Study of In Vitro Cell Culture and The Role of Rat Leydig Cells Conditioned Medium on Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Differentiation. Supervised
KAJIAN IN VITRO KULTUR SEL DAN CONDITIONED MEDIUM
SEL LEYDIG TIKUS DAN PERANANNYA TERHADAP
DIFERENSIASI STEM CELL MESENKIMAL SUMSUM TULANG
EKAYANTI MULYAWATI KAIIN
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER
INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul Kajian In Vitro
Kultur Sel dan Conditioned Medium Sel Leydig Tikus dan Peranannya Terhadap
Diferensiasi Stem Cell Mesenkimal Sumsum Tulang adalah benar karya saya
dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun
kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip
dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Pebruari 2014
Ekayanti Mulyawati Kaiin
B362080032
RINGKASAN
EKAYANTI MULYAWATI KAIIN. Kajian
In Vitro
Kultur Sel dan
Conditioned Medium Sel Leydig Tikus dan Peranannya Terhadap Diferensiasi
Stem Cell Mesenkimal Sumsum Tulang. Dibimbing oleh MOHAMAD AGUS
SETIADI, TUTY LASWARDI YUSUF dan ITA DJUWITA.
Penggunaan gradien Percoll untuk isolasi sel Leydig dilaporkan dapat
menyebabkan toksisitas pada sel sehingga dapat mengurangi viabilitas dan
perolehan jumlah sel hidup setelah dikultur. Untuk mengatasi permasalahan
tersebut, telah dilakukan penelitian isolasi dan purifikasi sel Leydig dengan
menggunakan gradien non toksik Nycodenz. Penggunaan gradien Nycodenz untuk
isolasi dan purifikasi sel Leydig belum pernah dilakukan oleh peneliti lain. Untuk
memperoleh potensi sel Leydig yang optimum, diperlukan medium yang
mengandung human Chorionic Gonadotrophin (hCG) sebagai induktor sekresi
testosteron oleh sel Leydig. Di samping itu, untuk menghasilkan kondisi
optimum sel Leydig secara in vitro, diperlukan faktor pertumbuhan yang akan
mendukung perkembangannya. Oleh karena itu dalam penelitian ini dilakukan
penambahan hCG dan Insulin Transferrin Selenium (ITS). Conditioned medium
(CM) kultur sel Leydig mengandung berbagai bahan bioaktif yang disekresikan
oleh sel Leydig secara in vitro seperti testosteron dan faktor pertumbuhan. Untuk
itu, penelitian penggunaan conditioned medium sel Leydig sebagai medium kultur
stem cell mesenkimal sumsum tulang dilakukan untuk mengetahui pengaruhnya
terhadap diferensiasi stem cell mesenkimal.
Tahapan penelitian yang dilakukan meliputi :
1.Isolasi dan purifikasi sel Leydig dengan dua perlakuan gradien Nycodenz yaitu:
(I) gradien terdiri dari 3 kolom (5%,10% ,15%) dan (II) gradien terdiri dari 5
kolom (4%, 8%, 10%, 12% ,15%) serta gradien Percoll (21%, 26%, 34% , 40%,
60%) sebagai kontrol.
2. Kultur in vitro sel Leydig hasil purifikasi dengan hasil yang terbaik dari
penelitian tahap 1 (gradien Nycodenz II) dengan penambahan hormon dan
faktor pertumbuhan sebagai berikut: (1) DMEM+NBCS 10% sebagai kontrol,
(2) DMEM+NBCS+hCG 2,5 IU/ml, (3) DMEM+NBCS+ insulin 5 μg/ml,
transferrin, 10 μg/ml, selenium 5 μg/ml (ITS) dan (4) DMEM+NBCS+hCG+
ITS.
3.Penggunaan CM sel Leydig yang telah dianalisis kandungan testosteron dan
proteinnya sebagai medium kultur stem cell mesenkimal sumsum tulang tikus
untuk mengetahui kemampuan CM tersebut dalam mengarahkan diferensiasi.
Hasil penelitian pertama menunjukkan bahwa gradien Nycodenz
menghasilkan tingkat kemurnian dan viabilitas sel yang setara dengan penggunaan
gradien Percoll. Namun demikian, setelah dikultur selama 3 hari, tampak
konsentrasi dan viabilitas sel Leydig hasil purifikasi dengan gradien Nycodenz
lebih tinggi dibandingkan dengan gradien Percoll.
Penambahan kombinasi hCG dan ITS dalam medium DMEM menghasilkan
tingkat proliferasi sel Leydig yang tertinggi (90,64%) dibandingkan dengan hanya
penambahan hCG (86,99%) atau ITS (88,35%), serta kontrol (86,82%).
Kecepatan proliferasi (Population Doubling Time, PDT) sel Leydig kultur
primer pada perlakuan kombinasi hCG dan ITS menunjukkan kecepatan
proliferasi yang paling cepat (0,88 hari) dibandingkan dengan perlakuan lainnya
(ITS 0,97 hari; hCG 1,02 hari; kontrol 1,03 hari). Hasil serupa juga tampak pada
kultur sel Leydig pada galur sel pertama dan kedua.
Hasil analisis testosteron pada medium kultur menunjukkan bahwa
perlakuan kombinasi hCG dan ITS menghasilkan testosteron paling tinggi (5,25
ng/ml) dibandingkan dengan perlakuan lain (hCG 5,06 ng/ml; ITS 3,19 ng/ml;
kontrol 2,46 ng/ml). Dari kedua hasil tersebut mengindikasikan bahwa kombinasi
medium kultur dengan penambahan hCG dan ITS mendukung pertumbuhan dan
produksi testosteron oleh sel Leydig secara in vitro yang lebih baik dibandingkan
dengan kombinasi medium lainnya.
Stem cell mesenkimal sumsum tulang yang dikultur dengan CM sel Leydig
mampu mengarahkan 53,2% sel berdiferensiasi menjadi sel Leydig yang
ditunjukkan dengan reaksi positif terhadap pewarnaan γ -HSD. Penambahan
hCG ke dalam medium kultur stem cell mesenkimal mengandung CM sel Leydig
mampu meningkatkan jumlah sel Leydig menjadi 71,9%. Hal tersebut didukung
pula dengan adanya kandungan testosteron di dalam medium kultur (0,93 ng/ml
dan 10,22 ng/ml).
Hasil pengujian lebih lanjut terhadap CM kultur sel Leydig dengan
perlakuan kombinasi hCG dan ITS memiliki kandungan testosteron (0,71 ng/ml)
dan protein (985,29 µg/ml) yang lebih tinggi dibandingkan dengan perlakuan
lainnya. Di samping itu, conditioned medium kultur sel Leydig pada penelitian ini
menghasilkan pita protein antara berat molekul (BM) mendekati 29 kDa, 62–70
kDa dan 95-130 kDa.
Berdasarkan hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa penggunaan gradien
Nycodenz II efektif untuk melakukan purifikasi sel Leydig. Kombinasi
penambahan ITS dan hCG menghasilkan tingkat proliferasi sel yang lebih baik
dengan PDT yang lebih pendek. Selain itu, diperoleh kandungan testosteron yang
lebih banyak di dalam medium kultur sel Leydig. Penggunaan CM Leydig mampu
mendiferensiasikan stem cell mesenkimal sumsum tulang menjadi sel Leydig
(transdiferensiasi).
Kata kunci: sel Leydig, tikus, Nycodenz, testosteron, stem cell mesenkimal,
sumsum tulang, conditioned medium, transdiferensiasi.
SUMMARY
EKAYANTI MULYAWATI KAIIN. Study of In Vitro Cell Culture and The
Role of Rat Leydig Cells Conditioned Medium on Bone Marrow Mesenchymal
Stem Cells Differentiation. Supervised by MOHAMAD AGUS SETIADI, TUTY
LASWARDI YUSUF and ITA DJUWITA.
The use of Percoll gradients for Leydig cells isolation has been reported to
influence cell toxicity and reduce the viability and the amount of living cells after
culture. To dissolve this problem, study has been carried out used non toxic
Nycodenz gradient to isolated and purified the Leydig cells. The use of
Nycodenz gradient for the isolation and purification of Leydig cells has not
been done by other researchers. To obtain the optimum condition of Leydig cells
production, growth factor is required as supporting factors for development of
growing cells. Therefore, hCG and ITS has been used in this study. Leydig cells
conditioned medium (LCM) contained bioactive materials such as testosterone
and growth factors. The Leydig cells conditioned medium as culture medium for
bone marrow mesenchymal stem cells will be used to determine its influence to
differentiation of cells.
The phase of this study included:
1. Isolation and purification of Leydig cells using Nycodenz gradient : (I) with 3
column ( 5 % , 10 % , 15 % ) and ( II ) with 5 columns ( 4 % , 8 % , 10 % , 12
% , 15 % ) and Percoll gradient ( 21 % , 26 % , 34 % , 40 % , 60 % ) as a
control .
2. In vitro culture of the best result from cell purification was cultured with the
addition of hormones and growth factors : (1) DMEM+NBCS 10% as control,
(2) DMEM + NBCS + 2.5 IU/ml hCG , (3) DMEM + NBCS+ 5 ug / ml insulin,
10 ug/ml transferrin, selenium 5 ug/ml (ITS ) and (4) DMEM +NBCS +
hCG+ITS .
3 . The concentration of testosteron and protein analyzed from Leydig cells
conditioned medium has been used for culturing bone marrow mesenchymal
stem cells.
The result of first phase study was Nycodenz gradient have the same purity
and viability compared with Percoll gradient. After 3 days cultured, in Nycodenz
gradient the concentration and viability of Leydig cells more higher than Percoll
gradient. The combination of hCG and ITS in DMEM produced Leydig cell
proliferation (90.64%) higher compared with hCG (86.99%), ITS (88.35%) and
control (86.82%). Proliferation rate (population doubling time, PDT) from
primary culture using combination of hCG and ITS showed the fastest (0.88 day)
compared with ITS (0.97 day), hCG (1.02 day) and control (1.03 day). The same
result of Leydig cells proliferation rate has also showed in first and second cell
lines. Testosterone consentration analyzed was the highest (5.25 ng/ml) in DMEM
combination with hCG and ITS compared with other treatments (hCG 5.06 ng/ml;
ITS 3.19 ng/ml and control 2.46 ng/ml).
Differentiation to became Leydig cells from bone marrow mesenchymal
stem cells has been known from positive reaction to γ -HSD staining. Added of
hCG to Leydig cells conditioned medium was able to increased the number of
Leydig cells to 71.9%. It was also showed that concentration of testosterone has
been increased (0.93 ng/ml and 10.22 ng/ml) in the culture medium.
The combination of hCG and ITS in DMEM had testosterone (0.71 ng/ml)
and protein concentration (985.29 µg/ml) higher than the other treatments. The
Leydig cell conditioned medium in this study had three protein bands with
molecular weight (MW) approximately to 29 kDa, 62-70 kDa and 95-130 kDa.
Based on these results it could be concluded that the use of Nycodenz
gradient II was effective to purified of Leydig cells. The combination of hCG and
ITS was the best result to increase proliferation and testosterone. Leydig cells
conditioned medium could also to differentiate mesenchymal stem cells into
Leydig cells (transdiferentiation).
Keywords: Leydig cells, rat, Nycodenz, testosterone, mesenchymal stem cells,
bone marrow, conditioned medium, transdiferentiation
Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
KAJIAN IN VITRO KULTUR SEL DAN CONDITIONED MEDIUM
SEL LEYDIG TIKUS DAN PERANANNYA TERHADAP
DIFERENSIASI STEM CELL MESENKIMAL SUMSUM TULANG
EKAYANTI MULYAWATI KAIIN
Disertasi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor
Pada
Program Studi Biologi Reproduksi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Penguji pada Ujian Tertutup: 1. Prof Dr drh Arief Boediono
2. drh Ni Wayan Kurniani Karja, MP, PhD
Penguji pada Ujian Terbuka: 1. Dr Siti Nuramaliati Prijono
2. Dr drh Joko Pamungkas, MSc
PRAKATA
Puji dan syukur kepada Allah Yang Maha Kasih atas segala karunia dan
penyertaan-Nya sehingga penulis menyelesaikan penelitian dan penulisan
disertasi dengan baik. Judul disertasi yang ditulis adalah Kajian In Vitro Kultur
Sel dan Conditioned Medium Sel Leydig
Tikus dan Peranannya Terhadap
Diferensiasi Stem Cell Sumsum Tulang, diajukan sebagai salah satu syarat untuk
menyelesaikan pendidikan Program Doktor pada Program Studi Biologi
Reproduksi, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Ucapan terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya penulis
sampaikan kepada Prof Dr drh Mohamad Agus Setiadi, selaku ketua komisi
pembimbing, Prof Dr drh Tuty Laswardi Yusuf, MS dan Dr drh Ita Djuwita,
M.Phil selaku anggota komisi pembimbing yang dengan penuh ketulusan
memberi arahan dan masukan sejak penyusunan proposal, selama masa penelitian
hingga penulisan disertasi. Ucapan terima kasih disampaikan pula kepada Prof
drh Arief Boediono, PhD dan drh Ni Wayan Kurniani Karja, MP, PhD selaku
penguji luar komisi pada Ujian Tertutup, kepada Dr Siti Nuramaliati Prijono
dan Dr drh Joko Pamungkas, MSc selaku penguji luar komisi pada Ujian Terbuka
atas masukan dan saran perbaikan yang memperkaya isi disertasi ini.
Ucapan terima kasih disampaikan pula kepada Kepala dan Staf
Laboratorium Embriologi, Departemen AFF, Fakultas Kedokteran Hewan IPB :
Prof drh Arief Boediono,PhD, drh Mokhamad Fachrudin, PhD, drh Wahono
Esthi Prasetyaningtyas, M.Si, drh Kusdiantoro Mohamad, M.Si dan Wahyudin,
A.Md yang telah mengijinkan dan mendukung kegiatan penelitian yang telah
dilakukan. Terima kasih juga disampaikan kepada seluruh dosen dan pegawai di
Bagian Reproduksi dan Kebidanan, Departemen KRP, Fakultas Kedokteran
Hewan IPB, juga kepada Dekan dan seluruh staf Sekolah Pascasarjana IPB.
Pada kesempatan ini penulis juga menyampaikan terima kasih kepada Prof
Dr Baharuddin Tappa dan Prof Dr Bambang Prasetya atas ijin dan kesempatan
yang diberikan kepada penulis untuk melanjutkan studi. Terima kasih
disampaikan juga kepada Kepala Bidang Biologi Sel dan Jaringan, Dr Puspita
Lisdiyanti atas segala dukungan dan bantuannya serta kepada Kepala Pusat
Penelitian Bioteknologi LIPI, Dr Witjaksono, MSc. atas ijin yang diberikan.
Kepada rekan-rekan saya, Dr drh Sri Wahyuni, MSi, Dr Tatan Kostaman,
MP, Dr Harry Murti diucapkan terima kasih atas kebersamaan dan
kekompakannya selama studi di IPB. Kepada seluruh rekan mahasiswa S2 dan S3
BRP, Dr Nurcholidah, bu Asri, pa Heri, bu Sri Gustina, pa Hasbi, pa Soni,
mahasiswa S2 APH, mahasiswa S1 lab Embriologi, Devi Syafriani, MSi,
Dr Katrin Roosita, Ria Ceriana, MSi atas hubungan baik dan kerjasamanya.
Terima kasih juga disampaikan kepada rekan Gholib, M.Si, Muhammad
Gunawan, M.Si, Nova Dila Yanthi, M.Si, Tulus Maulana, SPt dan Dr. Asrul M.
Fuad beserta staf yang telah banyak membantu penulis dalam penelitian. Kepada
rekan staf di Laboratorium Reproduksi dan Kultur Sel Hewan Puslit Bioteknologi
LIPI, serta teman-teman lain yang tidak dapat disebutkan satu per satu. Penulis
juga menyampaikan terima kasih kepada rekan Pengurus KSAA-GKP Bogor atas
pengertian dan dukungan doanya.
Akhirnya, karya ini dipersembahkan kepada suami dan anak-anak terkasih
Ir. Harry Prabowo Nikodemus, Sarah Aryka dan Kezia Rachel, yang dengan
penuh pengertian dan senantiasa mendukung penulis di dalam doa. Terima kasih
dan penghargaan yang tak terhingga disampaikan kepada ayahanda Drs. Mulyana
Kaiin, MM (almarhum) dan ibunda Suryati Elia yang telah membesarkan,
mendidik dan senantiasa mendoakan dan mendukung penulis sampai saat ini.
Kepada ibu mertua Etty Madjiah-Nikodemus, adikku Dwiyadi Mulyawan Kaiin,
SE dan seluruh keluarga besar atas dukungan dan doa yang diberikan. Apa yang
telah dicapai pada saat ini kiranya dapat menjadi penyemangat bagi anak-anakku
dan keponakan-keponakanku untuk meraih cita-citanya.
Kiranya kasih Tuhan selalu menyertai kita sekalian.
Semoga disertasi ini dapat memberikan manfaat yang sebesar-besarnya bagi
perkembangan ilmu pengetahuan pada umumnya.
Bogor, Pebruari 2014
Ekayanti Mulyawati Kaiin
DAFTAR ISI
xvii
DAFTAR TABEL
xvii
DAFTAR GAMBAR
xviii
DAFTAR LAMPIRAN
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
Manfaat Penelitian
3
Kerangka Pemikiran
3
KONSENTRASI, KEMURNIAN DAN VIABILITAS SEL LEYDIG
HASIL PURIFIKASI DENGAN GRADIEN NYCODENZ DAN
KULTUR IN VITRO
6
Pendahuluan
7
Materi dan Metode
8
Hasil dan Pembahasan
11
Simpulan
16
OPTIMASI KULTUR IN VITRO DAN ANALISIS TESTOSTERON
PADA MEDIUM
KULTUR
SEL
LEYDIG TIKUS HASIL
18
PURIFIKASI DENGAN GRADIEN NYCODENZ
Pendahuluan
19
Materi dan Metode
20
Hasil dan Pembahasan
23
Simpulan
28
UJI BIOLOGIS CONDITIONED MEDIUM SEL LEYDIG TERHADAP
TRANSDIFERENSIASI STEM SEL MESENKIMAL SUMSUM
TULANG TIKUS DEWASA
30
Pendahuluan
31
Materi dan Metode
33
Hasil dan Pembahasan
37
Simpulan
42
PEMBAHASAN UMUM
45
SIMPULAN DAN SARAN
46
DAFTAR PUSTAKA
48
LAMPIRAN
52
DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Konsentrasi, kemurnian dan viabilitas sel Leydig hasil purifikasi
dengan gradien Nycodenz dan Percoll
Konsentrasi dan viabilitas sel Leydig hasil purifikasi dan dikultur in
vitro selama 3 hari
Kemurnian, viabilitas dan konsentrasi sel Leydig hasil purifikasi
dengan gradien Nycodenz
Kultur primer sel Leydig hasil isolasi dan purifikasi dengan gradien
Nycodenz
Jumlah dan PDT suspensi sel pada kultur in vitro
Kemurnian,viabilitas dan jumlah sel hidup galur sel Leydig
Hasil pengujian testosteron dalam medium kultur sel Leydig
Analisis konsentrasi testosteron dan protein dari conditioned
medium kultur sel Leydig
Kultur in vitro sel mesenkimal sumsum tulang dengan perlakuan
conditioned medium kultur sel Leydig serta analisis konsentrasi
testosteron dan protein di dalam medium kultur
14
15
23
24
25
26
27
38
40
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
Alur kegiatan penelitian
Populasi suspensi sel testiskuler hasil disosiasi jaringan testis tikus
dengan enzim collagenase dan trypsin inhibitor.
Sel Leydig setelah pewarnaan 3β-HSD dan Trypan Blue
Sel Leydig hasil purifikasi dengan beberapa gradien perlakuan
setelah dikultur selama 3 hari
Hasil analisis SDS PAGE terhadap conditioned medium kultur sel
Leydig
Kultur sel mesenkimal sumsum tulang tikus yang diwarnai dengan
pewarnaan histokimia spesifik 3β-HSD
Morfologi sel mesenkimal sumsum tulang yang dikultur secara in
vitro
4
12
13
16
38
40
41
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
Pewarnaan histokimia γ -HSD
Penghitungan Sel Menggunakan Haemositometer (kamar hitung)
Improved Neubaeur
Komposisi medium DPBS serum
Komposisi medium DMEM serum
52
53
54
54
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kehidupan modern dewasa ini menyebabkan tingkat stress yang tinggi,
sehingga menjadi salah satu faktor pemicu berkembangnya berbagai macam
penyakit yang memerlukan penanganan khusus. Berbagai penyakit tersebut dapat
menyerang berbagai organ yang bersifat degeneratif, termasuk kelainan
reproduksi. Salah satu penyakit kelainan reproduksi yang ditakuti oleh laki-laki
adalah rendahnya produksi kadar testosteron, sehingga mengurangi kejantanan
pria. Hal ini karena kekurangan hormon testosteron di dalam tubuh jantan dapat
menghambat proses spermatogenesis (Hardy et al. 1991), sehingga menyebabkan
infertilitas.
Kegagalan reproduksi pada jantan seperti defisiensi hormonal, saat ini
umumnya diatasi dengan cara pemberian suplemen hormon testosteron sintetis,
tetapi terapi tersebut pada manusia dapat menyebabkan resiko jangka panjang
seperti menyebabkan penyakit jantung koroner, retensi cairan, kanker prostat dan
sebagainya (Gruennewald & Matsumoto 2003). Untuk itu, beberapa peneliti telah
melakukan upaya terapi lainnya dengan menggunakan sel Leydig sebagai sumber
sel penghasil hormon testosteron yang dapat ditransplantasikan ke dalam testis.
Penggunaan sel Leydig sebagai terapi alternatif penghasil hormon testosteron
membutuhkan sumber sel Leydig yang akan ditransplantasikan dalam jumlah
yang memadai. Produksi galur (cell line) sel Leydig secara in vitro diharapkan
sebagai upaya tersedianya sumber sel Leydig untuk digunakan dalam
mengembangkan terapi alternatif pada kegagalan reproduksi akibat defisiensi
hormonal.
Isolasi sel Leydig pada umumnya dilakukan menggunakan gradien Percoll,
tetapi diketahui bahwa Percoll dapat dimetabolisme oleh sel Leydig sehingga
dapat menurunkan viabilitas sel Leydig ketika dikultur. Oleh karena itu
diperlukan metoda isolasi dan purifikasi yang lebih baik. Nycodenz merupakan
gradien pemisah yang bersifat non toksik dan tidak dapat diabsorpsi oleh beberapa
jenis sel mammalia serta dapat dengan mudah dihilangkan dari sampel sel
dibandingkan dengan gradien pemisahan lain (Miller 2006).
Diketahui fungsi utama sel Leydig pada testis dewasa adalah memproduksi
testosteron yang diperlukan pada proses spermatogenesis. Pengaturan
spermatogenesis tergantung dari sistem hormon yang kompleks yang secara
langsung memerlukan testosteron. Sekresi testosteron oleh sel Leydig diatur
oleh hormon LH dari hipofisa dan merupakan bagian dari aksis hipotalamushipofisa-testis (Senger 2005, Yang et al. 2003). Sekresi testosteron tersebut tidak
hanya berdasarkan aktivitas sel Leydig pada interstitial tetapi juga berdasarkan
jumlah sel Leydig di dalam testis. Pada mamalia, fungsi sel Leydig melibatkan
dua generasi sel yaitu pertama adalah populasi sel Leydig yang berkembang
selama masa fetus. Sel Leydig pada tahap ini bertanggung jawab terhadap
maskulinisasi sistem urogenital jantan (Habert et al. 2001).
2
Progenitor sel Leydig diduga merupakan stem cell mesenkimal karena
mempunyai morfologi seperti sel yang terdapat pada jaringan ikat yang berasal
dari mesoderm embrio (Hardy et al 1991). Pada tikus, progenitor sel Leydig
mempunyai kemampuan proliferasi tinggi dan menunjukkan marker fungsi
diferensiasi (Ge et al. 2005). Disisi lain hormon LH atau hCG sangat diperlukan
untuk proliferasi dan diferensiasi sel Leydig (Saez 1994) sehingga sel Leydig
mampu memproduksi testosteron. Proliferasi sel Leydig di dalam kultur secara in
vitro memerlukan bahan bioaktif tambahan dan yang umum digunakan adalah
ITS (Insulin Transferrin Sodium Selenite) yang mengandung tiga faktor
pertumbuhan. Selain itu juga berfungsi mengurangi penggunaan serum di dalam
medium kultur.
Sel-sel yang dikultur secara in vitro mampu mensekresikan berbagai bahan
bioaktif seperti faktor pertumbuhan (growth factor) yang bermanfaat bagi
pertumbuhan sel dalam kultur. Kultur sel Leydig diduga mensekresikan berbagai
bahan bioaktif seperti peptida, faktor pertumbuhan, hormon testosteron ke
dalam medium kultur (Chemes et al. 1992, Cudicini et al. 1997, Hu et al. 1998).
Medium tersebut dapat digunakan untuk mengkultur kembali sel Leydig maupun
sel yang lain dan dikenal sebagai conditioned medium. Penggunaan conditioned
medium ditemukan dapat mengarahkan diferensiasi stem cell mesenkimal
menjadi sel tertentu (Djuwita et al. 2010), selain itu stem cell mesenkimal
sumsum tulang belakang yang ditransplantasikan ke dalam testis menyebabkan
sel tersebut berdiferensiasi menjadi sel Leydig (Yazawa et al. 2006).
Berdasarkan beberapa hal yang telah diuraikan di atas, maka perlu
dilakukan penelitian untuk mendapatkan teknik isolasi dan pemurnian sel Leydig
yang mempunyai viabilitas sel setelah kultur yang tinggi sehingga diperoleh
galur sel sebagai sumber sel Leydig, untuk mendapatkan sistem kultur sel Leydig
yang optimum, serta untuk mendapatkan sel Leydig alternatif dari stem cell
mesenkimal yang diferensiasinya diarahkan dengan menggunakan conditioned
medium kultur sel Leydig (transdiferensiasi).
Tujuan Penelitian
1. Menguji efektivitas gradien Nycodenz dalam meningkatkan
konsentrasi, kemurnian dan viabilitas sel Leydig setelah diisolasi,
dipurifikasi dan kultur in vitro.
2. Menguji pengaruh penambahan hCG dan/atau ITS ke dalam medium
DMEM terhadap proliferasi dan perkembangan sel untuk mendapatkan
kondisi optimum kultur in vitro sel Leydig hasil purifikasi dengan
gradien Nycodenz.
3. Mengidentifikasi sekresi testosteron dan protein yang terdapat dalam
conditioned medium (CM) kultur sel Leydig.
4. Memperoleh sel Leydig dari hasil kultur stem cell mesenkimal
sumsum tulang dengan CM kultur sel Leydig.
3
Manfaat Penelitian
Sel Leydig dan CM kultur sel Leydig dapat digunakan untuk aplikasi
terapi reproduksi pada manusia dan hewan terutama hewan yang terancam punah.
Kerangka Pemikiran
Penggunaan gradien Percoll banyak digunakan untuk
melakukan
purifikasi sel Leydig berdasarkan densitas sel. Percoll terdiri dari silica koloid
yang dilapisi oleh polyvinylpyrrolidone (PVP) dan merupakan medium yang
mempunyai partikel dengan diameter 15-30 nm. Keuntungan penggunaan gradien
Percoll adalah untuk memisahkan sel karena mempunyai viskositas, osmolaritas
dan toksisitas yang rendah. Namun penggunaan Percoll untuk mempurifikasi sel
Leydig ditemukan bersifat toksik terhadap sel karena adanya proses pinositosis
sehingga partikel Percoll dapat masuk ke dalam sel Leydig.
Oleh karena itu, diperlukan gradien lainnya yang digunakan untuk
mengatasi masalah toksisitas sel Leydig setelah purifikasi. Di samping itu, gradien
alternatif yang digunakan untuk purifikasi sel Leydig juga harus menghasilkan
kemurnian yang tinggi. Gradien non toksik Nycodenz yang merupakan gradien
non partikel sudah sering digunakan untuk memperoleh berbagai jenis sel.
Nycodenz atau iohexol bersifat non ionik dan non toksik serta tidak
dimetabolisme oleh sel. Lebih lanjut diketahui juga bahwa Nycodenz merupakan
larutan non partikel, sehingga mudah dihilangkan dari medium setelah digunakan
untuk memisahkan sel. Purifikasi sel dengan gradien Nycodenz dilakukan dengan
cara sentrifugasi sehingga sel dengan densitas tertentu akan berada pada
konsentrasi gradien Nycodenz tertentu. Penggunaan gradien Nycodenz untuk
mempurifikasi Leydig diharapkan dapat memperoleh tingkat kemurnian sel
Leydig yang tinggi dan setara dengan penggunaan gradien Percoll.
Kultur sel Leydig yang optimal memerlukan berbagai bahan bioaktif yang
mampu mendukung proliferasi dan perkembangan sel di dalam kultur. Produksi
hormon testosteron oleh sel Leydig diatur oleh hormon gonadotropin yaitu
hormon LH yang diperlukan oleh sel Leydig sebagai induktor untuk memproduksi
testosteron secara in vivo. Di dalam kultur in vitro, penambahan hormon hCG
yang merupakan analog dari LH digunakan untuk menginduksi sel Leydig dalam
memproduksi testosteron. Di samping hormon, diduga bahwa untuk proliferasi
sel diperlukan penambahan faktor pertumbuhan yang dapat mendukung proliferasi
sel dengan baik. Faktor pertumbuhan ITS merupakan faktor yang berperan dalam
proliferasi sel. Untuk itu kajian penambahan hCG atau ITS ke dalam medium
kultur sel Leydig secara in vitro dilakukan untuk dapat meningkatkan
konsentrasi sel serta memperoleh testosteron dan bahan bioaktif lainnya .
Sel Leydig dewasa berasal dari progenitor sel Leydig yang merupakan
stem cell mesenkimal yang terdapat di dalam testis. Untuk pembuktian lebih
4
lanjut tentang kemampuan sekreta bahan bioaktif yang dihasilkan oleh kultur sel
Leydig, maka dilakukan penelitian kemampuan conditioned medium sel Leydig
untuk mengarahkan diferensiasi stem cell mesenkimal sumsum tulang menjadi sel
Leydig. Untuk mencapai hasil di atas, maka dilakukan serangkai penelitian
dalam tiga tahap, yaitu : (1) isolasi dan purifikasi sel Leydig menggunakan
gradien Nycodenz, (2) optimasi medium kultur sel Leydig serta memperoleh
conditioned medium serta galur sel Leydig dan (3) mengkultur stem cell
mesenkimal sumsum tulang dengan conditioned medium sel Leydig untuk
memperoleh sel Leydig (Gambar 1). Sebagai data tambahan juga dilakukan
analisis terhadap kandungan testosteron dan kandungan protein yang terdapat di
dalam conditioned medium sel Leydig.
5
Testis tikus
Tahap pertama
Isolasi dan purifikasi:
Nycodenz I, II dan Percoll
Kemurnian,
konsentrasi dan
viabilitas sel Leydig
Tahap kedua
Sel Leydig
Viabilitas setelah
kultur (3 hari)
Kultur in vitro dengan perlakuan:
1. DMEM+ NBCS 10%
2. DMEM + NBCS 10%+hCG 2,5 IU/ml
3. DMEM + NBCS 10%+ITS
4. DMEM + NBCS 10%+hCG +ITS
Medium Kultur
Optimum
Koleksi conditioned
medium (CM)
Pasase
Population Doubling Time (PDT)
Kemurnian, konsentrasi dan viabilitas galur sel
CML1, CML2, CML3, CML4
Tahap ketiga
ELISA, SDS PAGE, Spektrofotometer
Profil hormon testosteron dan protein CM
Isolasi tibia atau femur
tikus dewasa
Koleksi stem cell
mesenkimal sumsum
tulang
CML 4 (hCG+ITS)
Kultur in vitro:
1.DMEM+NBCS10%
2.DMEM+testosteron 10 ng/ml
3.DMEM+CML 50%
4.DMEM+CML 50%+hCG 2,5 IU/ml
Uji testosteron (ELISA)
Uji protein (spektrofotometer)
Gambar 1. Alur kegiatan penelitian
Deteksi Sel Leydig ??
Pewarnaan γ -HSD
Morfologi
6
KONSENTRASI, KEMURNIAN DAN VIABILITAS SEL
LEYDIG HASIL PURIFIKASI DENGAN GRADIEN
NYCODENZ DAN KULTUR IN VITRO
ABSTRAK
Peran sel Leydig sebagai penghasil hormon testosteron di dalam tubuh
jantan diketahui diperlukan untuk terjadinya proses spermatogenesis. Pada kasus
hipogonadism, terapi transplantasi sel Leydig telah dilakukan. Dengan demikian
penelitian kultur in vitro sel Leydig diperlukan untuk mendukung ketersediaan
sumber sel Leydig yang akan ditransplantasi.
Koleksi sel dari jaringan testis menghasilkan suspensi dengan jenis sel yang
beragam. Untuk mendapatkan sel Leydig diperlukan proses purifikasi dan yang
umum digunakan adalah gradien Percoll, namun dilaporkan bahwa Percoll dapat
dimetabolisme oleh sel Leydig sehingga menyebabkan toksisitas rendah pada sel
yang dapat mempengaruhi viabilitas dan perolehan jumlah sel hidup setelah
dikultur. Untuk mengatasi permasalahan tersebut, telah dilakukan purifikasi
dengan menggunakan gradien Nycodenz yang tidak toksik terhadap sel. Perlakuan
dilakukan dengan gradien Nycodenz I, 3 kolom (5%, 10%, 15%) dan II, 5 kolom
(4%,8%,10%,12%,15%) yang dibandingkan dengan gradien Percoll 5 kolom
(21%, 26%, 34%, 40% dan 60%). Parameter yang diamati adalah konsentrasi,
kemurnian, viabilitas serta jumlah sel Leydig hidup setelah purifikasi dan kultur
in vitro. Hasil menunjukkan bahwa isolasi dan purifikasi sel Leydig dengan
gradien Nycodenz I (85,53%) dan II (91,40%) menghasilkan kemurnian yang
tidak berbeda dibandingkan dengan gradien Percoll (92,22%). Viabilitas sel
Leydig pada Nycodenz I (85,53%) dan Nycodenz II (91,40%) juga tidak berbeda
dibandingkan dengan Percoll (92,22%). Konsentrasi sel yang diperoleh setelah
dipurifikasi menggunakan gradien Nycodenz I (7,12x106sel/ml) dan gradien
Nycodenz II (7,03 x 106sel/ml ) masih rendah (p
SEL LEYDIG TIKUS DAN PERANANNYA TERHADAP
DIFERENSIASI STEM CELL MESENKIMAL SUMSUM TULANG
EKAYANTI MULYAWATI KAIIN
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER
INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul Kajian In Vitro
Kultur Sel dan Conditioned Medium Sel Leydig Tikus dan Peranannya Terhadap
Diferensiasi Stem Cell Mesenkimal Sumsum Tulang adalah benar karya saya
dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun
kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip
dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Pebruari 2014
Ekayanti Mulyawati Kaiin
B362080032
RINGKASAN
EKAYANTI MULYAWATI KAIIN. Kajian
In Vitro
Kultur Sel dan
Conditioned Medium Sel Leydig Tikus dan Peranannya Terhadap Diferensiasi
Stem Cell Mesenkimal Sumsum Tulang. Dibimbing oleh MOHAMAD AGUS
SETIADI, TUTY LASWARDI YUSUF dan ITA DJUWITA.
Penggunaan gradien Percoll untuk isolasi sel Leydig dilaporkan dapat
menyebabkan toksisitas pada sel sehingga dapat mengurangi viabilitas dan
perolehan jumlah sel hidup setelah dikultur. Untuk mengatasi permasalahan
tersebut, telah dilakukan penelitian isolasi dan purifikasi sel Leydig dengan
menggunakan gradien non toksik Nycodenz. Penggunaan gradien Nycodenz untuk
isolasi dan purifikasi sel Leydig belum pernah dilakukan oleh peneliti lain. Untuk
memperoleh potensi sel Leydig yang optimum, diperlukan medium yang
mengandung human Chorionic Gonadotrophin (hCG) sebagai induktor sekresi
testosteron oleh sel Leydig. Di samping itu, untuk menghasilkan kondisi
optimum sel Leydig secara in vitro, diperlukan faktor pertumbuhan yang akan
mendukung perkembangannya. Oleh karena itu dalam penelitian ini dilakukan
penambahan hCG dan Insulin Transferrin Selenium (ITS). Conditioned medium
(CM) kultur sel Leydig mengandung berbagai bahan bioaktif yang disekresikan
oleh sel Leydig secara in vitro seperti testosteron dan faktor pertumbuhan. Untuk
itu, penelitian penggunaan conditioned medium sel Leydig sebagai medium kultur
stem cell mesenkimal sumsum tulang dilakukan untuk mengetahui pengaruhnya
terhadap diferensiasi stem cell mesenkimal.
Tahapan penelitian yang dilakukan meliputi :
1.Isolasi dan purifikasi sel Leydig dengan dua perlakuan gradien Nycodenz yaitu:
(I) gradien terdiri dari 3 kolom (5%,10% ,15%) dan (II) gradien terdiri dari 5
kolom (4%, 8%, 10%, 12% ,15%) serta gradien Percoll (21%, 26%, 34% , 40%,
60%) sebagai kontrol.
2. Kultur in vitro sel Leydig hasil purifikasi dengan hasil yang terbaik dari
penelitian tahap 1 (gradien Nycodenz II) dengan penambahan hormon dan
faktor pertumbuhan sebagai berikut: (1) DMEM+NBCS 10% sebagai kontrol,
(2) DMEM+NBCS+hCG 2,5 IU/ml, (3) DMEM+NBCS+ insulin 5 μg/ml,
transferrin, 10 μg/ml, selenium 5 μg/ml (ITS) dan (4) DMEM+NBCS+hCG+
ITS.
3.Penggunaan CM sel Leydig yang telah dianalisis kandungan testosteron dan
proteinnya sebagai medium kultur stem cell mesenkimal sumsum tulang tikus
untuk mengetahui kemampuan CM tersebut dalam mengarahkan diferensiasi.
Hasil penelitian pertama menunjukkan bahwa gradien Nycodenz
menghasilkan tingkat kemurnian dan viabilitas sel yang setara dengan penggunaan
gradien Percoll. Namun demikian, setelah dikultur selama 3 hari, tampak
konsentrasi dan viabilitas sel Leydig hasil purifikasi dengan gradien Nycodenz
lebih tinggi dibandingkan dengan gradien Percoll.
Penambahan kombinasi hCG dan ITS dalam medium DMEM menghasilkan
tingkat proliferasi sel Leydig yang tertinggi (90,64%) dibandingkan dengan hanya
penambahan hCG (86,99%) atau ITS (88,35%), serta kontrol (86,82%).
Kecepatan proliferasi (Population Doubling Time, PDT) sel Leydig kultur
primer pada perlakuan kombinasi hCG dan ITS menunjukkan kecepatan
proliferasi yang paling cepat (0,88 hari) dibandingkan dengan perlakuan lainnya
(ITS 0,97 hari; hCG 1,02 hari; kontrol 1,03 hari). Hasil serupa juga tampak pada
kultur sel Leydig pada galur sel pertama dan kedua.
Hasil analisis testosteron pada medium kultur menunjukkan bahwa
perlakuan kombinasi hCG dan ITS menghasilkan testosteron paling tinggi (5,25
ng/ml) dibandingkan dengan perlakuan lain (hCG 5,06 ng/ml; ITS 3,19 ng/ml;
kontrol 2,46 ng/ml). Dari kedua hasil tersebut mengindikasikan bahwa kombinasi
medium kultur dengan penambahan hCG dan ITS mendukung pertumbuhan dan
produksi testosteron oleh sel Leydig secara in vitro yang lebih baik dibandingkan
dengan kombinasi medium lainnya.
Stem cell mesenkimal sumsum tulang yang dikultur dengan CM sel Leydig
mampu mengarahkan 53,2% sel berdiferensiasi menjadi sel Leydig yang
ditunjukkan dengan reaksi positif terhadap pewarnaan γ -HSD. Penambahan
hCG ke dalam medium kultur stem cell mesenkimal mengandung CM sel Leydig
mampu meningkatkan jumlah sel Leydig menjadi 71,9%. Hal tersebut didukung
pula dengan adanya kandungan testosteron di dalam medium kultur (0,93 ng/ml
dan 10,22 ng/ml).
Hasil pengujian lebih lanjut terhadap CM kultur sel Leydig dengan
perlakuan kombinasi hCG dan ITS memiliki kandungan testosteron (0,71 ng/ml)
dan protein (985,29 µg/ml) yang lebih tinggi dibandingkan dengan perlakuan
lainnya. Di samping itu, conditioned medium kultur sel Leydig pada penelitian ini
menghasilkan pita protein antara berat molekul (BM) mendekati 29 kDa, 62–70
kDa dan 95-130 kDa.
Berdasarkan hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa penggunaan gradien
Nycodenz II efektif untuk melakukan purifikasi sel Leydig. Kombinasi
penambahan ITS dan hCG menghasilkan tingkat proliferasi sel yang lebih baik
dengan PDT yang lebih pendek. Selain itu, diperoleh kandungan testosteron yang
lebih banyak di dalam medium kultur sel Leydig. Penggunaan CM Leydig mampu
mendiferensiasikan stem cell mesenkimal sumsum tulang menjadi sel Leydig
(transdiferensiasi).
Kata kunci: sel Leydig, tikus, Nycodenz, testosteron, stem cell mesenkimal,
sumsum tulang, conditioned medium, transdiferensiasi.
SUMMARY
EKAYANTI MULYAWATI KAIIN. Study of In Vitro Cell Culture and The
Role of Rat Leydig Cells Conditioned Medium on Bone Marrow Mesenchymal
Stem Cells Differentiation. Supervised by MOHAMAD AGUS SETIADI, TUTY
LASWARDI YUSUF and ITA DJUWITA.
The use of Percoll gradients for Leydig cells isolation has been reported to
influence cell toxicity and reduce the viability and the amount of living cells after
culture. To dissolve this problem, study has been carried out used non toxic
Nycodenz gradient to isolated and purified the Leydig cells. The use of
Nycodenz gradient for the isolation and purification of Leydig cells has not
been done by other researchers. To obtain the optimum condition of Leydig cells
production, growth factor is required as supporting factors for development of
growing cells. Therefore, hCG and ITS has been used in this study. Leydig cells
conditioned medium (LCM) contained bioactive materials such as testosterone
and growth factors. The Leydig cells conditioned medium as culture medium for
bone marrow mesenchymal stem cells will be used to determine its influence to
differentiation of cells.
The phase of this study included:
1. Isolation and purification of Leydig cells using Nycodenz gradient : (I) with 3
column ( 5 % , 10 % , 15 % ) and ( II ) with 5 columns ( 4 % , 8 % , 10 % , 12
% , 15 % ) and Percoll gradient ( 21 % , 26 % , 34 % , 40 % , 60 % ) as a
control .
2. In vitro culture of the best result from cell purification was cultured with the
addition of hormones and growth factors : (1) DMEM+NBCS 10% as control,
(2) DMEM + NBCS + 2.5 IU/ml hCG , (3) DMEM + NBCS+ 5 ug / ml insulin,
10 ug/ml transferrin, selenium 5 ug/ml (ITS ) and (4) DMEM +NBCS +
hCG+ITS .
3 . The concentration of testosteron and protein analyzed from Leydig cells
conditioned medium has been used for culturing bone marrow mesenchymal
stem cells.
The result of first phase study was Nycodenz gradient have the same purity
and viability compared with Percoll gradient. After 3 days cultured, in Nycodenz
gradient the concentration and viability of Leydig cells more higher than Percoll
gradient. The combination of hCG and ITS in DMEM produced Leydig cell
proliferation (90.64%) higher compared with hCG (86.99%), ITS (88.35%) and
control (86.82%). Proliferation rate (population doubling time, PDT) from
primary culture using combination of hCG and ITS showed the fastest (0.88 day)
compared with ITS (0.97 day), hCG (1.02 day) and control (1.03 day). The same
result of Leydig cells proliferation rate has also showed in first and second cell
lines. Testosterone consentration analyzed was the highest (5.25 ng/ml) in DMEM
combination with hCG and ITS compared with other treatments (hCG 5.06 ng/ml;
ITS 3.19 ng/ml and control 2.46 ng/ml).
Differentiation to became Leydig cells from bone marrow mesenchymal
stem cells has been known from positive reaction to γ -HSD staining. Added of
hCG to Leydig cells conditioned medium was able to increased the number of
Leydig cells to 71.9%. It was also showed that concentration of testosterone has
been increased (0.93 ng/ml and 10.22 ng/ml) in the culture medium.
The combination of hCG and ITS in DMEM had testosterone (0.71 ng/ml)
and protein concentration (985.29 µg/ml) higher than the other treatments. The
Leydig cell conditioned medium in this study had three protein bands with
molecular weight (MW) approximately to 29 kDa, 62-70 kDa and 95-130 kDa.
Based on these results it could be concluded that the use of Nycodenz
gradient II was effective to purified of Leydig cells. The combination of hCG and
ITS was the best result to increase proliferation and testosterone. Leydig cells
conditioned medium could also to differentiate mesenchymal stem cells into
Leydig cells (transdiferentiation).
Keywords: Leydig cells, rat, Nycodenz, testosterone, mesenchymal stem cells,
bone marrow, conditioned medium, transdiferentiation
Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
KAJIAN IN VITRO KULTUR SEL DAN CONDITIONED MEDIUM
SEL LEYDIG TIKUS DAN PERANANNYA TERHADAP
DIFERENSIASI STEM CELL MESENKIMAL SUMSUM TULANG
EKAYANTI MULYAWATI KAIIN
Disertasi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor
Pada
Program Studi Biologi Reproduksi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Penguji pada Ujian Tertutup: 1. Prof Dr drh Arief Boediono
2. drh Ni Wayan Kurniani Karja, MP, PhD
Penguji pada Ujian Terbuka: 1. Dr Siti Nuramaliati Prijono
2. Dr drh Joko Pamungkas, MSc
PRAKATA
Puji dan syukur kepada Allah Yang Maha Kasih atas segala karunia dan
penyertaan-Nya sehingga penulis menyelesaikan penelitian dan penulisan
disertasi dengan baik. Judul disertasi yang ditulis adalah Kajian In Vitro Kultur
Sel dan Conditioned Medium Sel Leydig
Tikus dan Peranannya Terhadap
Diferensiasi Stem Cell Sumsum Tulang, diajukan sebagai salah satu syarat untuk
menyelesaikan pendidikan Program Doktor pada Program Studi Biologi
Reproduksi, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Ucapan terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya penulis
sampaikan kepada Prof Dr drh Mohamad Agus Setiadi, selaku ketua komisi
pembimbing, Prof Dr drh Tuty Laswardi Yusuf, MS dan Dr drh Ita Djuwita,
M.Phil selaku anggota komisi pembimbing yang dengan penuh ketulusan
memberi arahan dan masukan sejak penyusunan proposal, selama masa penelitian
hingga penulisan disertasi. Ucapan terima kasih disampaikan pula kepada Prof
drh Arief Boediono, PhD dan drh Ni Wayan Kurniani Karja, MP, PhD selaku
penguji luar komisi pada Ujian Tertutup, kepada Dr Siti Nuramaliati Prijono
dan Dr drh Joko Pamungkas, MSc selaku penguji luar komisi pada Ujian Terbuka
atas masukan dan saran perbaikan yang memperkaya isi disertasi ini.
Ucapan terima kasih disampaikan pula kepada Kepala dan Staf
Laboratorium Embriologi, Departemen AFF, Fakultas Kedokteran Hewan IPB :
Prof drh Arief Boediono,PhD, drh Mokhamad Fachrudin, PhD, drh Wahono
Esthi Prasetyaningtyas, M.Si, drh Kusdiantoro Mohamad, M.Si dan Wahyudin,
A.Md yang telah mengijinkan dan mendukung kegiatan penelitian yang telah
dilakukan. Terima kasih juga disampaikan kepada seluruh dosen dan pegawai di
Bagian Reproduksi dan Kebidanan, Departemen KRP, Fakultas Kedokteran
Hewan IPB, juga kepada Dekan dan seluruh staf Sekolah Pascasarjana IPB.
Pada kesempatan ini penulis juga menyampaikan terima kasih kepada Prof
Dr Baharuddin Tappa dan Prof Dr Bambang Prasetya atas ijin dan kesempatan
yang diberikan kepada penulis untuk melanjutkan studi. Terima kasih
disampaikan juga kepada Kepala Bidang Biologi Sel dan Jaringan, Dr Puspita
Lisdiyanti atas segala dukungan dan bantuannya serta kepada Kepala Pusat
Penelitian Bioteknologi LIPI, Dr Witjaksono, MSc. atas ijin yang diberikan.
Kepada rekan-rekan saya, Dr drh Sri Wahyuni, MSi, Dr Tatan Kostaman,
MP, Dr Harry Murti diucapkan terima kasih atas kebersamaan dan
kekompakannya selama studi di IPB. Kepada seluruh rekan mahasiswa S2 dan S3
BRP, Dr Nurcholidah, bu Asri, pa Heri, bu Sri Gustina, pa Hasbi, pa Soni,
mahasiswa S2 APH, mahasiswa S1 lab Embriologi, Devi Syafriani, MSi,
Dr Katrin Roosita, Ria Ceriana, MSi atas hubungan baik dan kerjasamanya.
Terima kasih juga disampaikan kepada rekan Gholib, M.Si, Muhammad
Gunawan, M.Si, Nova Dila Yanthi, M.Si, Tulus Maulana, SPt dan Dr. Asrul M.
Fuad beserta staf yang telah banyak membantu penulis dalam penelitian. Kepada
rekan staf di Laboratorium Reproduksi dan Kultur Sel Hewan Puslit Bioteknologi
LIPI, serta teman-teman lain yang tidak dapat disebutkan satu per satu. Penulis
juga menyampaikan terima kasih kepada rekan Pengurus KSAA-GKP Bogor atas
pengertian dan dukungan doanya.
Akhirnya, karya ini dipersembahkan kepada suami dan anak-anak terkasih
Ir. Harry Prabowo Nikodemus, Sarah Aryka dan Kezia Rachel, yang dengan
penuh pengertian dan senantiasa mendukung penulis di dalam doa. Terima kasih
dan penghargaan yang tak terhingga disampaikan kepada ayahanda Drs. Mulyana
Kaiin, MM (almarhum) dan ibunda Suryati Elia yang telah membesarkan,
mendidik dan senantiasa mendoakan dan mendukung penulis sampai saat ini.
Kepada ibu mertua Etty Madjiah-Nikodemus, adikku Dwiyadi Mulyawan Kaiin,
SE dan seluruh keluarga besar atas dukungan dan doa yang diberikan. Apa yang
telah dicapai pada saat ini kiranya dapat menjadi penyemangat bagi anak-anakku
dan keponakan-keponakanku untuk meraih cita-citanya.
Kiranya kasih Tuhan selalu menyertai kita sekalian.
Semoga disertasi ini dapat memberikan manfaat yang sebesar-besarnya bagi
perkembangan ilmu pengetahuan pada umumnya.
Bogor, Pebruari 2014
Ekayanti Mulyawati Kaiin
DAFTAR ISI
xvii
DAFTAR TABEL
xvii
DAFTAR GAMBAR
xviii
DAFTAR LAMPIRAN
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
Manfaat Penelitian
3
Kerangka Pemikiran
3
KONSENTRASI, KEMURNIAN DAN VIABILITAS SEL LEYDIG
HASIL PURIFIKASI DENGAN GRADIEN NYCODENZ DAN
KULTUR IN VITRO
6
Pendahuluan
7
Materi dan Metode
8
Hasil dan Pembahasan
11
Simpulan
16
OPTIMASI KULTUR IN VITRO DAN ANALISIS TESTOSTERON
PADA MEDIUM
KULTUR
SEL
LEYDIG TIKUS HASIL
18
PURIFIKASI DENGAN GRADIEN NYCODENZ
Pendahuluan
19
Materi dan Metode
20
Hasil dan Pembahasan
23
Simpulan
28
UJI BIOLOGIS CONDITIONED MEDIUM SEL LEYDIG TERHADAP
TRANSDIFERENSIASI STEM SEL MESENKIMAL SUMSUM
TULANG TIKUS DEWASA
30
Pendahuluan
31
Materi dan Metode
33
Hasil dan Pembahasan
37
Simpulan
42
PEMBAHASAN UMUM
45
SIMPULAN DAN SARAN
46
DAFTAR PUSTAKA
48
LAMPIRAN
52
DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Konsentrasi, kemurnian dan viabilitas sel Leydig hasil purifikasi
dengan gradien Nycodenz dan Percoll
Konsentrasi dan viabilitas sel Leydig hasil purifikasi dan dikultur in
vitro selama 3 hari
Kemurnian, viabilitas dan konsentrasi sel Leydig hasil purifikasi
dengan gradien Nycodenz
Kultur primer sel Leydig hasil isolasi dan purifikasi dengan gradien
Nycodenz
Jumlah dan PDT suspensi sel pada kultur in vitro
Kemurnian,viabilitas dan jumlah sel hidup galur sel Leydig
Hasil pengujian testosteron dalam medium kultur sel Leydig
Analisis konsentrasi testosteron dan protein dari conditioned
medium kultur sel Leydig
Kultur in vitro sel mesenkimal sumsum tulang dengan perlakuan
conditioned medium kultur sel Leydig serta analisis konsentrasi
testosteron dan protein di dalam medium kultur
14
15
23
24
25
26
27
38
40
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
Alur kegiatan penelitian
Populasi suspensi sel testiskuler hasil disosiasi jaringan testis tikus
dengan enzim collagenase dan trypsin inhibitor.
Sel Leydig setelah pewarnaan 3β-HSD dan Trypan Blue
Sel Leydig hasil purifikasi dengan beberapa gradien perlakuan
setelah dikultur selama 3 hari
Hasil analisis SDS PAGE terhadap conditioned medium kultur sel
Leydig
Kultur sel mesenkimal sumsum tulang tikus yang diwarnai dengan
pewarnaan histokimia spesifik 3β-HSD
Morfologi sel mesenkimal sumsum tulang yang dikultur secara in
vitro
4
12
13
16
38
40
41
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
Pewarnaan histokimia γ -HSD
Penghitungan Sel Menggunakan Haemositometer (kamar hitung)
Improved Neubaeur
Komposisi medium DPBS serum
Komposisi medium DMEM serum
52
53
54
54
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kehidupan modern dewasa ini menyebabkan tingkat stress yang tinggi,
sehingga menjadi salah satu faktor pemicu berkembangnya berbagai macam
penyakit yang memerlukan penanganan khusus. Berbagai penyakit tersebut dapat
menyerang berbagai organ yang bersifat degeneratif, termasuk kelainan
reproduksi. Salah satu penyakit kelainan reproduksi yang ditakuti oleh laki-laki
adalah rendahnya produksi kadar testosteron, sehingga mengurangi kejantanan
pria. Hal ini karena kekurangan hormon testosteron di dalam tubuh jantan dapat
menghambat proses spermatogenesis (Hardy et al. 1991), sehingga menyebabkan
infertilitas.
Kegagalan reproduksi pada jantan seperti defisiensi hormonal, saat ini
umumnya diatasi dengan cara pemberian suplemen hormon testosteron sintetis,
tetapi terapi tersebut pada manusia dapat menyebabkan resiko jangka panjang
seperti menyebabkan penyakit jantung koroner, retensi cairan, kanker prostat dan
sebagainya (Gruennewald & Matsumoto 2003). Untuk itu, beberapa peneliti telah
melakukan upaya terapi lainnya dengan menggunakan sel Leydig sebagai sumber
sel penghasil hormon testosteron yang dapat ditransplantasikan ke dalam testis.
Penggunaan sel Leydig sebagai terapi alternatif penghasil hormon testosteron
membutuhkan sumber sel Leydig yang akan ditransplantasikan dalam jumlah
yang memadai. Produksi galur (cell line) sel Leydig secara in vitro diharapkan
sebagai upaya tersedianya sumber sel Leydig untuk digunakan dalam
mengembangkan terapi alternatif pada kegagalan reproduksi akibat defisiensi
hormonal.
Isolasi sel Leydig pada umumnya dilakukan menggunakan gradien Percoll,
tetapi diketahui bahwa Percoll dapat dimetabolisme oleh sel Leydig sehingga
dapat menurunkan viabilitas sel Leydig ketika dikultur. Oleh karena itu
diperlukan metoda isolasi dan purifikasi yang lebih baik. Nycodenz merupakan
gradien pemisah yang bersifat non toksik dan tidak dapat diabsorpsi oleh beberapa
jenis sel mammalia serta dapat dengan mudah dihilangkan dari sampel sel
dibandingkan dengan gradien pemisahan lain (Miller 2006).
Diketahui fungsi utama sel Leydig pada testis dewasa adalah memproduksi
testosteron yang diperlukan pada proses spermatogenesis. Pengaturan
spermatogenesis tergantung dari sistem hormon yang kompleks yang secara
langsung memerlukan testosteron. Sekresi testosteron oleh sel Leydig diatur
oleh hormon LH dari hipofisa dan merupakan bagian dari aksis hipotalamushipofisa-testis (Senger 2005, Yang et al. 2003). Sekresi testosteron tersebut tidak
hanya berdasarkan aktivitas sel Leydig pada interstitial tetapi juga berdasarkan
jumlah sel Leydig di dalam testis. Pada mamalia, fungsi sel Leydig melibatkan
dua generasi sel yaitu pertama adalah populasi sel Leydig yang berkembang
selama masa fetus. Sel Leydig pada tahap ini bertanggung jawab terhadap
maskulinisasi sistem urogenital jantan (Habert et al. 2001).
2
Progenitor sel Leydig diduga merupakan stem cell mesenkimal karena
mempunyai morfologi seperti sel yang terdapat pada jaringan ikat yang berasal
dari mesoderm embrio (Hardy et al 1991). Pada tikus, progenitor sel Leydig
mempunyai kemampuan proliferasi tinggi dan menunjukkan marker fungsi
diferensiasi (Ge et al. 2005). Disisi lain hormon LH atau hCG sangat diperlukan
untuk proliferasi dan diferensiasi sel Leydig (Saez 1994) sehingga sel Leydig
mampu memproduksi testosteron. Proliferasi sel Leydig di dalam kultur secara in
vitro memerlukan bahan bioaktif tambahan dan yang umum digunakan adalah
ITS (Insulin Transferrin Sodium Selenite) yang mengandung tiga faktor
pertumbuhan. Selain itu juga berfungsi mengurangi penggunaan serum di dalam
medium kultur.
Sel-sel yang dikultur secara in vitro mampu mensekresikan berbagai bahan
bioaktif seperti faktor pertumbuhan (growth factor) yang bermanfaat bagi
pertumbuhan sel dalam kultur. Kultur sel Leydig diduga mensekresikan berbagai
bahan bioaktif seperti peptida, faktor pertumbuhan, hormon testosteron ke
dalam medium kultur (Chemes et al. 1992, Cudicini et al. 1997, Hu et al. 1998).
Medium tersebut dapat digunakan untuk mengkultur kembali sel Leydig maupun
sel yang lain dan dikenal sebagai conditioned medium. Penggunaan conditioned
medium ditemukan dapat mengarahkan diferensiasi stem cell mesenkimal
menjadi sel tertentu (Djuwita et al. 2010), selain itu stem cell mesenkimal
sumsum tulang belakang yang ditransplantasikan ke dalam testis menyebabkan
sel tersebut berdiferensiasi menjadi sel Leydig (Yazawa et al. 2006).
Berdasarkan beberapa hal yang telah diuraikan di atas, maka perlu
dilakukan penelitian untuk mendapatkan teknik isolasi dan pemurnian sel Leydig
yang mempunyai viabilitas sel setelah kultur yang tinggi sehingga diperoleh
galur sel sebagai sumber sel Leydig, untuk mendapatkan sistem kultur sel Leydig
yang optimum, serta untuk mendapatkan sel Leydig alternatif dari stem cell
mesenkimal yang diferensiasinya diarahkan dengan menggunakan conditioned
medium kultur sel Leydig (transdiferensiasi).
Tujuan Penelitian
1. Menguji efektivitas gradien Nycodenz dalam meningkatkan
konsentrasi, kemurnian dan viabilitas sel Leydig setelah diisolasi,
dipurifikasi dan kultur in vitro.
2. Menguji pengaruh penambahan hCG dan/atau ITS ke dalam medium
DMEM terhadap proliferasi dan perkembangan sel untuk mendapatkan
kondisi optimum kultur in vitro sel Leydig hasil purifikasi dengan
gradien Nycodenz.
3. Mengidentifikasi sekresi testosteron dan protein yang terdapat dalam
conditioned medium (CM) kultur sel Leydig.
4. Memperoleh sel Leydig dari hasil kultur stem cell mesenkimal
sumsum tulang dengan CM kultur sel Leydig.
3
Manfaat Penelitian
Sel Leydig dan CM kultur sel Leydig dapat digunakan untuk aplikasi
terapi reproduksi pada manusia dan hewan terutama hewan yang terancam punah.
Kerangka Pemikiran
Penggunaan gradien Percoll banyak digunakan untuk
melakukan
purifikasi sel Leydig berdasarkan densitas sel. Percoll terdiri dari silica koloid
yang dilapisi oleh polyvinylpyrrolidone (PVP) dan merupakan medium yang
mempunyai partikel dengan diameter 15-30 nm. Keuntungan penggunaan gradien
Percoll adalah untuk memisahkan sel karena mempunyai viskositas, osmolaritas
dan toksisitas yang rendah. Namun penggunaan Percoll untuk mempurifikasi sel
Leydig ditemukan bersifat toksik terhadap sel karena adanya proses pinositosis
sehingga partikel Percoll dapat masuk ke dalam sel Leydig.
Oleh karena itu, diperlukan gradien lainnya yang digunakan untuk
mengatasi masalah toksisitas sel Leydig setelah purifikasi. Di samping itu, gradien
alternatif yang digunakan untuk purifikasi sel Leydig juga harus menghasilkan
kemurnian yang tinggi. Gradien non toksik Nycodenz yang merupakan gradien
non partikel sudah sering digunakan untuk memperoleh berbagai jenis sel.
Nycodenz atau iohexol bersifat non ionik dan non toksik serta tidak
dimetabolisme oleh sel. Lebih lanjut diketahui juga bahwa Nycodenz merupakan
larutan non partikel, sehingga mudah dihilangkan dari medium setelah digunakan
untuk memisahkan sel. Purifikasi sel dengan gradien Nycodenz dilakukan dengan
cara sentrifugasi sehingga sel dengan densitas tertentu akan berada pada
konsentrasi gradien Nycodenz tertentu. Penggunaan gradien Nycodenz untuk
mempurifikasi Leydig diharapkan dapat memperoleh tingkat kemurnian sel
Leydig yang tinggi dan setara dengan penggunaan gradien Percoll.
Kultur sel Leydig yang optimal memerlukan berbagai bahan bioaktif yang
mampu mendukung proliferasi dan perkembangan sel di dalam kultur. Produksi
hormon testosteron oleh sel Leydig diatur oleh hormon gonadotropin yaitu
hormon LH yang diperlukan oleh sel Leydig sebagai induktor untuk memproduksi
testosteron secara in vivo. Di dalam kultur in vitro, penambahan hormon hCG
yang merupakan analog dari LH digunakan untuk menginduksi sel Leydig dalam
memproduksi testosteron. Di samping hormon, diduga bahwa untuk proliferasi
sel diperlukan penambahan faktor pertumbuhan yang dapat mendukung proliferasi
sel dengan baik. Faktor pertumbuhan ITS merupakan faktor yang berperan dalam
proliferasi sel. Untuk itu kajian penambahan hCG atau ITS ke dalam medium
kultur sel Leydig secara in vitro dilakukan untuk dapat meningkatkan
konsentrasi sel serta memperoleh testosteron dan bahan bioaktif lainnya .
Sel Leydig dewasa berasal dari progenitor sel Leydig yang merupakan
stem cell mesenkimal yang terdapat di dalam testis. Untuk pembuktian lebih
4
lanjut tentang kemampuan sekreta bahan bioaktif yang dihasilkan oleh kultur sel
Leydig, maka dilakukan penelitian kemampuan conditioned medium sel Leydig
untuk mengarahkan diferensiasi stem cell mesenkimal sumsum tulang menjadi sel
Leydig. Untuk mencapai hasil di atas, maka dilakukan serangkai penelitian
dalam tiga tahap, yaitu : (1) isolasi dan purifikasi sel Leydig menggunakan
gradien Nycodenz, (2) optimasi medium kultur sel Leydig serta memperoleh
conditioned medium serta galur sel Leydig dan (3) mengkultur stem cell
mesenkimal sumsum tulang dengan conditioned medium sel Leydig untuk
memperoleh sel Leydig (Gambar 1). Sebagai data tambahan juga dilakukan
analisis terhadap kandungan testosteron dan kandungan protein yang terdapat di
dalam conditioned medium sel Leydig.
5
Testis tikus
Tahap pertama
Isolasi dan purifikasi:
Nycodenz I, II dan Percoll
Kemurnian,
konsentrasi dan
viabilitas sel Leydig
Tahap kedua
Sel Leydig
Viabilitas setelah
kultur (3 hari)
Kultur in vitro dengan perlakuan:
1. DMEM+ NBCS 10%
2. DMEM + NBCS 10%+hCG 2,5 IU/ml
3. DMEM + NBCS 10%+ITS
4. DMEM + NBCS 10%+hCG +ITS
Medium Kultur
Optimum
Koleksi conditioned
medium (CM)
Pasase
Population Doubling Time (PDT)
Kemurnian, konsentrasi dan viabilitas galur sel
CML1, CML2, CML3, CML4
Tahap ketiga
ELISA, SDS PAGE, Spektrofotometer
Profil hormon testosteron dan protein CM
Isolasi tibia atau femur
tikus dewasa
Koleksi stem cell
mesenkimal sumsum
tulang
CML 4 (hCG+ITS)
Kultur in vitro:
1.DMEM+NBCS10%
2.DMEM+testosteron 10 ng/ml
3.DMEM+CML 50%
4.DMEM+CML 50%+hCG 2,5 IU/ml
Uji testosteron (ELISA)
Uji protein (spektrofotometer)
Gambar 1. Alur kegiatan penelitian
Deteksi Sel Leydig ??
Pewarnaan γ -HSD
Morfologi
6
KONSENTRASI, KEMURNIAN DAN VIABILITAS SEL
LEYDIG HASIL PURIFIKASI DENGAN GRADIEN
NYCODENZ DAN KULTUR IN VITRO
ABSTRAK
Peran sel Leydig sebagai penghasil hormon testosteron di dalam tubuh
jantan diketahui diperlukan untuk terjadinya proses spermatogenesis. Pada kasus
hipogonadism, terapi transplantasi sel Leydig telah dilakukan. Dengan demikian
penelitian kultur in vitro sel Leydig diperlukan untuk mendukung ketersediaan
sumber sel Leydig yang akan ditransplantasi.
Koleksi sel dari jaringan testis menghasilkan suspensi dengan jenis sel yang
beragam. Untuk mendapatkan sel Leydig diperlukan proses purifikasi dan yang
umum digunakan adalah gradien Percoll, namun dilaporkan bahwa Percoll dapat
dimetabolisme oleh sel Leydig sehingga menyebabkan toksisitas rendah pada sel
yang dapat mempengaruhi viabilitas dan perolehan jumlah sel hidup setelah
dikultur. Untuk mengatasi permasalahan tersebut, telah dilakukan purifikasi
dengan menggunakan gradien Nycodenz yang tidak toksik terhadap sel. Perlakuan
dilakukan dengan gradien Nycodenz I, 3 kolom (5%, 10%, 15%) dan II, 5 kolom
(4%,8%,10%,12%,15%) yang dibandingkan dengan gradien Percoll 5 kolom
(21%, 26%, 34%, 40% dan 60%). Parameter yang diamati adalah konsentrasi,
kemurnian, viabilitas serta jumlah sel Leydig hidup setelah purifikasi dan kultur
in vitro. Hasil menunjukkan bahwa isolasi dan purifikasi sel Leydig dengan
gradien Nycodenz I (85,53%) dan II (91,40%) menghasilkan kemurnian yang
tidak berbeda dibandingkan dengan gradien Percoll (92,22%). Viabilitas sel
Leydig pada Nycodenz I (85,53%) dan Nycodenz II (91,40%) juga tidak berbeda
dibandingkan dengan Percoll (92,22%). Konsentrasi sel yang diperoleh setelah
dipurifikasi menggunakan gradien Nycodenz I (7,12x106sel/ml) dan gradien
Nycodenz II (7,03 x 106sel/ml ) masih rendah (p