Production of Chimeric Mice by Aggregation Embryos Method

Prosisino Seminar Hasil-Hasil Penelitian Bidano lImu Havat

BRODUKSI KNIMERA MENCIT DENGAN METODE GGREGASI EMBRIO
PRODUCTION OF CHIMERIC MICE BY AGGREGATION EMBRYOS METHOD
Rosadi, B."), A. I3oediono2),K. A4ohamad2),S. ~ g u n ~ ~ r i ~dan
o nU.
o ~ u) k r a ~ '
2'

" Fakultas Peternakan Universitas Jambi
Bagian Anatomi Fakultas Kedokteran Hewan Institui Pertanian Bogor

ABSTRACT
The objective of this experiment was to study the developmental competence of single and
aggregated embryos in vitro and phenotyfic aspects of chimeric mice. Chimeric embryos
were produced by aggregation of 8-cell stage embryos from two strains of mice that have
different coat coloration (white and brown). Zona pellucida were removed using 0.25%
pronase and aggregation was done by physically micro-manipulation. The aggregation rate
between combination of white mice embryos (W:W) and white mice embryos and brown
mice embryos (W:B) (56/64, 87.5% and 41/46, 89.1% for W:W and W:B). Zona removal
and aggregation did not affect (P>0.05) the development competence of embryos cultured in

vitro up to expanded blastocyst stage. The development rate embryo up to expanded
blastocyst of single embryo with zona, without zona and aggregated two ernbryos was not
different (PS.05) among the treatment (64/74, 86.5%; 24/32, 75.0% and 39/54, 72.2% for
single embryo with zona, without zona and aggregated two embryos, respectively). Twenty
four aggregated embryos (W:B) were transferred to pseudopregnant recipient, two chimeric
mice were born phenotypically white color with brown spotted (male and female).
Biological tested showed that both female and male chimeric produced mic-e were
fertil.These results concluded that chimeric mice could be produced by aggregation of 8-cell
stage embryos and cultured in vitro without zona pellucida. The development competence of
embryo in viti-o was not affected by zona removal and aggregation.

..

.

-.

,

.

a-

ABSTRAK
.
."

Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari kapasitas perkembangan embrio tunggal dan
agregat embrio in vitl-o serta aspek fenotip dari mencit khimera. Embrio khimera diproduksi
dengan metode agregasi embrio tahap 8-seI dari dua strain mencit dengan warna rambut
yang berbeda (putih dan coklat). Zona pe'tusida dihilangkan menggunakan enzlrn pronase
0,25% dan agregasi dilakukan secara manipulasi mikro. Keberhasilan agregasi tidak berbeda
nyata (P>0,05) antara dua embrio mencit putih (P:P) dan embrio mencit putih dengan mencit
coklat ( P C ) (56164, 87,5% dan untuk P:P dan P:C 41/46? @,I%). Penghilangan zona dan
agregasi tidak mempengaruhi (P>0,05) kapasitas perkembangan embrio in vitro yang
dikuftur sampai tahap blastosis. Persentase blastosis ekspan tidak berbeda (P>Q,05) antara
embrio tunggal dengan zona, tunggal tanpa zona dan agregat dua embrio, rnasing-rnasing
(64/74, 86,5%; 24/32, 75,0% dan 39/54, 72,2%). Dua puluh empat agregat dua embrio (PC)
ditransfer ke betina resipien, dua khimera lahir belang putih-coklat dengan jenis kelamin
jantan dan betina. Hasil uji biologis perkawinan alami dengan mencit putih atau coklar

menunjukkan kedua mencit khimera tersebut fertil. Dari penelitian ini dapat disimpulkan
b;hwa khimera mencit dapat diproduksi defigan agregasi embrio tahap 8-sel yang dikultur in
vitro tanpa zona pelusida. Perkembangan embrio in vitro tidak dipengaruhi oleh
penghilangan zona dan agregasi.
Pusat Antar Universitas Ilmu Hayat I P B
Bogor, 16 September 1999

Prosising Seminar Hasil-Hasil Penelitian Bidang //mu Hayat

PENDAHULUAN
Berbagai macam metode digunakan dalam penelitian biologi perkembangan. Salah
satu teknik yang digunakan adalah pembuatan hewan khimera. Di dalam individu khimera
terdapat dua macam atau lebih populasi sel yang memiliki kandungan material genetik yang
berbeda. Khimera berguna untuk mempelajari jalur perkembangan sel pada embrio yang
sedang tumbuh (West disitasi Piedrahita et al., 1992), determinasi seks (Mc Laren, 19751,
interaksi sel (Papaiannou disitasi Piedrahita et al., 1992) dan menyelamatkan hewan dari
kemungkinan fenotip letal (Surani et al., 1977; Stevens, 1978; Boediono et al., 1999).
Khimera dapat diproduksi dengan menambahkan populasi sel ke dalam embrio pada
berbagai tahap perkembangan dini (Hogan et al., 1986; Polzln et aE., 1987) atau agregasi
pada tahap cleavage lebih awal (Mintz et al. dalam Gilbert, 1988; Piedrahita et al., 1992;

Boediono et al., 1995). Pada hewan mamalia tertentu khimera dapat diproduksi dengan
tranplantasi bagian embrio tahap lanjut dengan terminasi yang sudah diketahui ke individu
lain yang berbeda spesies (Gilbert, 1988).
Beberapa penelitian menunjukkan bahwa agregat embrio khimera memiliki kelebihan
dibandingkan zrnbrio tunggal. Dengan memanfaatkan sifat interaktif antar sel-sel blastorner,
teknik agregasi dapat meningkatkan viabilitas embrio partenogenetik in vitro dan in utero
sehingga sel-selnya dapat terdistribusi pada khimera yang lahir (Stevens, 1978; Fundele et
al., 1991; Boediono et al., 1999) meskipun kontribusi sel-sel partenogenon kurang dari 20%

dari total populasi sel (Surani et al., 1977). Khimera yang terbentuk melalui teknik ini juga
memungkin-kan mendapa6kan .sex ratio yang febih besar jantan, pada meneit 15% khimera

X X - X Y tumbuh menjadi betina, 6% intersex dan 80% jantan (Mullen dan Whitten, 1971;
Mc Laren, 1975).
Beberapa aspek agregat ernbrio yang merupakan talliapan produksi hewan khimera
perlu ditelaah. Untuk mendapatkan gambaran yang lebih jelas tentang karakteristik agregat
embrio khimera diperlukan penelitian khususnya yang difokuskan pada kapasitas
perkembangan dan fenotip yang muncul. Penelitian ini bertujuan mempelajari kapasitas
perkembangan irr i/itiz, embrio khimera diproduksi dengan teknik agregasi embrio penuh
tahap 8-sel serta fenotip yang muncul.

Pusat Antar Universitas Ilmu Wayai I P B
Bogor, 16 September 1999

-

Prosising Seminar Hasil-Hasil Penelitian Bidang //mu Hayat

BAHIAN DAN METODE
Embrio dikoleksi dari mencit putih dan mencit dengan fenotip warna coklat. Mencit
berumur 2-3 bulan disuperovulasi dengan penyuntikan 5 IU PMSG @regnant mare's serum
gonadotrophine, hlligon, Intervet, New Zealand) diikuti injeksi 5 IU hCG (human
chorionic gonadotrophine, Chorulon, Intervet, New Zealand) intraperitoneum 48 jam
berikutnya. Mencit yang sudah diprogram dikawinkan dengan jantan dari strain yang sama
setelah penyuntikan hC6. Keberhasilan perkawinan diamati dengan perneriksaan sumbat
vagina pada keesokan harinya. Embrio tahap 8-sel dikoleksi dengan cara seksi pada tuba
falopii menggunakan spuit 2 6 6 dalam medium M2 disuplementasi 2 rng/rnl BSA (bovine
serum alburnin, Gibco, USA) pada suhu 37OC.
Embrio hasil koleksi dicuci dengan medium M2 (Hogan et al., 1986) dan dilakukan
evaluasi. Hanya embrio tahap 8-sel yang digunakan untuk agregasi. Metode agregasi

dilakukan dengan menggabungkan dua embrio setelah zona pelusida dihilangkan (Gambar
1). Penghilangan zona dilakukan dengan menempatkan embrio daIam medium M2

mengandung 0,2596 pronase (Sigma, USA) selama 2-4 menit. Ernbrio tanpa zona dicuci tiga
kali dalam medium CZB (Chatot et al., 1989) yang telah dlsuplementasi 3 rng/ml BSA dan
5,56 rnNl glukosa. Agregasi dilakukan dalam drop (10 p1 medium CZB) dengan cara
mendekatkan embrio satu sama lain secara manipulasi mikro. Setiap drop hanya berisi satu
agregat, kombinasi antara embrio mencit putih : embrio mencit putih (P:P) dan embrio
mencit putih : embrio mencit coklat (P:C). Embrio agregat dikultur
lebih ]anjut pada sohu
-.
37OG dengan kondisi udara 5% COz, 5% O2 dan 90% N2 selama 48 jam. Reagregasi
dilakukan empat jam setelah agregasi bila didapatkan pasangan embrio yang tidak
teragregasi. Perkembangan embrio pada kultur in vitro diamati dengan interval waktu 24
jam.
Agregat embrio yang mencapai tahap blastosis ditransfer ke betina pseudopregnant
pada hari ke-4 kebuntingan (Johnson et al., 1996). Betina pseudopregnant diperoleh dengan
mengawinkan betina satu hari setelah betina donor dikawinkan menggunakan jantan yang
telah divasektomi. Betina yang positif kawin (ditandai adanya sumbat vagina) digunakan
sebagai resipien

Pusat Antar Universitas Ilmu Hayat I P B
Bogor, 16 September 1999

45

Prosising Seminar Hasil-Hasil Penelitian Bidang Nmu Hayat

--

PENGHIUNGAN
ZONA PELUSIDA

MENCIT PUTIH

AGREGASI

A.

Gambar 1 . Metode agregasi ernbrio rnencit putih dan embrio mencit coklat pada produksi

khimera
Dalam penelitian ini evaluasi dilakukan dengan pengamatan terhadap: a) perolehan
embrio hasil superovulasi, b) keberhasilan agragasi, c) keberhasilan perkernbangan embrio
pada kultur in vitro, dan d) penampilan eksterior dari khirnera yang dihasilkan.
Data perkembangan embrio dan agregat embrio sarnpai tahap blastosis dianalisis
dengan uji khi-kuadrat. Hasil panen ernbrio, keberhasilan agregasi dan komposisi fenotip
dianalisis menggunakan uji t (Student). Data disajikan dalarn bentuk rataan It standar deviasi
(Steel dan Torrie, 1991).

RASIL DAN PEMBAMASAN
Pernanenan ernbrio pada awal hari ketiga setelah fertilisasi dimaksudkan untuk
mendapatkan embrio tahap 8-sel

yang dianggap paling baik untuk dilakukan agregasi

(Mullen dan Whitten, 1971). Waktu pemanenan tersebut disesuaikan tahapan perkembangan
embrio irz vivo (Hogan et at., 1986).
Hasil panen pada Tabel 1 menunjukkan bahwa pada kedua strain yang dipanen pada
hari ke-3 sebagian besar perolehan embrio berada pada tahap perkembangan 8-sel. Rataan
jurnlah embrio yang diperoleh tiap ekor betina tidak menunjukkan perbedaan yang nyata

Pusat A n t a r Universitas Ilmu Hayat I P B
Bogor, 16 S e p t e m b e r 1999

46

Prosising Seminar Hasil-Hasil Penelitian Bidang //mu Hayai

antara keduanya (P