Isolation, Identification and Molecular Characterization of Hepatitis B Virus in Javan Gibbon in Indonesia
ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN KARAKTERISASI
MOLEKULAR VIRUS HEPATITIS B PADA
OWA JAWA (Hylobates moloch) DI INDONESIA
RACHMITASARI NOVIANA
SEKOLAH PASCA SARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Isolasi, Identifikasi dan Karakterisasi
Molekular Virus Hepatitis B pada Owa Jawa (Hylobates moloch) di
Indonesia adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Februari 2012
Rachmitasari Noviana
NRP. P053090031
ABSTRACT
RACHMITASARI NOVIANA. Isolation, Identification and Molecular
Characterization of Hepatitis B Virus in Javan Gibbon in Indonesia. Under
direction of JOKO PAMUNGKAS and DIAH ISKANDRIATI
Hepatitis B virus (HBV) was reported not only able to infect human being,
but also non-human primates, especially the great apes group such as orangutans,
gorillas, chimpanzees, as well as the lesser apes from the family of Hylobatidae.
Among other species within the genus, Hylobates moloch (owa jawa or silvery/
javan gibbons), which is considered as one of Indonesia’s endemic endangered
species, has been reported to harbor HBV of their own strain. Analyses of HBV
isolated from infected gibbons were done in this study to reveal their relatedness
to the published data. Plasma samples from nine javan gibbons were obtained as
part of diagnostic purpose. Those animals were previously tested positive for the
presence of hepatisis B-surface antigen (HBsAg) by enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA). DNA samples were extracted from these nine
plasma samples to be used as templates for amplification of the Pre-S1 region by
polymerase chain reactions (PCR) technique using semi degenerate primers that
could amplify several strains of HBVs. The PCR products of 457 - 459 base pairs
were then subject to restriction fragment length polymorphism (RFLP) analyses
using Bst2UI enzyme to evaluate the pattern of cleaved fragments. The PCR
products were sequenced for further homology analyses and to create
phylogenetic tree of the sequenced data obtained from the study in comparison
with published data. Two plasma samples were used as templates for whole region
amplification using sets of 4 primer. The PCR products of 3192 base pairs were
sequenced for further homology analyses and to create phylogenetic tree.
Phylogenetic tree analyses for Pre-S1 nucleotide region and whole region showed
that the javan gibbon isolates formed their own clusters, separate from the other
nonhuman primate isolates.
Keywords : Hepatitis B virus, Pre-S1, whole genome, javan gibbon, PCR,
Phylogenetic analysis
RINGKASAN
RACHMITASARI NOVIANA. Isolasi, Identifikasi dan Karakterisasi Molekular
Virus Hepatitis B pada Owa Jawa (Hylobates moloch) di Indonesia. Dibimbing
oleh JOKO PAMUNGKAS dan DIAH ISKANDRIATI.
Hepatitis atau peradangan hati adalah suatu kondisi klinis akibat terjadinya
peradangan atau inflamasi pada organ ataupun jaringan hati yang ditunjukkan
dengan ditemukannya sel-sel inflamatori pada jaringan hati tersebut. Infeksi virus
hepatitis merupakan salah satu penyebab terjadinya peradangan hati selain adanya
penyebab non infeksius seperti penggunaan obat-obatan terlarang dan minuman
beralkohol. Menurut data organisasi kesehatan dunia (WHO, 2011), satu dari tiga
penduduk dunia telah terinfeksi virus ini sementara satu dari 20 penduduk dunia
hidup dengan infeksi kronis. Infeksi virus hepatitis yang bersifat kronis dapat
mengakibatkan kematian karena menyebabkan sirosis hati.
Virus hepatitis B, salah satu dari 5 virus penyebab penyakit hepatitis, dapat
ditularkan melalui darah, hubungan kelamin (sexual intercourse) dan perinatal
(mother to child) pada saat melahirkan atau menyusui. Transmisi perinatal dan
infeksi carrier yang bersifat jangka panjang menyebabkan adanya endemisitas
dan prevalensi tinggi di benua Asia terutama bagian selatan dan timur.
Selain
dapat menyerang manusia, virus hepatitis B juga diketahui dapat menyerang satwa
primata terutama dari golongan kera. Infeksi virus hepatitis B pada satwa primata
terdeteksi melalui uji serologis maupun uji viral. Deteksi viral virus hepatitis B
dilakukan melalui polymerase chain reaction (PCR).Secara eksperimental telah
dilakukan transmisi VHB manusia melalui inokulasi cairan saliva dari manusia
yang menderita hepatitis B ke satwa primata keluarga Hylobatidae. Replikasi
virus yang terjadi pada satwa tersebut mengindikasikan adanya hubungan
kekerabatan yang dekat antara kedua inang (manusia dan Hylobatidae).
Penelitian mengenai infeksi virus hepatitis B pada owa jawa (Hylobates
moloch), salah satu spesies dari keluarga Hylobatidae, belum banyak dilakukan di
Indonesia meskipun spesies ini merupakan spesies endemik Indonesia. Penelitian
ini bertujuan mengeksplorasi informasi mengenai infeksi virus hepatitis B (VHB)
melalui penyidikan isolasi dan identifikasi VHB dari spesies owa jawa (Hylobates
moloch) yang berasal dari pusat rehabilitasi dan lembaga konservasi eks-situ di
Indonesia, dilanjutkan dengan melakukan pengkarakterisasian virus hepatitis B
asal spesies tersebut.
Penelitian ini dilakukan dari bulan Januari 2011 sampai Juni 2011. Metode
yang dilakukan untuk memperoleh isolat VHB yaitu melalui uji PCR yang
dilakukan terhadap sembilan sampel owa jawa yang telah berstatus positif antigen
hepatitis B permukaan (HbsAg). Menggunakan kit ekstraksi DNA (QIAmp DNA
Mini Blood Kit,Qiagen) didapatkan ekstrak DNA dari sediaan plasma owa jawa.
Amplifikasi DNA dilakukan dengan memanfaatkan primer yang dirancang
untuk mengamplifikasi daerah Pre-S1 yang merupakan daerah variabel dan
karakteristik untuk VHB yang berasal dari spesies yang berbeda. Untuk
mengamplifikasi VHB regio Pre-S1 digunakan pasangan primer hepB-SF1
dengan sekuens 5’-TGYGGGTCACCWTATTCTTGGG-3’ dan hepB-SRout
yang memiliki sekuens 5’-CACTGTTCCTGAACTGGAGC-3’. Pasangan primer
tersebut memiliki target produk kurang lebih 455 pasang basa. Pasangan primer
ini sebelumnya telah diketahui dapat mengamplifikasi VHB daerah Pre-S1 dari
isolat orangutan. Hasil amplifikasi menunjukkan bahwa semua isolat hasil studi
memperlihatkan pita DNA VHB pada elektroforesis horizontal menggunakan gel
agarosa.
Penggunaan enzim restriksi BST2UI mampu menunjukkan bahwa VHB
yang menginfeksi owa jawa berbeda dengan VHB yang menginfeksi orangutan
maupun manusia. Hal ini terlihat dari visualisasi gel elektroforesis produk PCR
yang terpotong dengan menggunakan enzim tersebut. Produk PCR dari owa jawa
maupun dari kontrol positif VHB dari orangutan, dapat terfragmentasi
menggunakan enzim restriksi BST2UI, namun produk PCR kontrol positif VHB
manusia tidak dapat terpotong. Posisi pemotongan enzim restriksi yaitu pada
urutan spesifik CC(A/T)GG, dari hasil sekuensing, terlihat bahwa tiap amplikon
mempunyai posisi dan jumlah situs pemotongan yang berbeda. Dengan demikian
enzim BST2UI dapat digunakan sebagai deteksi awal yang membedakan infeksi
VHB berasal dari manusia atau bukan manusia.
Untuk mendapatkan sekuens lengkap dari genom VHBGi dilakukan
amplifikasi menggunakan empat pasang primer yang didisain berasal dari daerah
yang conserved sehingga masing-masing amplikon yang dihasilkan mempunyai
fragmen kontagius yang saling overlapped. Pasangan primer pertama adalah
PreS1F (5’-GGGTCACCATATTCTTGGGAAC-3’) dan R5(5’- AGCCCAAA
AGACCCACAATTC-3’). Target produk PCR yang diharapkan sebesar 1840
pasang basa. Set primer kedua adalah F6 (5’-ATATGGATGATGTGGTA
TTGGG-3’) dan X102 (5’-ACCTTTAACCTAATCTCC-3’). Target produk PCR
yang diharapkan sebesar 1027 pasang basa. Primer forward X101 (5’TCTGTGCCTTCTCATCTG-3’) dengan primer reverse CORE2 (5’-CCCAC
CTTATGAGTCCAAGG-3’). Target produk PCR yang diharapkan sebesar 924
pasang basa. Set primer keempat adalah CORE1 (5’-GAGTGTGGATTC
GCACTCCTCC-3’) dan R1 (5’-TGTAACACGAGCAGGGGTCCTA-3’) dengan
target produk PCR sebesar 2109 pasang basa. Dua dari 9 isolat VHB dapat
teramplifikasi dengan baik menggunakan empat pasang primer tersebut. Hal ini
ditunjukkan dengan terlihatnya pita DNA hasil amplifikasi dari masing-masing
pasangan primer.
Produk PCR yang didapatkan baik menggunakan primer untuk daerah PreS1 maupun genom lengkap VHB kemudian dilakukan purifikasi menggunakan kit
ekstraksi gel QiaQuick (QiaGen, USA), sebelum dilakukan sekuensing untuk
mendapatkan data sekuens VHBGi dari isolat hasil studi, baik untuk regio Pre-S1
ataupun sekuens genom lengkap VHB Gi.
Hasil analisa filogenetik VHBGi daerah Pre-S1 (459 nukleotida)
menggunakan program MEGA memperlihatkan bahwa terjadi keragaman di
antara isolat owa jawa hasil studi, namun isolat owa jawa tersebut berada pada
percabangan tersendiri terpisah dari kelompok satwa primata lainnya yang data
sekuensya didapat dari GenBank.
Untuk sekuens genom lengkap, pohon filogenetik memperlihatkan bahwa
isolat hasil studi berada pada satu cluster tersendiri. Hubungan kekerabatan yang
dekat dengan orangutan diperlihatkan dengan adanya percabangan yang lebih
dekat antara isolat owa jawa hasil studi dengan isolat orangutan dibandingkan
dengan isolat manusia.
@Hak Cipta Milik IPB, tahun 2012
Hak Cipta dilindungi Undang-undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini
tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan
laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu
masalah
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar
IPB
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau
seluruh karya tulis dalam bentuk laporan apapun tanpa izin
IPB
ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN KARAKTERISASI
MOLEKULAR VIRUS HEPATITIS B
DI OWA JAWA (Hylobates moloch) DI INDONESIA
RACHMITASARI NOVIANA
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Primatologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis:
Dr. Ir. Dedi Duryadi Solihin, DEA
Judul Tesis
Nama
NIM
: Isolasi, Identifikasi dan Karakterisasi Molekular Virus Hepatitis B
pada Owa Jawa (Hylobates moloch) di Indonesia
: Rachmitasari Noviana
: P053090031
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. drh. Diah Iskandriati
Anggota
Dr. drh. Joko Pamungkas, M.Sc
Ketua
Diketahui
Ketua Mayor Primatologi
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. drh. Dondin Sajuthi, MST. PhD
Dr. Ir. Dahrul Syah, MSc.Agr
Tanggal Ujian : 24 November 2011
Tanggal Lulus: 13 Februari 2012
Judul Tesis
Nama
NIM
: Isolasi, Identifikasi dan Karakterisasi Molekular Virus Hepatitis B
pada Owa Jawa (Hylobates moloch) di Indonesia
: Rachmitasari Noviana
: P053090031
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. drh. Diah Iskandriati
Anggota
Dr. drh. Joko Pamungkas, M.Sc
Ketua
Diketahui
Ketua Mayor Primatologi
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. drh. Dondin Sajuthi, MST. PhD
Dr. Ir. Dahrul Syah, MSc.Agr
Tanggal Ujian : 24 November 2011
Tanggal Lulus: 13 Februari 2012
PRAKATA
Segala puji dan syukur penulis haturkan ke hadirat Allah SWT atas segala
limpahan
rahmatNya
pada
saat
melakukan
penelitian
hingga
dapat
diselesaikannya tesis yang bertema virus hepatitis B dengan judul tesis Isolasi,
Identifikasi dan Karakterisasi Molekular Virus Hepatitis B pada Owa Jawa
(Hylobates moloch) di Indonesia.
Penulis menyampaikan penghargaan setinggi-tingginya kepada Dr. drh.
Joko Pamungkas, M.Sc, selaku ketua komisi pembimbing sekaligus sebagai
kepala Pusat Studi Satwa Primata, LPPM-IPB dan Dr. drh. Diah Iskandriati selaku
anggota komisi pembimbing dan kepala Laboratorium Mikrobiologi dan
Imunologi PSSP, LPPM IPB atas segala bimbingan, arahan, pengertian dan
dukungan fasilitas serta dana penelitian sejak perencanaan penelitian sampai
penulisan tesis dapat diselesaikan. Ucapan terima kasih penulis sampaikan pula
kepada Dr. Ir. Dedi Duryadi Solihin, DEA sebagai penguji luar komisi yang tidak
hanya mengenalkan penulis dalam dunia analisa molekular namun juga
memberikan tambahan wawasan pengetahuan kepada penulis dan masukan dalam
penulisan tesis ini.
Rasa terima kasih dan penghargaan yang tulus penulis sampaikan kepada
Prof. drh. Dondin Sajuthi, MST, Ph.D; selaku Ketua Program Studi Primatologi
Sekolah Pascasarjana IPB yang telah membuka kesempatan kepada penulis untuk
melanjutkan pendidikan ke jenjang yang lebih tinggi. Kepada Direktur Taman
Safari Indonesia, atas kerjasamanya dalam penelitian ini, rasa terima kasih juga
penulis sampaikan.
Kepada teman sejawat di Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi, PSSP
LPPM-IPB, Uus Saepuloh, S.Si, M.BioMed; Silmi Mariya, S.Si, MS; dra. Maryati
Surya, MS; dra. Isti Kartika Sari; Sela Mariya, S.Si; Iin Indriawati, Tri Faujiani,
Dede Juarsa dan Budi Doyo serta teman-teman di Pusat Studi Satwa Primata
LPPM IPB atas kerjasamanya dan dukungan moril baik langsung maupun tidak
langsung.
Ucapan terima kasih tidak lupa penulis haturkan kepada seluruh staf
pengajar Program Studi Primatologi atas kesempatan untuk mendapatkan
tambahan wawasan ilmu pengetahuan dan etika keilmuan selama penulis
mengikuti perkuliahan di Program Studi Primatologi, Sekolah Pascasarjana IPB.
Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada staf administrasi Program Studi
Primatologi atas segala bantuannya selama ini.
Kepada ibunda tercinta, Siti Hidajati, yang tak pernah putus berdoa untuk
keberhasilan penulis, kepada suami dan anak-anakku terkasih, Dr. Ir. Entang
Iskandar, MS; Dienita Aulia dan Tiara Dwina Amany yang dengan penuh
kesabaran, pengertian dan kasih mendampingi penulis selama ini, penulis sangat
berterima kasih. Almarhum ayahanda Purnomo dan Mohamad Dawami serta
ibunda Siti Sadiah yang selama hidupnya selalu mengingatkan untuk selalu
belajar dan belajar. Kepada kakak-kakakku dan adik-adikku terima kasih atas doa
dan semangatnya selama ini.
Penghargaan dan ucapan terima kasih disampaikan kepada semua pihak
yang tidak dapat disebutkan satu persatu sehingga peneliti dapat menyelasaikan
studinya di program studi ini.
Semoga hasil penelitian penulis dapat menambah khasanah wawasan dan
berguna bagi dunia ilmu pengetahauan dan kesejahteraan manusia serta hewan.
Bogor, Februari 2012
Rachmitasari Noviana
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 14 November 1972 dari ayah
Purnomo dan ibu Siti Hidayati. Penulis merupakan putri pertama dari tiga
bersaudara.
Penulis menyelesaikan pendidikan dasarnya pada tahun 1985 di SD Hang
Tuah VI, Jakarta. Tahun 1988 menyelesaikan Sekolah Menengah Pertama di
SMPN 30 Jakarta, dan tahun 1991 menyelesaikan Sekolah Menengah Atas di
SMAN 3 Jakarta. Pada tahun yang sama, penulis lulus seleksi masuk IPB melalui
Undangan Seleksi Masuk IPB. Tahun 1996 penulis meyelesaikan pendidikan
Strata 1 dari Fakultas Kedokteran Hewan IPB.
Tahun 2009, penulis diterima masuk Sekolah Pascasarjana pada Mayor
Primatologi, Institut Pertanian Bogor.
DAFTAR ISI
halaman
DAFTAR GAMBAR ……………………………………………….
xi
DAFTAR TABEL …….……………………………………………
xi
DAFTAR LAMPIRAN ……………………………………………..
xii
PENDAHULUAN ……………………………………………………………… 1
Latar Belakang …………………………………………………………... 1
Tujuan Penelitian ………………………………………………………... 2
Manfaat Penelitian ……………………………………………………….. 3
TINJAUAN PUSTAKA …………………………………………..…………… 4
Owa jawa ………………………………………………………………... 4
Taxonomi ………………….………………………………………. 4
Morfologi owa jawa ………………….……………………………. 5
Status konservasi ……………… ………………………………….. 5
Virus Hepatitis B ………………………………………………………… 6
Klasifikasi Virus …………………………………………….…….. 6
Genom Virus ………………………………………………………. 6
Replikasi Virus …………………………………………………….. 7
Transmisi Virus ……………………………………………………. 8
Patogenesa ………………………………………………………….. 9
Virus Hepatitis B pada satwa primata ………………………………….... 9
Identifikasi asam nukleat ……………………………………………….. 10
METODE PENELITIAN ……………………………………………………... 12
Waktu dan Tempat Penelitian …………………………………………… 12
Sampel Penelitian………………………………………………………… 12
Ekstraksi DNA ………………………………………………………….. . 12
Amplifikasi DNA untuk Sekuens Daerah Pre-S1 VHB ………………… 12
Restriction Fragment Length Polymorphism ……………………………. 14
Amplifikasi DNA untuk Genom Lengkap VHB ………………………. 14
Pemurnian Produk PCR …………………………………………………. 15
Analisa Hasil Sekuensing ……………………………………………….. 15
Alur penelitian …………………………………………………………… 16
HASIL DAN PEMBAHASAN ………………………………………………. 17
Virus hepatitis B Gibbon Regio Pre-S1………………………………….. 17
Amplifikasi Virus Hepatitis B Regio Pre-S1 ……………………… 17
Restriction Fragment Length Polymorphism ……………………… 19
Pembuatan Pohon Filogenetik …………………………………….. 22
Sekuens Genom Lengkap Virus Hepatitis B Gibbon ……………………. 25
Amplifikasi Virus Hepatitis B Gibbon ……………………………. 25
Pohon Filogenetik …………………………………………………. 29
SIMPULAN DAN SARAN …………………………………………………... 31
DAFTAR PUSTAKA ………………………………………………………….. 32
LAMPIRAN ……………………………………………………………………. 35
DAFTAR GAMBAR
halaman
1
Organisasi genom virus hepatitis B manusia (sirkular) …………………… 7
2
Siklus hidup virus hepatitis B ………....………………………………….
8
3 Organisasi virus hepatitis B pada woolly monkey ……………………….. 10
4 Visualisasi PCR VHB regio Pre-S1 yang menginfeksi spesies owa jawa
di lokasi A
…………………………………………………………. 18
5 Visualisasi PCR VHB regio Pre-S1 yang menginfeksi spesies owa jawa
di lokasi B
…………………………………………………………. 18
6 Visualisasi pemotongan produk DNA menggunakan enzim restriksi
BSt2UI lokasi A…………………………………………………………..
20
7 Visualisasi pemotongan produk DNA menggunakan enzim restriksi
BSt2UI lokasi B ………………………………………………………….. 21
8 Pohon filogenetik VHB Hylobatidae berdasarkan (a) sekuens nukleotida
VHB regio Pre-S1 (459pb); (b) situs pemotongan sekuens nukleotida VHB
region pre-S1 menggunakan ensim restriksi BsT2UI …………………….. 22
9 Pohon filogenetik VHB Hylobatidae dan orangutan berdasarkan sekuens
nukleotida VHB regio Pre-S1 (459 nuklotida)…………………………… 24
10 Pohon filogenetik VHB Hylobatidae dan orangutan berdasarkan sekuens
asam amino VHB regio Pre-S1 …………………………………………… 24
11 Visualisasi hasil amplifikasi genom lengkap VHBGi
…………………... 26
12 Rekonstruksi genom lengkap VHBGi linear berdasarkan posisi primer
yang digunakan ……………………………………………………………. 26
13 Prediksi genom linear sekuens sampel C1 dibandingkan dengan sekuens
H. pileatus dari GenBank
……………………………………….….. 28
14 Pohon filogenetik VHB genom lengkap asal satwa primata dan
manusia …………………………………………………………………... 29
DAFTAR TABEL
halaman
1 Klasifikasi dan penyebaran genus Hylobates ………………………………. 4
2 Pasangan primer untuk amplifikasi genom lengkap VHBGi …………….
14
3 Hasil pemeriksaan serologis HbSAg (data sekunder) dan hasil PCR atas
Regio Pre-S1 dari virus hepatitis B pada owa jawa
………………….. 17
4 Data sekuens produk PCR VHBGi regio Pre-S1 dan situs pemotongan
dari enzim restriksi BSt2UI
.................................................................. 19
5 Data lokasi gen VHB pada isolat Ttblack (GenBank, AY330916)
….. 27
6 Daerah gen VHBGi berdasarkan pasangan primer yang digunakan
….. 28
DAFTAR LAMPIRAN
1
Pensejajaran berganda virus hepatitis B regio Pre-S1 isolat hasil
studi dan situs pemotongan enzim restriksi BSt2UI halaman ………….. 35
2 Data sekuens GeneBank virus hepatitis B
…………………………. 37
3 Komposisi asam amino VHBGi regio Pre-S1 ……………………………
38
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Hepatitis merupakan manifestasi klinis dari perubahan jaringan atau organ
hati berupa peradangan atau inflamasi yang dikarakterisasikan dengan terdapatnya
sel-sel inflamatori pada jaringan hati. Peradangan tersebut dapat diakibatkan oleh
agen yang bersifat non-infeksius seperti minuman beralkohol dan penggunaan
obat-obatan, sedangkan agen yang bersifat infeksius dapat disebabkan oleh infeksi
virus hepatitis atau bakteria. Pada infeksi virus hepatitis penyakit dapat bersifat
akut maupun kronis serta dapat berakhir dengan kematian akibat terjadinya sirosis
pada hati. Saat ini menurut data WHO
satu dari tiga penduduk dunia telah
terinfeksi virus ini sementara satu dari 20 penduduk dunia hidup dengan infeksi
kronis (WHO, 2011).
Sampai saat ini terdapat lima virus penting yang dilaporkan menjadikan hati
sebagai organ target utama infeksi, yaitu virus Hepatitis A (VHA), B (VHB), C
(VHC), D (VHD) dan virus Hepatitis E (VHE).
Virus hepatitis B (VHB)
merupakan satu-satunya virus DNA dalam keluarga virus hepatitis. Tiga cara
utama transmisi virus hepatitis B yaitu melalui darah, hubungan kelamin (sexual
intercourse) dan perinatal (mother to child) pada saat melahirkan atau menyusui.
Transmisi perinatal dan infeksi carrier yang bersifat jangka panjang menyebabkan
adanya endemisitas dan prevalensi tinggi di benua Asia terutama bagian selatan
dan timur.
Selain menginfeksi manusia, VHB dilaporkan dapat pula menginfeksi
beberapa spesies satwa primata di fasilitas konservasi eks-situ, terutama dari
golongan kera yaitu simpanse (Pan troglodytes), orangutan (Pongo sp), gorilla
dan gibbon (Hylobates sp), serta dari golongan monyet yaitu woolly monkey
(Lagothrix lagotricha).
Adanya infeksi VHB dapat dideteksi melalui uji serologis untuk antigen
permukaan VHB (HBsAg) dan deteksi DNA viral melalui uji polymerase chain
reaction (PCR). Mac Donnald et al. (2000), menemukan kejadian infeksi VHB
pada simpanse yang dilahirkan di alam (wild-born). Isolasi VHB pada satwa
primata dari golongan monyet dilaporkan pertama kali dilakukan dari Lagothrix
lagotricha
(woolly monkey) asal kebun binatang di Amerika Serikat,
yang
mengalami peradangan hati (Lanford et al. 1998).
Analisis pohon filogenetik mengindikasikan bahwa virus yang menginfeksi
simpanse dan Hylobates bersifat indigenus pada masing-masing inangnya (Norder
et al. 1996) dan berada pada cabang pohon filogenetik yang berbeda dengan
infeksi VHB pada manusia (Mac Donnald et al. 2000). Secara eksperimental telah
dilakukan pula transmisi VHB manusia melalui inokulasi cairan saliva dari
manusia yang menderita hepatitis B ke satwa primata keluarga Hylobatidae (Scott
et al. 1980). Replikasi virus yang terjadi pada satwa tersebut mengindikasikan
adanya hubungan kekerabatan yang dekat antara manusia dan Hylobatidae dan
kemungkinan adanya transmisi alami dari manusia ke keluarga Hylobatidae.
Penelitian mengenai infeksi virus hepatitis B pada owa jawa di Indonesia
belum banyak dilakukan. Informasi kejadian infeksi VHB pada satwa ini banyak
berasal dari luar Indonesia, meskipun spesies ini merupakan spesies endemik
Indonesia. Owa jawa juga merupakan spesies yang terancam punah menurut
International Union for Conservation of Nature (2008). Dengan status ini, telah
dilakukan upaya untuk mengatasi kepunahan spesies owa jawa ini melalui
beberapa usaha berupa penangkaran, taman satwa dan upaya pengembalian atau
pelepasliaran satwa ini ke habitat aslinya. Upaya tersebut sebaiknya diiringi pula
dengan pemeriksaan status kesehatan satwa dan orang-orang yang mengalami
kontak langsung dengan satwa tersebut. Salah satunya adalah virus hepatitis B
yang telah diketahui dapat menginfeksi manusia dan satwa primata.
Tujuan Penelitian
Mengeksplorasi informasi mengenai infeksi virus hepatitis B pada satwa
primata dari keluarga Hylobatidae, khususnya melalui penyidikan isolasi dan
identifikasi VHB dari spesies owa jawa (Hylobates moloch) yang berasal dari
pusat rehabilitasi dan beberapa lembaga konservasi eks-situ di Indonesia,
dilanjutkan dengan melakukan pengkarakterisasian virus hepatitis B asal spesies
tersebut.
Manfaat Penelitian
Dengan informasi yang diperoleh mengenai infeksi virus VHB dan
perbedaan karakter antara virus hepatitis B yang menginfeksi manusia (VHBHu)
dengan virus Hepatitis yang menginfeksi owa jawa (VHBGi), diharapkan dapat
membantu penapisan status mikrobiologik owa jawa di fasilitas lembaga
konservasi eks-situ, serta lebih lanjut dapat dimanfaatkan dalam pengelolaan
manajemen kesehatan satwa tersebut.
TINJAUAN PUSTAKA
Owa jawa
Taksonomi
Owa jawa (Hylobates moloch), dikenal pula dengan nama Javan gibbon
atau Silvery gibbon, menurut Napier dan Napier (1985), diklasifikasikan sebagai
berikut:
Ordo
: Primate
Subordo
: Anthropoidea
Infra-ordo
: Catarrhini
Superfamili
: Hominoidea
Famili
: Hylobatidae
Genus
: Hylobates
Spesies
: Hylobates moloch
Menurut Geissmann (1995), genus Hylobates dapat dikelompokkan dalam
empat subgenus, yaitu Hylobates, Nomascus, Bunopithecus dan Sympalangus.
Pola penyebaran dari masing-masing subgenus disajikan pada tabel di bawah ini.
Tabel 1 Klasifikasi dan Penyebaran genus Hylobates
Genus
Subgenus
Spesies
Penyebaran
Hylobates
Hylobates
Agilis
Moloch
Muelleri
Pileatus
Klosii
Concolor
Sumatera Barat,
Kalimantan,
Malaysia,Thailand, Burma,
Semenanjung Malaysia,
Yunan, Sumatera Barat
Jawa Barat, Jawa Tengah
Kalimantan
Thailand, Kamboja
Mentawai
Vietnam, Yunan, Laos
Nomascus
Leucogenys
Gabriellae
Laos, Vietnam
Laos, Vietnam, Kamboja
Bunopithecus
Hoolock
Assam, Bangladesh,
Burma
Sympalangus
Syndactylus
Semenanjung Malaysia,
Sumatera
Lar
Morfologi owa jawa
Owa jawa adalah satwa primata arboreal, dengan tempat hidupnya adalah
kanopi pohon. Mereka tidak mempunyai ekor, mempunyai formulasi gigi yang
sama dengan Pongidae. Mempunyai tangan yang panjang, dengan panjang tangan
dapat mencapai tanah disaat mereka berdiri dengan dua kaki (bipedal).
Pergelangan tangan dan bahu telah mengalami adaptasi sehingga memudahkan
pergerakan mereka dalam brakhiasi. Nowak (1999) mendefinisikan Hylobates
sebagai penghuni pohon, dan gibbon (owa) sangat sesuai dengan penamaan
tersebut. Ketangkasan genus ini dalam melakukan brakhiasi, bergerak dari satu
pohon ke pohon lainnya, melebihi satwa lainnya.
Supriatna dan Wahyono (2000) menyatakan bahwa tubuh owa Jawa
ditutupi rambut yang berwarna kecoklatan sampai keperakan atau kelabu. Bagian
dagu pada beberapa individu berwarna gelap. Rambut di atas kepala hitam dan
kulit muka hitam, alis berwarna putih, rambut pada bayi berwarna kelabu terang
dibanding dengan dewasa (Rowe 1996).
Adanya pembengkakan pada pada alat kelamin betina, terutama pada
Hylobates moloch, merupakan cirri menonjol pada genus Hylobates, namun
pembengkakan ini tidak begitu nyata terlihat pada Hylobates pileatus (Mootnick
2006).
Status Konservasi
Owa jawa merupakan salah satu spesies endemik Indonesia. Keberadaan
spesies ini telah dilindungi sejak tahun 1931 untuk menghindari kepunahan
melalui Peraturan Perlindungan Binatang Liar No. 266 yang kemudian diperkuat
dengan Undang-undang No. 5 tahun 1990 dan SK Menteri Kehutanan 10
Juni1991 (Supriatna & Wahyono 2000). Pada tahun 1986 – 1990, International
Union for Conservation Nation (IUCN) telah memasukkan owa jawa sebagai
spesies yang terancam punah. Dikatakan sebagai terancam punah karena
populasinya di alam diperkirakan kurang dari 2500 individu, kemudian dengan
observasi yang berkesinambungan terjadi penurunan jumlah individu dewasa dan
tidak ada subpopulasi yang terdiri lebih dari 250 individu dewasa (IUCN
Conservation Monitoring Center).
Virus Hepatitis B
Klasifikasi Virus
Virus Hepatitis adalah virus yang menjadikan hati sebagai target utama
infeksi. Infeksi virus dapat menyebabkan peradangan hati yang ditandai dengan
ditemukannnya sel-sel inflamatori pada hati. Terdapat lima virus yang dikenal
dapat mengakibatkan hepatitis dan berasal dari keluarga virus yang berbeda. Virus
hepatitis A merupakan anggota dari keluarga Picornaviridae. Virus hepatitis B
adalah anggota keluarga Hepadnavidae. Virus hepatitis C merupakan anggota dari
keluarga Flaviviridae, sedangkan virus hepatitis D dan E masing-masing
merupakan anggota dari keluarga Deltaviridae dan Caliciviridae.
Menurut Komite Internasional Taksonomi Virus (International Committee
on Taxonomy of Viruses, ICTV, 2009) keluarga Hepadnaviridae dibagi menjadi
dua genus yaitu:
1. Genus Orthohepadnavirus, yaitu virus hepatitis yang menyerang mamalia,
seperti hepatitis B virus (yang menginfeksi ordo primata), woodchuck
hepatitis virus, ground squirrel hepatitis virus dan arctic squirrel hepatitis
virus
2. Genus Avihepadnavirus, yaitu virus hepatitis yang menyerang bangsa
unggas, seperti duck hepatitis virus, heron hepatitis virus dan goose
hepatitis virus.
Genom Virus
Virus hepatitis B (VHB), sesuai dengan nama keluarga (Hepadnavirus)
adalah virus DNA dengan virion beramplop (envelope) berukuran 42-nm, dengan
sebagian DNA virion adalah utas ganda (partially double stranded). Virus ini
merupakan virus DNA hewan berukuran terkecil dan mempunyai ukuran genom
sebesar kurang lebih 3200 pasang basa, terdiri dari empat open reading frame
(ORF) untuk gen P, C, S dan X yang masing-masing mengkode DNA
polimerase/reverse transcriptase, protein inti (core), protein permukaan (surface)
dan protein X. Untuk gen S dibagi menjadi regio pre-S1, pre-S2 dan S. Gen C
terbagi menjadi regio pre-C dan C.
Protein permukaan yang berada pada pembungkus virus (envelope) dikenal
sebagai antigen permukaan (HbsAg) yang merupakan protein penting dalam
pendiagnosaan klinis infeksi dan imunisasi virus ini.
Selain HBsAg terdapat dua antigen penting lainnya yaitu antigen inti
hepatitis B (HBcAg) yang membentuk nukleokapsid virion, dan antigen e
(HBeAg) adalah antigen yang dikeluarkan ke dalam peredaran darah oleh sel-sel
yang terinfeksi virus (Levinson, 2008)
Gambar 1 Organisasi genom virus hepatitis B manusia (sirkular).
Sumber: Wands, JR. 2004
Replikasi Virus
Virus hepatitis B merupakan virus DNA dengan utas ganda sebagian yang
menggunakan enzim transkripsi balik (reverse transcriptase) dalam replikasinya.
Proses replikasi virus secara umum terdiri dari beberapa tahap, yaitu perlekatan
(attachment), penetrasi (penetration), uncoating, ekspresi gen, replikasi genom,
assembly dan pelepasan (release). Proses transkripsi terjadi di dalam nukleus,
sementara replikasi genom berlangsung di sitoplasma, di dalam protein inti (White
dan Fenner, 1994).
Protein permukaan virion dapat menempel (attach) pada permukaan sel
inang melalui reseptor spesifik. Situs penempelan virus hepatitis B adalah pada
protein L. Virion yang menempel pada permukaan sel inang mengalami
endositosis, kemudian nukleokapsid akan dikeluarkan dari endosoma melalui fusi
yang terjadi antara virion dan membran endosoma. Nukleokapsid akan memasuki
nukleus sel inang, genom virus akan terlepas dalam nukleus sel inang dan
berkonversi menjadi molekul DNA sirkular (Carter dan Sanders, 2007).
Gambar 2 Siklus hidup virus hepatitis B
(http://www.natap.org/2004/VHB/100804_02.htm)
Asam deoksiribonukleat rantai ganda sirkular (covalently closed circular,
cccDNA) ini kemudian menjadi cetakan untuk sintesa asam ribonukleat
messanger (mRNA) menggunakan enzim polimerase RNA selular. Hepadnavirus
merupakan keluarga DNA virus yang unik karena menggunakan mRNA sebagai
cetakan dalam menghasilkan genom DNA melalui transkripsi terbalik (reverse
transcription) (White dan Fenner, 1994).
Transmisi Virus
Infeksi virus ini ditularkan melalui darah, hubungan kelamin dan perinatal
(dari ibu ke anak saat melahirkan dan menyusui). Transmisi melalui jarum suntik
yang terkontaminasi virus memperlihatkan bahwa transmisi sangat mudah terjadi.
Infeksi kronis VHB dapat mengakibatkan sirosis pada hati dan hepatocellular
carcinoma (Levinson, 2008).
Patogenesa
Setelah menginfeksi inangnya dan memasuki peredaran darah, VHB akan
menginfeksi hepatosit kemudian antigen viral akan berada pada permukaan sel
inang. Sel T sitotoksik akan memediasi sistem pertahanan tubuh untuk melawan
masuknya antigen viral berupa adanya inflamasi dan nekrosis. Virus ini tidak
menghasilkan efek sitopatik, sehingga diduga patogenesa virus ini merupakan
hasil dari pertahanan tubuh bermediasi sel (White dan Fenner, 1994). Penderita
dapat menjadi chronic carrier, bila antigen permukaan VHB (HBsAg) terdeteksi
lebih dari 6 bulan. Pada penderita chronic carrier, terjadi kasus hepatocellular
carcinoma dengan prevalensi tinggi (Levinson, 2008)
Virus Hepatis B Pada Satwa Primata
Warren et al. (1999) menemukan adanya infeksi VHB di lapangan secara
alami pada orangutan yang berada di Pusat Rehabilitasi Orangutan Wanariset,
Kalimantan Timur. Sebanyak 195 sampel serum diujikan untuk mendeteksi antihepatitis B inti (HBcAb), anti-HB permukaan (HBsAb) dan antigen permukaan
hepatitis B (HBsAg) serta uji PCR. Ditemukan bahwa 55 individu adalah HBsAg
positif, 28 HBsAb positif, uji PCR yang dilakukan pada individu HbsAg positif
diperoleh 32 sampel adalah positif VHB.
Vaudin et al. (1988) menemukan adanya infeksi VHB pada simpanse (Pan
troglodytes), VHB juga terbukti dapat menginfeksi genus Hylobates dan
Nomascus (Noppornpanth et al. 2003), Gorilla gorilla (Grethe et al. 2000) dan
Lagothrix lagothricha (Lanford et al. 1998).
Infeksi VHB yang terjadi pada woolly monkey menjadi acuan awal
penelitian hepatitis B pada satwa primata. Lanford et al. (1998) menemukan
bahwa hepadnavirus yang diisolasi dari woolly monkey mempunyai perbedaan
dari VHB yang berasal dari isolat manusia. Analisa filogenetik terhadap sekuens
nukleotida dilakukan pada bagian gen inti dan permukaan. Ditemukan bahwa
sekuens tersebut merupakan basal atau ancestral dari grup VHB pada manusia,
sehingga diperkirakan bahwa virus hepatitis B yang menginfeksi woolly monkey
merupakan progenitor dari virus hepatitis B manusia.
Gambar 3 Organisasi virus VHB pada woolly monkey (WMHBV)
(Lanford et al. 1998)
Transmisi VHB juga terjadi pada genus Hylobates. Analisa filogenetik dari
isolat genus tersebut menyatakan bahwa sekuens nukleotida gen permukaan VHB
yang menginfeksi Hylobates yang berada dalam lembaga konservasi berada pada
cluster yang berbeda dengan VHB yang berasal dari inang lainnya (Noppornpanth
et al. 2003). Virus hepatitis B ditemukan tidak hanya pada sediaan darah namun
juga dari cairan saliva Hylobates pileatus, H. lar, dan H. concolar. Dari analisa
lanjutan menggunakan enzim restriksi (analisis RFLP) dari isolat gibbon dan
isolat manusia terlihat bahwa VHB yang menginfeksi keduanya merupakan VHB
yang mempunyai karakterisasi molekular yang berbeda (Noppornpanth et al.
2003).
Identifikasi Asam Nukleat Virus
Identifikasi agen virus dapat dilakukan melalui analisa genom virus.
Penggunaan reaksi enzim Taq DNA polimerase dalam tehnik PCR (Polymerase
Chain Raction) memungkinkan identifikasi secara molekular yang memiliki
sensitifitas tinggi dengan mengamplifikasi hanya dari satu molekul DNA tunggal
dan kopi gen tunggal dapat diekstraksi dari campuran genomik yang kompleks.
Dengan kata lain, PCR merupakan suatu reaksi in vitro untuk menggandakan
(mengamplifikasikan) jumlah molekul DNA pada target tersebut dengan bantuan
enzim Taq DNA polimerase dan oligonukleotida sebagai primer dalam sebuah
mesin thermocycler (Ubaidillah dan Sutrisno, 2009).
Tehnik amplifikasi DNA berbasis pada siklus termal berupa pemanasan dan
pendinginan secara berulang yang terdiri dari tiga tahap yaitu pemecahan
(denaturation), penempelan (annealing) dan pemanjangan (elongation). Primer
yang
digunakan
berisi
sekuens
komplementari
yang
didisain
untuk
mengamplifikasi region target tertentu . Primer yang berada sebelum daerah target
disebut primer forward dan yang berada setelah target disebut primer reverse
(Ubaidillah dan Sutrisno, 2009). Hasil amplifikasi DNA dengan tehnik PCR
kemudian dapat divisualisasikan sebagai pita-pita DNA pada gel agarosa. Teknik
ini sangat efisien untuk mengamplifikasi urutan DNA VHB.
Enzim endonuklease restriksi adalah enzim bakteri yang digunakan dalam
tehnik molekular untuk mengenali sekuens spesifik dalam DNA dan kemudian
melakukan pemotongan DNA tersebut untuk mendapatkan fragmen-fragmen
spesifik yang dikenal sebagai fragmen restriksi (Ubaidillah dan Sutrisno, 2009).
Ensim restriksi memainkan peranan penting dalam konstruksi molekul DNA
rekombinan dan mapping lokasi dari situs restriksi pada DNA. Selain itu, situs
spesifik dari enzim restriksi ini pada fragmen gen tertentu dapat dijadikan sebagai
alat genotiping (karakteristik genotipe) dari individu pada spesies tersebut
(Ubaidillah dan Sutrisno, 2009).
METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan dari bulan Januari sampai dengan bulan Juni 2011,
bertempat di Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi, Pusat Studi Satwa
Primata, Lembaga Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat, Institut
Pertanian Bogor (PSSP LPPM-IPB), Jalan Lodaya II/5, Bogor 16151.
Sampel Penelitian
Sampel yang dimanfaatkan dalam penelitian ini adalah plasma owa jawa
yang merupakan koleksi sampel Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi PSSP
LPPM-IPB, sebagai bagian dari pemeriksaan rutin kesehatan satwa dari beberapa
fasilitas konservasi eks-situ satwa primata. Semua sampel yang digunakan dalam
penelitian ini, berasal dari 9 ekor satwa owa jawa yang memiliki status positif
atas pemeriksaan terhadap antigen permukaan virus hepatitis B (HBsAg) melalui
uji ELISA (data sekunder).
Ekstraksi DNA
Pemurnian DNA virus dilakukan dari sampel plasma owa jawa
menggunakan kit QIAmp DNA Mini Blood Kit (Qiagen, USA) sesuai dengan
petunjuk dari pedoman penggunaan dari perusahaan. Sebanyak 200µl sampel
plasma ditambahkan ke dalam tabung mikro yang telah berisi 20µl (20mg/ml)
proteinase K. Larutan penyangga pelisis (lisis buffer) ditambahkan sebanyak
200µl ke dalam masing-masing tabung mikro. Untuk menghomogenkan campuran
tersebut dilakukan homogenisasi menggunakan vortex dan dilanjutkan dengan
inkubasi selama 10 menit pada suhu 560 C. Prosedur selanjutnya dilakukan
sentrifugasi, pencucian dan elusi sesuai dengan prosedur baku dari kit ekstraksi
DNA QiAmp DNA Miniblood Kit.
Amplifikasi DNA untuk Sekuens Daerah Pre-S1 VHB
Amplifikasi DNA dilakukan menggunakan metode polymerase chain
reaction
(PCR)
dengan
memanfaatkan
primer
yang
dirancang
untuk
mengamplifikasi daerah Pre-S1 yang merupakan daerah variabel dan karakteristik
untuk VHB yang berasal dari spesies yang berbeda. Set primer forward dan
reverse disintesa dari sekuens bagian paling conserved di daerah yang variabel di
antara berbagai strain VHB.
Sebanyak 50 µl reagen PCR yang terdiri dari, masing-masing 1µl primer
forward dan reverse (10 pmol/µl), 4 µl MgCl2 (25mM), 5 µl dNTPs (10 mM),
0,5µl Taq Gold Polymerase (5 U/µl), 5 µl PCR Buffer 10X (500mM KCl,
100mM Tris-HCl (pH 8,3), sampel DNA (10 ul) dan ddH2O (23,5 ul) dimasukkan
ke dalam tabung mikro 200µl dan dihomogenkan menggunakan vortex.
Merujuk kepada penelitian yang dilakukan oleh Warren et al. (1999) yang
telah berhasil mengamplifikasi VHB daerah Pre-S1 dari isolat orangutan,
digunakan pasangan primer yang sama untuk mengamplifikasi VHB daerah PreS1
dari
isolat
DNA
owajawa
yaitu
hepB-SF1
dengan
sekuens
5’-
TGYGGGTCACCWTATTCTTGGG-3’ dan hepB-SRout yang memiliki sekuens
5’-CACTGTTCCTGAACTGGAGC-3’. Pasangan primer tersebut memiliki target
produk kurang lebih 455 pasang basa.
Amplifikasi DNA dilakukan menggunakan mesin PCR (Perkin Elmer,
Model 9700), melalui beberapa tahapan. Pada tahap awal dilakukan pre-PCR
untuk mengaktifkan enzim polymerase pada suhu 940C selama 10 menit. Tahapan
selanjutnya adalah amplifikasi PCR yang terdiri atas denaturasi sampel pada suhu
940C selama 30 detik, annealing pada suhu 620C selama 30 detik, dan tahap
elongasi pada suhu 720C selama 1 menit. Tahapan ini dilakukan selama 30 kali
dengan siklus yang berulang. Tahap akhir adalah post-PCR dengan suhu 720C
selama 10 menit.
Produk PCR yang telah diamplifikasi tersebut dijalankan pada gel agarosa
2% yang mengandung ethidium bromida 1 µg/ml dalam bufer TAE menggunakan
elektroforesis horizontal. Penanda DNA 1 kb (Invitrogen, USA) dan produk PCR
yang telah ditambahkan pewarna (loading dye) dimasukkan ke dalam sumur gel.
Alat dokumentasi Gel Doc 2000 (BioRad, USA)
digunakan untuk
memvisualisasikan hasil elektroforesis. Sebagai kontrol positif PCR digunakan
DNA positif VHB gibbon (VHBGi), VHB manusia (VHBHu) dan VHB
orangutan (VHBOu).
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
Terhadap produk PCR yang memberikan hasil positif pada uji PCR
dilakukan digesti menggunakan enzim restriksi BSt2UI (1 U/µl) yang bekerja
pada sekuens spesifik yaitu CC(A/T)GG dari sekuens nukleotida sampel. Enzim
restriksi ini telah diketahui dapat memotong sekuens nukelotida dari VHBOu
namun tidak dapat memotong sekuens nukleotida dari VHBHu. Sebanyak 20µl
campuran reagensia yang terdiri dari 1µl enzim BSt2UI (1IU/ul), buffer pereaksi
10 x sebanyak 1,5µl, dan produk PCR sebanyak 3,5µl. Ditambahkan air destilasi
sampai volume mencapai 20µl. Kemudian dilakukan inkubasi pada suhu 600C
selama 1 jam.
Untuk memvisualisasikan hasil restriksi enzim, produk PCR yang telah
diinkubasi dengan enzim restriksi tersebut dijalankan melalui gel agarosa
menggunakan elektroforesis
horizontal dengan berkonsentrasi
2%
yang
ditambahkan ethidium bromida sebagai pewarna (staining), selama 1,5 jam, 100V.
Pembacaan hasil eletroforesis dilakukan melalui alat GelDoc.
Amplifikasi DNA untuk Sekuens Genom Lengkap VHB
Amplifikasi DNA untuk mendapatkan sekuens genom lengkap VHBGi
merujuk kepada Sa-Nguanmoo et al. (2008) yang menggunakan empat set primer
seperti tertera pada tabel 2 di bawah ini.
Tabel 2 Pasangan primer untuk amplifikasi genom lengkap VHBGi
Primer
Primer
Sekuens primer
Posisi nukleotida
set
1
2
3
4
Target
produk (pb)
PreS1F
5’-GGGTCACCATATTCTTGGGAAC-3’
2814 -2835
R5
5’-AGCCCAAAAGACCCACAATTC-3’
1015 - 995
F6
5’-ATATGGATGATGTGGTATTGGG-3’
737-758
X102
5’-ACCTTTAACCTAATCTCC-3’
1764 - 1748
X101
5’-TCTGTGCCTTCTCATCTG-3’
1552 - 1569
CORE2
5’-CCCACCTTATGAGTCCAAGG-3’
2476 - 2457
CORE1
5’-GAGTGTGGATTCGCACTCCTCC-3’
2268 - 2289
R1
5’-TGTAACACGAGCAGGGGTCCTA-3’
201 - 180
1840
1027
924
2109
Sebanyak 50 µl reagensia PCR yang terdiri dari, masing-masing satu pasang
primer forward dan reverse sebanyak 1µl (10 pmol/µl), 4 µl MgCl2 (25mM), 5 µl
dNTPs (10 mM), 1µl Taq Gold Polymerase (5 U/µl), 5 µl PCR Buffer 10X
(500mM KCl, 100mM Tris-HCl (pH 8,3), sampel DNA (10 ul) dan ddH2O
(23ul) dimasukkan ke dalam tabung mikro 200µl dan dihomogenkan
menggunakan vortex.
Amplifikasi DNA dilakukan menggunakan mesin PCR (Perkin Elmer,
Model 9700), melalui beberapa tahapan. Pada tahap awal dilakukan pre-PCR
untuk mengaktifkan enzim polymerase pada suhu 940C selama 10 menit. Tahapan
selanjutnya adalah amplifikasi PCR yang terdiri atas denaturasi sampel pada suhu
940C selama 30 detik, annealing pada suhu 550C selama 30 detik, dan tahap
elongasi pada suhu 720C selama 2 menit. Tahapan ini dilakukan selama 40 kali
dengan siklus yang berulang. Tahap akhir adalah post-PCR dengan suhu 720C
selama 10 menit.
Produk PCR yang telah diamplifikasi tersebut dijalankan pada gel agarosa
2% yang mengandung ethidium bromida 1 µg/ml dalam bufer TAE menggunakan
elektroforesis horizontal. Penanda DNA 1 kb dan produk PCR yang telah
ditambahkan pewarna (loading dye) dimasukkan ke dalam sumur gel. Alat
dokumentasi Gel Doc 2000 (BioRad, USA) digunakan untuk memvisualisasikan
hasil elektroforesis. Sebagai kontrol positif digunakan DNA positif VHB gibbon
(VHBGi), VHB manusia (VHBHu) dan VHB orangutan (VHBOU).
Pemurnian Produk PCR
Pemotongan gel produk PCR dilakukan dengan memotong gel yaitu tepat
pada bagian gel yang memiliki pita yang berpendar saat diradiasi sinar UV.
Potongan
gel hasil amplifikasi kemudian dilakukan pemurnian menggunakan
kit ekstraksi gel QiaQuick (Qiagen, USA). Untuk mendapatkan sekuens
nukleotida, hasil pemurnian produk PCR dilakukan di Macrogen Inc, Korea.
Sekuensing dilakukan baik terhadap produk PCR VHBGi regio Pre-S1 maupun
genom lengkap VHBGi.
Analisa Hasil Sekuensing
Pembacaan hasil sekuensing mengunakan perangkat lunak komputer
BioEdit. Pensejajaran urutan nukleotida dianalisa menggunakan program BLAST
2.0 (BLAST, 2011) dan ClustalW2 (Kumar et al. 2011). Pembuatan pohon
filogenetik menggunakan perangkat lunak komputer MEGA versi 5.0 (Kumar et
al. 2011). Sebagai pembanding dimasukkan urutan nukleotida virus Hepatitis B
asal spesies Gibbon lainnya di luar Indonesia, orangutan, manusia , woolly
monkey, simpanse dan gorilla dari data GeneBank.
Alur Penelitian
Seleksi owa jawa yang terdeteksi positif dari hasil uji serologi HBsAg akan
dilanjutkan dengan uji karakteristik diagnostik cepat melalui PCR dengan primer
daerah Pre-S21 VHB.
Isolat yang memberikan karakteristik spesifik dengan sediaan material DNA
yang memadai maka akan dilakukan karakteristik nukleotida penyusun virus
hepatitis B pada owa jawa secara utuh.
Kemungkinan terjadinya transmisi
VHB secara interspesies maupun
intraspesies pada owa jawa
Sampel darah owa jawa
penangkaran eksitu
owa jawa yang positif secara
uji serologi HBsAg
Rekonstruksi pohon
filogenetik dengan satwa
primata lain
Karakteristik diagnostik cepat
melalui PCR dengan primer
spesifik VHB daerah preS1dari sampel positif serologi
Rekonstruksi pohon
filogenetik dengan manusia
dan satwa primata lain
Karakteristik molekular secara
utuh VHB pada owa jawa
HASIL DAN PEMBAHASAN
Virus Hepatitis B Gibbon Regio Pre-S1
Amplifikasi Virus Hepatitis B Regio Pre-S1
Hasil amplifikasi dari 9 sampel DNA owa jawa yang telah berstatus serologis
positif terhadap antigen virus hepatitis B menggunakan pasangan primer hepSF-1
dan hepSR-out menghasilkan fragmen pita DNA sekitar 459 pasang basa (Tabel
3). Hal ini menunjukkan bahwa ke-9
individu owa jawa tersebut terinfeksi
dengan virus hepatitis B (VHB).
Tabel 3 Hasil pemeriksaan serologis HbsAg (data sekunder) dan hasil PCR
atas regio Pre-S1 dari virus hepatitis B pada owa jawa
No.
ID
HBsAg
1
2
3
4
5
6
7
8
9
A1
A2
A3
A5
A6
A8
A9
C1
C2
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Hasil PCR VHB
regio pre-S1
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Tempat Asal
Satwa
A
A
A
A
A
A
A
B
B
Sebagai pembanding dalam amplifikasi digunakan kontrol positif yang
berasal dari pasien manusia dan orangutan penderita hepatitis B. Gambar 4 dan 5
menunjukkan hasil amplifikasi virus hepatitis B gibbon yang dilalukan pada gel
agarosa menggunakan elektroforesis horizontal. Pada kontrol positif pasien
manusia, terlihat bahwa pita DNA isolat VHB manusia berada di atas pita DNA
dari isolat kontrol positif DNA VHB orangutan maupun sampel penelitian. Posisi
pita isolat kontrol positif VHB orangutan berada di antara pita isolat VHB sampel
dan kontrol positif VHB manusia. Hasil PCR memperlihatkan bahwa ketujuh
(Gambar 4) dan kedua (Gambar 5) sampel DNA owa jawa teramplifikasi dengan
baik menggunakan pasangan primer untuk regio pre-S1 VHB dengan ukuran
sekitar 459 pasang basa.
pb
500
459 pb
300
200
100
1
23 3
4
5
6
7
8
9 10 11 12
Gambar 4 Visualisasi PCR VHB Regio Pre-S1 yang menginfeksi spesies
owa jawa pada lokasi A. (1)Penanda DNA 1kpb, (2) isolat
A1, (3) A2, (4) A3, (5) A5, (6) A6, (7) A8, (8) A9, (9)
kontrol positif VHBGi, (10) kontrol positif VHBHu, (11)
kontrol positif VHBOu
459 pb
500 pb
400 pb
300 pb
200 pb
100 pb
1
2
3
4
5
6
Gambar 5 Visualisasi PCR VHB Regio Pre-S1 yang menginfeksi spesies
owa jawa pada lokasi B.(1) marker DNA 1kbp, (2) isolat C1,
(3) C2, (4) kontrol positif VHBHu, (5) kontrol positif
VHBOu1 dan (6) kontrol positif VHBOu2.
Menurut Warren et.al (1999), dengan menggunakan pasangan primer
hepSF-1 dan hepSR-out, akan menghasilkan amplikon VHB Regio Pre-S1 sebesar
455 pasang basa. Jika mengacu pada hasil sekuensing beberapa sampel yang
dilakukan di Macrogen (Korea), didapatkan bahwa besar masing-masing
amplikon berbeda-beda (Tabel 4). Dengan melakukan pensejajaran sekuens
terhadap semua sekuens isolat sampel VHB menggunakan program ClustalW2
(Larkin MA, et al. 2007) terlihat adanya keragaman pada besar amplikon, hal ini
mungkin disebabkan adanya insersi ataupun delesi nukleotida dari masing-masing
produk PCR. Data sekuen isolat VHB bervariasi antara 457pb, 458pb dan 459 pb,
berbeda dengan target produk yang diharapkan sebesar 455pb.
Tabel 4 Data sekuens produk PCR VHBGi regio Pre-S1
dan situs pemotongan dari enzim restriksi BSt2UI
ID
Besar
amplikon
Hasil
Pemotongan
S
MOLEKULAR VIRUS HEPATITIS B PADA
OWA JAWA (Hylobates moloch) DI INDONESIA
RACHMITASARI NOVIANA
SEKOLAH PASCA SARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Isolasi, Identifikasi dan Karakterisasi
Molekular Virus Hepatitis B pada Owa Jawa (Hylobates moloch) di
Indonesia adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Februari 2012
Rachmitasari Noviana
NRP. P053090031
ABSTRACT
RACHMITASARI NOVIANA. Isolation, Identification and Molecular
Characterization of Hepatitis B Virus in Javan Gibbon in Indonesia. Under
direction of JOKO PAMUNGKAS and DIAH ISKANDRIATI
Hepatitis B virus (HBV) was reported not only able to infect human being,
but also non-human primates, especially the great apes group such as orangutans,
gorillas, chimpanzees, as well as the lesser apes from the family of Hylobatidae.
Among other species within the genus, Hylobates moloch (owa jawa or silvery/
javan gibbons), which is considered as one of Indonesia’s endemic endangered
species, has been reported to harbor HBV of their own strain. Analyses of HBV
isolated from infected gibbons were done in this study to reveal their relatedness
to the published data. Plasma samples from nine javan gibbons were obtained as
part of diagnostic purpose. Those animals were previously tested positive for the
presence of hepatisis B-surface antigen (HBsAg) by enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA). DNA samples were extracted from these nine
plasma samples to be used as templates for amplification of the Pre-S1 region by
polymerase chain reactions (PCR) technique using semi degenerate primers that
could amplify several strains of HBVs. The PCR products of 457 - 459 base pairs
were then subject to restriction fragment length polymorphism (RFLP) analyses
using Bst2UI enzyme to evaluate the pattern of cleaved fragments. The PCR
products were sequenced for further homology analyses and to create
phylogenetic tree of the sequenced data obtained from the study in comparison
with published data. Two plasma samples were used as templates for whole region
amplification using sets of 4 primer. The PCR products of 3192 base pairs were
sequenced for further homology analyses and to create phylogenetic tree.
Phylogenetic tree analyses for Pre-S1 nucleotide region and whole region showed
that the javan gibbon isolates formed their own clusters, separate from the other
nonhuman primate isolates.
Keywords : Hepatitis B virus, Pre-S1, whole genome, javan gibbon, PCR,
Phylogenetic analysis
RINGKASAN
RACHMITASARI NOVIANA. Isolasi, Identifikasi dan Karakterisasi Molekular
Virus Hepatitis B pada Owa Jawa (Hylobates moloch) di Indonesia. Dibimbing
oleh JOKO PAMUNGKAS dan DIAH ISKANDRIATI.
Hepatitis atau peradangan hati adalah suatu kondisi klinis akibat terjadinya
peradangan atau inflamasi pada organ ataupun jaringan hati yang ditunjukkan
dengan ditemukannya sel-sel inflamatori pada jaringan hati tersebut. Infeksi virus
hepatitis merupakan salah satu penyebab terjadinya peradangan hati selain adanya
penyebab non infeksius seperti penggunaan obat-obatan terlarang dan minuman
beralkohol. Menurut data organisasi kesehatan dunia (WHO, 2011), satu dari tiga
penduduk dunia telah terinfeksi virus ini sementara satu dari 20 penduduk dunia
hidup dengan infeksi kronis. Infeksi virus hepatitis yang bersifat kronis dapat
mengakibatkan kematian karena menyebabkan sirosis hati.
Virus hepatitis B, salah satu dari 5 virus penyebab penyakit hepatitis, dapat
ditularkan melalui darah, hubungan kelamin (sexual intercourse) dan perinatal
(mother to child) pada saat melahirkan atau menyusui. Transmisi perinatal dan
infeksi carrier yang bersifat jangka panjang menyebabkan adanya endemisitas
dan prevalensi tinggi di benua Asia terutama bagian selatan dan timur.
Selain
dapat menyerang manusia, virus hepatitis B juga diketahui dapat menyerang satwa
primata terutama dari golongan kera. Infeksi virus hepatitis B pada satwa primata
terdeteksi melalui uji serologis maupun uji viral. Deteksi viral virus hepatitis B
dilakukan melalui polymerase chain reaction (PCR).Secara eksperimental telah
dilakukan transmisi VHB manusia melalui inokulasi cairan saliva dari manusia
yang menderita hepatitis B ke satwa primata keluarga Hylobatidae. Replikasi
virus yang terjadi pada satwa tersebut mengindikasikan adanya hubungan
kekerabatan yang dekat antara kedua inang (manusia dan Hylobatidae).
Penelitian mengenai infeksi virus hepatitis B pada owa jawa (Hylobates
moloch), salah satu spesies dari keluarga Hylobatidae, belum banyak dilakukan di
Indonesia meskipun spesies ini merupakan spesies endemik Indonesia. Penelitian
ini bertujuan mengeksplorasi informasi mengenai infeksi virus hepatitis B (VHB)
melalui penyidikan isolasi dan identifikasi VHB dari spesies owa jawa (Hylobates
moloch) yang berasal dari pusat rehabilitasi dan lembaga konservasi eks-situ di
Indonesia, dilanjutkan dengan melakukan pengkarakterisasian virus hepatitis B
asal spesies tersebut.
Penelitian ini dilakukan dari bulan Januari 2011 sampai Juni 2011. Metode
yang dilakukan untuk memperoleh isolat VHB yaitu melalui uji PCR yang
dilakukan terhadap sembilan sampel owa jawa yang telah berstatus positif antigen
hepatitis B permukaan (HbsAg). Menggunakan kit ekstraksi DNA (QIAmp DNA
Mini Blood Kit,Qiagen) didapatkan ekstrak DNA dari sediaan plasma owa jawa.
Amplifikasi DNA dilakukan dengan memanfaatkan primer yang dirancang
untuk mengamplifikasi daerah Pre-S1 yang merupakan daerah variabel dan
karakteristik untuk VHB yang berasal dari spesies yang berbeda. Untuk
mengamplifikasi VHB regio Pre-S1 digunakan pasangan primer hepB-SF1
dengan sekuens 5’-TGYGGGTCACCWTATTCTTGGG-3’ dan hepB-SRout
yang memiliki sekuens 5’-CACTGTTCCTGAACTGGAGC-3’. Pasangan primer
tersebut memiliki target produk kurang lebih 455 pasang basa. Pasangan primer
ini sebelumnya telah diketahui dapat mengamplifikasi VHB daerah Pre-S1 dari
isolat orangutan. Hasil amplifikasi menunjukkan bahwa semua isolat hasil studi
memperlihatkan pita DNA VHB pada elektroforesis horizontal menggunakan gel
agarosa.
Penggunaan enzim restriksi BST2UI mampu menunjukkan bahwa VHB
yang menginfeksi owa jawa berbeda dengan VHB yang menginfeksi orangutan
maupun manusia. Hal ini terlihat dari visualisasi gel elektroforesis produk PCR
yang terpotong dengan menggunakan enzim tersebut. Produk PCR dari owa jawa
maupun dari kontrol positif VHB dari orangutan, dapat terfragmentasi
menggunakan enzim restriksi BST2UI, namun produk PCR kontrol positif VHB
manusia tidak dapat terpotong. Posisi pemotongan enzim restriksi yaitu pada
urutan spesifik CC(A/T)GG, dari hasil sekuensing, terlihat bahwa tiap amplikon
mempunyai posisi dan jumlah situs pemotongan yang berbeda. Dengan demikian
enzim BST2UI dapat digunakan sebagai deteksi awal yang membedakan infeksi
VHB berasal dari manusia atau bukan manusia.
Untuk mendapatkan sekuens lengkap dari genom VHBGi dilakukan
amplifikasi menggunakan empat pasang primer yang didisain berasal dari daerah
yang conserved sehingga masing-masing amplikon yang dihasilkan mempunyai
fragmen kontagius yang saling overlapped. Pasangan primer pertama adalah
PreS1F (5’-GGGTCACCATATTCTTGGGAAC-3’) dan R5(5’- AGCCCAAA
AGACCCACAATTC-3’). Target produk PCR yang diharapkan sebesar 1840
pasang basa. Set primer kedua adalah F6 (5’-ATATGGATGATGTGGTA
TTGGG-3’) dan X102 (5’-ACCTTTAACCTAATCTCC-3’). Target produk PCR
yang diharapkan sebesar 1027 pasang basa. Primer forward X101 (5’TCTGTGCCTTCTCATCTG-3’) dengan primer reverse CORE2 (5’-CCCAC
CTTATGAGTCCAAGG-3’). Target produk PCR yang diharapkan sebesar 924
pasang basa. Set primer keempat adalah CORE1 (5’-GAGTGTGGATTC
GCACTCCTCC-3’) dan R1 (5’-TGTAACACGAGCAGGGGTCCTA-3’) dengan
target produk PCR sebesar 2109 pasang basa. Dua dari 9 isolat VHB dapat
teramplifikasi dengan baik menggunakan empat pasang primer tersebut. Hal ini
ditunjukkan dengan terlihatnya pita DNA hasil amplifikasi dari masing-masing
pasangan primer.
Produk PCR yang didapatkan baik menggunakan primer untuk daerah PreS1 maupun genom lengkap VHB kemudian dilakukan purifikasi menggunakan kit
ekstraksi gel QiaQuick (QiaGen, USA), sebelum dilakukan sekuensing untuk
mendapatkan data sekuens VHBGi dari isolat hasil studi, baik untuk regio Pre-S1
ataupun sekuens genom lengkap VHB Gi.
Hasil analisa filogenetik VHBGi daerah Pre-S1 (459 nukleotida)
menggunakan program MEGA memperlihatkan bahwa terjadi keragaman di
antara isolat owa jawa hasil studi, namun isolat owa jawa tersebut berada pada
percabangan tersendiri terpisah dari kelompok satwa primata lainnya yang data
sekuensya didapat dari GenBank.
Untuk sekuens genom lengkap, pohon filogenetik memperlihatkan bahwa
isolat hasil studi berada pada satu cluster tersendiri. Hubungan kekerabatan yang
dekat dengan orangutan diperlihatkan dengan adanya percabangan yang lebih
dekat antara isolat owa jawa hasil studi dengan isolat orangutan dibandingkan
dengan isolat manusia.
@Hak Cipta Milik IPB, tahun 2012
Hak Cipta dilindungi Undang-undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini
tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan
laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu
masalah
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar
IPB
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau
seluruh karya tulis dalam bentuk laporan apapun tanpa izin
IPB
ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN KARAKTERISASI
MOLEKULAR VIRUS HEPATITIS B
DI OWA JAWA (Hylobates moloch) DI INDONESIA
RACHMITASARI NOVIANA
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Primatologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis:
Dr. Ir. Dedi Duryadi Solihin, DEA
Judul Tesis
Nama
NIM
: Isolasi, Identifikasi dan Karakterisasi Molekular Virus Hepatitis B
pada Owa Jawa (Hylobates moloch) di Indonesia
: Rachmitasari Noviana
: P053090031
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. drh. Diah Iskandriati
Anggota
Dr. drh. Joko Pamungkas, M.Sc
Ketua
Diketahui
Ketua Mayor Primatologi
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. drh. Dondin Sajuthi, MST. PhD
Dr. Ir. Dahrul Syah, MSc.Agr
Tanggal Ujian : 24 November 2011
Tanggal Lulus: 13 Februari 2012
Judul Tesis
Nama
NIM
: Isolasi, Identifikasi dan Karakterisasi Molekular Virus Hepatitis B
pada Owa Jawa (Hylobates moloch) di Indonesia
: Rachmitasari Noviana
: P053090031
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. drh. Diah Iskandriati
Anggota
Dr. drh. Joko Pamungkas, M.Sc
Ketua
Diketahui
Ketua Mayor Primatologi
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. drh. Dondin Sajuthi, MST. PhD
Dr. Ir. Dahrul Syah, MSc.Agr
Tanggal Ujian : 24 November 2011
Tanggal Lulus: 13 Februari 2012
PRAKATA
Segala puji dan syukur penulis haturkan ke hadirat Allah SWT atas segala
limpahan
rahmatNya
pada
saat
melakukan
penelitian
hingga
dapat
diselesaikannya tesis yang bertema virus hepatitis B dengan judul tesis Isolasi,
Identifikasi dan Karakterisasi Molekular Virus Hepatitis B pada Owa Jawa
(Hylobates moloch) di Indonesia.
Penulis menyampaikan penghargaan setinggi-tingginya kepada Dr. drh.
Joko Pamungkas, M.Sc, selaku ketua komisi pembimbing sekaligus sebagai
kepala Pusat Studi Satwa Primata, LPPM-IPB dan Dr. drh. Diah Iskandriati selaku
anggota komisi pembimbing dan kepala Laboratorium Mikrobiologi dan
Imunologi PSSP, LPPM IPB atas segala bimbingan, arahan, pengertian dan
dukungan fasilitas serta dana penelitian sejak perencanaan penelitian sampai
penulisan tesis dapat diselesaikan. Ucapan terima kasih penulis sampaikan pula
kepada Dr. Ir. Dedi Duryadi Solihin, DEA sebagai penguji luar komisi yang tidak
hanya mengenalkan penulis dalam dunia analisa molekular namun juga
memberikan tambahan wawasan pengetahuan kepada penulis dan masukan dalam
penulisan tesis ini.
Rasa terima kasih dan penghargaan yang tulus penulis sampaikan kepada
Prof. drh. Dondin Sajuthi, MST, Ph.D; selaku Ketua Program Studi Primatologi
Sekolah Pascasarjana IPB yang telah membuka kesempatan kepada penulis untuk
melanjutkan pendidikan ke jenjang yang lebih tinggi. Kepada Direktur Taman
Safari Indonesia, atas kerjasamanya dalam penelitian ini, rasa terima kasih juga
penulis sampaikan.
Kepada teman sejawat di Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi, PSSP
LPPM-IPB, Uus Saepuloh, S.Si, M.BioMed; Silmi Mariya, S.Si, MS; dra. Maryati
Surya, MS; dra. Isti Kartika Sari; Sela Mariya, S.Si; Iin Indriawati, Tri Faujiani,
Dede Juarsa dan Budi Doyo serta teman-teman di Pusat Studi Satwa Primata
LPPM IPB atas kerjasamanya dan dukungan moril baik langsung maupun tidak
langsung.
Ucapan terima kasih tidak lupa penulis haturkan kepada seluruh staf
pengajar Program Studi Primatologi atas kesempatan untuk mendapatkan
tambahan wawasan ilmu pengetahuan dan etika keilmuan selama penulis
mengikuti perkuliahan di Program Studi Primatologi, Sekolah Pascasarjana IPB.
Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada staf administrasi Program Studi
Primatologi atas segala bantuannya selama ini.
Kepada ibunda tercinta, Siti Hidajati, yang tak pernah putus berdoa untuk
keberhasilan penulis, kepada suami dan anak-anakku terkasih, Dr. Ir. Entang
Iskandar, MS; Dienita Aulia dan Tiara Dwina Amany yang dengan penuh
kesabaran, pengertian dan kasih mendampingi penulis selama ini, penulis sangat
berterima kasih. Almarhum ayahanda Purnomo dan Mohamad Dawami serta
ibunda Siti Sadiah yang selama hidupnya selalu mengingatkan untuk selalu
belajar dan belajar. Kepada kakak-kakakku dan adik-adikku terima kasih atas doa
dan semangatnya selama ini.
Penghargaan dan ucapan terima kasih disampaikan kepada semua pihak
yang tidak dapat disebutkan satu persatu sehingga peneliti dapat menyelasaikan
studinya di program studi ini.
Semoga hasil penelitian penulis dapat menambah khasanah wawasan dan
berguna bagi dunia ilmu pengetahauan dan kesejahteraan manusia serta hewan.
Bogor, Februari 2012
Rachmitasari Noviana
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 14 November 1972 dari ayah
Purnomo dan ibu Siti Hidayati. Penulis merupakan putri pertama dari tiga
bersaudara.
Penulis menyelesaikan pendidikan dasarnya pada tahun 1985 di SD Hang
Tuah VI, Jakarta. Tahun 1988 menyelesaikan Sekolah Menengah Pertama di
SMPN 30 Jakarta, dan tahun 1991 menyelesaikan Sekolah Menengah Atas di
SMAN 3 Jakarta. Pada tahun yang sama, penulis lulus seleksi masuk IPB melalui
Undangan Seleksi Masuk IPB. Tahun 1996 penulis meyelesaikan pendidikan
Strata 1 dari Fakultas Kedokteran Hewan IPB.
Tahun 2009, penulis diterima masuk Sekolah Pascasarjana pada Mayor
Primatologi, Institut Pertanian Bogor.
DAFTAR ISI
halaman
DAFTAR GAMBAR ……………………………………………….
xi
DAFTAR TABEL …….……………………………………………
xi
DAFTAR LAMPIRAN ……………………………………………..
xii
PENDAHULUAN ……………………………………………………………… 1
Latar Belakang …………………………………………………………... 1
Tujuan Penelitian ………………………………………………………... 2
Manfaat Penelitian ……………………………………………………….. 3
TINJAUAN PUSTAKA …………………………………………..…………… 4
Owa jawa ………………………………………………………………... 4
Taxonomi ………………….………………………………………. 4
Morfologi owa jawa ………………….……………………………. 5
Status konservasi ……………… ………………………………….. 5
Virus Hepatitis B ………………………………………………………… 6
Klasifikasi Virus …………………………………………….…….. 6
Genom Virus ………………………………………………………. 6
Replikasi Virus …………………………………………………….. 7
Transmisi Virus ……………………………………………………. 8
Patogenesa ………………………………………………………….. 9
Virus Hepatitis B pada satwa primata ………………………………….... 9
Identifikasi asam nukleat ……………………………………………….. 10
METODE PENELITIAN ……………………………………………………... 12
Waktu dan Tempat Penelitian …………………………………………… 12
Sampel Penelitian………………………………………………………… 12
Ekstraksi DNA ………………………………………………………….. . 12
Amplifikasi DNA untuk Sekuens Daerah Pre-S1 VHB ………………… 12
Restriction Fragment Length Polymorphism ……………………………. 14
Amplifikasi DNA untuk Genom Lengkap VHB ………………………. 14
Pemurnian Produk PCR …………………………………………………. 15
Analisa Hasil Sekuensing ……………………………………………….. 15
Alur penelitian …………………………………………………………… 16
HASIL DAN PEMBAHASAN ………………………………………………. 17
Virus hepatitis B Gibbon Regio Pre-S1………………………………….. 17
Amplifikasi Virus Hepatitis B Regio Pre-S1 ……………………… 17
Restriction Fragment Length Polymorphism ……………………… 19
Pembuatan Pohon Filogenetik …………………………………….. 22
Sekuens Genom Lengkap Virus Hepatitis B Gibbon ……………………. 25
Amplifikasi Virus Hepatitis B Gibbon ……………………………. 25
Pohon Filogenetik …………………………………………………. 29
SIMPULAN DAN SARAN …………………………………………………... 31
DAFTAR PUSTAKA ………………………………………………………….. 32
LAMPIRAN ……………………………………………………………………. 35
DAFTAR GAMBAR
halaman
1
Organisasi genom virus hepatitis B manusia (sirkular) …………………… 7
2
Siklus hidup virus hepatitis B ………....………………………………….
8
3 Organisasi virus hepatitis B pada woolly monkey ……………………….. 10
4 Visualisasi PCR VHB regio Pre-S1 yang menginfeksi spesies owa jawa
di lokasi A
…………………………………………………………. 18
5 Visualisasi PCR VHB regio Pre-S1 yang menginfeksi spesies owa jawa
di lokasi B
…………………………………………………………. 18
6 Visualisasi pemotongan produk DNA menggunakan enzim restriksi
BSt2UI lokasi A…………………………………………………………..
20
7 Visualisasi pemotongan produk DNA menggunakan enzim restriksi
BSt2UI lokasi B ………………………………………………………….. 21
8 Pohon filogenetik VHB Hylobatidae berdasarkan (a) sekuens nukleotida
VHB regio Pre-S1 (459pb); (b) situs pemotongan sekuens nukleotida VHB
region pre-S1 menggunakan ensim restriksi BsT2UI …………………….. 22
9 Pohon filogenetik VHB Hylobatidae dan orangutan berdasarkan sekuens
nukleotida VHB regio Pre-S1 (459 nuklotida)…………………………… 24
10 Pohon filogenetik VHB Hylobatidae dan orangutan berdasarkan sekuens
asam amino VHB regio Pre-S1 …………………………………………… 24
11 Visualisasi hasil amplifikasi genom lengkap VHBGi
…………………... 26
12 Rekonstruksi genom lengkap VHBGi linear berdasarkan posisi primer
yang digunakan ……………………………………………………………. 26
13 Prediksi genom linear sekuens sampel C1 dibandingkan dengan sekuens
H. pileatus dari GenBank
……………………………………….….. 28
14 Pohon filogenetik VHB genom lengkap asal satwa primata dan
manusia …………………………………………………………………... 29
DAFTAR TABEL
halaman
1 Klasifikasi dan penyebaran genus Hylobates ………………………………. 4
2 Pasangan primer untuk amplifikasi genom lengkap VHBGi …………….
14
3 Hasil pemeriksaan serologis HbSAg (data sekunder) dan hasil PCR atas
Regio Pre-S1 dari virus hepatitis B pada owa jawa
………………….. 17
4 Data sekuens produk PCR VHBGi regio Pre-S1 dan situs pemotongan
dari enzim restriksi BSt2UI
.................................................................. 19
5 Data lokasi gen VHB pada isolat Ttblack (GenBank, AY330916)
….. 27
6 Daerah gen VHBGi berdasarkan pasangan primer yang digunakan
….. 28
DAFTAR LAMPIRAN
1
Pensejajaran berganda virus hepatitis B regio Pre-S1 isolat hasil
studi dan situs pemotongan enzim restriksi BSt2UI halaman ………….. 35
2 Data sekuens GeneBank virus hepatitis B
…………………………. 37
3 Komposisi asam amino VHBGi regio Pre-S1 ……………………………
38
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Hepatitis merupakan manifestasi klinis dari perubahan jaringan atau organ
hati berupa peradangan atau inflamasi yang dikarakterisasikan dengan terdapatnya
sel-sel inflamatori pada jaringan hati. Peradangan tersebut dapat diakibatkan oleh
agen yang bersifat non-infeksius seperti minuman beralkohol dan penggunaan
obat-obatan, sedangkan agen yang bersifat infeksius dapat disebabkan oleh infeksi
virus hepatitis atau bakteria. Pada infeksi virus hepatitis penyakit dapat bersifat
akut maupun kronis serta dapat berakhir dengan kematian akibat terjadinya sirosis
pada hati. Saat ini menurut data WHO
satu dari tiga penduduk dunia telah
terinfeksi virus ini sementara satu dari 20 penduduk dunia hidup dengan infeksi
kronis (WHO, 2011).
Sampai saat ini terdapat lima virus penting yang dilaporkan menjadikan hati
sebagai organ target utama infeksi, yaitu virus Hepatitis A (VHA), B (VHB), C
(VHC), D (VHD) dan virus Hepatitis E (VHE).
Virus hepatitis B (VHB)
merupakan satu-satunya virus DNA dalam keluarga virus hepatitis. Tiga cara
utama transmisi virus hepatitis B yaitu melalui darah, hubungan kelamin (sexual
intercourse) dan perinatal (mother to child) pada saat melahirkan atau menyusui.
Transmisi perinatal dan infeksi carrier yang bersifat jangka panjang menyebabkan
adanya endemisitas dan prevalensi tinggi di benua Asia terutama bagian selatan
dan timur.
Selain menginfeksi manusia, VHB dilaporkan dapat pula menginfeksi
beberapa spesies satwa primata di fasilitas konservasi eks-situ, terutama dari
golongan kera yaitu simpanse (Pan troglodytes), orangutan (Pongo sp), gorilla
dan gibbon (Hylobates sp), serta dari golongan monyet yaitu woolly monkey
(Lagothrix lagotricha).
Adanya infeksi VHB dapat dideteksi melalui uji serologis untuk antigen
permukaan VHB (HBsAg) dan deteksi DNA viral melalui uji polymerase chain
reaction (PCR). Mac Donnald et al. (2000), menemukan kejadian infeksi VHB
pada simpanse yang dilahirkan di alam (wild-born). Isolasi VHB pada satwa
primata dari golongan monyet dilaporkan pertama kali dilakukan dari Lagothrix
lagotricha
(woolly monkey) asal kebun binatang di Amerika Serikat,
yang
mengalami peradangan hati (Lanford et al. 1998).
Analisis pohon filogenetik mengindikasikan bahwa virus yang menginfeksi
simpanse dan Hylobates bersifat indigenus pada masing-masing inangnya (Norder
et al. 1996) dan berada pada cabang pohon filogenetik yang berbeda dengan
infeksi VHB pada manusia (Mac Donnald et al. 2000). Secara eksperimental telah
dilakukan pula transmisi VHB manusia melalui inokulasi cairan saliva dari
manusia yang menderita hepatitis B ke satwa primata keluarga Hylobatidae (Scott
et al. 1980). Replikasi virus yang terjadi pada satwa tersebut mengindikasikan
adanya hubungan kekerabatan yang dekat antara manusia dan Hylobatidae dan
kemungkinan adanya transmisi alami dari manusia ke keluarga Hylobatidae.
Penelitian mengenai infeksi virus hepatitis B pada owa jawa di Indonesia
belum banyak dilakukan. Informasi kejadian infeksi VHB pada satwa ini banyak
berasal dari luar Indonesia, meskipun spesies ini merupakan spesies endemik
Indonesia. Owa jawa juga merupakan spesies yang terancam punah menurut
International Union for Conservation of Nature (2008). Dengan status ini, telah
dilakukan upaya untuk mengatasi kepunahan spesies owa jawa ini melalui
beberapa usaha berupa penangkaran, taman satwa dan upaya pengembalian atau
pelepasliaran satwa ini ke habitat aslinya. Upaya tersebut sebaiknya diiringi pula
dengan pemeriksaan status kesehatan satwa dan orang-orang yang mengalami
kontak langsung dengan satwa tersebut. Salah satunya adalah virus hepatitis B
yang telah diketahui dapat menginfeksi manusia dan satwa primata.
Tujuan Penelitian
Mengeksplorasi informasi mengenai infeksi virus hepatitis B pada satwa
primata dari keluarga Hylobatidae, khususnya melalui penyidikan isolasi dan
identifikasi VHB dari spesies owa jawa (Hylobates moloch) yang berasal dari
pusat rehabilitasi dan beberapa lembaga konservasi eks-situ di Indonesia,
dilanjutkan dengan melakukan pengkarakterisasian virus hepatitis B asal spesies
tersebut.
Manfaat Penelitian
Dengan informasi yang diperoleh mengenai infeksi virus VHB dan
perbedaan karakter antara virus hepatitis B yang menginfeksi manusia (VHBHu)
dengan virus Hepatitis yang menginfeksi owa jawa (VHBGi), diharapkan dapat
membantu penapisan status mikrobiologik owa jawa di fasilitas lembaga
konservasi eks-situ, serta lebih lanjut dapat dimanfaatkan dalam pengelolaan
manajemen kesehatan satwa tersebut.
TINJAUAN PUSTAKA
Owa jawa
Taksonomi
Owa jawa (Hylobates moloch), dikenal pula dengan nama Javan gibbon
atau Silvery gibbon, menurut Napier dan Napier (1985), diklasifikasikan sebagai
berikut:
Ordo
: Primate
Subordo
: Anthropoidea
Infra-ordo
: Catarrhini
Superfamili
: Hominoidea
Famili
: Hylobatidae
Genus
: Hylobates
Spesies
: Hylobates moloch
Menurut Geissmann (1995), genus Hylobates dapat dikelompokkan dalam
empat subgenus, yaitu Hylobates, Nomascus, Bunopithecus dan Sympalangus.
Pola penyebaran dari masing-masing subgenus disajikan pada tabel di bawah ini.
Tabel 1 Klasifikasi dan Penyebaran genus Hylobates
Genus
Subgenus
Spesies
Penyebaran
Hylobates
Hylobates
Agilis
Moloch
Muelleri
Pileatus
Klosii
Concolor
Sumatera Barat,
Kalimantan,
Malaysia,Thailand, Burma,
Semenanjung Malaysia,
Yunan, Sumatera Barat
Jawa Barat, Jawa Tengah
Kalimantan
Thailand, Kamboja
Mentawai
Vietnam, Yunan, Laos
Nomascus
Leucogenys
Gabriellae
Laos, Vietnam
Laos, Vietnam, Kamboja
Bunopithecus
Hoolock
Assam, Bangladesh,
Burma
Sympalangus
Syndactylus
Semenanjung Malaysia,
Sumatera
Lar
Morfologi owa jawa
Owa jawa adalah satwa primata arboreal, dengan tempat hidupnya adalah
kanopi pohon. Mereka tidak mempunyai ekor, mempunyai formulasi gigi yang
sama dengan Pongidae. Mempunyai tangan yang panjang, dengan panjang tangan
dapat mencapai tanah disaat mereka berdiri dengan dua kaki (bipedal).
Pergelangan tangan dan bahu telah mengalami adaptasi sehingga memudahkan
pergerakan mereka dalam brakhiasi. Nowak (1999) mendefinisikan Hylobates
sebagai penghuni pohon, dan gibbon (owa) sangat sesuai dengan penamaan
tersebut. Ketangkasan genus ini dalam melakukan brakhiasi, bergerak dari satu
pohon ke pohon lainnya, melebihi satwa lainnya.
Supriatna dan Wahyono (2000) menyatakan bahwa tubuh owa Jawa
ditutupi rambut yang berwarna kecoklatan sampai keperakan atau kelabu. Bagian
dagu pada beberapa individu berwarna gelap. Rambut di atas kepala hitam dan
kulit muka hitam, alis berwarna putih, rambut pada bayi berwarna kelabu terang
dibanding dengan dewasa (Rowe 1996).
Adanya pembengkakan pada pada alat kelamin betina, terutama pada
Hylobates moloch, merupakan cirri menonjol pada genus Hylobates, namun
pembengkakan ini tidak begitu nyata terlihat pada Hylobates pileatus (Mootnick
2006).
Status Konservasi
Owa jawa merupakan salah satu spesies endemik Indonesia. Keberadaan
spesies ini telah dilindungi sejak tahun 1931 untuk menghindari kepunahan
melalui Peraturan Perlindungan Binatang Liar No. 266 yang kemudian diperkuat
dengan Undang-undang No. 5 tahun 1990 dan SK Menteri Kehutanan 10
Juni1991 (Supriatna & Wahyono 2000). Pada tahun 1986 – 1990, International
Union for Conservation Nation (IUCN) telah memasukkan owa jawa sebagai
spesies yang terancam punah. Dikatakan sebagai terancam punah karena
populasinya di alam diperkirakan kurang dari 2500 individu, kemudian dengan
observasi yang berkesinambungan terjadi penurunan jumlah individu dewasa dan
tidak ada subpopulasi yang terdiri lebih dari 250 individu dewasa (IUCN
Conservation Monitoring Center).
Virus Hepatitis B
Klasifikasi Virus
Virus Hepatitis adalah virus yang menjadikan hati sebagai target utama
infeksi. Infeksi virus dapat menyebabkan peradangan hati yang ditandai dengan
ditemukannnya sel-sel inflamatori pada hati. Terdapat lima virus yang dikenal
dapat mengakibatkan hepatitis dan berasal dari keluarga virus yang berbeda. Virus
hepatitis A merupakan anggota dari keluarga Picornaviridae. Virus hepatitis B
adalah anggota keluarga Hepadnavidae. Virus hepatitis C merupakan anggota dari
keluarga Flaviviridae, sedangkan virus hepatitis D dan E masing-masing
merupakan anggota dari keluarga Deltaviridae dan Caliciviridae.
Menurut Komite Internasional Taksonomi Virus (International Committee
on Taxonomy of Viruses, ICTV, 2009) keluarga Hepadnaviridae dibagi menjadi
dua genus yaitu:
1. Genus Orthohepadnavirus, yaitu virus hepatitis yang menyerang mamalia,
seperti hepatitis B virus (yang menginfeksi ordo primata), woodchuck
hepatitis virus, ground squirrel hepatitis virus dan arctic squirrel hepatitis
virus
2. Genus Avihepadnavirus, yaitu virus hepatitis yang menyerang bangsa
unggas, seperti duck hepatitis virus, heron hepatitis virus dan goose
hepatitis virus.
Genom Virus
Virus hepatitis B (VHB), sesuai dengan nama keluarga (Hepadnavirus)
adalah virus DNA dengan virion beramplop (envelope) berukuran 42-nm, dengan
sebagian DNA virion adalah utas ganda (partially double stranded). Virus ini
merupakan virus DNA hewan berukuran terkecil dan mempunyai ukuran genom
sebesar kurang lebih 3200 pasang basa, terdiri dari empat open reading frame
(ORF) untuk gen P, C, S dan X yang masing-masing mengkode DNA
polimerase/reverse transcriptase, protein inti (core), protein permukaan (surface)
dan protein X. Untuk gen S dibagi menjadi regio pre-S1, pre-S2 dan S. Gen C
terbagi menjadi regio pre-C dan C.
Protein permukaan yang berada pada pembungkus virus (envelope) dikenal
sebagai antigen permukaan (HbsAg) yang merupakan protein penting dalam
pendiagnosaan klinis infeksi dan imunisasi virus ini.
Selain HBsAg terdapat dua antigen penting lainnya yaitu antigen inti
hepatitis B (HBcAg) yang membentuk nukleokapsid virion, dan antigen e
(HBeAg) adalah antigen yang dikeluarkan ke dalam peredaran darah oleh sel-sel
yang terinfeksi virus (Levinson, 2008)
Gambar 1 Organisasi genom virus hepatitis B manusia (sirkular).
Sumber: Wands, JR. 2004
Replikasi Virus
Virus hepatitis B merupakan virus DNA dengan utas ganda sebagian yang
menggunakan enzim transkripsi balik (reverse transcriptase) dalam replikasinya.
Proses replikasi virus secara umum terdiri dari beberapa tahap, yaitu perlekatan
(attachment), penetrasi (penetration), uncoating, ekspresi gen, replikasi genom,
assembly dan pelepasan (release). Proses transkripsi terjadi di dalam nukleus,
sementara replikasi genom berlangsung di sitoplasma, di dalam protein inti (White
dan Fenner, 1994).
Protein permukaan virion dapat menempel (attach) pada permukaan sel
inang melalui reseptor spesifik. Situs penempelan virus hepatitis B adalah pada
protein L. Virion yang menempel pada permukaan sel inang mengalami
endositosis, kemudian nukleokapsid akan dikeluarkan dari endosoma melalui fusi
yang terjadi antara virion dan membran endosoma. Nukleokapsid akan memasuki
nukleus sel inang, genom virus akan terlepas dalam nukleus sel inang dan
berkonversi menjadi molekul DNA sirkular (Carter dan Sanders, 2007).
Gambar 2 Siklus hidup virus hepatitis B
(http://www.natap.org/2004/VHB/100804_02.htm)
Asam deoksiribonukleat rantai ganda sirkular (covalently closed circular,
cccDNA) ini kemudian menjadi cetakan untuk sintesa asam ribonukleat
messanger (mRNA) menggunakan enzim polimerase RNA selular. Hepadnavirus
merupakan keluarga DNA virus yang unik karena menggunakan mRNA sebagai
cetakan dalam menghasilkan genom DNA melalui transkripsi terbalik (reverse
transcription) (White dan Fenner, 1994).
Transmisi Virus
Infeksi virus ini ditularkan melalui darah, hubungan kelamin dan perinatal
(dari ibu ke anak saat melahirkan dan menyusui). Transmisi melalui jarum suntik
yang terkontaminasi virus memperlihatkan bahwa transmisi sangat mudah terjadi.
Infeksi kronis VHB dapat mengakibatkan sirosis pada hati dan hepatocellular
carcinoma (Levinson, 2008).
Patogenesa
Setelah menginfeksi inangnya dan memasuki peredaran darah, VHB akan
menginfeksi hepatosit kemudian antigen viral akan berada pada permukaan sel
inang. Sel T sitotoksik akan memediasi sistem pertahanan tubuh untuk melawan
masuknya antigen viral berupa adanya inflamasi dan nekrosis. Virus ini tidak
menghasilkan efek sitopatik, sehingga diduga patogenesa virus ini merupakan
hasil dari pertahanan tubuh bermediasi sel (White dan Fenner, 1994). Penderita
dapat menjadi chronic carrier, bila antigen permukaan VHB (HBsAg) terdeteksi
lebih dari 6 bulan. Pada penderita chronic carrier, terjadi kasus hepatocellular
carcinoma dengan prevalensi tinggi (Levinson, 2008)
Virus Hepatis B Pada Satwa Primata
Warren et al. (1999) menemukan adanya infeksi VHB di lapangan secara
alami pada orangutan yang berada di Pusat Rehabilitasi Orangutan Wanariset,
Kalimantan Timur. Sebanyak 195 sampel serum diujikan untuk mendeteksi antihepatitis B inti (HBcAb), anti-HB permukaan (HBsAb) dan antigen permukaan
hepatitis B (HBsAg) serta uji PCR. Ditemukan bahwa 55 individu adalah HBsAg
positif, 28 HBsAb positif, uji PCR yang dilakukan pada individu HbsAg positif
diperoleh 32 sampel adalah positif VHB.
Vaudin et al. (1988) menemukan adanya infeksi VHB pada simpanse (Pan
troglodytes), VHB juga terbukti dapat menginfeksi genus Hylobates dan
Nomascus (Noppornpanth et al. 2003), Gorilla gorilla (Grethe et al. 2000) dan
Lagothrix lagothricha (Lanford et al. 1998).
Infeksi VHB yang terjadi pada woolly monkey menjadi acuan awal
penelitian hepatitis B pada satwa primata. Lanford et al. (1998) menemukan
bahwa hepadnavirus yang diisolasi dari woolly monkey mempunyai perbedaan
dari VHB yang berasal dari isolat manusia. Analisa filogenetik terhadap sekuens
nukleotida dilakukan pada bagian gen inti dan permukaan. Ditemukan bahwa
sekuens tersebut merupakan basal atau ancestral dari grup VHB pada manusia,
sehingga diperkirakan bahwa virus hepatitis B yang menginfeksi woolly monkey
merupakan progenitor dari virus hepatitis B manusia.
Gambar 3 Organisasi virus VHB pada woolly monkey (WMHBV)
(Lanford et al. 1998)
Transmisi VHB juga terjadi pada genus Hylobates. Analisa filogenetik dari
isolat genus tersebut menyatakan bahwa sekuens nukleotida gen permukaan VHB
yang menginfeksi Hylobates yang berada dalam lembaga konservasi berada pada
cluster yang berbeda dengan VHB yang berasal dari inang lainnya (Noppornpanth
et al. 2003). Virus hepatitis B ditemukan tidak hanya pada sediaan darah namun
juga dari cairan saliva Hylobates pileatus, H. lar, dan H. concolar. Dari analisa
lanjutan menggunakan enzim restriksi (analisis RFLP) dari isolat gibbon dan
isolat manusia terlihat bahwa VHB yang menginfeksi keduanya merupakan VHB
yang mempunyai karakterisasi molekular yang berbeda (Noppornpanth et al.
2003).
Identifikasi Asam Nukleat Virus
Identifikasi agen virus dapat dilakukan melalui analisa genom virus.
Penggunaan reaksi enzim Taq DNA polimerase dalam tehnik PCR (Polymerase
Chain Raction) memungkinkan identifikasi secara molekular yang memiliki
sensitifitas tinggi dengan mengamplifikasi hanya dari satu molekul DNA tunggal
dan kopi gen tunggal dapat diekstraksi dari campuran genomik yang kompleks.
Dengan kata lain, PCR merupakan suatu reaksi in vitro untuk menggandakan
(mengamplifikasikan) jumlah molekul DNA pada target tersebut dengan bantuan
enzim Taq DNA polimerase dan oligonukleotida sebagai primer dalam sebuah
mesin thermocycler (Ubaidillah dan Sutrisno, 2009).
Tehnik amplifikasi DNA berbasis pada siklus termal berupa pemanasan dan
pendinginan secara berulang yang terdiri dari tiga tahap yaitu pemecahan
(denaturation), penempelan (annealing) dan pemanjangan (elongation). Primer
yang
digunakan
berisi
sekuens
komplementari
yang
didisain
untuk
mengamplifikasi region target tertentu . Primer yang berada sebelum daerah target
disebut primer forward dan yang berada setelah target disebut primer reverse
(Ubaidillah dan Sutrisno, 2009). Hasil amplifikasi DNA dengan tehnik PCR
kemudian dapat divisualisasikan sebagai pita-pita DNA pada gel agarosa. Teknik
ini sangat efisien untuk mengamplifikasi urutan DNA VHB.
Enzim endonuklease restriksi adalah enzim bakteri yang digunakan dalam
tehnik molekular untuk mengenali sekuens spesifik dalam DNA dan kemudian
melakukan pemotongan DNA tersebut untuk mendapatkan fragmen-fragmen
spesifik yang dikenal sebagai fragmen restriksi (Ubaidillah dan Sutrisno, 2009).
Ensim restriksi memainkan peranan penting dalam konstruksi molekul DNA
rekombinan dan mapping lokasi dari situs restriksi pada DNA. Selain itu, situs
spesifik dari enzim restriksi ini pada fragmen gen tertentu dapat dijadikan sebagai
alat genotiping (karakteristik genotipe) dari individu pada spesies tersebut
(Ubaidillah dan Sutrisno, 2009).
METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan dari bulan Januari sampai dengan bulan Juni 2011,
bertempat di Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi, Pusat Studi Satwa
Primata, Lembaga Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat, Institut
Pertanian Bogor (PSSP LPPM-IPB), Jalan Lodaya II/5, Bogor 16151.
Sampel Penelitian
Sampel yang dimanfaatkan dalam penelitian ini adalah plasma owa jawa
yang merupakan koleksi sampel Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi PSSP
LPPM-IPB, sebagai bagian dari pemeriksaan rutin kesehatan satwa dari beberapa
fasilitas konservasi eks-situ satwa primata. Semua sampel yang digunakan dalam
penelitian ini, berasal dari 9 ekor satwa owa jawa yang memiliki status positif
atas pemeriksaan terhadap antigen permukaan virus hepatitis B (HBsAg) melalui
uji ELISA (data sekunder).
Ekstraksi DNA
Pemurnian DNA virus dilakukan dari sampel plasma owa jawa
menggunakan kit QIAmp DNA Mini Blood Kit (Qiagen, USA) sesuai dengan
petunjuk dari pedoman penggunaan dari perusahaan. Sebanyak 200µl sampel
plasma ditambahkan ke dalam tabung mikro yang telah berisi 20µl (20mg/ml)
proteinase K. Larutan penyangga pelisis (lisis buffer) ditambahkan sebanyak
200µl ke dalam masing-masing tabung mikro. Untuk menghomogenkan campuran
tersebut dilakukan homogenisasi menggunakan vortex dan dilanjutkan dengan
inkubasi selama 10 menit pada suhu 560 C. Prosedur selanjutnya dilakukan
sentrifugasi, pencucian dan elusi sesuai dengan prosedur baku dari kit ekstraksi
DNA QiAmp DNA Miniblood Kit.
Amplifikasi DNA untuk Sekuens Daerah Pre-S1 VHB
Amplifikasi DNA dilakukan menggunakan metode polymerase chain
reaction
(PCR)
dengan
memanfaatkan
primer
yang
dirancang
untuk
mengamplifikasi daerah Pre-S1 yang merupakan daerah variabel dan karakteristik
untuk VHB yang berasal dari spesies yang berbeda. Set primer forward dan
reverse disintesa dari sekuens bagian paling conserved di daerah yang variabel di
antara berbagai strain VHB.
Sebanyak 50 µl reagen PCR yang terdiri dari, masing-masing 1µl primer
forward dan reverse (10 pmol/µl), 4 µl MgCl2 (25mM), 5 µl dNTPs (10 mM),
0,5µl Taq Gold Polymerase (5 U/µl), 5 µl PCR Buffer 10X (500mM KCl,
100mM Tris-HCl (pH 8,3), sampel DNA (10 ul) dan ddH2O (23,5 ul) dimasukkan
ke dalam tabung mikro 200µl dan dihomogenkan menggunakan vortex.
Merujuk kepada penelitian yang dilakukan oleh Warren et al. (1999) yang
telah berhasil mengamplifikasi VHB daerah Pre-S1 dari isolat orangutan,
digunakan pasangan primer yang sama untuk mengamplifikasi VHB daerah PreS1
dari
isolat
DNA
owajawa
yaitu
hepB-SF1
dengan
sekuens
5’-
TGYGGGTCACCWTATTCTTGGG-3’ dan hepB-SRout yang memiliki sekuens
5’-CACTGTTCCTGAACTGGAGC-3’. Pasangan primer tersebut memiliki target
produk kurang lebih 455 pasang basa.
Amplifikasi DNA dilakukan menggunakan mesin PCR (Perkin Elmer,
Model 9700), melalui beberapa tahapan. Pada tahap awal dilakukan pre-PCR
untuk mengaktifkan enzim polymerase pada suhu 940C selama 10 menit. Tahapan
selanjutnya adalah amplifikasi PCR yang terdiri atas denaturasi sampel pada suhu
940C selama 30 detik, annealing pada suhu 620C selama 30 detik, dan tahap
elongasi pada suhu 720C selama 1 menit. Tahapan ini dilakukan selama 30 kali
dengan siklus yang berulang. Tahap akhir adalah post-PCR dengan suhu 720C
selama 10 menit.
Produk PCR yang telah diamplifikasi tersebut dijalankan pada gel agarosa
2% yang mengandung ethidium bromida 1 µg/ml dalam bufer TAE menggunakan
elektroforesis horizontal. Penanda DNA 1 kb (Invitrogen, USA) dan produk PCR
yang telah ditambahkan pewarna (loading dye) dimasukkan ke dalam sumur gel.
Alat dokumentasi Gel Doc 2000 (BioRad, USA)
digunakan untuk
memvisualisasikan hasil elektroforesis. Sebagai kontrol positif PCR digunakan
DNA positif VHB gibbon (VHBGi), VHB manusia (VHBHu) dan VHB
orangutan (VHBOu).
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
Terhadap produk PCR yang memberikan hasil positif pada uji PCR
dilakukan digesti menggunakan enzim restriksi BSt2UI (1 U/µl) yang bekerja
pada sekuens spesifik yaitu CC(A/T)GG dari sekuens nukleotida sampel. Enzim
restriksi ini telah diketahui dapat memotong sekuens nukelotida dari VHBOu
namun tidak dapat memotong sekuens nukleotida dari VHBHu. Sebanyak 20µl
campuran reagensia yang terdiri dari 1µl enzim BSt2UI (1IU/ul), buffer pereaksi
10 x sebanyak 1,5µl, dan produk PCR sebanyak 3,5µl. Ditambahkan air destilasi
sampai volume mencapai 20µl. Kemudian dilakukan inkubasi pada suhu 600C
selama 1 jam.
Untuk memvisualisasikan hasil restriksi enzim, produk PCR yang telah
diinkubasi dengan enzim restriksi tersebut dijalankan melalui gel agarosa
menggunakan elektroforesis
horizontal dengan berkonsentrasi
2%
yang
ditambahkan ethidium bromida sebagai pewarna (staining), selama 1,5 jam, 100V.
Pembacaan hasil eletroforesis dilakukan melalui alat GelDoc.
Amplifikasi DNA untuk Sekuens Genom Lengkap VHB
Amplifikasi DNA untuk mendapatkan sekuens genom lengkap VHBGi
merujuk kepada Sa-Nguanmoo et al. (2008) yang menggunakan empat set primer
seperti tertera pada tabel 2 di bawah ini.
Tabel 2 Pasangan primer untuk amplifikasi genom lengkap VHBGi
Primer
Primer
Sekuens primer
Posisi nukleotida
set
1
2
3
4
Target
produk (pb)
PreS1F
5’-GGGTCACCATATTCTTGGGAAC-3’
2814 -2835
R5
5’-AGCCCAAAAGACCCACAATTC-3’
1015 - 995
F6
5’-ATATGGATGATGTGGTATTGGG-3’
737-758
X102
5’-ACCTTTAACCTAATCTCC-3’
1764 - 1748
X101
5’-TCTGTGCCTTCTCATCTG-3’
1552 - 1569
CORE2
5’-CCCACCTTATGAGTCCAAGG-3’
2476 - 2457
CORE1
5’-GAGTGTGGATTCGCACTCCTCC-3’
2268 - 2289
R1
5’-TGTAACACGAGCAGGGGTCCTA-3’
201 - 180
1840
1027
924
2109
Sebanyak 50 µl reagensia PCR yang terdiri dari, masing-masing satu pasang
primer forward dan reverse sebanyak 1µl (10 pmol/µl), 4 µl MgCl2 (25mM), 5 µl
dNTPs (10 mM), 1µl Taq Gold Polymerase (5 U/µl), 5 µl PCR Buffer 10X
(500mM KCl, 100mM Tris-HCl (pH 8,3), sampel DNA (10 ul) dan ddH2O
(23ul) dimasukkan ke dalam tabung mikro 200µl dan dihomogenkan
menggunakan vortex.
Amplifikasi DNA dilakukan menggunakan mesin PCR (Perkin Elmer,
Model 9700), melalui beberapa tahapan. Pada tahap awal dilakukan pre-PCR
untuk mengaktifkan enzim polymerase pada suhu 940C selama 10 menit. Tahapan
selanjutnya adalah amplifikasi PCR yang terdiri atas denaturasi sampel pada suhu
940C selama 30 detik, annealing pada suhu 550C selama 30 detik, dan tahap
elongasi pada suhu 720C selama 2 menit. Tahapan ini dilakukan selama 40 kali
dengan siklus yang berulang. Tahap akhir adalah post-PCR dengan suhu 720C
selama 10 menit.
Produk PCR yang telah diamplifikasi tersebut dijalankan pada gel agarosa
2% yang mengandung ethidium bromida 1 µg/ml dalam bufer TAE menggunakan
elektroforesis horizontal. Penanda DNA 1 kb dan produk PCR yang telah
ditambahkan pewarna (loading dye) dimasukkan ke dalam sumur gel. Alat
dokumentasi Gel Doc 2000 (BioRad, USA) digunakan untuk memvisualisasikan
hasil elektroforesis. Sebagai kontrol positif digunakan DNA positif VHB gibbon
(VHBGi), VHB manusia (VHBHu) dan VHB orangutan (VHBOU).
Pemurnian Produk PCR
Pemotongan gel produk PCR dilakukan dengan memotong gel yaitu tepat
pada bagian gel yang memiliki pita yang berpendar saat diradiasi sinar UV.
Potongan
gel hasil amplifikasi kemudian dilakukan pemurnian menggunakan
kit ekstraksi gel QiaQuick (Qiagen, USA). Untuk mendapatkan sekuens
nukleotida, hasil pemurnian produk PCR dilakukan di Macrogen Inc, Korea.
Sekuensing dilakukan baik terhadap produk PCR VHBGi regio Pre-S1 maupun
genom lengkap VHBGi.
Analisa Hasil Sekuensing
Pembacaan hasil sekuensing mengunakan perangkat lunak komputer
BioEdit. Pensejajaran urutan nukleotida dianalisa menggunakan program BLAST
2.0 (BLAST, 2011) dan ClustalW2 (Kumar et al. 2011). Pembuatan pohon
filogenetik menggunakan perangkat lunak komputer MEGA versi 5.0 (Kumar et
al. 2011). Sebagai pembanding dimasukkan urutan nukleotida virus Hepatitis B
asal spesies Gibbon lainnya di luar Indonesia, orangutan, manusia , woolly
monkey, simpanse dan gorilla dari data GeneBank.
Alur Penelitian
Seleksi owa jawa yang terdeteksi positif dari hasil uji serologi HBsAg akan
dilanjutkan dengan uji karakteristik diagnostik cepat melalui PCR dengan primer
daerah Pre-S21 VHB.
Isolat yang memberikan karakteristik spesifik dengan sediaan material DNA
yang memadai maka akan dilakukan karakteristik nukleotida penyusun virus
hepatitis B pada owa jawa secara utuh.
Kemungkinan terjadinya transmisi
VHB secara interspesies maupun
intraspesies pada owa jawa
Sampel darah owa jawa
penangkaran eksitu
owa jawa yang positif secara
uji serologi HBsAg
Rekonstruksi pohon
filogenetik dengan satwa
primata lain
Karakteristik diagnostik cepat
melalui PCR dengan primer
spesifik VHB daerah preS1dari sampel positif serologi
Rekonstruksi pohon
filogenetik dengan manusia
dan satwa primata lain
Karakteristik molekular secara
utuh VHB pada owa jawa
HASIL DAN PEMBAHASAN
Virus Hepatitis B Gibbon Regio Pre-S1
Amplifikasi Virus Hepatitis B Regio Pre-S1
Hasil amplifikasi dari 9 sampel DNA owa jawa yang telah berstatus serologis
positif terhadap antigen virus hepatitis B menggunakan pasangan primer hepSF-1
dan hepSR-out menghasilkan fragmen pita DNA sekitar 459 pasang basa (Tabel
3). Hal ini menunjukkan bahwa ke-9
individu owa jawa tersebut terinfeksi
dengan virus hepatitis B (VHB).
Tabel 3 Hasil pemeriksaan serologis HbsAg (data sekunder) dan hasil PCR
atas regio Pre-S1 dari virus hepatitis B pada owa jawa
No.
ID
HBsAg
1
2
3
4
5
6
7
8
9
A1
A2
A3
A5
A6
A8
A9
C1
C2
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Hasil PCR VHB
regio pre-S1
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Tempat Asal
Satwa
A
A
A
A
A
A
A
B
B
Sebagai pembanding dalam amplifikasi digunakan kontrol positif yang
berasal dari pasien manusia dan orangutan penderita hepatitis B. Gambar 4 dan 5
menunjukkan hasil amplifikasi virus hepatitis B gibbon yang dilalukan pada gel
agarosa menggunakan elektroforesis horizontal. Pada kontrol positif pasien
manusia, terlihat bahwa pita DNA isolat VHB manusia berada di atas pita DNA
dari isolat kontrol positif DNA VHB orangutan maupun sampel penelitian. Posisi
pita isolat kontrol positif VHB orangutan berada di antara pita isolat VHB sampel
dan kontrol positif VHB manusia. Hasil PCR memperlihatkan bahwa ketujuh
(Gambar 4) dan kedua (Gambar 5) sampel DNA owa jawa teramplifikasi dengan
baik menggunakan pasangan primer untuk regio pre-S1 VHB dengan ukuran
sekitar 459 pasang basa.
pb
500
459 pb
300
200
100
1
23 3
4
5
6
7
8
9 10 11 12
Gambar 4 Visualisasi PCR VHB Regio Pre-S1 yang menginfeksi spesies
owa jawa pada lokasi A. (1)Penanda DNA 1kpb, (2) isolat
A1, (3) A2, (4) A3, (5) A5, (6) A6, (7) A8, (8) A9, (9)
kontrol positif VHBGi, (10) kontrol positif VHBHu, (11)
kontrol positif VHBOu
459 pb
500 pb
400 pb
300 pb
200 pb
100 pb
1
2
3
4
5
6
Gambar 5 Visualisasi PCR VHB Regio Pre-S1 yang menginfeksi spesies
owa jawa pada lokasi B.(1) marker DNA 1kbp, (2) isolat C1,
(3) C2, (4) kontrol positif VHBHu, (5) kontrol positif
VHBOu1 dan (6) kontrol positif VHBOu2.
Menurut Warren et.al (1999), dengan menggunakan pasangan primer
hepSF-1 dan hepSR-out, akan menghasilkan amplikon VHB Regio Pre-S1 sebesar
455 pasang basa. Jika mengacu pada hasil sekuensing beberapa sampel yang
dilakukan di Macrogen (Korea), didapatkan bahwa besar masing-masing
amplikon berbeda-beda (Tabel 4). Dengan melakukan pensejajaran sekuens
terhadap semua sekuens isolat sampel VHB menggunakan program ClustalW2
(Larkin MA, et al. 2007) terlihat adanya keragaman pada besar amplikon, hal ini
mungkin disebabkan adanya insersi ataupun delesi nukleotida dari masing-masing
produk PCR. Data sekuen isolat VHB bervariasi antara 457pb, 458pb dan 459 pb,
berbeda dengan target produk yang diharapkan sebesar 455pb.
Tabel 4 Data sekuens produk PCR VHBGi regio Pre-S1
dan situs pemotongan dari enzim restriksi BSt2UI
ID
Besar
amplikon
Hasil
Pemotongan
S