Evaluasi Ketahanan Ikan Mas Turunan Ketiga Yang Mempunyai Marka Molekuler Cyca-DAB1*05 Terhadap Infeksi Bakteri Aeromonas hydrophila
EVALUASI KETAHANAN IKAN MAS TURUNAN KETIGA YANG
MEMPUNYAI MARKA MOLEKULER Cyca-DAB1*05 TERHADAP
INFEKSI BAKTERI Aeromonas hydrophila
LA ODE MUHAMMAD ARSAL
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Evaluasi Ketahanan Ikan
Mas Turunan Ketiga Yang Mempunyai Marka Molekuler Cyca-DAB1*05
Terhadap Infeksi Bakteri Aeromonas hydrophila” adalah benar karya saya dengan
arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan dan tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, September 2014
La Ode Muhammad Arsal
NIM C151100151
RINGKASAN
LA ODE MUHAMMAD ARSAL. Evaluasi Ketahanan Ikan Mas Turunan Ketiga
Yang Mempunyai Marka Molekuler Cyca-DAB1*05 Terhadap Infeksi Bakteri
Aeromonas hydrophila. Dibimbing oleh MUNTI YUHANA, SRI NURYATI dan
ALIMUDDIN.
Serangan penyakit merupakan salah satu kendala utama dalam kegiatan
budidaya ikan mas Cyprinus carpio, yang dapat menyebabkan kerugian ekonomi
yang cukup tinggi, sehingga perlu penanganan yang cukup serius guna
mengurangi tingkat kerugian yang ditimbulkan. Adanya infeksi akan ditanggapi
oleh sistem pertahanan tubuh khususnya imun non-spesifik sebagai pertahanan
pertama terhadap infeksi. Respons imun non-spesifik tersebut dapat diamati
melalui uji gambaran darah. Tujuan penelitian ini adalah untuk menguji pengaruh
infeksi bakteri Aeromonas hydrophila pada ikan mas turunan ketiga (F3) yang
membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05 terhadap gambaran darah sebagai
respresentasi tanggap kebal ikan mas, serta tingkat kelangsungan hidup ikan mas
pascainfeksi.
Penelitian ini dilakukan dengan menginfeksikan bakteri A. hydrophila
sebanyak 0,1 mL dengan kepadatan bakteri 108 cfu/mL pada ikan mas yang
membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05. Sebagai kontrol digunakan ikan mas
tanpa marka (tidak diseleksi kandungan marka molekulernya), yang diperoleh dari
pembudidaya ikan di Bogor, diinfeksi dengan bakteri sebagai kontrol positif, dan
diinjeksi dengan bufer fosfat salin sebagai kontrol negatif. Masing-masing
perlakuan terdiri atas tiga ulangan. Sebanyak 180 ekor ikan mas diuji tantang
menggunakan A. hydrophila, dan ikan dipelihara dalam akuarium berukuran
100x100x60 cm3. Uji tantang dilakukan selama 14 hari. Parameter yang diamati
meliputi gambaran darah dan kelangsungan hidup ikan. Darah diambil pada hari
ke-0, 3, 7 dan 14 pascainfeksi untuk menghitung total sel darah merah,
hemoglobin, hematokrit, total sel darah putih, dan diferensial leukosit.
Hasil penelitian terhadap gambaran darah menunjukkan bahwa ikan mas
yang membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05 memiliki imunitas yang lebih
baik dibandingkan ikan mas kontrol. Pada hari ke-3 pascainfeksi, terjadi
penurunan total sel darah merah, hemoglobin dan hematokrit. Sebaliknya, pada
hari ke-3, total sel darah putih meningkat sebagai indikasi respons imun nonspesifik. Hari ke-7 merupakan puncak dari kinerja respons imun non-spesifik yang
ditandai dengan peningkatan total sel darah putih dibandingkan hari ke-3, serta
adanya peningkatan persentase monosit dan neutrofil yang berperan dalam
mengeliminasi patogen. Hari ke-14, respons imun non-spesifik mengalami
penurunan, terlihat dari berkurangnya total sel darah putih, dan diiringi dengan
peningkatan total sel darah merah, hemoglobin dan hematokrit. Pengamatan
terhadap tingkat kelangsungan hidup menunjukkan ikan mas yang membawa
marka molekuler Cyca-DAB1*05 memiliki tingkat kelangsungan hidup 2,6 kali
lebih tinggi dibandingkan ikan mas tanpa marka. Dengan demikian, profil
gambaran darah ikan mas sejalan dengan daya tahannya terhadap infeksi A.
hydrophila.
Kata kunci: ikan mas, Aeromonas hydrophila, marka molekuler, Cyca-DAB1*05
SUMMARY
LA ODE MUHAMMAD ARSAL. Evaluation of Resistances of the 3rd
Generation Common Carp having Cyca-DAB1*05 Molecular Marker
Against Aeromonas hydrophila Infection. Supervised by MUNTI YUHANA,
SRI NURYATI and ALIMUDDIN.
Infectious disease is one of the major constraints in aquaculture of
common carp Cyprinus carpio, which can cause high economic losses, so it needs
a serious treatment to reduce the level of losses incurred. Infection should be dealt
with by the immune defense system of the body, especially the non-specific as the
first defense against infection. Non-specific immune response can be observed
through hematologycal test. This study was performed to observe the effect of
bacterial Aeromonas hydrophila infection on blood profilesas representative of
common carp immune response, and the survival of fish
The study was performed by infecting 0.1 mL bacterial A. hydrophila of
8
10 cfu/mL to common carp possessing a Cyca-DAB1*05 molecular marker. Fish
without the marker obtained from farmer in Bogor was used as control; infected
by bacterial as positive control and with phosphate buffer salin as negative
control. Each treatment was consisted of three replications. Challenge test was
conducted for 14 days and blood was collected at day 0, 3, 7 and 14 postinfection. As many as 180 common carp was challenged with A. hydrophila, and
maintained in an aquarium sized 100x100x60 cm3. The observed parameters were
blood profiles and the survival of fish. Blood samples were collected at day 0, 3, 7
and 14 post infectionsto measuring the numbers red blood cells, hemoglobin,
hematocrite, number of leukocytes and differential leukocytes.
The results of this study showed that common carp possessing CycaDAB1*05 molecular marker have better non-specific immunity than control. On
day 3post-infection (pi), number red blood cells, hemoglobin and hematocrite was
decreased. In contrast, on day 3, total white blood cell as an indication of nonspecific immune response was increased. Day 7was the peak of the non-specific
immune response indicated by an increase in total white blood cells compared to
day 3, as well as an increase in the percentage of monocytes and neutrophils that
play a role in eliminating pathogens. At day 14, non-specific immune
responseswere decreased, it seen from the reduction in the number of white blood
cells, and accompanied by an increase in he red blood cells, hemoglobin and
hematocrite. Observations on survival showed thatfish possessing Cyca-DAB1*05
molecular marker have 2.6 times higher survival than the control. Thus, common
carp blood profiles were in line with the resistance to A. hydrophila infection.
Keywords: Cyprinus carpio, Aeromonas hydrophila, molecular marker, CycaDAB1*05
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
EVALUASI KETAHANAN IKAN MAS TURUNAN KETIGA YANG
MEMPUNYAI MARKA MOLEKULER Cyca-DAB1*05 TERHADAP
INFEKSI BAKTERI Aeromonas hydrophila
LA ODE MUHAMMAD ARSAL
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Akuakultur
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis:
Dr. Ir. Mia Setiawati, MSi
Judul Tesis : Evaluasi Ketahanan Ikan Mas Turunan Ketiga Yang Mempunyai
Marka Molekuler Cyca-DAB1*05 Terhadap Infeksi Bakteri
Aeromonas hydrophila
Nama
: La Ode Muhammad Arsal
NIM
: C151100151
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr. Munti Yuhana, SPi MSi
Ketua
Dr. Sri Nuryati, SPi, MSi
Anggota
Dr. Alimuddin, SPi, MSc
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Ilmu Akuakultur
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. Ir. Widanarni, MSi
Dr. Ir. Dahrul Syah, MScAgr
Tanggal Ujian:
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah yang berjudul “Evaluasi Ketahanan
Ikan Mas Turunan Ketiga Yang Mempunyai Marka Molekuler Cyca-DAB1*05
Terhadap Infeksi Bakteri Aeromonas hydrophila” berhasil diselesaikan.Penelitian
ini dilaksanakan pada bulan Juni sampai dengan bulan Agustus 2014, yang
bertempat di Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik,
Departemen Budidaya Perairan (BDP) serta Laboratorium Kesehatan Ikan BDPFPIK-IPB.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr Munti Yuhana, SPi MSi, Ibu
Dr Sri Nuryati, SPi MSi dan Bapak Dr Alimuddin, SPi MSc selaku pembimbing.
Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada kedua orang tua tercinta,
Bapak La Ode Fahuma, SH MH (alm.) dan Ibu Samria, Kakak Wa Ode Sitti
Ilmawati, SSi MSc, adik Wa Ode Siti Musnina, SSi MSc, Wa Ode Sitti Aztin,
SSi, serta seluruh keluarga atas doa dan motivasinya. Terimakasih penulis
ucapkan kepada Sitti Yani, S.Si M.Si* yang setia menemani dan terus
memberikan semangat serta do’a, You are the best. Terima kasih kepada pihakpihak yang telah membantu serta memberikan masukan dan ide yang membangun,
Pak Ranta, teman-teman Laboratorium Kesehatan Ikan yang telah membantu
proses analisis sampel Dendi Hidayatullah, SPi, serta teman-teman Laboratorium
Reproduksi & Genetik Organisme Akuatik, Rangga Gernama, SPi, Asep Akmal,
SPi, Darmawan, SPi MSi, Fajar Maulana, SPi MSi yang senantiasa membantu dan
menyemangati selama masa penelitian. Terima kasih kepada saudara-saudaraku di
Wisma Firdaus (Kost AA) Dwi Arinto, SSi MSi, Ary Tjahyadi, SSi, La Ode Muh.
Hazairin Nadia, SPi, Agusrinal, SSi, Tezza Fauzan, SPi MSi, Arfan Afandi, SPi,
Ansar SPi. Terima kasih penulis ucapkan kepada teman-teman Forum Wacana
Sulawesi Tenggara. Terima kasih pula penulis ucapkan kepada teman-teman
mahasiswa Program Studi Ilmu Akuakultur angkatan 2010 atas kekompakan serta
motivasinya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2014
La Ode Muhammad Arsal
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang ............................................................................................... 1
Perumusan Masalah ....................................................................................... 2
Tujuan ............................................................................................................ 2
Manfaat .......................................................................................................... 2
METODOLOGI
3
Preparasi Bakteri ............................................................................................ 3
Penentuan LD-50 ........................................................................................... 3
Persiapan Ikan Uji.......................................................................................... 3
Uji Tantang .................................................................................................... 3
Parameter Uji ................................................................................................. 4
Pengambilan Sampel Darah ........................................................................... 4
Penghitungan Jumlah Sel Darah Merah ........................................................ 4
Penghitungan Kadar Hemoglobin.................................................................. 5
Penghitungan Kadar Hematokrit ................................................................... 5
Penghitungan Jumlah Total Sel Darah Putih ................................................. 5
Diferensial Leukosit....................................................................................... 6
Pengamatan Kelangsungan Hidup ................................................................. 6
Respons Makan .............................................................................................. 6
Gejala Klinis .................................................................................................. 6
Analisis Data .................................................................................................. 6
HASIL DAN PEMBAHASAN
7
Hasil ............................................................................................................... 7
Pembahasan ................................................................................................. 12
KESIMPULAN DAN SARAN
19
Kesimpulan .................................................................................................. 19
Saran ............................................................................................................ 19
DAFTAR PUSTAKA
21
LAMPIRAN
25
RIWAYAT HIDUP
39
DAFTAR GAMBAR
1 Total sel darah merah (SDM) ikan mas yang membawa marka
molekuler Cyca-DAB1*05 (M), dan tanpa marka yang diperoleh dari
pembudidaya di Bogor (N) pascainfeksi Aeromonas hydrophila……. ……..7
2 Kadar hemoglobin ikan mas yang membawa marka molekuler CycaDAB1*05 (M) dan tanpa marka yang diperoleh dari pembudidaya di
Bogor (N) pascainfeksi Aeromonas hydrophila………………………………8
3 Nilai hematokrit ikan mas yang membawa marka molekuler CycaDAB1*05 (M) dan tanpa marka yang diperoleh dari pembudidaya di
Bogor (N) pascainfeksi Aeromonas hydrophila………………………………9
4 Total sel darah putih ikan mas yang membawa marka molekuler CycaDAB1*05 (M) dan tanpa marka yang diperoleh dari pembudidaya di
Bogor (N) pascainfeksi Aeromonas hydrophila………………………………9
5 Persentase limfosit pada ikan mas yang membawa marka molekuler
Cyca-DAB1*05 (M) dan tanpa marka yang diperoleh dari pembudidaya
di Bogor (N)………………………………………………………..…...……10
6 Persentase monosit pada ikan mas yang membawa marka molekuler
Cyca-DAB1*05 (M) dan tanpa marka yang diperoleh dari pembudidaya
di Bogor (N).………………………………………………………...……….10
7 Persentase limfosit pada ikan mas yang membawa marka molekuler
Cyca-DAB1*05 (M) dan tanpa marka yang diperoleh dari pembudidaya
di Bogor (N)………………………………………………………………….11
8 Kurva kelangsungan hidup ikan mas selama percobaan yang membawa
marka molekuler Cyca-DAB1*05 dan tanpa marka .……………..…………11
9 Gejala klinis pada ikan mas pascainfeksi bakteri Aeromonas hydrophila
(A & B= radang pada lokasi suntik + hemoragi; C = nekrosis/kerusakan
jaringan; D = tukak/ulcer).…………………………………………….……..15
10 Proses penutupan luka pada ikan mas pascainfeksi Aeromonas
hydrophila (A = tukak/ulcer + hemoragi; B = tukak tanpa hemoragi; C=
terbentuknya jaringan baru; D= luka mulai menutup; E= luka hampir
menutup sempurna)………………………………………………….………16
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
Uji Anova total sel darah merah (SDM) …………………………..………25
Uji Anova kadar hemoglobin ………………………………………..…….27
Uji Anova hematokrit ……………………………………………...... ……29
Uji Anova total sel darah putih (SDP) ………………………………... ……31
Uji Anova diferensial leukosit ………………………………………. ……33
Uji Anova tingkat kelangsungan hidup (KH) ………………………. ….....38
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Ikan mas (Cyprinus carpio) merupakan salah satu komoditas budidaya
utama di Indonesia. Kebutuhan pasar yang tinggi diimbangi dengan produksi ikan
mas dalam jumlah yang besar melalui sistem budidaya intensif dengan tingkat
kepadatan tinggi. Namun demikian, dibalik keberhasilan tersebut masih terdapat
faktor pembatas dalam pelaksanaan budidaya ikan mas berupa serangan penyakit,
baik bakterial maupun viral yang juga merupakan salah satu permasalahan utama
dalam kegiatan akuakultur (Gilad et al. 2003). Angka kematian kumulatif yang
terkait dengan wabah penyakit memberikan dampak negatif yang besar pada
industri budidaya berupa kerugian ekonomi yang cukup signifikan.
Salah satu bakteri yang sering menyerang ikan mas adalah Aeromonas
hydrophila. Gejala infeksi A.hydrophila meliputi pembengkakan jaringan,
perdarahan yang meluas pada permukaan kulit (haemorrhagic septicemia),
nekrosis, luka pada kulit hingga luka terbuka (ulcer) pada permukaan tubuh atau
hingga ke dalam jaringan (Mu et al. 2011; Pridgeon dan Klesius 2011). Pada
beberapa jenis ikan lain sering ditemukan tanda klinis seperti sirip punggung dan
sirip ekor rontok, serta pembengkakan pada perut dan berisi cairan (dropsy), yang
diikuti dengan kematian (Popma & Masser 1999; Yuasa et al. 2003). Ikan-ikan
dari golongan cyprinidae, siluridae, ictaluridae, serta claridae adalah ikan yang
rentan terhadap serangan A. hydrophila. Meskipun sering dianggap sebagai
patogen sekunder yang terkait dengan wabah penyakit, A. hydrophila juga bisa
menjadi patogen utama, yang menyebabkan wabah dengan angka kematian yang
tinggi (Pridgeon et al. 2011).
Adanya infeksi akan ditanggapi oleh sistem imun dengan mengaktifkan
kekebalan tubuh bawaan (non-spesifik) yang merupakan pertahanan dasar
pertama yang aktif ketika terjadi infeksi baik viral maupun bakterial. Pada ikan,
respons imun bawaan memiliki peranan yang sangat penting dalam hal pertahanan
menghadapi invasi patogen (Uribe et al. 2011). Sistem pertahanan tubuh bawaan
seperti sel fagosit, monosit dan neutrofil akan diaktifkan ketika terjadi infeksi.
Salah satu indikator yang dapat dilihat dari adanya infeksi adalah
perubahan terhadap gambaran darah. Darah bertindak sebagai transportasi internal
dan memainkan peran penting dalam regulasi aktivitas kehidupan. Darah
bertanggung jawab untuk mengangkut oksigen, karbon dioksida, nutrisi, makanan,
hormon, dan juga terlibat dalam produksi antibodi. Gambaran darah ikan
merupakan faktor diagnostik penting pada keadaan patologis (Nuryati et al. 2006).
Gambaran darah juga dapat dijadikan sebagai indikator pertahanan imun nonspesifik. Pengetahuan mengenai hematologi, dalam hal ini pemeriksaan
komponen darah dapat digunakan untuk mengetahui kondisi kesehatan ikan,
mengevaluasi pertahanan non-spesifik pada spesies ikan yang berbeda, serta
mengetahui pengaruh perubahan fisiologis terhadap kesehatan ikan
(Satheeshkumar et al. 2011). Oleh karena itu, penting untuk melakukan pengujian
terhadap sistem pertahanan non-spesifik pada ikan mas C. carpio melalui
pengamatan gambaran darah.
2
Saat ini major histocompatibility complex (MHC) merupakan marka yang
umum digunakan dalam studi mengenai hubungan daya tahan ikan terhadap suatu
penyakit. Hal ini didasarkan karena MHC berperan penting dalam sistem imun.
MHC dikodekan oleh dua subfamili utama, yakni MHC kelas I dan kelas II yang
berfungsi untuk mengikat dan menyajikan antigen ke limfosit T melalui molekul
CD8+ dan CD4+ (Rakus 2008). MHC kelas I dan kelas II berperan dalam
pengenalan beragam patogen, antigen peptida asing dan berperan penting dalam
respons imun, baik bawaan maupun adaptif (Kales 2006).
Dengan menggunakan metode polymerase chain reaction, ikan mas yang
tahan terhadap infeksi patogen dapat diidentifikasi dengan primer yang didesain
dari sekuen Cyca-DAB1*05 yang termasuk MHC kelas II (Alimuddin et al.
2011). Saat ini telah diproduksi ikan mas strain Majayala generasi ketiga (F3) di
Balai Besar Perikanan Budidaya Air Tawar Sukabumi, yang membawa marka
molekuler MHC. Ikan mas F3 tersebut merupakan hasil pemijahan ikan F2 jantan
dan F2 betina yang tahan penyakit dan juga membawa marka molekuler CycaDAB1*05. Daya tahan terhadap patogen dan korelasinya dengan gambaran darah
perlu diuji sebelum ikan tersebut dapat dirilis ke pembudidaya.
Perumusan Masalah
Aeromonas hydrophila merupakan bakteri yang sering menyerang ikan
mas, baik di lingkungan alami maupun di wadah budidaya terkontrol. Akibat dari
serangan A. hydrophila, pembudidaya dapat mengalami kerugian yang signifikan,
sehingga perlu suatu usaha penanggulangan yang serius guna mencegah penularan
penyakit serta menekan kerugian ekonomi yang ditimbulkan. Salah satu usaha
yang dikembangkan hingga saat ini adalah dengan mengembangkan jenis ikan
mas yang tahan terhadap A. hydrophila melalui seleksi dengan bantuan marka
molekuler major histocompatibility complex II (Alimuddin et al. 2011). Individu
ikan mas yang tahan terhadap serangan A. hydrophila dianggap memiliki tingkat
imunitas yang lebih baik sehingga apabila kemudian dikembangkan sebagai induk,
maka keturunannya diharapkan memiliki daya tahan yang tinggi terhadap
serangan A. hydrophila.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk menguji pengaruh infeksi bakteri A.
hydrophila pada ikan mas F3 yang membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05
terhadap gambaran darah sebagai respresentasi tanggap kebal ikan mas serta
pengaruhnya terhadap tingkat kelangsungan hidup ikan mas pascainfeksi.
Manfaat
Hasil penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai informasi
mengenai status imunitas khususnya respons imun non-spesifik pada ikan mas
yang membawa marka Cyca-DAB1*05 yang terinfeksi A. hydrophila.
3
METODOLOGI
Preparasi Bakteri
Bakteri Aeromonas hydrophila yang digunakan berasal dari Laboratorium
Kesehatan Ikan, Departemen BDP, FPIK-IPB. Bakteri A. hydrophila ditumbuhkan
pada media trypticase soy agar (TSA). Selanjutnya bakteri A. hydrophila tersebut
diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 24-25˚C pada media TSA miring pada
tabung reaksi. Biakan A. hydrophila diambil menggunakan jarum Ose sampai
memenuhi lingkaran jarum, kemudian dilarutkan dalam media tripticase soy broth
(TSB). Bakteri tersebut diinkubasi selama 18-24 jam dalam waterbath.
Selanjutnya bakteri hasil inkubasi digunakan dalam uji tantang.
Penentuan LD-50
Penentuan LD-50 bertujuan untuk mengetahui konsentrasi bakteri yang
dapat menyebabkan kematian sebanyak 50% pada ikan uji setelah proses infeksi
melalui metode penyuntikan. Ikan disuntik secara intramuskuler menggunakan
bakteri A. hydrophila sebanyak 0,1 mL dengan konsentrasi 108, 107, 106, 105, 104,
dan 103 cfu/mL. Ikan uji merupakan ikan mas dengan bobot 10-15 gram sebanyak
10 ekor untuk setiap perlakuan. Hasil dari uji LD-50 menunjukkan bahwa dosis
yang dapat membunuh ikan mas sekitar 50% adalah konsentrasi 108 cfu/mL. Hasil
uji LD-50 selanjutnya digunakan untuk penyuntikan ikan pada saat uji tantang.
Persiapan Ikan Uji
Ikan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan mas keturunan
ketiga (F3) yang membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05, hasil pemijahan di
Balai Besar Perikanan Budidaya Air Tawar (BBPBAT), Sukabumi, serta ikan mas
yang tidak membawa marka (tidak diseleksi kandungan marka molekulernya)
diperoleh dari pembudidaya di wilayah Bogor. Ikan mas F3 tersebut
diaklimatisasi selama 2 minggu dalam wadah akuarium berukuran 100x100x60
cm3, sebanyak 6 buah, dan setiap akuarium diisi sebanyak 30 ekor ikan mas. Ikan
mas tersebut selanjutnya digunakan dalam uji tantang dengan A. hydrophila untuk
mengevaluasi gambaran darah serta tingkat kelangsungan hidup.
Uji Tantang
Penelitian ini dilakukan dengan menguji tantang ikan mas yang membawa
marka molekuler Cyca-DAB1*05 dan tanpa marka sebagai kontrol dengan
menggunakan bakteri A. hydrophila. Masing-masing perlakuan terdiri atas tiga
ulangan. Uji tantang dilakukan dengan menginjeksi bakteri A. hydrophila dengan
dosis 0,1 mL sebanyak 108 cfu/mL per ekor ikan. Perlakuan yang digunakan
dalam penelitian ini yaitu uji tantang bakteri A. hydrophila pada ikan mas yang
membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05, dan uji tantang bakteri A.
hydrophila pada ikan mas yang tidak mempunyai marka (kontrol positif), serta
ikan mas yang tidak mempunyai marka yang disuntik dengan PBS (kontrol
negatif).
4
Parameter Uji
Parameter uji yang diamati dalam penelitian ini meliputi total sel darah
merah, hemoglobin, hematokrit, total sel darah putih, diferensial leukosit, dan
tingkat kelangsungan hidup pascainfeksi A. hydrophila.
Pengambilan Sampel Darah
Untuk pengamatan gambaran darah, sampling dilakukan pada hari ke-0, 3,
7, dan 14 pascainfeksi. Setiap kali sampling, 3 ekor ikan diambil dari setiap
perlakuan. Ikan yang telah diambil darahnya dipisahkan pada akuarium yang
berbeda untuk mencegah kemungkinan terambil kembali saat pengamatan pada
hari berikutnya. Sebelum pengambilan darah, ikan terlebih dahulu dibius
menggunakan stabilizer, dengan cara mencampurkan 1 mL stabilizer ke dalam 1
liter air, kemudian ikan mas dimasukkan ke dalam wadah tersebut untuk dibius
dan selanjutnya dilakukan pengambilan sampel darah. Pada saat pengambilan
darah, ikan diletakkan dengan kepala di sebelah kiri. Jarum suntik (syringe) yang
sebelumnya sudah dibilas dengan natrium sitrat 3% (sebagai antikoagulan)
diarahkan ke bagian vena kaudalis (bagian ekor). Darah dihisap sampai batas yang
diinginkan. Alat suntik dicabut, kemudian darah ditempatkan ke dalam eppendorf
yang telah dibilas dengan natrium sitrat. Darah yang terambil diberi antikoagulan
dengan perbandingan 1:4 dengan jumlah darah yang diambil. Selanjutnya
dilakukan pengamatan terhadap parameter gambaran darah yang diperlukan.
Penghitungan Jumlah Sel Darah Merah
Darah dihisap dengan pipet yang berisi bulir pengaduk warna merah
sampai skala 0,5. Lalu tambahkan larutan Hayem’s (berfungsi untuk mematikan
sel-sel darah putih) sampai skala 101, pengadukan darah di dalam pipet dilakukan
dengan mengayunkan tangan yang memegang pipet seperti membentuk angka
delapan selama 3-5 menit sehingga darah tercampur rata. Setelah itu tetesan
pertama larutan darah dalam pipet dibuang, selanjutnya teteskan pada
hemositometer tipe Neubauer kemudian ditutup dengan gelas penutup. Jumlah sel
darah merah dihitung dengan bantuan mikroskop dengan perbesaran 400 x.
Jumlah total sel darah dihitung pada 5 kotak kecil hemositometer, dan jumlahnya
dihitung dengan rumus (Nabib & Pasaribu 1989):
SDM
Fp
Keterangan:
SDM = Jumlah sel darah merah.
A
= Jumlah sel darah merah terhitung.
N
= Jumlah kotak hemositometer yang diamati.
V
= Volume kotak hemositometer yang diamati.
Fp
= Faktor pengenceran
5
Penghitungan Kadar Hemoglobin
Kadar hemoglobin (Hb) diukur menurut metode Sahli (Wedemeyer dan
Yasutake 1977) yaitu dengan mengisi tabung Sahlinometer dengan larutan HCl
0,1 N sampai garis skala paling bawah (skala 10), kemudian ditempatkan diantara
2 tabung dengan warna standar. Darah ikan dari tabung Eppendorf diambil dengan
pipet Sahli sebanyak 0,02 mL dan dimasukkan ke tabung Sahli dan didiamkan
selama 3 menit, sebelumnya ujung pipet dibersihkan terlebih dahulu. Kemudian
ditambahkan akuades dengan pipet tetes sedikit demi sedikit dan diaduk sampai
berubah warna tepat sama dengan warna standar yang ada dalam Hb meter
tersebut. Skala dibaca dengan melihat permukaan cairan dan dicocokkan dengan
skala tabung Sahli yang dilihat pada skala jalur g% (kuning) yang berarti
banyaknya hemoglobin dalam gram per 100 mL darah.
Penghitungan Kadar Hematokrit
Kadar hematokrit (Ht) diukur menurut Svobodova (1991) yaitu dengan
memasukkan sampel darah ke dalam tabung mikrohematokrit sampai 2/3 bagian
tabung, ujung tabung disumbat dengan cretoceal dan disentrifugasi selama 3 menit
dengan kecepatan 8000 rpm. Kadar hematokrit dinyatakan sebagai % volume
padatan sel darah. Darah dihisap dengan tabung mikrohematokrit sampai
mencapai ¾ bagian tabung. Kemudian ujung tabung ditutup dengan cretoceal
sedalam 1 mm. Lalu tabung mikrohematokrit disentrifus dengan kecepatan 5000
rpm selama 5 menit dengan posisi tabung yang bervolume sama berhadapan agar
putaran sentrifugasi seimbang. Nilai kadar hematokrit ditentukan dengan
persentase panjang bagian darah yang mengendap (a) serta panjang total volume
darah yang terdapat di dalam tabung (b): (a/b) x 100%. Kadar hematokrit ini
mencerminkan banyaknya sel darah (digambarkan dengan endapan/padatan)
dalam cairan darah.
Penghitungan Jumlah Total Sel Darah Putih
Penghitungan total sel darah putih dilakukan dengan cara mengencerkan
darah terlebih dahulu dengan menggunakan larutan Turk’s. Penambahan larutan
Turk’s yang bersifat asam akan menyebabkan sel darah merah mengalami lisis
sehingga yang tertinggal hanya sel darah putih saja. Pencampuran dilakukan di
dalam pipet pencampur berskala maksimum 11. Pipet ini berisi bulir berwarna
putih yang berfungsi sebagai pengaduk. Untuk menghitung sel darah putih, darah
dihisap dengan pipet pencampur sampai skala 0,5 dan selanjutnya ditambahkan
dengan larutan Turk’s. Pipet digoyang membentuk angka delapan selama 3-5
menit sehingga darah tercampur rata.
Sebelum dilakukan penghitungan, dua tetes pertama dari campuran
tersebut dibuang dan selanjutnya diteteskan pada hemositometer tipe Neubauer
dan ditutup dengan gelas penutup. Jumlah sel darah putih dihitung dengan
bantuan mikroskop pada pembesaran 400 kali. Penghitungan dilakukan pada
kotak besar hemositometer dengan rumus sebagai berikut (Nabib & Pasaribu
1989).
6
Keterangan:
SDP
= Jumlah sel darah putih.
A
= Jumlah sel darah putih terhitung.
N
= Jumlah kotak hemositometer yang diamati.
V
= Volume kotak hemositometer yang diamati.
Fp
= Faktor pengenceran
Diferensial Leukosit
Darah diteteskan pada gelas objek bagian kanan atas. Selanjutnya gelas
objek yang lain diletakkan di atas tetesan darah sampai membentuk sudut sekitar
30o, lalu ditarik sampai darah menyebar sepanjang tepi gelas objek pertama.
Setelah itu ulasan darah dikeringudarakan, lalu direndam dalam larutan Giemsa
(1:20) selama 15-20 menit. Kemudian dibilas dengan akuades. Selanjutnya
diamati menggunakan mikroskop (Blaxhall & Daisley 1973).
Pengamatan Kelangsungan Hidup
Kematian ikan dicatat setiap hari setelah diinfeksi. Tingkat kelangsungan
hidup (KH) dihitung untuk masing-masing perlakuan. Perhitungan dilakukan
berdasarkan persamaan Zonnoveld et al. (1991):
Respons Makan
Pengamatan respons makan ikan mas dilakukan secara deskriptif selama
14 hari pascainfeksi A. hydrophila dengan melihat selang waktu ikan memakan
pakan yang diberikan, dan jumlah pakan yang dimakan.
Gejala Klinis
Pengamatan terhadap gejala klinis dilakukan secara deskriptif selama 14
hari pascainfeksi A. hydrophila, meliputi hiperemia, radang, hemoragi, nekrosis,
dan tukak. Ikan yang menunjukkan gejala klinis infeksi A.hydrophila dipisahkan
untuk mempermudah pengamatan proses recovery.
Analisis Data
Data gambaran darah dan tingkat kelangsungan hidup yang diperoleh
dianalisis menggunakan software SPSS 13 dan ditampilkan dalam bentuk tabel
atau gambar. Data tersebut dianalisis dengan cara membandingkan setiap
parameter yang sama, pada waktu pengamatan yang sama, antara ikan mas yang
membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05 dengan ikan mas tanpa marka.
7
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Gambaran Darah
Pengamatan terhadap total sel darah merah menunjukkan bahwa antara
ikan yang membawa marka molekuler dan ikan mas tanpa marka secara statistik
tidak berbeda nyata (Lampiran 1; p>0,05). Sel darah merah total ikan mas yang
membawa marka molekuler pada hari ke-0 berada pada nilai 1,56±0,20 (x 106
sel/mm3), sedangkan ikan mas tanpa marka sebesar 1,16±0,47 (x 106 sel/mm3)
(Gambar 1). Pada hari ke-3 sel darah merah total menurun, baik pada ikan mas
yang membawa marka molekuler maupun ikan tanpa marka. Sel darah merah total
ikan mas yang membawa marka molekuler 1,38±0,21 (x 106 sel/mm3), dan ikan
mas tanpa marka sebesar 0,85±0,30 (x 106 sel/mm3). Hari ke-7, jumlah sel darah
merah total menurun, pada ikan yang membawa marka molekuler 1,14±0,26 (x
106 sel/mm3), dan pada ikan mas tanpa marka 0,76±0,22 (x 106 sel/mm3). Pada
pengamatan hari ke-14 menunjukkan peningkatan sel darah merah total, baik pada
ikan mas yang membawa marka molekuler maupun ikan mas tanpa marka. Sel
darah merah total ikan mas yang membawa marka molekuler sebesar 1,17±0,06 (x
106 sel/mm3), sedangkan pada ikan mas tanpa marka sebesar 0,90±0,19 (x 106
sel/mm3).
Sel darah merah (x 106 sel/mm3)
2.0
1.8
a
1.6
a
a
a
1.4
a
1.2
a
a
1.0
a
M
0.8
N
0.6
0.4
0.2
0.0
H0
H3
H7
H14
Waktu (hari ke-)
Gambar 1. Total sel darah merah (SDM) ikan mas yang membawa marka
molekuler Cyca-DAB1*05 (M), dan tanpa marka yang diperoleh dari
pembudidaya di Bogor (N) pascainfeksi Aeromonas hydrophila.
Hemoglobin pada ikan mas yang membawa marka molekuler pada hari ke0 (7,77±0,15 g%) dan hari ke-3 (7,20±0,53 g%) adalah sama, dan kedua-duanya
lebih tinggi (p
MEMPUNYAI MARKA MOLEKULER Cyca-DAB1*05 TERHADAP
INFEKSI BAKTERI Aeromonas hydrophila
LA ODE MUHAMMAD ARSAL
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Evaluasi Ketahanan Ikan
Mas Turunan Ketiga Yang Mempunyai Marka Molekuler Cyca-DAB1*05
Terhadap Infeksi Bakteri Aeromonas hydrophila” adalah benar karya saya dengan
arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan dan tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, September 2014
La Ode Muhammad Arsal
NIM C151100151
RINGKASAN
LA ODE MUHAMMAD ARSAL. Evaluasi Ketahanan Ikan Mas Turunan Ketiga
Yang Mempunyai Marka Molekuler Cyca-DAB1*05 Terhadap Infeksi Bakteri
Aeromonas hydrophila. Dibimbing oleh MUNTI YUHANA, SRI NURYATI dan
ALIMUDDIN.
Serangan penyakit merupakan salah satu kendala utama dalam kegiatan
budidaya ikan mas Cyprinus carpio, yang dapat menyebabkan kerugian ekonomi
yang cukup tinggi, sehingga perlu penanganan yang cukup serius guna
mengurangi tingkat kerugian yang ditimbulkan. Adanya infeksi akan ditanggapi
oleh sistem pertahanan tubuh khususnya imun non-spesifik sebagai pertahanan
pertama terhadap infeksi. Respons imun non-spesifik tersebut dapat diamati
melalui uji gambaran darah. Tujuan penelitian ini adalah untuk menguji pengaruh
infeksi bakteri Aeromonas hydrophila pada ikan mas turunan ketiga (F3) yang
membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05 terhadap gambaran darah sebagai
respresentasi tanggap kebal ikan mas, serta tingkat kelangsungan hidup ikan mas
pascainfeksi.
Penelitian ini dilakukan dengan menginfeksikan bakteri A. hydrophila
sebanyak 0,1 mL dengan kepadatan bakteri 108 cfu/mL pada ikan mas yang
membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05. Sebagai kontrol digunakan ikan mas
tanpa marka (tidak diseleksi kandungan marka molekulernya), yang diperoleh dari
pembudidaya ikan di Bogor, diinfeksi dengan bakteri sebagai kontrol positif, dan
diinjeksi dengan bufer fosfat salin sebagai kontrol negatif. Masing-masing
perlakuan terdiri atas tiga ulangan. Sebanyak 180 ekor ikan mas diuji tantang
menggunakan A. hydrophila, dan ikan dipelihara dalam akuarium berukuran
100x100x60 cm3. Uji tantang dilakukan selama 14 hari. Parameter yang diamati
meliputi gambaran darah dan kelangsungan hidup ikan. Darah diambil pada hari
ke-0, 3, 7 dan 14 pascainfeksi untuk menghitung total sel darah merah,
hemoglobin, hematokrit, total sel darah putih, dan diferensial leukosit.
Hasil penelitian terhadap gambaran darah menunjukkan bahwa ikan mas
yang membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05 memiliki imunitas yang lebih
baik dibandingkan ikan mas kontrol. Pada hari ke-3 pascainfeksi, terjadi
penurunan total sel darah merah, hemoglobin dan hematokrit. Sebaliknya, pada
hari ke-3, total sel darah putih meningkat sebagai indikasi respons imun nonspesifik. Hari ke-7 merupakan puncak dari kinerja respons imun non-spesifik yang
ditandai dengan peningkatan total sel darah putih dibandingkan hari ke-3, serta
adanya peningkatan persentase monosit dan neutrofil yang berperan dalam
mengeliminasi patogen. Hari ke-14, respons imun non-spesifik mengalami
penurunan, terlihat dari berkurangnya total sel darah putih, dan diiringi dengan
peningkatan total sel darah merah, hemoglobin dan hematokrit. Pengamatan
terhadap tingkat kelangsungan hidup menunjukkan ikan mas yang membawa
marka molekuler Cyca-DAB1*05 memiliki tingkat kelangsungan hidup 2,6 kali
lebih tinggi dibandingkan ikan mas tanpa marka. Dengan demikian, profil
gambaran darah ikan mas sejalan dengan daya tahannya terhadap infeksi A.
hydrophila.
Kata kunci: ikan mas, Aeromonas hydrophila, marka molekuler, Cyca-DAB1*05
SUMMARY
LA ODE MUHAMMAD ARSAL. Evaluation of Resistances of the 3rd
Generation Common Carp having Cyca-DAB1*05 Molecular Marker
Against Aeromonas hydrophila Infection. Supervised by MUNTI YUHANA,
SRI NURYATI and ALIMUDDIN.
Infectious disease is one of the major constraints in aquaculture of
common carp Cyprinus carpio, which can cause high economic losses, so it needs
a serious treatment to reduce the level of losses incurred. Infection should be dealt
with by the immune defense system of the body, especially the non-specific as the
first defense against infection. Non-specific immune response can be observed
through hematologycal test. This study was performed to observe the effect of
bacterial Aeromonas hydrophila infection on blood profilesas representative of
common carp immune response, and the survival of fish
The study was performed by infecting 0.1 mL bacterial A. hydrophila of
8
10 cfu/mL to common carp possessing a Cyca-DAB1*05 molecular marker. Fish
without the marker obtained from farmer in Bogor was used as control; infected
by bacterial as positive control and with phosphate buffer salin as negative
control. Each treatment was consisted of three replications. Challenge test was
conducted for 14 days and blood was collected at day 0, 3, 7 and 14 postinfection. As many as 180 common carp was challenged with A. hydrophila, and
maintained in an aquarium sized 100x100x60 cm3. The observed parameters were
blood profiles and the survival of fish. Blood samples were collected at day 0, 3, 7
and 14 post infectionsto measuring the numbers red blood cells, hemoglobin,
hematocrite, number of leukocytes and differential leukocytes.
The results of this study showed that common carp possessing CycaDAB1*05 molecular marker have better non-specific immunity than control. On
day 3post-infection (pi), number red blood cells, hemoglobin and hematocrite was
decreased. In contrast, on day 3, total white blood cell as an indication of nonspecific immune response was increased. Day 7was the peak of the non-specific
immune response indicated by an increase in total white blood cells compared to
day 3, as well as an increase in the percentage of monocytes and neutrophils that
play a role in eliminating pathogens. At day 14, non-specific immune
responseswere decreased, it seen from the reduction in the number of white blood
cells, and accompanied by an increase in he red blood cells, hemoglobin and
hematocrite. Observations on survival showed thatfish possessing Cyca-DAB1*05
molecular marker have 2.6 times higher survival than the control. Thus, common
carp blood profiles were in line with the resistance to A. hydrophila infection.
Keywords: Cyprinus carpio, Aeromonas hydrophila, molecular marker, CycaDAB1*05
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
EVALUASI KETAHANAN IKAN MAS TURUNAN KETIGA YANG
MEMPUNYAI MARKA MOLEKULER Cyca-DAB1*05 TERHADAP
INFEKSI BAKTERI Aeromonas hydrophila
LA ODE MUHAMMAD ARSAL
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Akuakultur
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis:
Dr. Ir. Mia Setiawati, MSi
Judul Tesis : Evaluasi Ketahanan Ikan Mas Turunan Ketiga Yang Mempunyai
Marka Molekuler Cyca-DAB1*05 Terhadap Infeksi Bakteri
Aeromonas hydrophila
Nama
: La Ode Muhammad Arsal
NIM
: C151100151
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr. Munti Yuhana, SPi MSi
Ketua
Dr. Sri Nuryati, SPi, MSi
Anggota
Dr. Alimuddin, SPi, MSc
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Ilmu Akuakultur
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. Ir. Widanarni, MSi
Dr. Ir. Dahrul Syah, MScAgr
Tanggal Ujian:
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah yang berjudul “Evaluasi Ketahanan
Ikan Mas Turunan Ketiga Yang Mempunyai Marka Molekuler Cyca-DAB1*05
Terhadap Infeksi Bakteri Aeromonas hydrophila” berhasil diselesaikan.Penelitian
ini dilaksanakan pada bulan Juni sampai dengan bulan Agustus 2014, yang
bertempat di Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik,
Departemen Budidaya Perairan (BDP) serta Laboratorium Kesehatan Ikan BDPFPIK-IPB.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr Munti Yuhana, SPi MSi, Ibu
Dr Sri Nuryati, SPi MSi dan Bapak Dr Alimuddin, SPi MSc selaku pembimbing.
Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada kedua orang tua tercinta,
Bapak La Ode Fahuma, SH MH (alm.) dan Ibu Samria, Kakak Wa Ode Sitti
Ilmawati, SSi MSc, adik Wa Ode Siti Musnina, SSi MSc, Wa Ode Sitti Aztin,
SSi, serta seluruh keluarga atas doa dan motivasinya. Terimakasih penulis
ucapkan kepada Sitti Yani, S.Si M.Si* yang setia menemani dan terus
memberikan semangat serta do’a, You are the best. Terima kasih kepada pihakpihak yang telah membantu serta memberikan masukan dan ide yang membangun,
Pak Ranta, teman-teman Laboratorium Kesehatan Ikan yang telah membantu
proses analisis sampel Dendi Hidayatullah, SPi, serta teman-teman Laboratorium
Reproduksi & Genetik Organisme Akuatik, Rangga Gernama, SPi, Asep Akmal,
SPi, Darmawan, SPi MSi, Fajar Maulana, SPi MSi yang senantiasa membantu dan
menyemangati selama masa penelitian. Terima kasih kepada saudara-saudaraku di
Wisma Firdaus (Kost AA) Dwi Arinto, SSi MSi, Ary Tjahyadi, SSi, La Ode Muh.
Hazairin Nadia, SPi, Agusrinal, SSi, Tezza Fauzan, SPi MSi, Arfan Afandi, SPi,
Ansar SPi. Terima kasih penulis ucapkan kepada teman-teman Forum Wacana
Sulawesi Tenggara. Terima kasih pula penulis ucapkan kepada teman-teman
mahasiswa Program Studi Ilmu Akuakultur angkatan 2010 atas kekompakan serta
motivasinya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2014
La Ode Muhammad Arsal
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang ............................................................................................... 1
Perumusan Masalah ....................................................................................... 2
Tujuan ............................................................................................................ 2
Manfaat .......................................................................................................... 2
METODOLOGI
3
Preparasi Bakteri ............................................................................................ 3
Penentuan LD-50 ........................................................................................... 3
Persiapan Ikan Uji.......................................................................................... 3
Uji Tantang .................................................................................................... 3
Parameter Uji ................................................................................................. 4
Pengambilan Sampel Darah ........................................................................... 4
Penghitungan Jumlah Sel Darah Merah ........................................................ 4
Penghitungan Kadar Hemoglobin.................................................................. 5
Penghitungan Kadar Hematokrit ................................................................... 5
Penghitungan Jumlah Total Sel Darah Putih ................................................. 5
Diferensial Leukosit....................................................................................... 6
Pengamatan Kelangsungan Hidup ................................................................. 6
Respons Makan .............................................................................................. 6
Gejala Klinis .................................................................................................. 6
Analisis Data .................................................................................................. 6
HASIL DAN PEMBAHASAN
7
Hasil ............................................................................................................... 7
Pembahasan ................................................................................................. 12
KESIMPULAN DAN SARAN
19
Kesimpulan .................................................................................................. 19
Saran ............................................................................................................ 19
DAFTAR PUSTAKA
21
LAMPIRAN
25
RIWAYAT HIDUP
39
DAFTAR GAMBAR
1 Total sel darah merah (SDM) ikan mas yang membawa marka
molekuler Cyca-DAB1*05 (M), dan tanpa marka yang diperoleh dari
pembudidaya di Bogor (N) pascainfeksi Aeromonas hydrophila……. ……..7
2 Kadar hemoglobin ikan mas yang membawa marka molekuler CycaDAB1*05 (M) dan tanpa marka yang diperoleh dari pembudidaya di
Bogor (N) pascainfeksi Aeromonas hydrophila………………………………8
3 Nilai hematokrit ikan mas yang membawa marka molekuler CycaDAB1*05 (M) dan tanpa marka yang diperoleh dari pembudidaya di
Bogor (N) pascainfeksi Aeromonas hydrophila………………………………9
4 Total sel darah putih ikan mas yang membawa marka molekuler CycaDAB1*05 (M) dan tanpa marka yang diperoleh dari pembudidaya di
Bogor (N) pascainfeksi Aeromonas hydrophila………………………………9
5 Persentase limfosit pada ikan mas yang membawa marka molekuler
Cyca-DAB1*05 (M) dan tanpa marka yang diperoleh dari pembudidaya
di Bogor (N)………………………………………………………..…...……10
6 Persentase monosit pada ikan mas yang membawa marka molekuler
Cyca-DAB1*05 (M) dan tanpa marka yang diperoleh dari pembudidaya
di Bogor (N).………………………………………………………...……….10
7 Persentase limfosit pada ikan mas yang membawa marka molekuler
Cyca-DAB1*05 (M) dan tanpa marka yang diperoleh dari pembudidaya
di Bogor (N)………………………………………………………………….11
8 Kurva kelangsungan hidup ikan mas selama percobaan yang membawa
marka molekuler Cyca-DAB1*05 dan tanpa marka .……………..…………11
9 Gejala klinis pada ikan mas pascainfeksi bakteri Aeromonas hydrophila
(A & B= radang pada lokasi suntik + hemoragi; C = nekrosis/kerusakan
jaringan; D = tukak/ulcer).…………………………………………….……..15
10 Proses penutupan luka pada ikan mas pascainfeksi Aeromonas
hydrophila (A = tukak/ulcer + hemoragi; B = tukak tanpa hemoragi; C=
terbentuknya jaringan baru; D= luka mulai menutup; E= luka hampir
menutup sempurna)………………………………………………….………16
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
Uji Anova total sel darah merah (SDM) …………………………..………25
Uji Anova kadar hemoglobin ………………………………………..…….27
Uji Anova hematokrit ……………………………………………...... ……29
Uji Anova total sel darah putih (SDP) ………………………………... ……31
Uji Anova diferensial leukosit ………………………………………. ……33
Uji Anova tingkat kelangsungan hidup (KH) ………………………. ….....38
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Ikan mas (Cyprinus carpio) merupakan salah satu komoditas budidaya
utama di Indonesia. Kebutuhan pasar yang tinggi diimbangi dengan produksi ikan
mas dalam jumlah yang besar melalui sistem budidaya intensif dengan tingkat
kepadatan tinggi. Namun demikian, dibalik keberhasilan tersebut masih terdapat
faktor pembatas dalam pelaksanaan budidaya ikan mas berupa serangan penyakit,
baik bakterial maupun viral yang juga merupakan salah satu permasalahan utama
dalam kegiatan akuakultur (Gilad et al. 2003). Angka kematian kumulatif yang
terkait dengan wabah penyakit memberikan dampak negatif yang besar pada
industri budidaya berupa kerugian ekonomi yang cukup signifikan.
Salah satu bakteri yang sering menyerang ikan mas adalah Aeromonas
hydrophila. Gejala infeksi A.hydrophila meliputi pembengkakan jaringan,
perdarahan yang meluas pada permukaan kulit (haemorrhagic septicemia),
nekrosis, luka pada kulit hingga luka terbuka (ulcer) pada permukaan tubuh atau
hingga ke dalam jaringan (Mu et al. 2011; Pridgeon dan Klesius 2011). Pada
beberapa jenis ikan lain sering ditemukan tanda klinis seperti sirip punggung dan
sirip ekor rontok, serta pembengkakan pada perut dan berisi cairan (dropsy), yang
diikuti dengan kematian (Popma & Masser 1999; Yuasa et al. 2003). Ikan-ikan
dari golongan cyprinidae, siluridae, ictaluridae, serta claridae adalah ikan yang
rentan terhadap serangan A. hydrophila. Meskipun sering dianggap sebagai
patogen sekunder yang terkait dengan wabah penyakit, A. hydrophila juga bisa
menjadi patogen utama, yang menyebabkan wabah dengan angka kematian yang
tinggi (Pridgeon et al. 2011).
Adanya infeksi akan ditanggapi oleh sistem imun dengan mengaktifkan
kekebalan tubuh bawaan (non-spesifik) yang merupakan pertahanan dasar
pertama yang aktif ketika terjadi infeksi baik viral maupun bakterial. Pada ikan,
respons imun bawaan memiliki peranan yang sangat penting dalam hal pertahanan
menghadapi invasi patogen (Uribe et al. 2011). Sistem pertahanan tubuh bawaan
seperti sel fagosit, monosit dan neutrofil akan diaktifkan ketika terjadi infeksi.
Salah satu indikator yang dapat dilihat dari adanya infeksi adalah
perubahan terhadap gambaran darah. Darah bertindak sebagai transportasi internal
dan memainkan peran penting dalam regulasi aktivitas kehidupan. Darah
bertanggung jawab untuk mengangkut oksigen, karbon dioksida, nutrisi, makanan,
hormon, dan juga terlibat dalam produksi antibodi. Gambaran darah ikan
merupakan faktor diagnostik penting pada keadaan patologis (Nuryati et al. 2006).
Gambaran darah juga dapat dijadikan sebagai indikator pertahanan imun nonspesifik. Pengetahuan mengenai hematologi, dalam hal ini pemeriksaan
komponen darah dapat digunakan untuk mengetahui kondisi kesehatan ikan,
mengevaluasi pertahanan non-spesifik pada spesies ikan yang berbeda, serta
mengetahui pengaruh perubahan fisiologis terhadap kesehatan ikan
(Satheeshkumar et al. 2011). Oleh karena itu, penting untuk melakukan pengujian
terhadap sistem pertahanan non-spesifik pada ikan mas C. carpio melalui
pengamatan gambaran darah.
2
Saat ini major histocompatibility complex (MHC) merupakan marka yang
umum digunakan dalam studi mengenai hubungan daya tahan ikan terhadap suatu
penyakit. Hal ini didasarkan karena MHC berperan penting dalam sistem imun.
MHC dikodekan oleh dua subfamili utama, yakni MHC kelas I dan kelas II yang
berfungsi untuk mengikat dan menyajikan antigen ke limfosit T melalui molekul
CD8+ dan CD4+ (Rakus 2008). MHC kelas I dan kelas II berperan dalam
pengenalan beragam patogen, antigen peptida asing dan berperan penting dalam
respons imun, baik bawaan maupun adaptif (Kales 2006).
Dengan menggunakan metode polymerase chain reaction, ikan mas yang
tahan terhadap infeksi patogen dapat diidentifikasi dengan primer yang didesain
dari sekuen Cyca-DAB1*05 yang termasuk MHC kelas II (Alimuddin et al.
2011). Saat ini telah diproduksi ikan mas strain Majayala generasi ketiga (F3) di
Balai Besar Perikanan Budidaya Air Tawar Sukabumi, yang membawa marka
molekuler MHC. Ikan mas F3 tersebut merupakan hasil pemijahan ikan F2 jantan
dan F2 betina yang tahan penyakit dan juga membawa marka molekuler CycaDAB1*05. Daya tahan terhadap patogen dan korelasinya dengan gambaran darah
perlu diuji sebelum ikan tersebut dapat dirilis ke pembudidaya.
Perumusan Masalah
Aeromonas hydrophila merupakan bakteri yang sering menyerang ikan
mas, baik di lingkungan alami maupun di wadah budidaya terkontrol. Akibat dari
serangan A. hydrophila, pembudidaya dapat mengalami kerugian yang signifikan,
sehingga perlu suatu usaha penanggulangan yang serius guna mencegah penularan
penyakit serta menekan kerugian ekonomi yang ditimbulkan. Salah satu usaha
yang dikembangkan hingga saat ini adalah dengan mengembangkan jenis ikan
mas yang tahan terhadap A. hydrophila melalui seleksi dengan bantuan marka
molekuler major histocompatibility complex II (Alimuddin et al. 2011). Individu
ikan mas yang tahan terhadap serangan A. hydrophila dianggap memiliki tingkat
imunitas yang lebih baik sehingga apabila kemudian dikembangkan sebagai induk,
maka keturunannya diharapkan memiliki daya tahan yang tinggi terhadap
serangan A. hydrophila.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk menguji pengaruh infeksi bakteri A.
hydrophila pada ikan mas F3 yang membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05
terhadap gambaran darah sebagai respresentasi tanggap kebal ikan mas serta
pengaruhnya terhadap tingkat kelangsungan hidup ikan mas pascainfeksi.
Manfaat
Hasil penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai informasi
mengenai status imunitas khususnya respons imun non-spesifik pada ikan mas
yang membawa marka Cyca-DAB1*05 yang terinfeksi A. hydrophila.
3
METODOLOGI
Preparasi Bakteri
Bakteri Aeromonas hydrophila yang digunakan berasal dari Laboratorium
Kesehatan Ikan, Departemen BDP, FPIK-IPB. Bakteri A. hydrophila ditumbuhkan
pada media trypticase soy agar (TSA). Selanjutnya bakteri A. hydrophila tersebut
diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 24-25˚C pada media TSA miring pada
tabung reaksi. Biakan A. hydrophila diambil menggunakan jarum Ose sampai
memenuhi lingkaran jarum, kemudian dilarutkan dalam media tripticase soy broth
(TSB). Bakteri tersebut diinkubasi selama 18-24 jam dalam waterbath.
Selanjutnya bakteri hasil inkubasi digunakan dalam uji tantang.
Penentuan LD-50
Penentuan LD-50 bertujuan untuk mengetahui konsentrasi bakteri yang
dapat menyebabkan kematian sebanyak 50% pada ikan uji setelah proses infeksi
melalui metode penyuntikan. Ikan disuntik secara intramuskuler menggunakan
bakteri A. hydrophila sebanyak 0,1 mL dengan konsentrasi 108, 107, 106, 105, 104,
dan 103 cfu/mL. Ikan uji merupakan ikan mas dengan bobot 10-15 gram sebanyak
10 ekor untuk setiap perlakuan. Hasil dari uji LD-50 menunjukkan bahwa dosis
yang dapat membunuh ikan mas sekitar 50% adalah konsentrasi 108 cfu/mL. Hasil
uji LD-50 selanjutnya digunakan untuk penyuntikan ikan pada saat uji tantang.
Persiapan Ikan Uji
Ikan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan mas keturunan
ketiga (F3) yang membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05, hasil pemijahan di
Balai Besar Perikanan Budidaya Air Tawar (BBPBAT), Sukabumi, serta ikan mas
yang tidak membawa marka (tidak diseleksi kandungan marka molekulernya)
diperoleh dari pembudidaya di wilayah Bogor. Ikan mas F3 tersebut
diaklimatisasi selama 2 minggu dalam wadah akuarium berukuran 100x100x60
cm3, sebanyak 6 buah, dan setiap akuarium diisi sebanyak 30 ekor ikan mas. Ikan
mas tersebut selanjutnya digunakan dalam uji tantang dengan A. hydrophila untuk
mengevaluasi gambaran darah serta tingkat kelangsungan hidup.
Uji Tantang
Penelitian ini dilakukan dengan menguji tantang ikan mas yang membawa
marka molekuler Cyca-DAB1*05 dan tanpa marka sebagai kontrol dengan
menggunakan bakteri A. hydrophila. Masing-masing perlakuan terdiri atas tiga
ulangan. Uji tantang dilakukan dengan menginjeksi bakteri A. hydrophila dengan
dosis 0,1 mL sebanyak 108 cfu/mL per ekor ikan. Perlakuan yang digunakan
dalam penelitian ini yaitu uji tantang bakteri A. hydrophila pada ikan mas yang
membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05, dan uji tantang bakteri A.
hydrophila pada ikan mas yang tidak mempunyai marka (kontrol positif), serta
ikan mas yang tidak mempunyai marka yang disuntik dengan PBS (kontrol
negatif).
4
Parameter Uji
Parameter uji yang diamati dalam penelitian ini meliputi total sel darah
merah, hemoglobin, hematokrit, total sel darah putih, diferensial leukosit, dan
tingkat kelangsungan hidup pascainfeksi A. hydrophila.
Pengambilan Sampel Darah
Untuk pengamatan gambaran darah, sampling dilakukan pada hari ke-0, 3,
7, dan 14 pascainfeksi. Setiap kali sampling, 3 ekor ikan diambil dari setiap
perlakuan. Ikan yang telah diambil darahnya dipisahkan pada akuarium yang
berbeda untuk mencegah kemungkinan terambil kembali saat pengamatan pada
hari berikutnya. Sebelum pengambilan darah, ikan terlebih dahulu dibius
menggunakan stabilizer, dengan cara mencampurkan 1 mL stabilizer ke dalam 1
liter air, kemudian ikan mas dimasukkan ke dalam wadah tersebut untuk dibius
dan selanjutnya dilakukan pengambilan sampel darah. Pada saat pengambilan
darah, ikan diletakkan dengan kepala di sebelah kiri. Jarum suntik (syringe) yang
sebelumnya sudah dibilas dengan natrium sitrat 3% (sebagai antikoagulan)
diarahkan ke bagian vena kaudalis (bagian ekor). Darah dihisap sampai batas yang
diinginkan. Alat suntik dicabut, kemudian darah ditempatkan ke dalam eppendorf
yang telah dibilas dengan natrium sitrat. Darah yang terambil diberi antikoagulan
dengan perbandingan 1:4 dengan jumlah darah yang diambil. Selanjutnya
dilakukan pengamatan terhadap parameter gambaran darah yang diperlukan.
Penghitungan Jumlah Sel Darah Merah
Darah dihisap dengan pipet yang berisi bulir pengaduk warna merah
sampai skala 0,5. Lalu tambahkan larutan Hayem’s (berfungsi untuk mematikan
sel-sel darah putih) sampai skala 101, pengadukan darah di dalam pipet dilakukan
dengan mengayunkan tangan yang memegang pipet seperti membentuk angka
delapan selama 3-5 menit sehingga darah tercampur rata. Setelah itu tetesan
pertama larutan darah dalam pipet dibuang, selanjutnya teteskan pada
hemositometer tipe Neubauer kemudian ditutup dengan gelas penutup. Jumlah sel
darah merah dihitung dengan bantuan mikroskop dengan perbesaran 400 x.
Jumlah total sel darah dihitung pada 5 kotak kecil hemositometer, dan jumlahnya
dihitung dengan rumus (Nabib & Pasaribu 1989):
SDM
Fp
Keterangan:
SDM = Jumlah sel darah merah.
A
= Jumlah sel darah merah terhitung.
N
= Jumlah kotak hemositometer yang diamati.
V
= Volume kotak hemositometer yang diamati.
Fp
= Faktor pengenceran
5
Penghitungan Kadar Hemoglobin
Kadar hemoglobin (Hb) diukur menurut metode Sahli (Wedemeyer dan
Yasutake 1977) yaitu dengan mengisi tabung Sahlinometer dengan larutan HCl
0,1 N sampai garis skala paling bawah (skala 10), kemudian ditempatkan diantara
2 tabung dengan warna standar. Darah ikan dari tabung Eppendorf diambil dengan
pipet Sahli sebanyak 0,02 mL dan dimasukkan ke tabung Sahli dan didiamkan
selama 3 menit, sebelumnya ujung pipet dibersihkan terlebih dahulu. Kemudian
ditambahkan akuades dengan pipet tetes sedikit demi sedikit dan diaduk sampai
berubah warna tepat sama dengan warna standar yang ada dalam Hb meter
tersebut. Skala dibaca dengan melihat permukaan cairan dan dicocokkan dengan
skala tabung Sahli yang dilihat pada skala jalur g% (kuning) yang berarti
banyaknya hemoglobin dalam gram per 100 mL darah.
Penghitungan Kadar Hematokrit
Kadar hematokrit (Ht) diukur menurut Svobodova (1991) yaitu dengan
memasukkan sampel darah ke dalam tabung mikrohematokrit sampai 2/3 bagian
tabung, ujung tabung disumbat dengan cretoceal dan disentrifugasi selama 3 menit
dengan kecepatan 8000 rpm. Kadar hematokrit dinyatakan sebagai % volume
padatan sel darah. Darah dihisap dengan tabung mikrohematokrit sampai
mencapai ¾ bagian tabung. Kemudian ujung tabung ditutup dengan cretoceal
sedalam 1 mm. Lalu tabung mikrohematokrit disentrifus dengan kecepatan 5000
rpm selama 5 menit dengan posisi tabung yang bervolume sama berhadapan agar
putaran sentrifugasi seimbang. Nilai kadar hematokrit ditentukan dengan
persentase panjang bagian darah yang mengendap (a) serta panjang total volume
darah yang terdapat di dalam tabung (b): (a/b) x 100%. Kadar hematokrit ini
mencerminkan banyaknya sel darah (digambarkan dengan endapan/padatan)
dalam cairan darah.
Penghitungan Jumlah Total Sel Darah Putih
Penghitungan total sel darah putih dilakukan dengan cara mengencerkan
darah terlebih dahulu dengan menggunakan larutan Turk’s. Penambahan larutan
Turk’s yang bersifat asam akan menyebabkan sel darah merah mengalami lisis
sehingga yang tertinggal hanya sel darah putih saja. Pencampuran dilakukan di
dalam pipet pencampur berskala maksimum 11. Pipet ini berisi bulir berwarna
putih yang berfungsi sebagai pengaduk. Untuk menghitung sel darah putih, darah
dihisap dengan pipet pencampur sampai skala 0,5 dan selanjutnya ditambahkan
dengan larutan Turk’s. Pipet digoyang membentuk angka delapan selama 3-5
menit sehingga darah tercampur rata.
Sebelum dilakukan penghitungan, dua tetes pertama dari campuran
tersebut dibuang dan selanjutnya diteteskan pada hemositometer tipe Neubauer
dan ditutup dengan gelas penutup. Jumlah sel darah putih dihitung dengan
bantuan mikroskop pada pembesaran 400 kali. Penghitungan dilakukan pada
kotak besar hemositometer dengan rumus sebagai berikut (Nabib & Pasaribu
1989).
6
Keterangan:
SDP
= Jumlah sel darah putih.
A
= Jumlah sel darah putih terhitung.
N
= Jumlah kotak hemositometer yang diamati.
V
= Volume kotak hemositometer yang diamati.
Fp
= Faktor pengenceran
Diferensial Leukosit
Darah diteteskan pada gelas objek bagian kanan atas. Selanjutnya gelas
objek yang lain diletakkan di atas tetesan darah sampai membentuk sudut sekitar
30o, lalu ditarik sampai darah menyebar sepanjang tepi gelas objek pertama.
Setelah itu ulasan darah dikeringudarakan, lalu direndam dalam larutan Giemsa
(1:20) selama 15-20 menit. Kemudian dibilas dengan akuades. Selanjutnya
diamati menggunakan mikroskop (Blaxhall & Daisley 1973).
Pengamatan Kelangsungan Hidup
Kematian ikan dicatat setiap hari setelah diinfeksi. Tingkat kelangsungan
hidup (KH) dihitung untuk masing-masing perlakuan. Perhitungan dilakukan
berdasarkan persamaan Zonnoveld et al. (1991):
Respons Makan
Pengamatan respons makan ikan mas dilakukan secara deskriptif selama
14 hari pascainfeksi A. hydrophila dengan melihat selang waktu ikan memakan
pakan yang diberikan, dan jumlah pakan yang dimakan.
Gejala Klinis
Pengamatan terhadap gejala klinis dilakukan secara deskriptif selama 14
hari pascainfeksi A. hydrophila, meliputi hiperemia, radang, hemoragi, nekrosis,
dan tukak. Ikan yang menunjukkan gejala klinis infeksi A.hydrophila dipisahkan
untuk mempermudah pengamatan proses recovery.
Analisis Data
Data gambaran darah dan tingkat kelangsungan hidup yang diperoleh
dianalisis menggunakan software SPSS 13 dan ditampilkan dalam bentuk tabel
atau gambar. Data tersebut dianalisis dengan cara membandingkan setiap
parameter yang sama, pada waktu pengamatan yang sama, antara ikan mas yang
membawa marka molekuler Cyca-DAB1*05 dengan ikan mas tanpa marka.
7
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Gambaran Darah
Pengamatan terhadap total sel darah merah menunjukkan bahwa antara
ikan yang membawa marka molekuler dan ikan mas tanpa marka secara statistik
tidak berbeda nyata (Lampiran 1; p>0,05). Sel darah merah total ikan mas yang
membawa marka molekuler pada hari ke-0 berada pada nilai 1,56±0,20 (x 106
sel/mm3), sedangkan ikan mas tanpa marka sebesar 1,16±0,47 (x 106 sel/mm3)
(Gambar 1). Pada hari ke-3 sel darah merah total menurun, baik pada ikan mas
yang membawa marka molekuler maupun ikan tanpa marka. Sel darah merah total
ikan mas yang membawa marka molekuler 1,38±0,21 (x 106 sel/mm3), dan ikan
mas tanpa marka sebesar 0,85±0,30 (x 106 sel/mm3). Hari ke-7, jumlah sel darah
merah total menurun, pada ikan yang membawa marka molekuler 1,14±0,26 (x
106 sel/mm3), dan pada ikan mas tanpa marka 0,76±0,22 (x 106 sel/mm3). Pada
pengamatan hari ke-14 menunjukkan peningkatan sel darah merah total, baik pada
ikan mas yang membawa marka molekuler maupun ikan mas tanpa marka. Sel
darah merah total ikan mas yang membawa marka molekuler sebesar 1,17±0,06 (x
106 sel/mm3), sedangkan pada ikan mas tanpa marka sebesar 0,90±0,19 (x 106
sel/mm3).
Sel darah merah (x 106 sel/mm3)
2.0
1.8
a
1.6
a
a
a
1.4
a
1.2
a
a
1.0
a
M
0.8
N
0.6
0.4
0.2
0.0
H0
H3
H7
H14
Waktu (hari ke-)
Gambar 1. Total sel darah merah (SDM) ikan mas yang membawa marka
molekuler Cyca-DAB1*05 (M), dan tanpa marka yang diperoleh dari
pembudidaya di Bogor (N) pascainfeksi Aeromonas hydrophila.
Hemoglobin pada ikan mas yang membawa marka molekuler pada hari ke0 (7,77±0,15 g%) dan hari ke-3 (7,20±0,53 g%) adalah sama, dan kedua-duanya
lebih tinggi (p