Aktivitas protease ekstraseluler dan interaksi escherichia coli Enteropatogenetik K1. 1 pada substrat imunoglobin A sekretori manusia

AKTIVITAS PRUTEASE EKSTRASELULER DAN

INTERAKSX Escherichilr cats' ENTERUPATOGENIK K l .I
PADA SUBSTRAT

IMUNOGCQBULIN A SEKRIETOM MANUSXA

OLEB:
DEWA AYU C I T M M S M I

PROGRAM PASCASARJANA
\

/

INSTITUT PERTPNIAN BOGOR
d

I

r

i

DEWA AYU CITRA RASMI. Aktivitas Frotease Ekstraseluler dm Interaksi
Escherichia coli Enteropatogenik K 1 .1 pada Substrat f munaglobulin A Sehetori
Manusia. Dibirnbing oteh SRT BUDXARTX PQERWANTO dm MAGGY
THENAWXJAYA SUHARTUNQ.
lmunoglobulin A seizetori manusia (sIgA) adalah salah satu pertahanan
imunofogis di daerah permukaan mukasa terljadap invasi bttlsteri, virus, dm patogen.
Antibadi ini rnempunyai kernampurn untuk menginakeifkan enzirn dm toksin bakteri,
menetralkm virus, dm rneningkatkm fagasitusis sel-sel fagasitasit. Warnun dernikian
banyak bakteri patogen menghasilkm protease IgA yang m m p u meodegradasi
anti bodi tersebut. Protease ekstraseluler Escherichia coli enteropatogenik (EPEC) K1.l
teI& terbukti mempunyai kemmpum mendegradasi musin. Penelitian ini bertujum
untuk melihat aktivitas protease ekstraseluler dan interaksi EPEC K1 . I pada substrat
irnunoglabulin R sekretori manusia.
Protease EPEC K 1 . I diproduksi menggunakan media limbah cair t&u yang
diperkaya dengan O,5% susu skim dm 0,5% pati. Enzim dipresipitasi dengan 45% (b/v)
ammonium suifat dan dimurnikan dengan kalam krurnatogmfi filtrasi gel Shepadex G1 00. Sebagai kontrol pusitif, protease d a i fraksi ke 9 dengm akrivicas spesifik tertinggi
terhadap musin diinkubasi dengan musin mumi (4% b/v) sefama 1 jam pada subu 37°C

dengan perbandingan enzim : musin 1 :2. Seianjutnya divisualisasi dengan SXIS-PAGE
(Sodium Dedocyl Sulaphat-Poly A crilarnide Gel Electrophoresis) konsentrasi 15%.
Protease ymg diproduksi dari fmksi yang sama selanjutnya diuji aktivitasnya terhadap
substrat sIgA (1,6-2,4 rnghl) dengan perbandingan sXgA : enzirn adalah 5: 1 dan 3: I .
Cmpuran enzim dan substrat diikubasi pada suhu 37°C selarna 4, 8, 12, dan 24 jam,
dan divisualisasi dengan SDS-PAGE 12,5% dm 15%. Dalarn penelitian ini juga diuji
interaksi antara sIgA dengan sel EPEC K l . I dengm metade Dot Blot, dan kernampwin
tumbuh bakteri tersebut pada media yang ditambah substrat sIgA manusia.
EIasil peneIitian rnenunjulckan bakwa sXgA mmusia cidak mampu didegradasi
oleh extirim eksrraseluler EPEC Kf .l sampai ikubasi 24 jam. Dari analisa One way
A~tovamenunjukkan Rahwa perturnbuhm EI'EC K 1.1 diharnbat oleh aadanya sIgA
manusia pada konsentrasi 0,4 - Q,6mgml untuk f o2CF'J/ml sel bakteri di dalarn media
Luria B e m i Broth. Hasil ini sejalan dengan observasi dengan metode Dot Blot yang
menunjukkan bzth~aslgA riapat bereaksi dengan sel EPEC K 1.1.

PERNYATAAN
Dcngan ini saya rnenyatakm bahwa dalm tesis yang berjudul Aktivitas
Protease Ekstrasefuler dam Irrteraksi Escheriekia coli Enteropatogenik. Kl.l pada

Su bstrat Imunaglotrufin A Sekretori Manusia sebagai karya tulis ilrniah yang tidak

diterbitkan adalah hasil penef itian penulis dm tidak terdapat karya yang pernah

diajukan untuk n~emperolehgelar kesarjanaan di suaittu perguruan tinggi, dm sepanjang
pengetahuan saya juga tidak terdapat kaya atau pendapat yang pmah ditulis atau
diterbitkan oleh orang lain kecuali yang secara tertulis diacuan naskah ini dan
disebutkan dalam dafiar pustaka.

/

Dews Ayu Citra Rasrni

AKTIVITAS PROTEASE EKSTMSELULER DAN
INTERPLKSX Escherichira coli ENTEIROPATOGENIK K1.1
PADA SUBSTRAT

IMUNOGLOBULXN A SEKRETORI MANUSIA

DEWA AYU CITRA RASMX

Tesis

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gefar
Magister Sains pada
Program Studi Ejialagi

PROGRAM PASCASARJANA

XNSTITUT PERTANIAN BQGOR
2002

Judul Tesis

: Aktivitas Protease EkstraseIuIer dan Xntexaksi Fschcrichiu coli

Nama

Enteropatogenik K1.1 pada Substrat f munoglobulin A Sekretori
Manusia
: Dewa Ayu Cifra Rasmi

NRP

: 99435

Program Studi

: Biologi

Dr. dr. Sri Budiarti Poerwanto

roc Dr.Ma

f+

Thenawi'a a Suhartono

Ketua

2. Ketua Program St~rdiBiologi

,,--

Dr. Ir. Dedy Duyadi Solihin

r Program Pascasarjana

RIWAYAT HIDUP
Penufis dilahirkan di Klungkung, Bali pada tanggal. 9 April 1966 dari ayah
1 Dewa Made Oka dm Ibu Desak Gde Oka. Penulis rnerupalcan an& bungsu dari tiga
bmudara
Mass pendidikan mulai sekolah dasar hingga sekolah menengah ditempuh di
KIungkung Bdi. Pada tahun f 991 penulis menyelesaikan pndidikm sarjaxla di
Fakultas MXPA jmsan Biologi Universitas Airinngga di Surabaya. Penulis diterimrt di
Program Studi Biologi program P a s c w a n a di lnstitut Pertmian Bagor t&un X 999 .
Beasiswa pndidikan pascasarjana diperoleh dari pruyek Due Like Universitas
Mataram.
Penulis bekerja sebagri tenaga pengajar di Jurusan Bialagi Fakultm MIPA
Unversitas Udayana dari tahun 1992 sampai tahun 1996. Mulai t&un 1997 hingga
sekarang penulis bekej a sebagai tenaga pengajar di Program Studi Pendidikan BiaIagi
Juasan Pendidikan MlPA Fakultas Keguruan dan llmu Perrdidikan Universitas
Mataram.

Tahun 2994 penulfs rnenikah dengm Dm, Arifuddin dm dilcaruniai seorang
putra bemama Arditra dm janin ymg rnasih di dalarn rahirn.

Puji dm syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya
sehingga karya ilrniah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dlpilih dalam penelitim ini
adalah penanggulangan penyakit diare, dengan judul Aktivitsrs Protease EkstraseIuler
dan Interaksi Escherichia cali Enteropatogenik K1.1 pada Substrat
Im unoglobulin A Sekreturi Manusia,
Prtda kesernpatan ini pnulis uctppakan 'terirna kasih kepada:
I . Xbu Dr. dr. Sri Budiarti Poenvantu sebgai pernbimbing u t m a yang sangat
banyak mcrnbantu selama maxi pendidikan Pascasarjana di IPB.
2. fbu Prof. Dr. Maggy Tbcnawijaya Suhartona selaku pembirnbing kedua yang
sangat banyak memberikan bimbingm dm saran selarna penel itian dan penulisan
k q a ilmiah ini,
3. Bapak Dr. drh. I Wayan Teguh Wibawan, MSc. selaku penguji diluar karnisi
yang telah turut memberikan sam-saran yang sangat berguna untuk perbaikan
k q a tulis ini.
4, Xbu Dr. dr. Sri Rudiarti Poemanto sebagai kepala Lab. Bioteknologi Hewan dm
Biomedis Pusat Penelitim Bioteknologi IPB yang telah mendanai seluruh
penelitian ini.

6 . Ayahmda I Dewa Made Oka dan ibunda Desak Gde Oka yang tetah dipanggil ofeh
Yarig Maha Kuasa, semoga diberikm ternpat yang fayak bagimu.
7. Kepada suamiku tercinta Drs. Arifuddln yang dengan sabar menunggu, metldoakacan
dan memberikan motivasi kepadaku hingga sef esai studi ini. lJntuk perrnata hati ku
Arditra serta janitl yang masih dirahirn yang telah menernaniku, rnaafkan atas
ket idak sabaran dan kekhilafanku. Semoga Allah S WT memberikan hikmah,
karunia, dan ridho-Nya hagi kehidupan kita, amin.
8. Serta kepada sexnua ternan yang teIah rnernbantu kingga setesainya studi irli
Sernoga karya ilmiah ini bermanfaat

Bogor, Agustus 2002

Dewa Ayu Citra Rasmi

DAFTAR IS1

DAFTAR TABEL ................................. .,...,,... ..................................................... vi
DAFTAR GAMBAR ......................................i.. ..................................................... vii

DAFTAR LAMPIRAN ........................,,................................................................

...

VIII

PENI)AHUI.,UAN
Latar Belakang .................................... .,,.................................................... I
Tujuan Penelitian .......................,,.,............................................................... 3

TINJAUAN PUSTAKA
ImunogIobulin A ........................................................................................
4
Irnunoglobulin A Sekretori .............................................................. 4
.............. 5
Struktur IrnunoglobuIin A Seicrttori ......................
,
.
,
,....,
Sintesis Xmunoglobulin A Sekretori ............................

.
.
..............7
Fungsi Xrnunaglobulin A Sekretari ..................................... ........ 8
Escherichiu coIi enteropatogenik (EPEC) ............................................ 13
Protease Bakteri Patogen ...............................................................................16
Protease sebagai Faktor Virufensi ................................................... 16
Protease EPEC ...............................................................................
17
Procease IgA ......................................................................................
18
Sistem Pertahanan Mukosa ...........................................................................
18
Lapisan Musin ...................................................................................
19
BAHAN DAN METODE
Tempat Penelitian ....................................................................................... 20
Pernurnian Pro tease
lsolasi Eks'irak. Kasar Protcase ........................... ,.,............................ 20
Pengendapan dengan Ammonium Sulfat ....................... ,,.......,,.......20

Dialisis ............................................................................................. 21
Fraksinasi dengan Kromatagrafi Filtrasi Gel .................................... 22
a. Pernbuatan KoIom Kromatagrafi .............. ::........................ 22
b . Fraksinasi Protein ......................... .,.,. ............................ 22
Penguicurm Konsentmsi Protein dm Abivitas Prutease
Pengukwan Konsentrasi ....................,.....
23
.............................................................................
Aktivitas Prateme
23
Elektrofosesis dengm SDS-PAGE ................................................................25

Uji aktivihs Protease terhadap Musin
dengm SDS-PAGE ..........................................................................
26
Uji aktivibs Protease terhadap sfgA Manusia
dengm SDS-PAGE ..........................................................................
26
Metade Dot blot .............................,.............................................................
27
Analisis Perturnbuhan EPEC K l .1 di dalam Larutan sEgA ...........................
27

I.IASIL DAN PEMBAHASAN
Pemurnian Protease .......................................................................................
29
Aktivitas Protease EPEC K l .1 terhadap sIgA Manusia ....................., .... 32
Kurva Pertumbuhan dan Uji Reaksi dengan Metade Dot blot ......................
36
KESIMPULAN DAN SARAN .................................................................................
40
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................
41
DAFTAR LAMPIRAN ....................................
.........................................................
46

DAFTAR GAMBAR
I,ialaman
Gambar I . Diagram stmktw IgA i dm fgA2 menurut
S trober dm James f 1994). ....,............. ,
,
,
.................................................

6

Gambar 2 . Diagram stmktur sXgA menurut .
Strober dan James f 1994)......................................................................... 7
Gambar 3 .Transport I@ rnenyeberangi sel epitel
(Strober dan James 1994) ......................................................................... 8

Gambar 4. Perbandingan model patogenitas EPEC model tradisianil tiga
&hap dm model barn empat asp (Hick et al. 1988)..*.............*..*..
,. ... 1 5
Gambzlr 5. tiasil pengukmn ponsentrasi protein dm aktivitas
protealitik fraksi-fdsi pa& pernumian dengan
icromatografi filtrasi gel ..................................,. .......................................30
Gambar 6 . Pernotongan musin oleh protease ekstrstseluler EPEC K l. .l
Gambar 7. Hasil inkubasi pratease ekstraseluler EPEC K 1 .1 dengan
slgA manusia pada gel 15% ....................................................................
32
Gmbar 8. Hasil irkubasi protease ekscmseluler EPEC K 1. t dengan
sIgA rnanusia pada gel 12% ....................................................................
33

Crambar 9. Kurva pertumbuhan EPEC K 1 . I ddam media 1/ 1Q LB .......................... 37

Gambar 10. Eiasil uj i reaksi EPEC K l .1 dengan metode Dot Eliot ...........................37

tampiran 1 . Pernbuatan per&si Bradford untuk pengukuran
konsentrasiprotein ......................:.......................................................... 46
Lampiran 2 . Bahan-bahan untuk pengukuran Aktivitas protein ............................... 46

Lampiran 3.Prosedur pewmaan standar Coornassie Blue ......................................

47

Idampiran4. Kornpusisi larutan stok SDS-PAGE ...................................................... 48

Lampiran 5 . Kompasisi b&an untuk mernbuat get pengumpul
dm pemisah .............................................................................................
50

PENDAHULUAN
Sistem irnunitas rnukasal rnerupakan pertahanan di daerah mukosa cerhadap
invasi patagen. lmunaglabulin A sekretari (sXgA) merupakm antibodi sistern
pertahanan yang spesifik di daerah permukaan mukosa terhadap invasi bakteri, virus,

dm patogcn yang lain. Bekrapa peneiitian rnenyatakan bahwa IgA dapat rnencegah
perlekataxl bakteri ke sel epitel, marnpu menginaktivasi enzirn bztkteri dan toksin,

rnenetralisir virus dan rneningkatkan kernampurn fagasitosis sel-sel fagositasit.
Peranan ini berjalan bersama-sama dengan faktor pert indungan nanimunologik di
daerah mukosa, misalnya bakteri flora normal yang rnenghambat perturnbuhan

rnikroba patogen, aktivitas rnotorik mukosal (perisla1tik dan siliari), subscansi mukosa
(asam lambung dan garam ernpedu), sekresi mukus, dm substansi lain seperti

laktoferin, laktoperoksidase, dan lisozim. IgA sekretori dapat juga bekerja secara

sinergis dengan substansi per1indungan nonimunolog i k yang ada di daerah rnukosa.
Anti bodi tersebut dapat menstabilkan aktivitas antirnikrokial

dan enzirnatik

laktoperoksidase, juga rneningkatkan aktivitas bakteriastatik dari laktoferin.
Perleksltan sTgA dengan bakteri rnenyebabkan baktcri tersebut rnenjadi sangat

mukofilik sehingga memudahkan untuk dikeluarkan dari mukosa saat mukus luruh.
Musin merupakan glikoprotein yang diproduksi oleh sel goblet dari Xapisan epitel
intestinurn, berfungsi untuk. rnelindungi daerah rnukasa secara fisik dari lingkungan
luminal sal uran intestinum. Karbohidrat yang menyusun musin mampu menjcrat
bakteri sehingga tidak rnampu melekat ice Iqism sel intestinum.

Mukasa usus dilindungi oleh tapisan musin yang k p r m sebagai
pnghalang fisik dm prangkap bagi balderi agar tidak rnencapai rnembran mukosa.
Hmcurnya lapisan mukus rnerupakan awd proses patogenitas. Namun dernikian,

banyak Itakteri patogen ymg mengkoloni permukw rnukasa dapat mentsak sistern
pxhhanan yang ada di daerah rnukusa, Beberap bakteri patagerr menghasilkan IgA

protease ymg

rnampu rnendegadasi IgA. Beberapa bakteri patogen yang

me nghasiIkan IgA protease antara lain: Neisseria gonnorrheae, yang j uga mampu

memeah LAMP1 (lysosame-associatad membrane protein 1) (Hopper el ai. 20001,
Strepfococcus przeumoniae, S. sanpis, Haemophr'lus

influenza, ff a e ~ p f i c u s

(Kilian 1979) dan beberapa bakteri oral penyebab penyakit periodontal (Kilian et ui.
1981). I - I a i I penelitim yang $elah ditapurkan menyatakan b h w a protease XgA

bakteri-balcteri tersebut berkontribusi dalam mekmisme virulensinya. Disarnping itu,
Vibrio cholera juga rnensekresikan protease yang tergantung pa& seng dm kalsium,
disebut juga musinase. Enzim ini mempunyai kmampuan rnendegradasi sejjurnlah
protein yang krbeda termasuk fibronektin dm iaktaferin (Salyers d m Whitt 1994).

Jika bakteri-bakteri tersebut kehilangan kemampuan memproduksi protease, &an
rnenyebabkan kehiiangan sifat virulcnsinya,
Esckrichia coli enteropatogenik (EPEC) rnerupakan bakteri penyebab diare
utama p d a bayi dm an&-an& di negara-negm berkernbang (Levine dm Melman

19841, termasuk di Indonesia. dm menyebabkw ratusan ribu mak meninggd dunia
tiap tahunnya. Menunrt menteri kesehatnn RI, Dr. Achmad Suyudi, angka kematian

pnduduk Indonesia karma penyakit d i m mencapai 54 per seratus ribu pnduduk

(Depkes R.I. 2000). Hd senada diungkapkm aIeh Budiarti (1 997) bahwa 55% dari
an&-an&

dm bayi penderita diare di lndonesia terinfeksi oleh EPEC. lnfeksi EPEC

biasanya terjadi melaiui rnakman dm minuman yang tercemar kuman tersebut. Di
daiam usus hang EPEC &an berhadapan dengan sistern imunitns inmg. Salah satu
faktor ymg dapat melewati sistem pertahman ini adalah aktivitas protwlitik (Strober
dan James 1994).
Klapprutfr et ul. (1995) menyatakan bahwa kberapa strain EPEC

rnengekspresikan satu atau beberap protein yang secara sciekti f rnenghambat
aictivitas Iimfosit dan produksi Iirnfokia. EPEC telafi terbukti secwa in vilro mampu

rnelisis sel darah rnerah (Warawa et a/. 1999). Kusumayanti (1 998) menyatakan
bahwa lreberapa galur EPEC rnemproduksi protease ekstmseluler yang rnerniIiki

spesifitas yang tinggi pada substrat rnusin. Selanjutnya: dalam sistem pertahanan

mukosa, EPEC telah terbukti mampu mendegradasi rnusin rnenjadi molekul y m g
berukuran Iebih kecil (Waturangi 1999). Sampai saat ini belum ada informasi
mengenai aktivitas EPEC terhadap imunoglobulin A sekrclori pada manusia.

Tujuan penelitian
Penelitian ini dilakukan tlntuk rnengetahui aktivitas enzirn protease
+

ekstraseluter dan interaksi bakteri EPEC K 1 . I terhadap substrat irnunoglobulin A

sekretori (sIgA) manusia .

TINJAUAN PUSTAKA
Imunoglabulin A

Xmunoglabulin A adalah sa1ah satu kelampok dari 5 jenis mtibodi yang ada di

Urn tubufi rnanusia. Di dalam serum antibdi ini hmya ditemukm 10- 15% dari

xu
lruXx anfibodi yang ada, dan IgA adatah antibodi yang dorninan di daerah sekret
tubuh, Dibanding di dalam serum, IgA banyak diternukan dalam air ludafi, air mata,
rnukus intestinal, sekret trakeabronkiaI, kolustrum, air susu, dm sekret uragenehl.
IgA s e m diproduksi aleh sei B di sumsum tulang, tetapi XgA lebih bmyak

diproduksi oleh sel B di dalam payer'patches, tonsil, dm jaringan lirnfoid submukosal
lainnya. IgA terdapat sebagai monomer atau polirner dengan dua atau lebih monomer
( 160.000 Da), dan paling dorninan dalam bentuk dirner atau trirner. Xrnunogfobulin ini

terdapat dalam dua subklas yaitu IgAX d m lgA2. Diagram struktur IgA l dan lgA2

dapat dilihat pada gambar 1.

Xmunoglobulirr A Sekretori
IgA di daerah mukosa terdapat dalam bentuk dirner y m g mengandung dua

monomer TgAT dan atau XgA2 scrta kornponen sekretori, sehingga antibodi ini

biasmya dikenal sekgai IgA sekretori (sIgA) (Goodman dm Parslaw 1994). EgA
sekretori addah imunuglobdin utama yang berperanan dalam respon imun mukosa

dm merupakm antibodi yang paling banyak terdapat:di daerah rnukusa dibandingkan
dengm antibodi yang lain. Di daerah lambung terdapat 80% IgA, 13% ZgM, dm 7%
IgG (Baratawidjaja 1996). Hasil penelitian Majxjurndar dm Ghuse (1981)
4

menunjukkan b&wa kandungm imunoglobufin h i 1 Fraksinasi filtrasi gel dari air
susu manusist addah 2,50 mdml IgA, 0,7 rng/ml IgG, dm 0,3 mglrnt EgM.

Struktur imunogtobulin A aekreturi (sIgA)

Seperti fialnya irnunoglabulin, yang lain, monomer sXgA terdiri atas 4 rantai
polipeptida dasar ymg terdiri atas 2 rantai berat (heavy chain) dm 2 rantai ringan
(Eighl chain) yang identik serta dihubungkm satu s m a iain oleh ikatan disulfida.

Rantai berat dm rantai ringan terdiri 472 residu asam amino dan 8,7% kwbahidrat, Di
daemh N-terminal pada palipeptida rantai trerat

d m rantai ringan disebut variable

region (VH dm VL). Sernentara di daerah C-terminal disebut constun region (CFtd m

CI). Seriap daerah VH seialu terletak berpasangan dengan VL membentuk suatu situs
perlekatm antigen (antigen-bifiu'ing site). Secwa rnikrograpik elektron, igA

menunjukkm bentuk seperti huruf Y d m sXgA berbentuk dabel Y yang masingmasing subunit manornernya dihubungkm di daerah C-terminai. Daerah pada dasar

setiap fengan dari bentuk Y tersebut terletak di antara daerah CHI dan CH2, disebut
hinge region. Beberaga bakteri ymg mcnghasilkan protease igA biasmyif memotong

di daerah tersebut, dan mexlgkilkan tiga bagian imunoglobulin. Dua diantxmya

identik satu sama lain, yang masingmasing mengandung seluruh bagian dari rantai

ringan, dm satu bagian Iainnya rnengandung rantai berat. Kedua fragmen yang
identik tersebut rnerup&m tempat pertekatrin antigen sehingga disebut Fab

figments (antigen binding Pagmenfs). (Roitt ef al. 1998; Goodman dm Parst ow
1994; Tornma et al. 1972).

Monomer IgA merniliki BM 160,000 Da. sEgA dilengkapi dengan ranhi J

(joining), suatu protein asam dengm BM 15.000 Da. Kompunen sckretori fSC)
addah suatu protein yang mengalami glikusilasi dengan krat malekul kira-kira

70.000 Da. SC terdapat:baik secara bebas maupun terikat ke rnolekul XgA. Protein
. ini
m

menyebabkan IgA menjadi lebih resisten terhadap enzirn proteolitik dalam skret,

rneningkrttkan kernampurn moiekul IgA krintemksi dengan patogen sehingga
mencegah perlekamya ke pemukaan rnukusa, dm mempertahankan hngsi biologi

imunogiobulin ini d a m sekret (Mwcotte dm Lavaie 1998; Strober dm James 1994).
Untuk lebih jelas mengenai s w u r sXgA, dapat dilihat gmbar 2,

lgAl monomer

tgA2m (I)
monomer

Daerrth Variahl (antigen-Mndlng

Rantal h r a t

Gambar 1. Diagram struktur fgA I dm lgA2 menurut Strobr dm Jmes (1 994)

Gambar 2. Diagram scmktctur sIgA menurut Strober d m James (1 994)

IgAl rnerniliki sedikit perbedaan dengm IgA2 yaitu 22 asam amino pada
susunan rantai beracnya, t i p belas a s m amino diantara~ryatidak dimiliki oleh IgA2.

Scruktur ini menyebabkan IgA2 lebih resisten terhadap sejurnlah protease yang

spesifik memecah igA 1di daerah hinge (Marcatkc dan I.,avaie 199&). Perbedaan yang
lain antara kedua subunit. IgA adalah IgA2 ada dalam dua bentuk alotipik, IgA2(rnT)
dan IgA2(rn2), dimana IgA2(ml) tidak ada ikatan disulfida (H-L) (Strober &an James

1994).

Sintesis Imunoglobulin A Sekretori

Imunoglobulin A sekretori diproduksi oleh se1 B di daerah mukosa yaitu
Peyer's patches, tonsil, dm jaringan limfoid rnukosal lainnya (Goodman d m Parslow
>

1994). Sel I3 (sel plasma) tersebut merupakan turunrtn sel B yang diproduksi di

sumsum tuimg ymg kernudian bermigrwi ke jaringan limfoid di daerah rnukosa

(Parslow 1994). IgA dipraduksi sebagai monomer IgAI dan IgA2 kemudian &an

terjadi polirnerisasi yang dihubunglcan oleh suatu polipeptida tunggd yang disebut

rantai J . Rantai J addah suatu protein yang bersifat asam, dengan BM 15.000 Da,

disintesis ateh smua sel plasma yang mensekresikm imonoglabulin pot imer, Rantai

J beyeranan dalam proses awal palimerisasi lgA (Goodman dm Parslow 1994).
Transpart IgA ke: daerafi rnukosa diperanmai oteh kompanen. sehtori (SC)
(gmbar 3).

SC dipruduksi oleh sel epitef, m m s a di permukaan jaringan

Peyer 'patches limfosit submukosaf iainnya. SC hanya dirniliki aleh imtutaglabulin A.
Protein ini bertugas sebagai reseptur transprt XgA menyebrangi sel epitel menuju

mukosa (Goodman dm Pmlow f 994; Strober dm J m e s 1994).

Sel Plasma

el epltel

Gambrtr 3. Transport IgA menyeberangi sel epitel (Strober clan dames 1994).

Furtgsi imunogiobulin A sekretori

Imunaglobulin A sekretori dianggap merupakan pertahanan
- p m a melawan
patogen di daerah membran mukusa. TeI& diketatxui bahwa sIgA k r p r a n a n penting

d a b pertahanan, melawan infeksi yang disebabkan oleb enteropatogen dm virus

pada manusia dan hewan. sXgA mampu mengaglutinasi bakteri sehingga menghmbat

perlekatan bakteri ke sel inmg, menetrdisir tobin, enzim, dm virus. sIgA bekerja
secara sinergis dengm faktor imunitas lain ymg terdapat di daerah rnukosa dan dapat

mengaktifkan 4-sel fagositik (Marcotte dm Lavaie 1 998).

Pewhambatan wrlekatan bakteri
Kernsunpuctn sIgA menghambat perlekatan bakteri didtiga mempakan

rnekmisme pertrthanan yang terpenting melawan invasi bakterri di daerah rnukosa.

Banyak laporan bahwa s e w a in vitro, sXgA &pat mengurangi pertelcatan bakteri ke
sel epitef, sehingga diduga mtibodi ini rnempunyai kemampuan untuk rnelindungi sel
dari patogen. IgA seketuri merniliki reseptor terhadap karbohidrat mannose-spesifik

tipe satu pada firnbrie E. coii (Marcatte Ban Lavoie 1998). Antibodi ini $el& terbukti

rnarnpu bereaksi dengan bekrapa bakteri strcptacocci oral (Ssrecococcus muluns, S,

snguinis, S.saiivarius) (Galinberg dan Krasse 1981). Sel utuh bakteri Streptococcus
mulaus, S. oralis,

27. rnl'tis biovar 1, dm Enrerococcus fueculis adalah bakteri

Streptococci oral pioxlir pada bayi smpai umur dua tahun, dapet hereaksi dengan
sXgAl dm sIgA2 dalam level yang sangat kecil (Cole el a!. 1999). Secara in vifro

perlekatan Vibrio cholera ke potongan intestin secara signifikan terhambat uleh sXgA

(Majurndstr dm Ghose 198 1 ).
Mcnumt Marcotte dm Lavaie (1 9981, IgA sekretori rnempengaruhi

perk katan bakteri ke pennukaan inang dengan rnencegalr interaksi s e c m nonspesi fik
maupun stereakimia. Ikatm ?gA pada adesin bakteri ini dapat rnereduksi muatan
negatif permukmn dan hidrofobisitas bakteri, sehingga mengurangi potensi untuk

interaksi ionik dm hidrofobik anm bakteri dm reseptor inang, Reduksi
hidrofobisitas bakteri mungkin disebabkan aleh kuamya glikosilasi komponen Fc
dm SC sehingga merngubah sifat hidrafabisitas mlekul dgA. Selmjutnya dikatdcan
beberap pnelitian *el& rnenernukm b&wa sXgA &pat memblok dengan sangat
nyata ikatan adesin bakteri ke reseptor ymg

cocok pada perrnukaan inang. Antibudi

sIgA me1awan firnbrie Gonococci dm mggata Enterobacferiaceae d e n p mereduksi

adesin bakteri-bakteri tersebut kt: sel epitel. Pada penefitian ymg lain, Gregory dan
Filler (1987) menyatakm M w a sXgA dari air ludah menghambat aktivitas
glukotransferase d a i balrteri Steptococcux mutaw, saIah satu bakteri penyebab
utma penyakit karies gigi, sehingga dapat mengurangi perlekatannya ke sel inmg.

Hal selrada diungkapkan juga oleh Blmchard et a/. (1995) bahwa antibodi

rnonakianal f t gA) 7 1 menetralisir kemmpum E-Xeiicobacterfelis, bakteri penghasi l

urease spsifik terhadap slgA, mengkoloni lambung mencit. Lebih jauh diungkapkan,
diduga antibadi tersebut bekerja dengm dua cam. Pertarna, dengan menghambat

perlekatan reseptor atau enzirnatik

protein u m e b&t:eri icf: sel inang, Kedua,

antibodi rnenghambttt kalanisasi dengan mengaglutinasi bakteri dm rnenyebabkan

lunrhnya mukus lambung.

fnalctivasi enzirn bakteri dm taksin

-

EgA sehetori rnampu menedisir toksin dengm menghalangi perlekatannya

ke reseptor sel, d m ke sel epitel intestinurn. D m s e w # pwsial melindungi inang
melawan penyakit d i m , sIgA juga rnenghmbat kerja sejumlah enzirn, mugkin.

dengan rnenghafangi perlekatannya ke substrat

atttu

dengan destabilisasi komplek

enzirn-substrat. slgA secara langsung melawan glikotrmsferase streptococci dengan

menghambat sintesis ekstraseluler dm mefeduksi akumulasi plak gigi. sl@
menghambat protease IgA 1 dari N. gonorrkeae, N. meningitides dm S, sapaguinis.
Jika protease IgAf perperman ddam proses infeksi, kernampurn menetralisir
protease IgAl mungkin m e n i p a h suatu mekmisme pertahanan melawan invasi
rnukasal aleh kberapa patagen (Marcotte h Lavoie 1998). fgA sekretari rnampu
secara efektif rnenetralisir toksin kolera dengan mengaglutinasi toksin tersebut secara

in viva Akan tetapi antibodi ini tidak bersifat vibriocidal meskipun ada lisozim
sebagai kampunen sinergid dalam mekanisme sistem irnunitnsnya (Majumdar dan

Ghose 198 1), Ha1 senanda juga diungkapkm oleh Vaerman

el

al. ( I 984) bahwa, IgA

sekrctori dari ernpedu tikus rnarnpu menetralisir toksin kolera.

Netralisasi virus
Antlbodi menyediakm pertahanan terhadap penyebaran virus antara sel d m
jaringan. Ancibudi dapat menetralisir virus atau mernbunuh sel yang terinfeksi virus

sebingga tidak menyebar. Dalam ha1 melawan v i m , antibodi dapat bertindak sendiri,
sinergis dengan kompfemen, atau tergantung pada sel pembunuh, rnkopag, atau

neutrofil, Antibadi dapar mencegah perlekatan virus atau rnencegah rnasuknya virus

ke el. Bersama dengm komplemen, antibodi dapat merusak amplop a m reseptar
virus (Roitt et al. 1998).

Sebagai antibadi ymg procfuksinya terfakus didaerah rnukosa, EgA sekreeori

memegang peranan y m g penting dalam imunitas v i d , Suatu efek perlindungm sIgA

melawan infeksi virus respiratari dm enterik telah banyak: dibuktikan. Tikus yang
diimunisasi secara pasif dengan antibodi ini mampu melawan virus influenza yang
diinfeksikan secara intra nasal, dm w x a in vidro jugst m m p u menetralisir
imunudefisiensi virus tipe 1 pada mmusia. Mekanisme inaktivasi virus sangat

kumplek dm belum banyak diketahui, dan hanya diketakui bahwa sIgA mengblangi
perlekatan virus ke sel epite1 (Mwcatte dm Lavaie 1998). Disamping itu IgA dapat
juga digunakm mtuk mendiagnosis infeksi virus Ep~tein-Barrpada anak-anak

(Schaade et al. 200 1).

Sinergisme d e n ~ mrnekanisme pertahanan van2 lain
sXgA juga bekerja secara sinergis dengan faktor imun yang ada di sekret
antara lain: laktoperoksidase,

laktoferin, musin (Mmcotte dm Lavuie 1998).

Aktivitas iaktoperoksidase melawan Szrepfococcus mulans ditingkatkan oleh

keberadaan antibodi ini. lnteraksi mtara Fc dari IgA d m laktoperoksidase

menstabilisasi aktivitas smtimikrubial dan enzimatik laktoperoksidase (Tenovuo e t al.
1982; Mxcatte dan lavoie 1 998).

laktoferin. Xi@

sXgA juga meningkatkan efek bakteriostatik

sekretori juga hkerja sinergis dengm musin. Perlekatan sIgA dengm

baicteri menyebabkan bakteri tersebut menjadi sangat mukofilik

sebingga

mernudahkan dikeluarkm dari mukosa saat lapism rnukus lumh. Asosiasi mma sIgA
aglutinin di d a l m saliva mungkin juga meningkatkm agregasi bakteri (Marcatte dan
Lavoie 1988).

strain EPEC rnengekspresikan satu atau kberapa protein yang secara selektif

merighambat aktivitas limfosit dm produksi Iimfokin.

Aka etapi mekanisme

patogenitas EPEC secara langsung lebih bmyak disebabkan karma perlekatm bakteri

tersebut ke XI inang.
Menurut Domenberg dan Kapler (19921, patogenitas EPEC diawali dengm

perlekatan ymg tidak erat yang dipemtarai aleh bundle-forming pili (bfp).
Kemudim terjadi transduksi signal yang diperantai oleh protein sekresi (Esp) dm

pengikatan ymg erat yang melibatkm intimin. Sebalihya Hicks

ef

a/. (1998)

menjelaskan dengan model yang berbeda, yaitu diawali dengm perlekatan seam

tidak erat pada sel epitel ymg diperantarai oleh adesin. Tafrap selanjutnya interaksi
EPEC adalah transduksi sinyal dalam sel inang yang dipacu oleh EspA, EspB, dan

EspD. Tafiap ketiga melibatkan intirnin pada Tir yang terfosfarilasi pada tirosin untuk
merighasilkan ikatan yang errtt. T&ap ter&ir

adalah pernkntukztn mikrokoioni ymg

diperantarai oleh bfp. Model patogenitas EPEC ditampilkan dalam gambar 4.

Meskipun mode! patogenitas EEPEC yang dijelaskm diatas berbeda, namun
pada dasmya sama-sama menganggap bfp adalah pmegang perman utarna ddam

rnekanisrne patugenitas EPEC, Matara et al. (1987) meneliti EPEC strain 0127:W6
rnenyatakm bahwa plasmid ymg mengkdekan f&tw perlekatan EPEC (EAF)
diperlukan untuk faktor virulensi bakteri ini. D a l m penelitim yang lain, Hicks et a[.
(1998) rnenyatak:~peranan intirnin dm bundle-forming pili (BFP) yang mengawdi

perlekatan dm pernbentukan lesi attaching and @facing {ME) pada sei inang d m

mewpalcan sentral patogeni tas EPEC. Selanjutnya menurut Blank dan Domen berg
(20011, EPEC rnempxaduksi BFP, suatu firnbxie t i p IV yang terlibat daalam virulensi,

autoagregasi, dm perlekatan IokaI bakteri ke sel inang. Untuk melihat ekspresi DFP

EPEC paling optimal jika baktcri tersebut cfiturnbuhkan pada media agar brucella

ymg diperkaya dengan sodium bisulfit (Gismero-Ordonez el al. 2002).
Bakteri ini juga terbukti mampu mefisis sel darah rnanusia secara in vitro
dengan mensckresikan protein EspA, EspB, dan EspD. Kdiga protein tersebut

diprlukan untuk translokasi protein Tir, yaitu susttu pratein yang merupstkan reseptar
intimin dan diperlukan untuk membentuk ikatm yang erat antara EPEC dengan sel
hang (Warawa et a!. 1999).

(a)

(b)

Gambu: 4. Perbandingan model patogenesis EPEC (a). model tradisionil tiga tahap,
(b) model baru ernpat tahap (Hicks et a!. f. 998)
15

Protease Bakteri Patugen
Proksse sebagai Faktar ViruIensi

Virulensi atau patogenisitas addah kernampurn smtu bakteri untuk
menyebabkm infeksi. Faktor Grulensi mem&

produlr; atau strategi suatu bakteri

yang krkoiltribusi dalam virulensinya. F&or vinrlensi dikelompokkm menjadi dua
kategori yaitu: rnernacu invasi dm kolonisasi bakteri dm menyebabkan kerusakan

jaringan inrtng. Beberapa f&ar virufensi baicteri antara lain pilti, protein tobik,
enzirn hidralitik dli. Bekrapa brrkteri patagen mempruduksi enzirn hidrolitik, seperti

hialurodidase dm procease, yang mendegradasi kampanen rnatrik ekstrasdufer
sehingga merusak struictur jaringan inmg. Enzim fiidrolitik ini digmatcan oleh bakteri
untuk memperoleh surnber kwbon dm energi dengm menghancurkan polimer inang

menjadi gula sederhana dan asam amino (Salyers dm Whitt 1994).

Protease terlibat baik secara langsung rnaupun tidak langsung di dalam
mekmisme patugenesis banyak rnikoba penyebab penyakit pada rnmusia, hewm
maupun tanaman (Suhartona 2002). Senyawa musin dapat didegradasi oleb protease
Clostridiuna dm Bacceriodes (Stanley er al. 1979) dan protease dari Sfr~:~tococcus
pneumoniae rnampu rnendegradasi komponenen sistem komplemen (Angel el al.
1994). Bucceriodes usccharoiyticus dm B. melali~logenicussubsp. Iu~e~.medius
addah

bakteri ymg menyebabkan penyakit periodontal, menghasilkan protease yang mampu
mendegradasi pofiklonal irnuxloglobulin G (Kilian 198 1).

Vibrio ckolerae

menselrresih protease yang tergantung pada seng dm kdsiunz, disebut juga
musinase, mernpunyai kernampuan rnendegradasi sejumlah t i p protein ymg berbeda,

Protease E f EC

EPEC telah terbukti menghasifkan protease yang mampu mendegadasi
musin, yang optimum pada suhu 37'C dm pH 8. Protease ini tergalang metdoxrin
protease f Waturangi 1999) d m Nurhayati (2000) lebih spesifik lagi rnengelampokkan

enzim tersebut ke dalam zinc-serin protease. Aktivatur pada substrat, musin adalah

c$', M ~ " ,

dm L?'

(2mM) (Watwangi 1999) d m juga

z$'

(2rnM) dm B$'

(SrnM) sertst dihmbat oleh ~ a ( 1~mM),
' N H ~ ~( I' mM), PMSF, EDTA dan 1,10phenantroli (Nurhayati 2000). Selanjutnya Nurhztyati (2000) rnenjelaskan, protease

EPEC masih rnemifiki aktivitas lebih dari 70% setelah disimpan selama 5 rninggu
pada suhu

~OC,

tetapi penyimpanan pada suhu 37' C dalarn waktu yang sama

aktivibsnya akan turun 70%. Enzim ini tidak tzliran terhadap Sodium Dodecyl

Sulphute (SDS), dm akan mengalami penurunan aktivitas sebesar 75% pada

konsentrasi 0,5% SDS. Pada analisis dengm SDS-PAGE, protease EPEC mempunyai
limit pita yang berukurm 60,9, 39,3, 32,9, 23,9, dm 1 7,3 kya. Kunfirmasi dengan

pernotongan. gel diketahui bahwa protease y m g mempunyai aktivitas proteolitik
tertinggi terhadap musin berukwan 39,J kDa. Waturangi (1999) melaporkan bahwa

pratease EPEC yang berukuran 42 ld3a dapat memotong musin menjadf dua bagian
masing-mstsing bemkurm 38 dm 33 M3a

. Alcan tetapi EPEC K l . l

tidak mmpu

rnendegradasi lisozim ( D m a 200 1).

Protease IgA
Penelitian tentang IgA telah banyak membuhikan bahwa kberapa bakteri
patogen rnenghasilkan protease yang mampu mendegradasi IgA. ~ i l i a h(1 98 1)

meneliti beberapa bakteri penyebab penyakit periodontal seprti Bacferiades

mslanininogenicus subsp melaninogenicus d m Capnocyfophagc~memotong lgAl
dan IgA2 di daerah hinge menjadi Fab d m Fc. Sementara Bacteroides
mecharolyticus d m B. rnelani~ogenicussubsp, intermedius menyebabkan IgA f

terdegradasi tuntas rnenjadi fragrnen dengan berat molekul ymg lebih kecil dari

FabCFc. Dalam penelitian yang di1akuk.m ateh Hopper el a!. (2000), rnenyatdm
bahwa Neisseria gonorrhoeae menghasilkan pratease yang spesifik terhadap XgAl ,
jyga mampu mendegradasi LAMP (rysosome ussociafed membrun pratein), sehingga

mempemuciah bakteri patugen ini menyebrangi sel-seI epitel secara in virro. Senior
ef ul. (2000) rnernbuktikan rekombinan IgA2 dengan XgAl dapat ddipcah okh

be berapa bakteri, antara lain: Prevorella meiminogenica, Streptococcus pneumoniae,
S.sunguinis,Neisse~.iameningitidis, N. gonordtoeue, dm II~emophiEusr'njluenzue.

Sistem pertahanan rnukusa

Sistem pertahanan didaerah rnukasa terdiri atas IgA, sistern komplemen sel T,
dm iapism sel epiteliurn, Fungsi utama dwi sistern pertahanan rnukosa adalah

menyedidan pertahman inag di pemukaan mukasa. Peranan ini berjalan bersamasama dengan faktar perlindungan nonimunologik, misalnya bakteri

flora normal yang

merighambat prtumbuhm miboba patogen, aktivitas rnoturik muIcosal (peristaltik

dan siliari), substrtnsi mukosa (rnisainya: asam lambung dm gwm empdu), sehesi
mukus, dm substansi lain seperti Iaktoferin, laktoperoksidase, dm tisozim (Strober
dm James 19941%

Lapisan Musin

Permukaan epitel intestinurn dibatasi oleh suatu lapisan mukus yang
diproduksi oleh se1 goblet sebagai sekresi rnusin. Musin adalah sekelampok
glikaprotein yang melidungi epial dengan beberapa cam. Musin meiindungi s m a

fisik dengm mernbatasi epitel dari lingkungan lurninal saluran intestinurn., dm

karbahidrahya rnampu menjerat bakteri sehingga tidak m m p u melekztt ke lapisan sel
intestinurn. Musin secara kuntinyu akan luruh sehingga akan sekaligus memburtng
bakteri yang menernpel. Dengan demikian rnusin diannggap menyurnbang respon

imun di dalarn intesninum (Pitman dm Blumberg 2000). Disamping itu, bakteri yang
terjerat oleh musin juga dapat dihancurkan aleh senyawa &an enzim-enzim yang
terdapat didalamnya seperti lisazim, XgA sekretori, laktoferin, dm laktuperoksidase

(Slayers d m Whitt 1994).

BAHAN DAN METODE
Tempat Penelitism
PeneIitian dilatcsanakan di Lab. Bioteknolagi Hewm Efan Biamedis, Pusat
Penelitian Biateknafogi Institut: Pertmian Bogur.

Pemurnian Protease

isalasi ekstrak Xrasrtr protease
Bakteri yang digunakan edal& Escherichia caii Enteropathogenik isolat K 1. I

(EPEC K 1.1) y m g diperuleh dari an&-an& penderita diare di Depok yang telssh
dikoleksi di Lab, Bioteknolagi H e m dm Biomedis, Pusat Penetitian Biateknalogi
Institut Pertmian Bagor.

EPEC KI .1 ditumbuhkan pada media limbah tahu cair (I.,CT) yang
disupIementasi dengan 0,596 skim dan 0,5% (blv) pati, kernudim diinkubasi pada
suhu 37'C selama 8 jam.Sebanyak 2% (vlv)biakan ditumbuhkan untuk isolasi enzirn

dm diinkubasi dalam media yang sama selama X2 jam. Untuk rnemisahken sel
dilakukan sentrifugasi d e ~ l g mkecepatan 3000 rpm selama 30 menit pada sutru 4'C.
Supernakn yang mengandung enzim diuji akrivitasnya menggunakan metade Walter

(1984) pada substrat musin (Sigma) dm kadar proteimya menurut metode Bradford
( t 976).

Pengendolpan dengan arnanium sulfat
Unhk

menggumpalkan protein, supernam basil

sentrifugasi yang
20

mengandung enzim ekstrak kasar ditambah runanium sulfa (teknis) sedikit demi
sedikit sambil diaduk dengan rnag~zeticstirer hingga konsentrasinya 45% (blv) dm

dibiarkan selama satu m a l m pada suhu 4'C. Filtrat protease dipisahkan deagan
sentrifugasi 10.000 rpm pada suhu 4'C selrtma 30 menit. Pelet yyag ddiperoleh
diresuspensi dalam bufer Tris-EICL 10 m M pH 8, Kemudian diadakm pengujian
aktivitas dengan, metode Walter f 19841, pada substrat musin dm penenturn kadar
protein dengan metode Bradford (19761, Sisa enzirn disimpan pada suhu 4'C untuk

segera dilkukan proses berikutnya.

Dialisis
Dialisis dilakukan untuk menghilangkan k d a r garam yang tersisa pada proses
pengendapandengan rnenggunakm kantong dialisis. Kantong dial isis (Sigma) dengan

lebar 25 mm, diameter 16 mrn dipotung sepanjang 10 cm d m dicuci dengm air

mengalir sefama 3-4 jam. Kantung selanjurnya diperlakukan dengan larutan NazS

0.3% (w/v) parla 80°C selama satu rnenit dan dicuci dengan air hangat (60' C) seiama
2 rnenit. Setelah pencucian, kantung direndam H2S04 0.2% (v/v) dm dicuci lagi

dengan air hangat. Kantung disimpan ddam larutan bufe'er yang &an digunakan pada

strhu 4OC.

Pada saat akm digunakan, salah satu ujung kantung diikat dengan benang
jahit laiu dirnasukan 10 ml larutan enzim, lalu ujung lain diikat dengan benang.
Kmtung dimasukkan dalam larutan Tris-Cl 20 m M dengm volume IOOX volume

filtmt Dan diagitasi secara perlahan gada suhu 4' C selma I jam. Setelah 30 menit
2X

bufer diganti dengan bder %gar. Enzirn h a i l dialisis dipkatkan menjadi setengah

volume dengan freeze dryer dm disimpan pada suhu 4'C unhk segera dil&ukm
krarnatografi fi ltrasi gel.

Fraksinasi dengan Kromatografi Filtrasi Eel
a. Pernbuatm kolam kornatopfi

Gel Sephadex G-100 sebmyak I,7 gram direndam dalam air bebas ion steril

dm diaduk perlahm selama 30 menit kemudian d i d i d a n semalam pada suhu
4'C. Air bebas ion dibuang dm diganti dengan bufer Trls-HCL

O,I M pH 8

sambil diaduk perlahan selama 30 menit kemudian didiamkan semalrim pada suhu
4'C, Gel dicuci dtngan buffer Tris-IICL t 0

m M pH 8 sebanyak tiga kali dan

didiamkan selma satu jam.
Kolorn kromatografi dibuat rnenggunakan tabung Icromatografi dengan

diameter 1 cm. Seem perlahan gel dituang ke dalam tabung yang telah terisi
buffer Tris-HCL 10 mkl: hingga rnencapai tinggi 40 cm. Dius&&an jangan
sarnpai ada gelernbung yang terperangkap dalam kolom. Koiam diekuilibrasi
dengan mengalirkan buffer Tris-HCL I0 m M sebanyak 2UQ rnl dm didiamkan
selama sernaIam pada s&u 4'C.

b. Fraksinasi protein

Larutan protease sebanyak 2 ml dimaukan dengan pipet s ~ a pertahan
a

kedalam koiorn tepat diatas pemukartn gel. Enzlm dibiarkm mengalir perl&an
sehingga seluruh enzim krada sedikit dibawah permukaan gel. Kotom diisi

dengan pengelusi yaitu buffer 'Tris-HCL 10 m M pH 8, Diambil20 fraksi masing-

masing sebanyak 70 tetes ditampung dalam fracrion coliecfur f Redifrac,
Pbarmacia-Biotech). Tiap fraksi diukur aktivitas protease dm kadaf prateinnya.

Pengukuran Komsentrasi Protein dan Aktivitas Pratease
Konsentrasi protein dm &tivim protease padst tiap-tiap @hap pernumian,
ditetapkan dengm metode Bradford ( t 976) dm Walter (1 9841,

Pengukuran Konsentrasi Protein
Konsentrasi protein

diukur dengan menggunakan standar protein Bovine

Serum Albumin (BSA) dengan kansentrasi rnulai O,l hingga 1,0 rng/rnl. 100 pl tiap

kansentrasi BSA dm sample protease ditempatkan pada tabung rc&si dm ditambatr 5
ml peraksi Bradford. Carnpuran ini d i h a m o g e n h dm diinkubasi selma 5 menit
pada suhu 37OC kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofutorneter pada h 595

nm.
Persamaan garis rcgresi ditentukan dengan rnenggunztkan nilai absorbansi dm
kansentrasi protein dari standar BBSA dengan konsentrasi sebagai absis dm absarbansi
sebagai ordinat. Konsentrasi protein dari sample protease ditentukan dengan

menggunakan kurva standar yang terbentuk.

Pen~ukuranAktivitas Protease
Aktivitas protease dilakukan menurut prusedur krikut (table I). Bahan-bahan
23

yang diperlukan u n t k mengdcur &tivita protein tertelra pada lampiran 2.
Tabel I.. Prosedur Pengujian Aktivitas Protease.

rp'--

,-,

Pereaksi

Jumlah (mi) pereaksi yang ditrrrnbahkgada
1

1

8

Musin 1%
0,2
Aquades
0,2
Tirosin standar
Enzirn contoh
Inkubasi pada suhu 3 7 ' ~selama I0 rnenit
TCA 0,l M
7
2
2
Enzirn contoh
0,2
awaddes
Inkubasi pada suhu 37 C selarna 10 menit
1 Sentrifugasi 4.000 ~ r serama
n
10 menit
Fif trat
Natriurn Karbonat
5
p l i n ( 1 :21
I
nkubasi pada suhu 3 7 ' ~selama 20 menit
~daorbansidiukur denganspektrofotome5ada ?.
578 nrn

I
I

/

-,,

1

,,,,,,,

I

02

'7- 2
I
1
L.,..,.

"

*

I

"' T

,,,-

I

1

,

,,,,,-,,-

..........................................................

I

1

Aktivitas proteolitik di hitung dengan rnenggunakan rumus:

U A :jurnlah enzinl yang dapat menghasilkan 1pmof tirosin permenit (IIJ/rnl)

Absp:Absorhansi sampie
Abbl:Absurbansi blanko
Ab, : Absarbansi standar
FP : Faktor pengenceran
T : Waktu
Satu unit internasionai (UI) rnenyatakm jumlah enzim yang dapat rnenghasilkan satu
rnikrornol produk tirosin setiap milliliter setiap rnenit.

Elektruforesis SDS-PAGE
Protease hail pernumian dianalisa dengan Sodium P)ndecyl Sulpkate-ply
Acriiamide Gel Eiecbroforesis (SDS-PAGE) (Laemmli, 1 970). Penanda berat malekul
digunakan marker dengan berat molekul rendah (Sigma) dm tinggi (Amersham

Phmrtcia). Marker dengan BM rendah terdiri a-lactztlbumin (1 4,4 kDa), tripsin

inhibitor (20, t kDa),carbonic anhydmse (30 kDa), ovalbumin (45 kDa), albumin f 66
kDa), fosfurilase B (97 kDa). Marker dengan BM tinggi terdiri dari glutamic
dehydrogenase (53 kDa), transferin (76 kDa), P-Galrtctosidase (1 16 kDa), az-

Macroglobulin (1 70 kDa), myosin (220 kDa).
Konsentrasi gel pmisah untuk marker dengm BM rendah 15% dan BM

tinggi 12% dan gel pengurnpul4%. Kompasis bahan untuk mernbuat gel pernisah dan

pengurnpul tertera pada lampiran 3.
Sampel protein yang akan dianalisis dan molecular weight marker
dicampurkan dengan buffer sample dengan perbandingan I : 1, campuran ini

dipanaskan selama 5-10 menit sebelum dirnasukkm ke dalm surnur gel
elektroforesis dengan vulurnc tertzntu.

Elektruforesis dijalankan dengan arus 20 mA dm voltage 50 volt.
EIektrofuresis krakhlr apabila pewarna sample mencapai batas 0,3 cm hingga 0,5 cm
dari bagian bawah gel. Diukur jar& d a i pangkai gel pernisah hingga pewma sample
setelah eIektrofocesis berakhir.

Gel direndam di dalam pewarna commassie brilliant blue sambil diagitasi
perlahan selama dua jam. Pewma yang tidak terikat pada protein dicuci dengan
25

merendam gel datam crtmpuran methanol dm asam asetaf hingga gel benvarna bening

dm pita-pita protein terlihat jelas. S&an dm prosedur untuk pewarna commassie
briIiia~ltblue daptt dilihat pada lmpiran 4.

Uji aktivitas protease terhadap musin dengarr SDS-PAGE

Untuk rnengetahui hasil hidrolisis fraksi hasil hmatografi gel yang
rnempunyai akcvitas protease pada rnusin paling tinggi diuji aktivitas degradasinya

terhadap musin dengan SDS-PAGE 15 %. Pada pngujian aktivitas, musin dm
praetease EPEC direaksikan dengan perbandingan I : 2 dengan konsetrasi musin 4%

(b/v), kernudian diinkubasi pada suhu 37'C selma setenganh dan satu jmz. Untuk
rnelihat berat rnalekuX protein digunakan protein standar der~ganBM rendah produksi
Sigma.

Uji aktivitas protease terhadap s1gA rnanusia dengan SDS-PAGE

Uji pernotangan protease EPEC K 1. i terhadap sIgA manusia dengan

konsentrasi 1,6-2,4

m@mI (Sigma) diand isis derlgan SDS-PAGE 12% dan I 5%.

Fraksi enzim yang digunakan sama dengan fraicsi untuk menguji aktivitas protease

EPEC K I . ), pada substrat rnusin. Pada pengujian aktivi tas, perbandingan anti bodi
dengan protease adaiah 1 : 5 &an 1 : 3 dibuat beberapa ut angan dengan waktu inkubasi
masing-masing 4 jam,12 jam,d m 24 jam.

Pengujisrn Kemttmpudtn Reaksi sIgA dengan EPEC K1.l

dengan Metode Dot

Blots (Harlow dan Lane 1988)
EPEC KI.1 dicurnbuMan pada media Luria Bertani Broth (LB) selama 8 jam,
untuk rnenurunkan sel disentifiigasi 3000 rpm selma 15 menit kemudian dicuci

dengan PBS {Phosphai bufer solution) 2 kali. Sebanyak 5 pl sel utuh EPEC K1.I
diteteskan pada mernbran nitroseiulosa dan dibiarkan mengering sehingga antigen
terikat pada rnembran, Kcmudim rnernbran diblok dengan skim-PBS0,5%(b/v) dm

diinkubasi di &lam shaker water bath suhu37'C, kemudian skim yang berlebih
dibuang dan rnembran dicuci dengan PBS sebanyak tiga kali. sfgA manusia (Sigma)

diteteskm di atas antigen yang terikrtt padst rnembran sebanyak: 5p1 yang diencerkan
dengan PBS Iima kali, diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37C.

Untuk

rnenghilangkan ancibodi y m g tidak berikatan dengan antigen, mernbran dicuci
dengan PBS sebanyak tiga kali. Mernbran ditetesi dengan 5 ~ konjugace
1
(rabbit anti

human) (Sigma) dan diinkubasi selama satu jam pada suhu mmg. Untuk melihat hasil

uji ditambahkan lamtan a-chloronaptholyang ditambak N2U2( 9 rng a-chloronapthof

+ 3 rnl methanol -I-25 mf PBS + 2 rnf H202 3% V/V) . Bila hasil uji pasitif rnakt aican
tamp& titiUlingkaran hitam pada mernbrm.

Analisis pertumbuhan EPEC K l .l di dalam larutan sIgA manusia
EPEC KI .1 diturnbuhkan pada media LB selama 8 jam, Sd dipmen dengan

sentrifugasi 300 rpm se1m 15 menit dm dicuci dengan PBS sekali. Kernudian

bakteri ditumbuhkm pada media 1/20 LB yang disuplementasi dengan Q,4-0,6 mgml

sIgA dengan btal jumlah bateri awal lo2 cfu/ml. Sebagai kontral, bakteri juga

diturnbukkan pada media 1/10 XB
, yang ditambah bufer sXgA yang terdiri dari &Of. M
Tris-HC1,O. 1 M NaCl, dan 15 m M Na Azida. Pertumbuhan bakteri diamati seiama 24

jam,dilakukm dengan cam menyebar kultur pada media EMB (Eosin Metiline Blue
agar) setiap 4 jam sekali dm diinkubasi pada suhu 37'C. Sernua perlakuan dibuat dua
kali. Pengarnatan dilakukan dengan rnenghitung jurnlah koloni sel yang turnbuh
sealah 12 jam.

Untuk rnengetahui pengaruh sIgA terhadap perturnbuhan EPEC KI .1
dilakukan dengan mernbandingkan pupulasi EPEC pada kultur dengan sIgA dan
dengan bufer, Data yang diperolel~kernudian dianalisa dcngan rnengunakan O~re
Way Anuva.

HASZL DAN PEMBAHASAN
Pemurnian Protease
Protease ekstraseluler Escherichiu coli K 1 .1 dapat disintesis secara konsisten
j i ka diproduksi pada kondisi perturnbuhan yang sesuai.EPEC K l .1 rnerupakan isolat

yang menghasilkan pratease ekstraseluler dengan aktivitas tertinggi pada substrat
musin (Kusun~ayanti 1998). Aktivitas pratease ekstrascluler EPEC K1.1 hasil

krornatografi fi ltrasi gel terhadap nus sin dapat dilihar pada tabel 2.
Tabel 2. Aktivitas Proteasc Ekstraseluler EPEC KT. 1 terhadap Substrat Musin pacla
Beberapa Tingkat Pemurnian
Aktivitas
Tingkat
f Konsentrasi f Aktivi t as
Proscdur Pemurnian
Protein
Protease
Spesifik
~ernurnian
(rnglmt)
1 (UEl~nl)
Ekstrak Kasar
0.73
0.48
Pengendapan dengan
Arnaniurn sulfat
6.98
Eiialisis
I
3,2
6,8
6.8
Krornata~rafiFiltrasi 1
1.08

I
I

I

I

/

I

I

1

Pemurnian perlu dilakukan untuk rnenghilangkan kolztaminan seperti IogamIagam berat, karbohidrat, dan garam organik, karena kontaminan tersebut dapat.
mengganggu kerja enzirn. Kromatografi fil trasi gel rnerupakan tzthapan pemurnian

untuk rnenghilangkan protein-protein kantarninan dari enzim. Pernisahan dari protein
pengotor ini dilakukan berdasarkan perbedam berat atau ukuran malekul protein.
Protein yang berukuran lebi h besar dan lebih berat a