Production of mice cloned embryo by development of Somatic Cell Nuclear Transfer Technique
PRODUKSI EMBRIO KLONING MENCIT DENGAN
PENGEMBANGAN TEKNIK TRANSFER INTI SEL SOMATIS
HARRY MURTI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul Produksi Embrio Kloning
Mencit dengan Pengembangan Teknik Transfer Inti Sel Somatis adalah benar
karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Juli 2013
Harry Murti
NIM B362080041
RINGKASAN
HARRY MURTI. Produksi Embrio Kloning Mencit dengan Pengembangan
Teknik Transfer Inti Sel Somatis. Dibimbing oleh ARIEF BOEDIONO,
MOKHAMAD FAHRUDIN dan MOHAMAD AGUS SETIADI.
Sel punca embrionik pada umumnya diperoleh dari embrio hasil fertilisasi,
namun sekarang dilaporkan bahwa embrio juga dapat diperoleh dari hasil Transfer
Inti Sel Somatis (TISS). Prosedur ini diharapkan dapat mengatasi masalah etik
dalam penggunaan embrio yang sebelumnya dihasilkan untuk tujuan reproduksi.
Tingkat efisiensi kloning reproduksi yang relatif sangat rendah menjadi salah satu
alasan menjajaki pemanfaatan TISS untuk kepentingan biomedis yaitu
memproduksi ntESC. Embrio kloning mengalami hipermetilasi DNA yang diduga
merupakan salah satu penyebab perkembangannya tidak bisa optimal
Penelitian memiliki lima tujuan utama, yaitu: (1) melakukan optimasi
perlakuan superovulasi, metode aktivasi, dan enukleasi pada mencit sebagai
hewan model; (2) untuk memproduksi embrio kloning, embrio partenogenetik,
dan embrio fertilisasi in vivo mencit; (3) mempelajari tahapan perkembangan praimplantasi pada kultur in vitro; (4) menentukan tahap siklus sel kumulus dengan
menggunakan analisa flowcytometri; (5) mengkaji pengembangan teknik TISS
dengan perlakuan penambahan Scriptaid sebagai senyawa penghambat enzim
HDAC (histones deacetylases).
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa dosis PMSG dan hCG 7,5 IU
dapat meningkatkan jumlah oosit pada aplikasi superovulasi. Perlakuan dengan
medium CZB & CB & SrCl2 (medium segar) selama enam jam (perlakuan C)
merupakan metode aktivasi yang paling optimal dan dapat mencapai tingkat
aktivasi 97,21%. Penambahan sukrosa 3% dapat meningkatkan keberhasilan
enukleasi. Hasil menunjukkan bahwa aplikasi TISS dapat menghasilkan embrio
kloning yang mampu berkembang hingga mencapai tahap blastosis (3,2%).
Embrio partenogenetik yang dihasilkan oleh aktivasi buatan dapat berkembang
hingga tahap blastosis (8,6%). Hasil penelitian menunjukkan bahwa sel kumulus
yang dipakai sebagai donor inti berada pada tahap siklus sel G0/G1. Sel kumulus
ini yang berukuran 5-7µm dan populasinya sebesar 70,84% dari total sel kumulus
yang diisolasi. Tahap enukleasi dapat mencapai tingkat efisiensi sebesar 49%,
sedangkan tahap transfer inti dapat mencapai tingkat efisiensi 40,8%.
Penambahan Scriptaid berhasil meningkatkan efisiensi embrio kloning yang
mencapai tahap blastosis menjadi 10,8%. Tingkat efisiensi tersebut naik lebih dari
3 kali lipat dibandingkan dengan kontrol (3,2%).
Optimasi terhadap perlakuan superovulasi, enukleasi, dan metode aktivasi
dapat meningkatkan efisiensi aplikasi TISS untuk memproduksi embrio kloning
mencit. Sel kumulus yang digunakan sebagai donor inti telah dipastikan pada
tahap siklus sel G0 atau G1. Embrio kloning mencit dapat dihasilkan melalui
aplikasi TISS. Perkembangan praimplantasi secara in vitro embrio fertilisasi dan
partenogenetik masih lebih baik dibandingkan dengan embrio kloning.
Penambahan HDACi (Scriptaid dan TSA) dapat meningkatkan tingkat efisiensi
hingga tiga kali lipat dibandingkan dengan kontrol.
Kata kunci: superovulasi, enukleasi, activasi, embrio kloning, scriptaid
SUMMARY
HARRY MURTI. Production of mice cloned embryo by development of Somatic
Cell Nuclear Transfer Technique. Supervised by ARIEF BOEDIONO,
MOKHAMAD FAHRUDIN and MOHAMAD AGUS SETIADI.
Embryonic stem cells can be obtained from an embryo generated through
fertilization, recently it has been reported that an embryo can also be generated
asexually through Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT). This procedure will
overcome the ethical issue regarding the usage of embryo that was initially
generated for reproductive purposes. The low efficiency of reproductive cloning is
one of the reasons to explore the use of SCNT for biomedical purpose,
specifically through nuclear transfer Embryonic Stem Cell (ntESC) production.
Cloned embryos undergo DNA hypermethylation, which is thought to be one of
the causes of sub-optimal growth.
This study has five main objective that include the following: (1) to obtain
an optimized oocyte superovulation, activation method, and enucleation using
mice oocytes as a model; (2) to produce mouse cloned embryo, parthenogenetic
embryo, and in vivo fertilized embryo; (3) to study the stages of pre-implantation
development in vitro culture; (4) to determined the cumulus cell cycle using flow
cytometry; (5) to study the development of SCNT technique by adding Scriptaid
as an inhibitory enzyme HDAC (histone deacetylase).
This study showed that using doses of 7.5 IU PMSG and hCG hormones can
increase the oocyte cell production optimization through superovulation
treatment. The most optimal method of activation is medium CZB & CB & SrCl2
(fresh medium) for six hours (method C) to activate oocyte cells until it reaches
the level of activation of 97.21%. The addition of 3% sucrose able to increase the
enucleation rate. The result of the research indicated that SCNT application is able
to produce cloned embryos which are capable to develop to blastocyst stage
(3,2%). In addition artificial activation of oocytes could produce parthenogenetic
embryos which are capable to develop up to the blastocyst stage (8,6%). The
results show that cumulus cells used as nuclei donors are in the G0/G1 cell cycle
phase. The cumulus cells measure at 5-7 µm in diameter and accounts for 70,84%
of the total isolated cumulus cell population. The enucleation process could
achieve an efficiency rate of 49%, while the nuclear transfer achieves a 40,8%
efficiency rate. The addition of Scriptaid successfully increase the embryonic
cloning at the blastocyst stage’s success rate to 10,8%. This efficiency rate is three
times higher compared to the control, which only shows a 3,2% success rate.
Optimization of the superovulation treatment, enucleation, and the
activation method could improve the efficiency of SCNT application to produce
cloned mice embryos. Cumulus cells were used as donor nuclei has been
confirmed at G0 or G1 stage of the cell cycle. Embryos cloned mice could be
generated through the SCNT application. Preimplantation development of
fertilized and parthenogenetic embryos still better than the cloned embryos. The
addition of Scriptaid and TSA could increase the level of efficiency of up to threefold compared with controls.
Keywords: superovulation, enucleation, activation, cloned embryo, scriptaid
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2013
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
PRODUKSI EMBRIO KLONING MENCIT DENGAN
PENGEMBANGAN TEKNIK TRANSFER INTI SEL SOMATIS
HARRY MURTI
Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor
pada
Program Studi Biologi Reproduksi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Penguji pada Ujian Tertutup: Prof. Dr. Ir. Cece Sumantri, MAgr.Sc
Drh. Ni Wayan Kurniani Karja, MP, Ph.D.
Penguji pada Ujian Terbuka: Prof. Amin Soebandrio W.K. Ph.D, dr., Sp.MK (K)
Dr. drh. Bambang Purwantara, M.Sc
PRAKATA
Assalamu’alaikum warrohmatullohi wabarokatuh,
Puji dan syukur Alhamdulillah penulis panjatkan kepada Alloh Subhanahu
Wa Ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan
dengan baik. Karya ilmiah ini merupakan hasil dari penelitian jenjang doktoral
yang dilakukan di Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Prof. Dr. drh. Arief Boediono selaku
ketua komisi pembimbing, Dr. drh. Mokhamad Fahrudin dan Prof. Dr. drh. M.
Agus Setiadi selaku anggota komisi pembimbing yang dengan penuh ketulusan
memberikan arahan dan saran selama penulis melaksanakan penelitian hingga
penulisan disertasi.
Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Prof. Dr. Ir. Cece Sumantri,
MAgr.Sc dan Drh. Ni Wayan Kurniani Karja, MP, Ph.D selaku penguji luar
komisi pada Ujian Tertutup, Prof. Amin Soebandrio W.K. Ph.D, dr., Sp.MK (K)
dan Dr. drh. Bambang Purwantara, M.Sc, selaku penguji luar komisi pada Ujian
Terbuka, atas segala kritik dan saran yang sangat bermanfaat untuk
menyempurnakan tulisan ini.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Rektor, Dekan Sekolah
Pascasarjana, Dekan Fakultas Kedokteran Hewan, Ketua Departemen Klinik,
Reproduksi dan Patologi, Ketua Program Studi, staf pengajar dan staf administrasi
Biologi Reproduksi, serta seluruh staf Pascasarjana IPB yang telah menerima
penulis untuk melanjutkan studi di IPB serta membantu kelancaran proses
penyelesaian studi penulis. Ucapan yang sama juga disampaikan kepada jajaran
direksi PT. Kalbe Farma, Tbk. yang telah memberikan ijin studi dan dukungan
finansial (beasiswa) dalam rangka penyelesaian studi penulis.
Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Dr. drh. Ita Djuwita, M. Phil,
sebagai Kepala Laboratorium Embriologi, Bagian Anatomi, Histologi dan
Embriologi, Depertemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi, Fakultas
Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor yang telah memberi ijin kepada
penulis untuk melakukan penelitian dan menggunakan berbagai fasilitas yang ada
di laboratorium tersebut, kepada drh. Kusdiantoro Muhammad, drh. Wahono Esti
Prasetyaningtias, M.Si, atas dukungan dan bantuan dalam bentuk informasi ilmiah
yang diterima penulis selama studi di Bogor. Kepada rekan-rekan senior, Dr. Ir.
Thomas Mata Hine, MS, Dr. drh. I Wayan Batan, MS, Bayu Rosadi, S.Pt, M.Si
atas segala dukungan dan bantuannya. Kepada laboran, Mas Wahyu dan Ibu Yani
atas segala kebaikan dan bantuannya selama penulis melakukan penelitian di
Laboratorium Embriologi.
Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada Owner dan Founder PT.
Kalbe Farma, Tbk. Yaitu Dr. Boenjamin Setiawan Ph.D atas kepercayaan dan
kesempatan yang diberikan kepada penulis dalam bentuk beasiswa selama
menempuh studi di SPs IPB. Kepada kolega di Stem Cell and Cancer Institute
(SCI) yaitu Indra Bachtiar Ph.D, Yuyus Kusnadi Ph.D, Ahmad Utomo Ph.D, Andi
Utama Ph.D, Drs. Sie Djohan Apt., drg. Ferry Sandra Ph.D., dr. Caroline Tan
Sardjono Ph.D., Fernandina Stella Setiawan BSc, Maurin Merlina S.Si, Yurista
Septiani Dewi Apt., MSi, Halida Widyastuti BSc, Sonya A. Tandy Apt., Wara
Noveka, Wireni Ayuningtyas S.Si atas dukungan yang diberikan kepada penulis
selama menyelesaikan pendidikan program doktor di SPs IPB.
Kepada rekan-rekan saya, Dwi Agustina, S.Si, M.Si, Dini Budiharko, S.Si,
M.Si, Riris Lindiawati Puspitasari, S.Si, M.Si, Dr. Enny T. Setiatin, Nuril Farizah,
S.Pi, M.Si, Sigit Prastowo, S.Pt, M.Si, Adkhilni Utami, S.KH, dan Dr. Irma
Andriani, S.Pi, M.Si. Kepada rekan satu angkatan BRP 2008 yaitu Dr. drh. Sri
Wahyuni, M.Si, Dra. Ekayanti M. Kaiin, M.Si, Dr. Tatan Kostaman, S.Si, MP
serta semua rekan-rekan mahasiswa BRP atas hubungan baik dan kerjasamanya
selama studi.
Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayahanda Drs. Mardjoko
Muljono, ibunda drg. Djauhar Harini, istri tercinta Laura Angelia, Amd., adinda
Handaka Murti & Bayu Murti, keluarga besar bapak Ferry Firdaus Salindeho &
ibu Komala Gandasamita, keluarga besar Alm. Widyoharsono & Alm. Moh.
Tarom serta seluruh keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya. Semoga karya
ilmiah ini bermanfaat.
Wassalamu’alaikum warrohmatullohi wabarokatuh
Bogor, Juli 2013
Harry Murti
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
xiii
xiv
xv
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
1
1
1
2
2
3
TINJAUAN PUSTAKA
Transfer Inti Sel Somatis
Siklus Sel Resipien dan Donor Inti
Sinkronisasi Siklus Sel dan Aktivasi
Modifikasi Epigenetik pada Embrio Kloning
Perkembangan Embrionik Praimplantasi
3
3
4
5
6
7
OPTIMASI SUPEROVULASI, METODE AKTIVASI, DAN
ENUKLEASI
PADA
PENGEMBANGAN
TEKNIK
TRANSFER INTI SEL SOMATIS
Abstract
Abstrak
Pendahuluan
Metode Penelitian
Hasil dan Pembahasan
Simpulan
8
8
8
9
10
12
17
PRODUKSI DAN KULTUR IN VITRO EMBRIO
KLONING DAN EMBRIO PARTENOGENETIK MENCIT
Abstract
Abstrak
Pendahuluan
Metode Penelitian
Hasil dan Pembahasan
Simpulan
18
18
18
19
21
24
29
PRODUKSI EMBRIO KLONING MENCIT DENGAN
PENAMBAHAN
SCRIPTAID
PADA
APLIKASI
TRANSFER INTI SEL SOMATIS
Abstract
Abstrak
Pendahuluan
Metode Penelitian
Hasil dan Pembahasan
Simpulan
30
30
30
31
32
36
39
PEMBAHASAN UMUM
41
SIMPULAN DAN SARAN
44
DAFTAR PUSTAKA
45
LAMPIRAN
51
RIWAYAT HIDUP
56
DAFTAR TABEL
1. Perlakuan superovulasi untuk menghasilkan sel oosit
2. Perlakuan metode aktivasi sel oosit
3. Keberhasilan enukleasi inti oosit (sel resipien)
4. Tahapan perkembangan kultur embrio secara in vitro
5. Siklus sel kumulus sebagai donor inti setelah isolasi
6. Hasil enukleasi & transfer inti pada produksi embrio kloning mencit
7. Perkembangan sel embrio kloning mencit secara in vitro
12
15
16
27
37
38
38
DAFTAR GAMBAR
1. Sel oosit mencit hasil superovulasi
2. Sel oosit setelah diaktivasi
3. Enukleasi dengan menggunakan sukrosa 3%
4. Isolasi sel oosit dan sel cumulus
5. Aplikasi Transfer Inti Sel Somatik
6. Tahapan perkembangan embrio kloning
7. Grafik hasil analisa flowcytometri sel kumulus setelah isolasi
8. Sel kumulus setelah isolasi
9. Tahapan perkembangan kultur in vitro embrio kloning
14
15
17
25
26
28
36
37
39
DAFTAR LAMPIRAN
1. Komposisi larutan stok CZB
2. Larutan stok CZB- PVA
3. Larutan stok kalsium
4. Larutan stok strontium
5. Larutan stok cytochalasin B
6. Larutan stok hyaluronidase
7. Resep Medium CZB
6. Resep medium M2
52
52
52
52
52
53
53
55
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perkembangan teknik Transfer Inti Sel Somatis (TISS) telah menjadi tren
baru dalam kemajuan ilmu embriologi dan biomedis (McLaren 2000). Aplikasi
ini menjadi sangat populer setelah terungkap dari beberapa hasil studi yang
meneliti tentang kemungkinan pemanfaatan teknik transfer inti untuk
memproduksi ntESC (nuclear transfer Embryonic Stem Cell) dan
pemanfaatannya untuk terapi penyakit degeneratif (Hochedlinger & Jaenisch
2003). Teknik TISS pada dasarnya meliputi enukleasi (pengeluaran inti oosit
resipien), transfer inti (inti sel somatis dimasukkan ke dalam sitoplasma oosit
resipien), dan aktivasi (menginduksi oosit hasil rekontruksi untuk mengalami
nuclear reprogramming dan berkembang seperti embrio yang normal)
(Colman 2000).
Aplikasi TISS untuk memproduksi ntESC memberi harapan baru dalam
pengembangan therapeutic cloning sebagai alternatif pengobatan berbagai
penyakit degeneratif. Secara teoritis ntESC memiliki beberapa keunggulan
dibandingkan dengan sel punca (stem cell) dari sumber yang lain. Transplantasi
ntESC yang bersifat autologous diharapkan mampu mengatasi masalah
penolakan sistem imun pada penderita (Cibelli et al. 2001). Ketidakcocokan
karakter HLA (Human Lymphocyte Antigen), antara sel donor dengan sel
pasien menyebabkan sel donor dianggap sebagai substansi asing yang dapat
menimbulkan reaksi penolakan yang dikenal dengan “graft versus host
diseases” (Wobus & Boheler 2005). Pemanfaatan ntESC dalam terapi berbasis
sel (cell replacement therapy) berpotensi dapat mengatasi permasalahan
penolakan sistem imunitas tersebut karena memiliki genom yang sama dengan
sel-sel dari individu yang sakit (Moon et al. 2006). Berdasarkan hasil
penelitian sebelumnya telah dilaporkan bahwa ESC dapat diarahkan menjadi
sel-sel neuron (Wakayama et al. 2001), ginjal (Hipp & Atala 2004), otot
jantung (Kodifis et al. 2004), dan pankreas (Paek et al. 2005).
Keberhasilan kloning dengan teknik TISS telah mengubah pandangan
tentang pola ekpresi gen yang ternyata bersifat reversibel. Inti sel somatis yang
telah memiliki pola ekspresi gen tertentu sesuai dengan jenis dan fungsinya,
setelah mengalami nuclear reprogramming dapat mengalami perubahan pola
ekspresi gen menjadi seperti pada tahap perkembangan embrionik (Wilmut et
al. 2002).
Perumusan Masalah
Salah satu kendala pada aplikasi TISS baik untuk memproduksi ntESC
maupun hewan kloning adalah rendahnya tingkat efisiensi perkembangan
embrio hasil TISS hingga tahap blastosis dan keberhasilan kultur sel lestari
ntESC (Gurdon et al. 2003). Penelitian sebelumnya menunjukkan adanya
indikasi bahwa penyebab rendahnya efisiensi pada embrio hasil kloning adalah
proses nuclear reprogramming belum berjalan secara sempurna, sehingga inti
2
sel belum sepenuhnya dapat berubah pola ekspresi genetiknya menjadi seperti
pola perkembangan embrionik (Hochedlinger & Jaenisch 2003). Berbagai
pengembangan teknik TISS telah dilakukan, namun hingga saat ini belum
diperoleh hasil yang memuaskan. Selain itu aplikasi TISS pada manusia masih
menjadi perdebatan dalam masalah etika, sehingga pengembangan teknik ini
lebih banyak dikaji pada hewan coba (Murti et al. 2008).
Materi genetik (genom) dan urutan DNA pada sel somatik yang
menyusun satu individu pada dasarnya sama. Dinamika perubahan gen yang
aktif dan non aktif merupakan penyebab terjadinya modifikasi epigenetik.
Teknik kloning dapat memfasilitasi modifikasi epigenetik yaitu memprogram
kembali sel yang telah berdiferensiasi (sel somatik) menjadi ke tahapan awal
embrionik yang bersifat totipoten (Wang et al. 2007). Modifikasi epigenetik
diduga memegang peranan penting pada proses nuclear reprogramming,
walaupun hingga saat ini mekanisme pemrograman belum diketahui
(Humpherys et al. 2001). Pada embrio kloning telah diketahui bahwa setelah
aktivasi, akan terjadi peningkatan hipermetilasi DNA dan deasetilasi histon
(Wang et al. 2007). Asetilasi histon juga berperan dalam modifikasi epigenetik
karena dapat mempengaruhi metilasi DNA dan ekspresi protein (Enright et al.
2003). Penelitian ini akan mengkaji pengembangan teknik TISS meliputi
optimasi superovulasi, optimasi enukleasi, optimasi metode aktivasi, penentuan
siklus sel donor inti, dan perlakuan penambahan Scriptaid sebagai senyawa
penghambat enzim HDAC (histones deacetylases), sehingga diharapkan dapat
meningkatkan efisiensi perkembangan embrio kloning hasil TISS.
Tujuan Penelitian
Secara umum, tujuan penelitian ini adalah mengembangkan teknik
TISS dengan perlakuan penambahan Scriptaid untuk meningkatkan efisiensi
produksi embrio kloning pada mencit. Tujuan khususnya adalah:
1. Melakukan optimasi superovulasi, enukleasi dan metode aktivasi untuk
pengembangan aplikasi TISS
2. Menentukan tahap siklus sel donor inti
3. Memproduksi embrio kloning dengan menggunakan aplikasi TISS
4. Mempelajari perkembangan embrio kloning secara in vitro dibandingkan
dengan embrio partenogenetik dan embrio fertilisasi in vivo
5. Mempelajari pengaruh penambahan Scriptaid dan Trichostatin A
terhadap perkembangan embrio kloning pada tahapan praimplantasi
Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat bagi pengembangan
teknik TISS untuk meningkatkan efisiensi produksi embrio kloning mencit.
Aplikasi TISS pada mencit juga dapat dikembangkan sebagai model dalam
penelitian biomedis dan konservasi satwa langka.
3
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini menggunakan oosit mencit hasil superovulasi dengan
penyuntikan hormon PMSG dan hCG secara intraperitonial. Produksi embrio
kloning menggunakan teknik TISS yang meliputi: enukleasi, transfer inti dan
aktivasi. Sel resipien adalah oosit pada tahap metaphase II sedangkan sel donor
inti adalah sel kumulus. Optimasi dilakukan untuk menentukan dosis hormon
PMSG dan hCG, metode aktivasi, dan enukleasi yang paling efektif. Siklus sel
donor inti dianalisa dengan menggunakan teknik flowcytometri. Perkembangan
praimplantasi embrio kloning secara in vitro dibandingkan dengan embrio hasil
fertilisasi in vivo dan embrio partenogenetik. Penambahan senyawa inhibitor
enzim Histone Deacetylase yaitu Scriptaid dilakukan sebagai upaya untuk
meningkatkan efisiensi aplikasi teknik TISS dalam menghasilkan embrio
kloning yang mampu berkembang hingga tahap blastosis.
TINJAUAN PUSTAKA
Transfer Inti Sel Somatis
Pada tahun 1997, Wilmut dan koleganya di Roslin Institute telah
berhasil memanfaatkan teknik TISS untuk memproduksi domba kloning yang
pertama di dunia. Domba Dolly adalah mamalia pertama yang dihasilkan
bukan dari proses fertilisasi, namun berasal dari inti sel somatis yang ditransfer
ke oosit dan selanjutnya dapat melakukan perkembangan embrionik seperti
embrio normal. Ada tiga fakta baru yang terungkap dari hasil penelitian
tersebut, yaitu (1) sel somatis yang telah berdiferensiasi masih menyimpan
potensi untuk dilakukan reprogramming setelah dikultur selama kurun waktu
tertentu, (2) sel somatis yang dikultur dengan kondisi rendah/tanpa serum dapat
masuk ke dalam tahap G0 dalam siklus sel, dan (3) aplikasi teknik TISS dapat
memprogram inti sel somatis dewasa kembali ke perkembangan tahap
embrionik (Wilmut et al. 1997).
Keberhasilan kloning Dolly memacu aplikasi TISS pada hewan
mamalia lainnya. Beberapa mamalia yang telah berhasil dikloning adalah
mencit (Wakayama et al. 1998 ), babi (Tomii et al. 2005), sapi (Kasinathan et
al. 2001), ferret (Li et al. 2003; Li et al. 2005), anjing (Lee et al. 2005), tikus
(Iannacone et al. 2001), dan kambing (Baguisi et al. 1999). Tingkat efisiensi
hasil kloning yang relatif sangat rendah (
PENGEMBANGAN TEKNIK TRANSFER INTI SEL SOMATIS
HARRY MURTI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul Produksi Embrio Kloning
Mencit dengan Pengembangan Teknik Transfer Inti Sel Somatis adalah benar
karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Juli 2013
Harry Murti
NIM B362080041
RINGKASAN
HARRY MURTI. Produksi Embrio Kloning Mencit dengan Pengembangan
Teknik Transfer Inti Sel Somatis. Dibimbing oleh ARIEF BOEDIONO,
MOKHAMAD FAHRUDIN dan MOHAMAD AGUS SETIADI.
Sel punca embrionik pada umumnya diperoleh dari embrio hasil fertilisasi,
namun sekarang dilaporkan bahwa embrio juga dapat diperoleh dari hasil Transfer
Inti Sel Somatis (TISS). Prosedur ini diharapkan dapat mengatasi masalah etik
dalam penggunaan embrio yang sebelumnya dihasilkan untuk tujuan reproduksi.
Tingkat efisiensi kloning reproduksi yang relatif sangat rendah menjadi salah satu
alasan menjajaki pemanfaatan TISS untuk kepentingan biomedis yaitu
memproduksi ntESC. Embrio kloning mengalami hipermetilasi DNA yang diduga
merupakan salah satu penyebab perkembangannya tidak bisa optimal
Penelitian memiliki lima tujuan utama, yaitu: (1) melakukan optimasi
perlakuan superovulasi, metode aktivasi, dan enukleasi pada mencit sebagai
hewan model; (2) untuk memproduksi embrio kloning, embrio partenogenetik,
dan embrio fertilisasi in vivo mencit; (3) mempelajari tahapan perkembangan praimplantasi pada kultur in vitro; (4) menentukan tahap siklus sel kumulus dengan
menggunakan analisa flowcytometri; (5) mengkaji pengembangan teknik TISS
dengan perlakuan penambahan Scriptaid sebagai senyawa penghambat enzim
HDAC (histones deacetylases).
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa dosis PMSG dan hCG 7,5 IU
dapat meningkatkan jumlah oosit pada aplikasi superovulasi. Perlakuan dengan
medium CZB & CB & SrCl2 (medium segar) selama enam jam (perlakuan C)
merupakan metode aktivasi yang paling optimal dan dapat mencapai tingkat
aktivasi 97,21%. Penambahan sukrosa 3% dapat meningkatkan keberhasilan
enukleasi. Hasil menunjukkan bahwa aplikasi TISS dapat menghasilkan embrio
kloning yang mampu berkembang hingga mencapai tahap blastosis (3,2%).
Embrio partenogenetik yang dihasilkan oleh aktivasi buatan dapat berkembang
hingga tahap blastosis (8,6%). Hasil penelitian menunjukkan bahwa sel kumulus
yang dipakai sebagai donor inti berada pada tahap siklus sel G0/G1. Sel kumulus
ini yang berukuran 5-7µm dan populasinya sebesar 70,84% dari total sel kumulus
yang diisolasi. Tahap enukleasi dapat mencapai tingkat efisiensi sebesar 49%,
sedangkan tahap transfer inti dapat mencapai tingkat efisiensi 40,8%.
Penambahan Scriptaid berhasil meningkatkan efisiensi embrio kloning yang
mencapai tahap blastosis menjadi 10,8%. Tingkat efisiensi tersebut naik lebih dari
3 kali lipat dibandingkan dengan kontrol (3,2%).
Optimasi terhadap perlakuan superovulasi, enukleasi, dan metode aktivasi
dapat meningkatkan efisiensi aplikasi TISS untuk memproduksi embrio kloning
mencit. Sel kumulus yang digunakan sebagai donor inti telah dipastikan pada
tahap siklus sel G0 atau G1. Embrio kloning mencit dapat dihasilkan melalui
aplikasi TISS. Perkembangan praimplantasi secara in vitro embrio fertilisasi dan
partenogenetik masih lebih baik dibandingkan dengan embrio kloning.
Penambahan HDACi (Scriptaid dan TSA) dapat meningkatkan tingkat efisiensi
hingga tiga kali lipat dibandingkan dengan kontrol.
Kata kunci: superovulasi, enukleasi, activasi, embrio kloning, scriptaid
SUMMARY
HARRY MURTI. Production of mice cloned embryo by development of Somatic
Cell Nuclear Transfer Technique. Supervised by ARIEF BOEDIONO,
MOKHAMAD FAHRUDIN and MOHAMAD AGUS SETIADI.
Embryonic stem cells can be obtained from an embryo generated through
fertilization, recently it has been reported that an embryo can also be generated
asexually through Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT). This procedure will
overcome the ethical issue regarding the usage of embryo that was initially
generated for reproductive purposes. The low efficiency of reproductive cloning is
one of the reasons to explore the use of SCNT for biomedical purpose,
specifically through nuclear transfer Embryonic Stem Cell (ntESC) production.
Cloned embryos undergo DNA hypermethylation, which is thought to be one of
the causes of sub-optimal growth.
This study has five main objective that include the following: (1) to obtain
an optimized oocyte superovulation, activation method, and enucleation using
mice oocytes as a model; (2) to produce mouse cloned embryo, parthenogenetic
embryo, and in vivo fertilized embryo; (3) to study the stages of pre-implantation
development in vitro culture; (4) to determined the cumulus cell cycle using flow
cytometry; (5) to study the development of SCNT technique by adding Scriptaid
as an inhibitory enzyme HDAC (histone deacetylase).
This study showed that using doses of 7.5 IU PMSG and hCG hormones can
increase the oocyte cell production optimization through superovulation
treatment. The most optimal method of activation is medium CZB & CB & SrCl2
(fresh medium) for six hours (method C) to activate oocyte cells until it reaches
the level of activation of 97.21%. The addition of 3% sucrose able to increase the
enucleation rate. The result of the research indicated that SCNT application is able
to produce cloned embryos which are capable to develop to blastocyst stage
(3,2%). In addition artificial activation of oocytes could produce parthenogenetic
embryos which are capable to develop up to the blastocyst stage (8,6%). The
results show that cumulus cells used as nuclei donors are in the G0/G1 cell cycle
phase. The cumulus cells measure at 5-7 µm in diameter and accounts for 70,84%
of the total isolated cumulus cell population. The enucleation process could
achieve an efficiency rate of 49%, while the nuclear transfer achieves a 40,8%
efficiency rate. The addition of Scriptaid successfully increase the embryonic
cloning at the blastocyst stage’s success rate to 10,8%. This efficiency rate is three
times higher compared to the control, which only shows a 3,2% success rate.
Optimization of the superovulation treatment, enucleation, and the
activation method could improve the efficiency of SCNT application to produce
cloned mice embryos. Cumulus cells were used as donor nuclei has been
confirmed at G0 or G1 stage of the cell cycle. Embryos cloned mice could be
generated through the SCNT application. Preimplantation development of
fertilized and parthenogenetic embryos still better than the cloned embryos. The
addition of Scriptaid and TSA could increase the level of efficiency of up to threefold compared with controls.
Keywords: superovulation, enucleation, activation, cloned embryo, scriptaid
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2013
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
PRODUKSI EMBRIO KLONING MENCIT DENGAN
PENGEMBANGAN TEKNIK TRANSFER INTI SEL SOMATIS
HARRY MURTI
Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor
pada
Program Studi Biologi Reproduksi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Penguji pada Ujian Tertutup: Prof. Dr. Ir. Cece Sumantri, MAgr.Sc
Drh. Ni Wayan Kurniani Karja, MP, Ph.D.
Penguji pada Ujian Terbuka: Prof. Amin Soebandrio W.K. Ph.D, dr., Sp.MK (K)
Dr. drh. Bambang Purwantara, M.Sc
PRAKATA
Assalamu’alaikum warrohmatullohi wabarokatuh,
Puji dan syukur Alhamdulillah penulis panjatkan kepada Alloh Subhanahu
Wa Ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan
dengan baik. Karya ilmiah ini merupakan hasil dari penelitian jenjang doktoral
yang dilakukan di Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Prof. Dr. drh. Arief Boediono selaku
ketua komisi pembimbing, Dr. drh. Mokhamad Fahrudin dan Prof. Dr. drh. M.
Agus Setiadi selaku anggota komisi pembimbing yang dengan penuh ketulusan
memberikan arahan dan saran selama penulis melaksanakan penelitian hingga
penulisan disertasi.
Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Prof. Dr. Ir. Cece Sumantri,
MAgr.Sc dan Drh. Ni Wayan Kurniani Karja, MP, Ph.D selaku penguji luar
komisi pada Ujian Tertutup, Prof. Amin Soebandrio W.K. Ph.D, dr., Sp.MK (K)
dan Dr. drh. Bambang Purwantara, M.Sc, selaku penguji luar komisi pada Ujian
Terbuka, atas segala kritik dan saran yang sangat bermanfaat untuk
menyempurnakan tulisan ini.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Rektor, Dekan Sekolah
Pascasarjana, Dekan Fakultas Kedokteran Hewan, Ketua Departemen Klinik,
Reproduksi dan Patologi, Ketua Program Studi, staf pengajar dan staf administrasi
Biologi Reproduksi, serta seluruh staf Pascasarjana IPB yang telah menerima
penulis untuk melanjutkan studi di IPB serta membantu kelancaran proses
penyelesaian studi penulis. Ucapan yang sama juga disampaikan kepada jajaran
direksi PT. Kalbe Farma, Tbk. yang telah memberikan ijin studi dan dukungan
finansial (beasiswa) dalam rangka penyelesaian studi penulis.
Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Dr. drh. Ita Djuwita, M. Phil,
sebagai Kepala Laboratorium Embriologi, Bagian Anatomi, Histologi dan
Embriologi, Depertemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi, Fakultas
Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor yang telah memberi ijin kepada
penulis untuk melakukan penelitian dan menggunakan berbagai fasilitas yang ada
di laboratorium tersebut, kepada drh. Kusdiantoro Muhammad, drh. Wahono Esti
Prasetyaningtias, M.Si, atas dukungan dan bantuan dalam bentuk informasi ilmiah
yang diterima penulis selama studi di Bogor. Kepada rekan-rekan senior, Dr. Ir.
Thomas Mata Hine, MS, Dr. drh. I Wayan Batan, MS, Bayu Rosadi, S.Pt, M.Si
atas segala dukungan dan bantuannya. Kepada laboran, Mas Wahyu dan Ibu Yani
atas segala kebaikan dan bantuannya selama penulis melakukan penelitian di
Laboratorium Embriologi.
Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada Owner dan Founder PT.
Kalbe Farma, Tbk. Yaitu Dr. Boenjamin Setiawan Ph.D atas kepercayaan dan
kesempatan yang diberikan kepada penulis dalam bentuk beasiswa selama
menempuh studi di SPs IPB. Kepada kolega di Stem Cell and Cancer Institute
(SCI) yaitu Indra Bachtiar Ph.D, Yuyus Kusnadi Ph.D, Ahmad Utomo Ph.D, Andi
Utama Ph.D, Drs. Sie Djohan Apt., drg. Ferry Sandra Ph.D., dr. Caroline Tan
Sardjono Ph.D., Fernandina Stella Setiawan BSc, Maurin Merlina S.Si, Yurista
Septiani Dewi Apt., MSi, Halida Widyastuti BSc, Sonya A. Tandy Apt., Wara
Noveka, Wireni Ayuningtyas S.Si atas dukungan yang diberikan kepada penulis
selama menyelesaikan pendidikan program doktor di SPs IPB.
Kepada rekan-rekan saya, Dwi Agustina, S.Si, M.Si, Dini Budiharko, S.Si,
M.Si, Riris Lindiawati Puspitasari, S.Si, M.Si, Dr. Enny T. Setiatin, Nuril Farizah,
S.Pi, M.Si, Sigit Prastowo, S.Pt, M.Si, Adkhilni Utami, S.KH, dan Dr. Irma
Andriani, S.Pi, M.Si. Kepada rekan satu angkatan BRP 2008 yaitu Dr. drh. Sri
Wahyuni, M.Si, Dra. Ekayanti M. Kaiin, M.Si, Dr. Tatan Kostaman, S.Si, MP
serta semua rekan-rekan mahasiswa BRP atas hubungan baik dan kerjasamanya
selama studi.
Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayahanda Drs. Mardjoko
Muljono, ibunda drg. Djauhar Harini, istri tercinta Laura Angelia, Amd., adinda
Handaka Murti & Bayu Murti, keluarga besar bapak Ferry Firdaus Salindeho &
ibu Komala Gandasamita, keluarga besar Alm. Widyoharsono & Alm. Moh.
Tarom serta seluruh keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya. Semoga karya
ilmiah ini bermanfaat.
Wassalamu’alaikum warrohmatullohi wabarokatuh
Bogor, Juli 2013
Harry Murti
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
xiii
xiv
xv
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
1
1
1
2
2
3
TINJAUAN PUSTAKA
Transfer Inti Sel Somatis
Siklus Sel Resipien dan Donor Inti
Sinkronisasi Siklus Sel dan Aktivasi
Modifikasi Epigenetik pada Embrio Kloning
Perkembangan Embrionik Praimplantasi
3
3
4
5
6
7
OPTIMASI SUPEROVULASI, METODE AKTIVASI, DAN
ENUKLEASI
PADA
PENGEMBANGAN
TEKNIK
TRANSFER INTI SEL SOMATIS
Abstract
Abstrak
Pendahuluan
Metode Penelitian
Hasil dan Pembahasan
Simpulan
8
8
8
9
10
12
17
PRODUKSI DAN KULTUR IN VITRO EMBRIO
KLONING DAN EMBRIO PARTENOGENETIK MENCIT
Abstract
Abstrak
Pendahuluan
Metode Penelitian
Hasil dan Pembahasan
Simpulan
18
18
18
19
21
24
29
PRODUKSI EMBRIO KLONING MENCIT DENGAN
PENAMBAHAN
SCRIPTAID
PADA
APLIKASI
TRANSFER INTI SEL SOMATIS
Abstract
Abstrak
Pendahuluan
Metode Penelitian
Hasil dan Pembahasan
Simpulan
30
30
30
31
32
36
39
PEMBAHASAN UMUM
41
SIMPULAN DAN SARAN
44
DAFTAR PUSTAKA
45
LAMPIRAN
51
RIWAYAT HIDUP
56
DAFTAR TABEL
1. Perlakuan superovulasi untuk menghasilkan sel oosit
2. Perlakuan metode aktivasi sel oosit
3. Keberhasilan enukleasi inti oosit (sel resipien)
4. Tahapan perkembangan kultur embrio secara in vitro
5. Siklus sel kumulus sebagai donor inti setelah isolasi
6. Hasil enukleasi & transfer inti pada produksi embrio kloning mencit
7. Perkembangan sel embrio kloning mencit secara in vitro
12
15
16
27
37
38
38
DAFTAR GAMBAR
1. Sel oosit mencit hasil superovulasi
2. Sel oosit setelah diaktivasi
3. Enukleasi dengan menggunakan sukrosa 3%
4. Isolasi sel oosit dan sel cumulus
5. Aplikasi Transfer Inti Sel Somatik
6. Tahapan perkembangan embrio kloning
7. Grafik hasil analisa flowcytometri sel kumulus setelah isolasi
8. Sel kumulus setelah isolasi
9. Tahapan perkembangan kultur in vitro embrio kloning
14
15
17
25
26
28
36
37
39
DAFTAR LAMPIRAN
1. Komposisi larutan stok CZB
2. Larutan stok CZB- PVA
3. Larutan stok kalsium
4. Larutan stok strontium
5. Larutan stok cytochalasin B
6. Larutan stok hyaluronidase
7. Resep Medium CZB
6. Resep medium M2
52
52
52
52
52
53
53
55
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perkembangan teknik Transfer Inti Sel Somatis (TISS) telah menjadi tren
baru dalam kemajuan ilmu embriologi dan biomedis (McLaren 2000). Aplikasi
ini menjadi sangat populer setelah terungkap dari beberapa hasil studi yang
meneliti tentang kemungkinan pemanfaatan teknik transfer inti untuk
memproduksi ntESC (nuclear transfer Embryonic Stem Cell) dan
pemanfaatannya untuk terapi penyakit degeneratif (Hochedlinger & Jaenisch
2003). Teknik TISS pada dasarnya meliputi enukleasi (pengeluaran inti oosit
resipien), transfer inti (inti sel somatis dimasukkan ke dalam sitoplasma oosit
resipien), dan aktivasi (menginduksi oosit hasil rekontruksi untuk mengalami
nuclear reprogramming dan berkembang seperti embrio yang normal)
(Colman 2000).
Aplikasi TISS untuk memproduksi ntESC memberi harapan baru dalam
pengembangan therapeutic cloning sebagai alternatif pengobatan berbagai
penyakit degeneratif. Secara teoritis ntESC memiliki beberapa keunggulan
dibandingkan dengan sel punca (stem cell) dari sumber yang lain. Transplantasi
ntESC yang bersifat autologous diharapkan mampu mengatasi masalah
penolakan sistem imun pada penderita (Cibelli et al. 2001). Ketidakcocokan
karakter HLA (Human Lymphocyte Antigen), antara sel donor dengan sel
pasien menyebabkan sel donor dianggap sebagai substansi asing yang dapat
menimbulkan reaksi penolakan yang dikenal dengan “graft versus host
diseases” (Wobus & Boheler 2005). Pemanfaatan ntESC dalam terapi berbasis
sel (cell replacement therapy) berpotensi dapat mengatasi permasalahan
penolakan sistem imunitas tersebut karena memiliki genom yang sama dengan
sel-sel dari individu yang sakit (Moon et al. 2006). Berdasarkan hasil
penelitian sebelumnya telah dilaporkan bahwa ESC dapat diarahkan menjadi
sel-sel neuron (Wakayama et al. 2001), ginjal (Hipp & Atala 2004), otot
jantung (Kodifis et al. 2004), dan pankreas (Paek et al. 2005).
Keberhasilan kloning dengan teknik TISS telah mengubah pandangan
tentang pola ekpresi gen yang ternyata bersifat reversibel. Inti sel somatis yang
telah memiliki pola ekspresi gen tertentu sesuai dengan jenis dan fungsinya,
setelah mengalami nuclear reprogramming dapat mengalami perubahan pola
ekspresi gen menjadi seperti pada tahap perkembangan embrionik (Wilmut et
al. 2002).
Perumusan Masalah
Salah satu kendala pada aplikasi TISS baik untuk memproduksi ntESC
maupun hewan kloning adalah rendahnya tingkat efisiensi perkembangan
embrio hasil TISS hingga tahap blastosis dan keberhasilan kultur sel lestari
ntESC (Gurdon et al. 2003). Penelitian sebelumnya menunjukkan adanya
indikasi bahwa penyebab rendahnya efisiensi pada embrio hasil kloning adalah
proses nuclear reprogramming belum berjalan secara sempurna, sehingga inti
2
sel belum sepenuhnya dapat berubah pola ekspresi genetiknya menjadi seperti
pola perkembangan embrionik (Hochedlinger & Jaenisch 2003). Berbagai
pengembangan teknik TISS telah dilakukan, namun hingga saat ini belum
diperoleh hasil yang memuaskan. Selain itu aplikasi TISS pada manusia masih
menjadi perdebatan dalam masalah etika, sehingga pengembangan teknik ini
lebih banyak dikaji pada hewan coba (Murti et al. 2008).
Materi genetik (genom) dan urutan DNA pada sel somatik yang
menyusun satu individu pada dasarnya sama. Dinamika perubahan gen yang
aktif dan non aktif merupakan penyebab terjadinya modifikasi epigenetik.
Teknik kloning dapat memfasilitasi modifikasi epigenetik yaitu memprogram
kembali sel yang telah berdiferensiasi (sel somatik) menjadi ke tahapan awal
embrionik yang bersifat totipoten (Wang et al. 2007). Modifikasi epigenetik
diduga memegang peranan penting pada proses nuclear reprogramming,
walaupun hingga saat ini mekanisme pemrograman belum diketahui
(Humpherys et al. 2001). Pada embrio kloning telah diketahui bahwa setelah
aktivasi, akan terjadi peningkatan hipermetilasi DNA dan deasetilasi histon
(Wang et al. 2007). Asetilasi histon juga berperan dalam modifikasi epigenetik
karena dapat mempengaruhi metilasi DNA dan ekspresi protein (Enright et al.
2003). Penelitian ini akan mengkaji pengembangan teknik TISS meliputi
optimasi superovulasi, optimasi enukleasi, optimasi metode aktivasi, penentuan
siklus sel donor inti, dan perlakuan penambahan Scriptaid sebagai senyawa
penghambat enzim HDAC (histones deacetylases), sehingga diharapkan dapat
meningkatkan efisiensi perkembangan embrio kloning hasil TISS.
Tujuan Penelitian
Secara umum, tujuan penelitian ini adalah mengembangkan teknik
TISS dengan perlakuan penambahan Scriptaid untuk meningkatkan efisiensi
produksi embrio kloning pada mencit. Tujuan khususnya adalah:
1. Melakukan optimasi superovulasi, enukleasi dan metode aktivasi untuk
pengembangan aplikasi TISS
2. Menentukan tahap siklus sel donor inti
3. Memproduksi embrio kloning dengan menggunakan aplikasi TISS
4. Mempelajari perkembangan embrio kloning secara in vitro dibandingkan
dengan embrio partenogenetik dan embrio fertilisasi in vivo
5. Mempelajari pengaruh penambahan Scriptaid dan Trichostatin A
terhadap perkembangan embrio kloning pada tahapan praimplantasi
Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat bagi pengembangan
teknik TISS untuk meningkatkan efisiensi produksi embrio kloning mencit.
Aplikasi TISS pada mencit juga dapat dikembangkan sebagai model dalam
penelitian biomedis dan konservasi satwa langka.
3
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini menggunakan oosit mencit hasil superovulasi dengan
penyuntikan hormon PMSG dan hCG secara intraperitonial. Produksi embrio
kloning menggunakan teknik TISS yang meliputi: enukleasi, transfer inti dan
aktivasi. Sel resipien adalah oosit pada tahap metaphase II sedangkan sel donor
inti adalah sel kumulus. Optimasi dilakukan untuk menentukan dosis hormon
PMSG dan hCG, metode aktivasi, dan enukleasi yang paling efektif. Siklus sel
donor inti dianalisa dengan menggunakan teknik flowcytometri. Perkembangan
praimplantasi embrio kloning secara in vitro dibandingkan dengan embrio hasil
fertilisasi in vivo dan embrio partenogenetik. Penambahan senyawa inhibitor
enzim Histone Deacetylase yaitu Scriptaid dilakukan sebagai upaya untuk
meningkatkan efisiensi aplikasi teknik TISS dalam menghasilkan embrio
kloning yang mampu berkembang hingga tahap blastosis.
TINJAUAN PUSTAKA
Transfer Inti Sel Somatis
Pada tahun 1997, Wilmut dan koleganya di Roslin Institute telah
berhasil memanfaatkan teknik TISS untuk memproduksi domba kloning yang
pertama di dunia. Domba Dolly adalah mamalia pertama yang dihasilkan
bukan dari proses fertilisasi, namun berasal dari inti sel somatis yang ditransfer
ke oosit dan selanjutnya dapat melakukan perkembangan embrionik seperti
embrio normal. Ada tiga fakta baru yang terungkap dari hasil penelitian
tersebut, yaitu (1) sel somatis yang telah berdiferensiasi masih menyimpan
potensi untuk dilakukan reprogramming setelah dikultur selama kurun waktu
tertentu, (2) sel somatis yang dikultur dengan kondisi rendah/tanpa serum dapat
masuk ke dalam tahap G0 dalam siklus sel, dan (3) aplikasi teknik TISS dapat
memprogram inti sel somatis dewasa kembali ke perkembangan tahap
embrionik (Wilmut et al. 1997).
Keberhasilan kloning Dolly memacu aplikasi TISS pada hewan
mamalia lainnya. Beberapa mamalia yang telah berhasil dikloning adalah
mencit (Wakayama et al. 1998 ), babi (Tomii et al. 2005), sapi (Kasinathan et
al. 2001), ferret (Li et al. 2003; Li et al. 2005), anjing (Lee et al. 2005), tikus
(Iannacone et al. 2001), dan kambing (Baguisi et al. 1999). Tingkat efisiensi
hasil kloning yang relatif sangat rendah (