran
enzim hasil inkubasi. Sebagai kontrol, ke dalam tabung reaksi
yang lain dimasukkan 0.05 ml enzim, 2m1 TCA 20%, 2.5 ml
akuades, dan 0.45 ml larutan kontrol hasil inkubasi. Ke dalam
masing-masing tabung ditambahkan 6.25 ml larutan molibdat
vanadatdan didiamkan selama 10 menit, lalu diencerkan hingga
25 ml. Standardibuatdengan melanitkan0.3834 g KH2PO4dalam
100 ml akuades, kemudian diencerkan 100 kali sehingga setiap
ml larutan mengandung 0.03834mg KH2PO4. Sen standar dibuat
dengan mengambil 0,0.25, 0.5,0.75, 1.0, 2.0,3.0, dan 4.0 ml
larutan standar, kemudian masing-masing ditambahi 6.25 ml
molibdat-vanadat, didiamkan 10 menit, dan diencerkan hingga
25 ml. Larutan standar, sampel, dan kontrol diukur serapannya
pada 1 = 420 nm. Satu unit aktivitas enzim dinyatakan sebagai
satu rniknomol P043 yang dilepas per menit pada kondisi opti
mum reaksi.
HASIL DAN PEMBAIIASAN
Pengaruh Penambaban Mineral terhadap AktivitasHtase.
Penambahan Fe2 pada konsentrasi 1.0 dan 1.5 mM
menyebabkan kenaikan aktivitas sebesar 350.0 dan 43.8%,
sedangkan pada konsentrasi lebih tinggi 2.0, 2.5, dan 3.0 mM
justru menurunkan aktivitas sebesar 18.7% Tahcl 2.
Penurunan mi disebabkan karena terjadinya pengendapan
substrat yang berikatan dengan Fe2. Enzim berkompetisi
dengan ion besi untuk mengikat molekul fitat yang ditandai
dengan teramatinya endapan Fe-fitat Lolas & Markakis 1977,
Greiner eta!. 1993, hal mi diperkuat oleh Powar & Jagannathan
1982 dan Shimizu 1992 bahwa Fe2 bertindak sebagai in
hibitor fitase B. substilis, sedangkan menurut Ullah 1988 min
eral mi tidak berpengaruh terhadap fitaseAspergillusficuum.
Mineral Li2 pada konsentrasi 0.5 mM dapat berfungsi
sebagai aktivator kedua setelah mineral Fe2, yaitu mampu
meningkatkan aktivitas sebesar 281.3%, sedangkan pada
konsentrasi 1.0mM menurunkan aktivitas sebesar 31 .2%. Hal
mi sesuai dengan laporan Young etal. 1998 bahwa mineral
Li2 pada konsentrasi 1.0 dan 5.0 mM masing-masing
menurunkan dan tidak berpengaruh terhadap aktivitas fitase
Bacillus DS 11.
Penambahan mineral Mg2 dan Zn2 pada konsentrasi 1.5
mM mampu meningkatkan aktivitas fitase masing-masing 87.5
dan 75.0%, tetapi pada konsentrasi 1.0 dan 1.5 mM kedua min
eral mi justru menurunkan aktivitas fitase Bacillus DSI I Young
etaL 1998. Demikian pula Liu eta!. 1998 melaporkan, bahwa
mineral Mg2 dan Zn2 menurunkan aktivitas fitase yang
diperoleh dan berbagai sumber. Laporan lain menyebutkan
bahwa Zn2 sebagai kofaktor bagi fitase meningkatkan
aktivitasnya sebesar 40% pada penambahan 20-80mM Bitar
& Reinhold 1972.
3. Mikrobiol. Indon. 29
Vol.6,2001
label I. Pengaruh bcrbagai konsentrasi mineral terhadap aktiv lies
fitase Bacillu3 coag3dans E1.4.4.
Konsentrasi
mM
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Li
Mg
100.0
381.3
68.8
12.5
118.8
75.0
75.0
100.0
75.0
118.8
187.5
168,8
156.3
118.8
Aiclivitas reladf%
Fe
Ca
Mn Cu
Ni
Na
100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0
100.0 118.8 150.0 100.0 88.2 97.1 85.3
150.0 450.0 243.8 85.2 100.0 97.1 244.1
175.0 143.8 37.5 97.1 85.3 6.7 106.0
162.5 81.3 31.3 97.1 85.3 85.3 91.2
150.0 87.5
6.3 91.2 88.2 88.2 91.2
118.8 87.5 18.7 88.2 97.1 88.2 88.2
Zn
Mineral Ca2 dapat berfungsi sebagai aktivator pads
konsentrasi 0.5 dan 1.0 mM dengan meningkatkan aktivitas
fitase sebesar 50.0 dan 143.8%, sedangkan pada konsentrasi
yang lebih tinggi berfungsi sebagai inhibitor yang kuat dengan
menurunkan aktivitas sebesar 93.7%. Mineral mi memang telah
dikenal sebagai aktivator, Beberapahasil penelitian menyatakan
bahwa mineral liii mampu meningkatkan aktivitas fitase Powar
& Jagannathan 1982, HaraeraL 1985, Shimizu 1992, Laboure
eta!. 1993. Young eraL 1998 melaporkan bahwa mineral mi
mampu mempertahankan kestabilan fitase dan pengaruh panas
setelah inkubasi pada suhu 90°C selama 10 menit.
Mineral Na2 sebagai aktivator pada konsentrasi 1.0 dan
1.5 mM meningkatkan aktivitas fitase hingga 244.1 dan 106.0%,
sedangkanpada konsentrasi lebih tinggi serta0.5 mM terjadi
penurunan. Schwimmer era!. 1981 menyatakan bahwa min
eral mi sebagai aktivator bagi enzim.
Mineral Mn2 lebih berfungsi sebagai inhibitor dengan
menurunkan aktivitas fitase pada berbagai konsentrasi 1.5,
2.0, 2.5, dan 3.0 mM, sedangkan pada konsentrasi 0.5 mM
mampu menstabilkan fitase. Hasil ml sesuai dengan laporan
Young ci aL 1998 bahwa pada konsentrasi 1.0 dan 5.0mM
mineral Mn2 mampu menurunkan aktivitas hingga 65 dan 10%.
Dengan demikian, mineral mi dapat dikatakan sebagai inhibi
tor Powar& Jagannathan 1982, Hara et aL 1985, Shimizu 1992,
Segueilha et aL 1992, Yoon eta!. 1996.
Mineral Ni2 dan Cu2" cenderung sebagai inhibitor.
Penurunan terbesar terjadi saat penambahan Ni2 pada
konsentrasi 1.5mM sebesar93.3%. Penambahan 1.0mM Cu2
tidak mempengaruhi aktivitas fitase, sedangkan pada
konsentrasi lainnya cenderung sebagai inhibitor. Penurunan
terbesar ialah pada penambahan 1.5 dan 2.0 mM yang
menyebabkan turunnya aktivitas sebesar 14.7%. Hasil mi
memperkuat hasil penelitian Shimizu 1992 serta Yoon el a!.
1996 yang mengemukakan bahwa mineral Cu2merupakan
inhibitor bagi fitase dan B. substilis dan Enterobacter.
Konsentrasi mineral yang menghasilkan aktivitas enzim
relatiftinggi, yaitu F& 1.0 mM, Li2 0.5 mM, Na24 1.0mM, Cu24
1.0 mM, Ni2 1.0 mM, Zn2" 1.5 mM, Car' 1.0 mM, Mg2 1.5 mM,
dan Mn24 1.5 mM. Masing-masing konsentrasi terpilih dan
berbagai mineral mi diuji pengaruhnya terhadap aktivitas fitase
selama penyimpanan. Gambar 1 dan 2 menyatakan persentase
relatif terhadap masing-masing aktivitas fitase sebelum
penyimpanan. Aktivitas relatif kontrol mulai minggu ke-1
hingga ke-6 menunjukkan penurunan. Aktivitas relatif fitase
0
1
2
3
4
5
8
Lame penyimpanan minggu keGambar 1. Pengaruh mineral Zn2, Ca2, Mg, dan Mn34 terhadap
aktivitas relatif fitase selama penyimpanan. . kontrol. u Zn 1.5 mM,
A Ca2 I mM, . Mg2 1.5 mM, : Mn2 1.5 mM.
100
.-.
80
I
6o
1
40
20
0
0
1
2
3
4
5
6
Lama pcnyimpanan minggu ke-
Gambar 2. Pengarub mineral Fc, Li2, Cu2, Ni2, dan Na2 terhadap
aktivitas relatif fitase selama penyimpanan. * kontrol, U Fe2 1.5 mM,
a Li2 I mM, : Cu
"
1.0 mM,
Ni 2mM, sNa2 1.5 mM.
dengan penambahan mineral Zn2, Ca2, Mg2, dan Mn2* lebih
rendah dibandingkan kontrol dan minggu ke-l hingga ke-6
Gambar 1, dengan demikiani keempat mineral mi tidak dapat
mempertahankan aktivitas fitase selama penyimpanan.
Aktivitas relatif fitase dengan penambahan mineral Cu2
dan Ni2 pada konsentrasi 1 mM lebih tinggi dibandingkan
konirol mulai minggu ke-3 hingga ke-6 Gambar2. Penambahan
mineral Fe 1.0 mM, Li2 0.5 mM, dan Na2 1.0mM menghasilkan
aktivitas relatiflebih tinggi dibandingkan kontrol mulai minggu
ke-4 hingga minggu ke-6. Menurut Ullah 1988 ion-ion logam
yang ditambahkan dalam bentuk garam-garam organik dapat
memberikan kestabilan enzim dengan cars menetralkan muatan
elektrostatik yang melindungi molekul enzim sehingga
konformasi dapat dipertahankan.
Pada awal penyimpanan fitase dengan penambahan min
eral Li2, Fe24, Na2, Ni2, dan Cu2 terlihat bahwa aktivitas
fitase lebih rendah dibandingkan kontrol, hal mi diduga akibat
terjadinya adaptasi enzim dengan lingkungannya maupun
logam yang ditambahkan. Peningkatan aktivitas fitase
bergantung oleh jenis dan konsentrasi masing-masing mineral
yang ditambahkan Nord 1980.
30
THONTOWIETAL.
Penambahan mineral Li2 0.5 mM, Na2 1.0 mM, Cu2 1.0
mM, Ni2 1.0 mM, dan Fe2 1.0 mM dapat mengurangi
penurunan aktivitas relatif fitase pada penyimpanan 4°C,
sedangkan penambahan mineral Zn2 1.5 mM, Ca2* 1.0 mM,
Mg2* 1.5 mM, dan Mn2* 1.5 mMjustru mempercepat penurunan
aktivitas fitase selania penyimpanan.
DAF1'ARPUSTAKA
Bitar K. Reinhold JG. 1972. Phytases and alkaline phospatase activities
in the intestinal mucosa of rats, chicken, calf, and man. Bloc/tern
Biophys AcVa 268:442-452.
Greiner R, Konietzny U, Jany KU. 1993. Purification and
characterisation of two phytases from Escherichia coil. Arch
Bloc/tern Biophys 303:107-113.
Hammond N. 1994. Functional and nutrional characteristic of rice bran
extracts. Amer Assoc Cereal C/tern Inc 39:752-753.
Hara A. Ebina S. Kondo A. 1985. A new type of phytase from pollen of
Typha latifolia L. Agric Blot Chem 49:3539-3544.
Laboure AM, Gagnon J, Lescure AM. 1993. Purification and
characterisation of a phytase rnyo-inositol-hexakisphosphate
phosphohydrolase accumulated in maize Zea mays seedlings dur
ing germination. J Biochem 295:413-419.
Liu BL, Rafiq A. Tzeng YM. Rob A. 1998. The induction and charac
terisation of phytase and beyond. En-yme Microb Technol 22:415424.
Lolas GM, Markakis P. 1977. The phytase of navy beans Phaseolus
vulgaris. J Food Sci 42:1094-1096.
Nagai Y, Funahashi S. 1962. Phylase myo-inositol-hexakisphosphate
phosphohydrolase from wheat bran. Part I. Purification and sub
strate specivity. Agric Biol Chem 26:794-803.
Nord. 1980. Advanced in Enzymoiogy. New York: interscience.
Powar VK. Jagannathan V. 1982. Purification and properties of' phytase
spesitic phosphatase from Bacillus subsillis. J Bacterloi 151:11021108.
J. Mikrobiol. Indon.
Richardson T, Hyslop 0G. 1985. Enzyme. Di dalam: Fenema OR. ed.
Food Chemistry. New York: Marcel Dekker Inc. him 235-249.
Rosmimik, Widowati S. Andriani U, Indarwati S. Damardjati US. 1998.
Skrining bakteri penghasil fitase dan pengujian aktivitasnya pada
media PSM dan bekatut. Di dalam: Presiding Temu Ilmiah
Bioleknologi Pertanian. Bogor, 26 Mar 1998. hIm 43-48.
Satiawihardja B, Suhartono MT. Kusnidar A. 1997. Mempelajari pengaruh
Iingkungan kimiawi terhadap aktivitas dan daya tahan panas protease dan Bacillus pumilus Yl. But Teknoi Industri Pangan 7:4756.
Schwinimer S. 1981. Source Book of Food Enzymology. Connecticut:AVI.
Segueilha L, Lambrechts C, Boze H, Moulin G, & Gaizy P. 1992. Puri
fication and properties of the phytase from Schwanniomyces
castelli. J Fermeni Bloeng 74:7-Il.
Shimizu M. 1992. Purification and characterisation of phytase from
Bacillus substillis natto N-77. Biosc, Biotec/mol Bloc/tern 56:12661269.
Syahbirin G, Syatria A. Ambarsani L, Widowati S. 2000. Optimasi dan
karakterisasi enzim fitase dan Bacillus coagulans. Di dalam:
Mikrobiologi, Ensim. dan Bioleknologi dalam Perspekuf Ekonorni
dan Industri. Prosiding Seminar Naslonal Industri dan Bioteknologi.
Jakarta, 15-16 Feb 2000. hIm 361-369.
Ullab AHJ. 1988. Aspergillus flcuurn phytase: partial primary struc
ture, substrate selectivity, and kinetic characterisation. Prep Bloc/tern
18:459-471.
Vihinen M, Manstala P. 1989. Microbial amylolitic enzymes. Bloc/tern
Mol Biol 24:329-418.
Widowati S. Andniani U, Azizah N, Sukarno L, Damardjati US. 2000.
Produksi fitase dan Bacillus coagulans isolat E.I.4.4 dan aplikasinya
untuk memperbaiki gizi bekatul. J Agrobiolek 1:16-21.
Yoon SJ, Choi YJ, Mm HK, Cho KK, Kim JW, Lee SC, Jung YH. 1996.
Isolation and identification of phytase-producing bacterium
Enterobacter sp4 and enzymatic properties of phytase enzyme.
Enzyme Microb Technol 18:449-454.
Young OK, Kini HK, Bae KS, Yu JH, Oh TK. 1998. Purification and
properties of a thermostable phytase from Bacillus DSI 1. Enzyme
Microb Technol 22:2-7.
Vol. 6, No. I
ISSN 0853-358X
Penambahan Mineral untuk Meningkatkan Aktivitas dan
Stabilitas Fitase Bacillus coagulans E1.4.4.
Mineral Addition to Enhance Activity and Stability
ofPhytase Bacillus coagulans E1.4.4.
AHMAD THONTOWI', ENY IDA RIVANTI, SRI WIDOWATI & HETI'Y FIERAWATT
Balal Penelitlan Biotekno!ogl Tanwuan Pangan, Juian Tentara Pelajar No. 3A, Bogor 16111
TeL +62-251-337975,339793, Fax. +62-251-338820
Mineral addition can be used to enhance activity and stabilization of phytase. The aims of this study were to
investigate effect of minerals, by addition of some minerals LP, Mg2, Zn2, Fez, Cat', Mn2, Cu2', Ni2', and Nit' at
several concentrations 0, 0.5, 1.0, 2.0, 2.5, and 3.0 mM. Effect of mineral addition on enzyme stability during storage
0, I, 2, 3, 4. 5, and 6 weeks was also Investigated. The most effective concentration of mineral Li2' was 0.5 mM, givi.g
the highest activity I.e. 281.3%. MIneral Fe1' and Na2' were an effective activator at 1.0 mM concentration, giving tie
highest activity I.e. 350 and 144.1%, respectively. Minerals Mg2' and Zn2' were effective stabilizers at 1.5 mM concen
tration, that Increased the activity of 87.5 and 75%, respectively. On the other hand minerals Ca2' at 0.5 and 1.0 mM
concentration act as activator, whereas Mn2', Ni', and Cu2' minerals act as inhibitors. Furthermore 0.5 mM Liz', Nat',
Cu", Ni2', md Fe2' at 1.0 mM could minimize the rate of degradation of phytase activity during storage at 4C, wheress
other minerals accelererated of phytase degradation.
Key words: phytase, minerals, Bac11us coagulans E 1.4.4.
Fitase atau mio-inositol-heksakisfosfat fosfohidrolisa
EC.3. 1.3.8 pertama kali ditemukan oleh Suzuki eta!. dalam
penelitiannya tentang hidrolisis bekatul Nagai & Funahashi
1962. Pemanfaatan bekatul masih terbatas, meskipun bernilai
gizi tinggi. Salah satu kendala pemanfaatan bekatul sebagai
bahan pangan ialah adanya zat antigizi berupa asam fitat yang
mengikat beberapa mineral penting sehingga membentuk
senyawa kompleks dengan Ca2', Zn2', Mg" dan Fe"'. Hal
ml mengakibatkan berkurangnya nilai cerna dan
bioavailabilitasnya Hammond 1994.
Aplikasi fitase dalam mereduksi asam fitat akan
meningkatkan nilai nutrisi dan bahan pangan dan produk
produk pakan yang mengandung fitat. Bacillus coagulans
El .4.4 mampu menghasilkan fitase yang mampu menghidrolisis
fitat pada bekatul Rosmimik eta!. 1998. Isolat mi mempunyai
kondisi optimum untuk produksi fitase skala saw liter pada pH
6,8, agitasi 175 rpm, suhu 37°C serta mempunyal aktivitas
spesifik tertinggi padajam ke-20. Aplikasi fitase pada bekatul
mampu meningkatkan nilai cema protein bekatul dan 29 menjadi
53% Widowati eta!. 2000.
Walaupun aktivitas spesifik dan kultur mi relatifbesar, tetapi
setelah beberapa perlakuan sebelum aplikasi, seperti
pengendapan dengan amonium sulfat atau aseton,
pengeningbekuan, dan penyimpanan, enzim kasar mi sering
mengalami penurunan aktivitas. Selain itu konsentrasi enzim
kasar mi masih rendah, yaltu 1.6-3.6 mg/mI kultur setelah melalui
*
Penulis untuk korespondensi
tahapan perlakuan pengendapan dengan amonium sulfat, serta
dilanjutkan dengan dialisis dan pengeringbekuan.
Aktivitas enzim berhubungan langsung dengan perubahan
struktur tersier dan molekul protein enzim. Pada keadaan suhu,
pH, dan konsentrasi ion normal, struktur tersier distabilkan
oleh empatjenis reaksi. Interaksi tersebut ialah ikatan hidrogen,
gaya tank ion, interaksi hidirofobik, dan jembatan kovalen.
Berbagai cara dapat dilakukan untuk meningkatkan aktivitas
dan stabilitas enzim, salah satunya ialah penambahan aditif
berupa ion logam Vihinen & Manstala 1989, Satiawihardja et
a!. 1997.
Ion logam sebagai aditif umumnya ditambahkan dalam
bentuk garam, misalnya ion Ca" dalam bentuk garam kionida
Schwimmer 1981. Kation lain yang diketahui mengaktifkan
enzim ialah Na', K', Rb', Cs', Mg", Zn2', Cr", Cu", Fe",
Co", Ni", dan Al". Ion tersebut dapat mengaktitkan enzim
karena beberapaperubahan mekanis, antara lain: adanya bagian
yang utuh pada sisi aktif, bentuk ikatan rantai antara enzim
dan substrat, perubahan konstanta keseimbangan pada reaksi,
perubahan muatan permukaari pada protein enzim, digantinya
hambatan pada reaksi yang hilang, digantinya ion-ion logam
yang tidak efektifdari sisi aktifatau substrat, dan keseimbangan
konformasi dan kurang aktif diganti menjadi lebih aktif
Richardson & Hyslop 1985.
Pengaruh mineral terhadap fitase masih membingungkan
dan belum dapat diketahui mekanismenya, karena fitase yang
diisolasi dan spesies berbeda menunjukkan respons berbeda
pula. Sebagai contoh ion Mg" dan Mn"membenikan pengaruh
28
THONTOW1 FT AL.
schagai aktivator fitase Phaseolus vulgaris Lolas & Markakis
1977, namun bagi fitase Enterobacter sp4 memberikan hal
yang sebaliknya Yoon eta!. 1996. Berbagai mineral dilaporkan
dapat memberikan pengaruh sebagai aktivator seperti Mg2,
Mn2, dan Ca2 pada konsentrasi 1.0 mM, sedangkan mineral
Fe2 atau Fe tidak meningkatkan aktivitas fitase. Mineral Mg2
dan Mn2 pada konsentrasi 1.0 mM mainpu meningkatkan
aktivitas fitase sebesar 5.79% dibandingkan tanpa
penambahan mineral, sedangkan Ca2 meningkatkan aktivitas
sebesar 8.46% Syahbirin etal. 2000. Oleh sebab itu, penelitian
lanjut mengenai pengaruh berbagai macam konsentrasi min
eral lainnya terhadap aktivitas fitase perlu dilakukan.
BABAN DAN MEFODE
Mikroorganisme. Bakteri yang digunakan sebagai
penghasil fitase ialah Bacillus coagulans El .4.4. berasal dan
koleksi Balai Penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan, Bogor.
Produksi Fitase Skala 5 liter. Sebanyak lima ose B.
coagulans E 1.4.4. diinokulasikan ke dalam 500 ml media ekstrak
malt khamir pH 6.8 dengan komposisi per liter: 3 g ekstrak
malt Difco, 3 g ekstrak khamirDifco, 0.5 g pepton Sigma,
dan lOg glukosa Merck. Biakan dalam media diinkubasikan
pada inkubator bergoyang dengan suhu 37°C, kecepatan agitasi
175 rpm selama 24 jam.
Produksi enzim dilakukan dengan menginokulasikan
sehanyak 7.5% biakan mi ke dalam 5 I media cair fitase Yoon et
a!. 1996 yang telah dimodifikasi fitat dan bekatul 0.3%, 300
mgNH4S04, 5OmgMgSO4, lOingCaCl2, 1 mgMnSO4, 1000
mg Glukosa, dan 10 mgFeSO4. Produksi enzim dilakukan dalam
hioreaktor BIOSTATB B. Braun Biotech International
berkapasitas 5 L. Setelah fermentasi, larutan disentrifugasi path
23300 g 12 000 rpm dengan rotor RP 45T selama 15 menit,
suhu 4°C dan diambil supernatannya sebagai fraksi enzim kasar.
Pengaruh PenambahanMineral terhadap Aktivitas Fitase.
Sumber mineral yang digunakan ialah LiCI2, MgCI2, ZnCl2,
FeCI2, CaCI2, MnCI2, CuCI2, NiCI2, dan NaCI2. Mineral tersebut
ditambahkan pada enzim kasar sehingga konsentrasi akhir
masing-masing sebesar 0, 0.5, 1.0, 2.0, 2.5, dan 3.0mM dan
aktivitas fitasenya dianalisis.
Beberapa konsentrasi yang memberikan aktivitas tinggi
ditambahkan ke supernatan enzim kasar fitase hasil sentrifugasi
dan aktivitas fitasenya diukur pada minggu ke 0. 1,2, 3,4,5,
dan 6. Enzim kasar mi disimpan pada suhu 4°C.
Analisis Aktivitas Fitase. Analisis dilakukan berdasarkan
metode Young et a!. 1998 yang dimodifikasi. Pereaksi
molibdat-vanadat dibuat dengan mencainpurkan larutan
amonium heptamolibdat 20 g/400 ml dan larutan amonium
monovanadat 1 g/300 ml ke dalam 140 ml HNO3 pekat,
kemudian diencerkan menjadi satu liter.
Aktivitas enzim diukurdengan memasukkan 4.5 ml bufer
asetat 0.2 M pH 6.5, 4.5 ml standar fitat 0.5%, serta 1.0 ml
campuran enzim kasar dan mineral ke dalam erlenmeyer. Larutan
mi diinkubasi pada suhu 40°C selama 30 menit dalam penangas
J. Mikrobiol. Indon.
air sambil digoyang. Kontrol dibuat dengan mengmnkubasi 5.0
ml bufer asetat 0.2 M pH 6 dan 5.0 ml standar fitat 0.5 % pada
kondisi yang sama.
Ke dalam masing-masing tabung reaksi dimasukkan 2.0 ml
TCA 20% dan 2.5 ml akuades dan ditambah 0.5 ml campuran
enzim hasil inkubasi. Sebagai kontrol, ke dalam tabung reaksi
yang lain dimasukkan 0.05 ml enzim, 2m1 TCA 20%, 2.5 ml
akuades, dan 0.45 ml larutan kontrol hasil inkubasi. Ke dalam
masing-masing tabung ditambahkan 6.25 ml larutan molibdat
vanadatdan didiamkan selama 10 menit, lalu diencerkan hingga
25 ml. Standardibuatdengan melanitkan0.3834 g KH2PO4dalam
100 ml akuades, kemudian diencerkan 100 kali sehingga setiap
ml larutan mengandung 0.03834mg KH2PO4. Sen standar dibuat
dengan mengambil 0,0.25, 0.5,0.75, 1.0, 2.0,3.0, dan 4.0 ml
larutan standar, kemudian masing-masing ditambahi 6.25 ml
molibdat-vanadat, didiamkan 10 menit, dan diencerkan hingga
25 ml. Larutan standar, sampel, dan kontrol diukur serapannya
pada 1 = 420 nm. Satu unit aktivitas enzim dinyatakan sebagai
satu rniknomol P043 yang dilepas per menit pada kondisi opti
mum reaksi.
HASIL DAN PEMBAIIASAN
Pengaruh Penambaban Mineral terhadap AktivitasHtase.
Penambahan Fe2 pada konsentrasi 1.0 dan 1.5 mM
menyebabkan kenaikan aktivitas sebesar 350.0 dan 43.8%,
sedangkan pada konsentrasi lebih tinggi 2.0, 2.5, dan 3.0 mM
justru menurunkan aktivitas sebesar 18.7% Tahcl 2.
Penurunan mi disebabkan karena terjadinya pengendapan
substrat yang berikatan dengan Fe2. Enzim berkompetisi
dengan ion besi untuk mengikat molekul fitat yang ditandai
dengan teramatinya endapan Fe-fitat Lolas & Markakis 1977,
Greiner eta!. 1993, hal mi diperkuat oleh Powar & Jagannathan
1982 dan Shimizu 1992 bahwa Fe2 bertindak sebagai in
hibitor fitase B. substilis, sedangkan menurut Ullah 1988 min
eral mi tidak berpengaruh terhadap fitaseAspergillusficuum.
Mineral Li2 pada konsentrasi 0.5 mM dapat berfungsi
sebagai aktivator kedua setelah mineral Fe2, yaitu mampu
meningkatkan aktivitas sebesar 281.3%, sedangkan pada
konsentrasi 1.0mM menurunkan aktivitas sebesar 31 .2%. Hal
mi sesuai dengan laporan Young etal. 1998 bahwa mineral
Li2 pada konsentrasi 1.0 dan 5.0 mM masing-masing
menurunkan dan tidak berpengaruh terhadap aktivitas fitase
Bacillus DS 11.
Penambahan mineral Mg2 dan Zn2 pada konsentrasi 1.5
mM mampu meningkatkan aktivitas fitase masing-masing 87.5
dan 75.0%, tetapi pada konsentrasi 1.0 dan 1.5 mM kedua min
eral mi justru menurunkan aktivitas fitase Bacillus DSI I Young
etaL 1998. Demikian pula Liu eta!. 1998 melaporkan, bahwa
mineral Mg2 dan Zn2 menurunkan aktivitas fitase yang
diperoleh dan berbagai sumber. Laporan lain menyebutkan
bahwa Zn2 sebagai kofaktor bagi fitase meningkatkan
aktivitasnya sebesar 40% pada penambahan 20-80mM Bitar
& Reinhold 1972.
3. Mikrobiol. Indon. 29
Vol.6,2001
label I. Pengaruh bcrbagai konsentrasi mineral terhadap aktiv lies
fitase Bacillu3 coag3dans E1.4.4.
Konsentrasi
mM
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Li
Mg
100.0
381.3
68.8
12.5
118.8
75.0
75.0
100.0
75.0
118.8
187.5
168,8
156.3
118.8
Aiclivitas reladf%
Fe
Ca
Mn Cu
Ni
Na
100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0
100.0 118.8 150.0 100.0 88.2 97.1 85.3
150.0 450.0 243.8 85.2 100.0 97.1 244.1
175.0 143.8 37.5 97.1 85.3 6.7 106.0
162.5 81.3 31.3 97.1 85.3 85.3 91.2
150.0 87.5
6.3 91.2 88.2 88.2 91.2
118.8 87.5 18.7 88.2 97.1 88.2 88.2
Zn
Mineral Ca2 dapat berfungsi sebagai aktivator pads
konsentrasi 0.5 dan 1.0 mM dengan meningkatkan aktivitas
fitase sebesar 50.0 dan 143.8%, sedangkan pada konsentrasi
yang lebih tinggi berfungsi sebagai inhibitor yang kuat dengan
menurunkan aktivitas sebesar 93.7%. Mineral mi memang telah
dikenal sebagai aktivator, Beberapahasil penelitian menyatakan
bahwa mineral liii mampu meningkatkan aktivitas fitase Powar
& Jagannathan 1982, HaraeraL 1985, Shimizu 1992, Laboure
eta!. 1993. Young eraL 1998 melaporkan bahwa mineral mi
mampu mempertahankan kestabilan fitase dan pengaruh panas
setelah inkubasi pada suhu 90°C selama 10 menit.
Mineral Na2 sebagai aktivator pada konsentrasi 1.0 dan
1.5 mM meningkatkan aktivitas fitase hingga 244.1 dan 106.0%,
sedangkanpada konsentrasi lebih tinggi serta0.5 mM terjadi
penurunan. Schwimmer era!. 1981 menyatakan bahwa min
eral mi sebagai aktivator bagi enzim.
Mineral Mn2 lebih berfungsi sebagai inhibitor dengan
menurunkan aktivitas fitase pada berbagai konsentrasi 1.5,
2.0, 2.5, dan 3.0 mM, sedangkan pada konsentrasi 0.5 mM
mampu menstabilkan fitase. Hasil ml sesuai dengan laporan
Young ci aL 1998 bahwa pada konsentrasi 1.0 dan 5.0mM
mineral Mn2 mampu menurunkan aktivitas hingga 65 dan 10%.
Dengan demikian, mineral mi dapat dikatakan sebagai inhibi
tor Powar& Jagannathan 1982, Hara et aL 1985, Shimizu 1992,
Segueilha et aL 1992, Yoon eta!. 1996.
Mineral Ni2 dan Cu2" cenderung sebagai inhibitor.
Penurunan terbesar terjadi saat penambahan Ni2 pada
konsentrasi 1.5mM sebesar93.3%. Penambahan 1.0mM Cu2
tidak mempengaruhi aktivitas fitase, sedangkan pada
konsentrasi lainnya cenderung sebagai inhibitor. Penurunan
terbesar ialah pada penambahan 1.5 dan 2.0 mM yang
menyebabkan turunnya aktivitas sebesar 14.7%. Hasil mi
memperkuat hasil penelitian Shimizu 1992 serta Yoon el a!.
1996 yang mengemukakan bahwa mineral Cu2merupakan
inhibitor bagi fitase dan B. substilis dan Enterobacter.
Konsentrasi mineral yang menghasilkan aktivitas enzim
relatiftinggi, yaitu F& 1.0 mM, Li2 0.5 mM, Na24 1.0mM, Cu24
1.0 mM, Ni2 1.0 mM, Zn2" 1.5 mM, Car' 1.0 mM, Mg2 1.5 mM,
dan Mn24 1.5 mM. Masing-masing konsentrasi terpilih dan
berbagai mineral mi diuji pengaruhnya terhadap aktivitas fitase
selama penyimpanan. Gambar 1 dan 2 menyatakan persentase
relatif terhadap masing-masing aktivitas fitase sebelum
penyimpanan. Aktivitas relatif kontrol mulai minggu ke-1
hingga ke-6 menunjukkan penurunan. Aktivitas relatif fitase
0
1
2
3
4
5
8
Lame penyimpanan minggu keGambar 1. Pengaruh mineral Zn2, Ca2, Mg, dan Mn34 terhadap
aktivitas relatif fitase selama penyimpanan. . kontrol. u Zn 1.5 mM,
A Ca2 I mM, . Mg2 1.5 mM, : Mn2 1.5 mM.
100
.-.
80
I
6o
1
40
20
0
0
1
2
3
4
5
6
Lama pcnyimpanan minggu ke-
Gambar 2. Pengarub mineral Fc, Li2, Cu2, Ni2, dan Na2 terhadap
aktivitas relatif fitase selama penyimpanan. * kontrol, U Fe2 1.5 mM,
a Li2 I mM, : Cu
"
1.0 mM,
Ni 2mM, sNa2 1.5 mM.
dengan penambahan mineral Zn2, Ca2, Mg2, dan Mn2* lebih
rendah dibandingkan kontrol dan minggu ke-l hingga ke-6
Gambar 1, dengan demikiani keempat mineral mi tidak dapat
mempertahankan aktivitas fitase selama penyimpanan.
Aktivitas relatif fitase dengan penambahan mineral Cu2
dan Ni2 pada konsentrasi 1 mM lebih tinggi dibandingkan
konirol mulai minggu ke-3 hingga ke-6 Gambar2. Penambahan
mineral Fe 1.0 mM, Li2 0.5 mM, dan Na2 1.0mM menghasilkan
aktivitas relatiflebih tinggi dibandingkan kontrol mulai minggu
ke-4 hingga minggu ke-6. Menurut Ullah 1988 ion-ion logam
yang ditambahkan dalam bentuk garam-garam organik dapat
memberikan kestabilan enzim dengan cars menetralkan muatan
elektrostatik yang melindungi molekul enzim sehingga
konformasi dapat dipertahankan.
Pada awal penyimpanan fitase dengan penambahan min
eral Li2, Fe24, Na2, Ni2, dan Cu2 terlihat bahwa aktivitas
fitase lebih rendah dibandingkan kontrol, hal mi diduga akibat
terjadinya adaptasi enzim dengan lingkungannya maupun
logam yang ditambahkan. Peningkatan aktivitas fitase
bergantung oleh jenis dan konsentrasi masing-masing mineral
yang ditambahkan Nord 1980.
30
THONTOWIETAL.
Penambahan mineral Li2 0.5 mM, Na2 1.0 mM, Cu2 1.0
mM, Ni2 1.0 mM, dan Fe2 1.0 mM dapat mengurangi
penurunan aktivitas relatif fitase pada penyimpanan 4°C,
sedangkan penambahan mineral Zn2 1.5 mM, Ca2* 1.0 mM,
Mg2* 1.5 mM, dan Mn2* 1.5 mMjustru mempercepat penurunan
aktivitas fitase selania penyimpanan.
DAF1'ARPUSTAKA
Bitar K. Reinhold JG. 1972. Phytases and alkaline phospatase activities
in the intestinal mucosa of rats, chicken, calf, and man. Bloc/tern
Biophys AcVa 268:442-452.
Greiner R, Konietzny U, Jany KU. 1993. Purification and
characterisation of two phytases from Escherichia coil. Arch
Bloc/tern Biophys 303:107-113.
Hammond N. 1994. Functional and nutrional characteristic of rice bran
extracts. Amer Assoc Cereal C/tern Inc 39:752-753.
Hara A. Ebina S. Kondo A. 1985. A new type of phytase from pollen of
Typha latifolia L. Agric Blot Chem 49:3539-3544.
Laboure AM, Gagnon J, Lescure AM. 1993. Purification and
characterisation of a phytase rnyo-inositol-hexakisphosphate
phosphohydrolase accumulated in maize Zea mays seedlings dur
ing germination. J Biochem 295:413-419.
Liu BL, Rafiq A. Tzeng YM. Rob A. 1998. The induction and charac
terisation of phytase and beyond. En-yme Microb Technol 22:415424.
Lolas GM, Markakis P. 1977. The phytase of navy beans Phaseolus
vulgaris. J Food Sci 42:1094-1096.
Nagai Y, Funahashi S. 1962. Phylase myo-inositol-hexakisphosphate
phosphohydrolase from wheat bran. Part I. Purification and sub
strate specivity. Agric Biol Chem 26:794-803.
Nord. 1980. Advanced in Enzymoiogy. New York: interscience.
Powar VK. Jagannathan V. 1982. Purification and properties of' phytase
spesitic phosphatase from Bacillus subsillis. J Bacterloi 151:11021108.
J. Mikrobiol. Indon.
Richardson T, Hyslop 0G. 1985. Enzyme. Di dalam: Fenema OR. ed.
Food Chemistry. New York: Marcel Dekker Inc. him 235-249.
Rosmimik, Widowati S. Andriani U, Indarwati S. Damardjati US. 1998.
Skrining bakteri penghasil fitase dan pengujian aktivitasnya pada
media PSM dan bekatut. Di dalam: Presiding Temu Ilmiah
Bioleknologi Pertanian. Bogor, 26 Mar 1998. hIm 43-48.
Satiawihardja B, Suhartono MT. Kusnidar A. 1997. Mempelajari pengaruh
Iingkungan kimiawi terhadap aktivitas dan daya tahan panas protease dan Bacillus pumilus Yl. But Teknoi Industri Pangan 7:4756.
Schwinimer S. 1981. Source Book of Food Enzymology. Connecticut:AVI.
Segueilha L, Lambrechts C, Boze H, Moulin G, & Gaizy P. 1992. Puri
fication and properties of the phytase from Schwanniomyces
castelli. J Fermeni Bloeng 74:7-Il.
Shimizu M. 1992. Purification and characterisation of phytase from
Bacillus substillis natto N-77. Biosc, Biotec/mol Bloc/tern 56:12661269.
Syahbirin G, Syatria A. Ambarsani L, Widowati S. 2000. Optimasi dan
karakterisasi enzim fitase dan Bacillus coagulans. Di dalam:
Mikrobiologi, Ensim. dan Bioleknologi dalam Perspekuf Ekonorni
dan Industri. Prosiding Seminar Naslonal Industri dan Bioteknologi.
Jakarta, 15-16 Feb 2000. hIm 361-369.
Ullab AHJ. 1988. Aspergillus flcuurn phytase: partial primary struc
ture, substrate selectivity, and kinetic characterisation. Prep Bloc/tern
18:459-471.
Vihinen M, Manstala P. 1989. Microbial amylolitic enzymes. Bloc/tern
Mol Biol 24:329-418.
Widowati S. Andniani U, Azizah N, Sukarno L, Damardjati US. 2000.
Produksi fitase dan Bacillus coagulans isolat E.I.4.4 dan aplikasinya
untuk memperbaiki gizi bekatul. J Agrobiolek 1:16-21.
Yoon SJ, Choi YJ, Mm HK, Cho KK, Kim JW, Lee SC, Jung YH. 1996.
Isolation and identification of phytase-producing bacterium
Enterobacter sp4 and enzymatic properties of phytase enzyme.
Enzyme Microb Technol 18:449-454.
Young OK, Kini HK, Bae KS, Yu JH, Oh TK. 1998. Purification and
properties of a thermostable phytase from Bacillus DSI 1. Enzyme
Microb Technol 22:2-7.