16
mineral oil Sigma-Aldrich. Inc, M-8410 kemudian dimaturasi dalam inkubator 5 CO
2,
temperatur 38,5
o
C selama 28 jam.
Pembuatan Preparat Fiksasi Oosit
Oosit yang telah dimaturasi dicuci dan dihilangkan semua bagian sel kumulus dengan bantuan 0,25 enzim hyaluronidase dengan cara dipipet berulang-ulang
menggunakan pipet yang disesuaikan dengan ukuran oosit. Kemudian oosit diletakkan pada drop 0,7 KCl diatas gelas objek yang sebelumnya telah direndam
dalam alkohol, lalu difiksir dengan cara ditutup dengan cover glass yang memiliki bantalan paraffin dan vaselin 1:9 pada kedua sisinya. Preparat tersebut
dimasukkan dalam larutan fiksasi yang mengandung asam asetat dan ethanol 1:3 selama 3 hari.
Evaluasi Pematangan Inti Oosit
Preparat yang telah difiksasi selama 3 hari selanjutnya diwarnai dengan pewarna 2 aceto-orcein selama ±5 menit. Kemudian zat pewarna dibersihkan
dengan 25 asam asetat dan keempat sisi cover glass diberi larutan kuteks bening untuk selanjutnya dilakukan pengamatan morfologi dengan mikroskop fase kontras
Olympus IX 70, Japan.
Evaluasi tingkat kematangan inti dinilai dengan cara menghitung jumlah oosit pada setiap tahap pembelahan meiosis. Status inti oosit dikelompokkan
menjadi tahap germinal vesicle GV, germinal vesicle break down GVBD, metaphase
I MI, anaphase I- telophase I AI-TI dan metaphase II MII. Tahap GV ditandai dengan membran inti yang masih menyatu dengan vesicle, GVBD
ditandai dengan robeknya membran inti dan inti sudah tidak terlihat jelas, sedangkan MI ditandai dengan adanya kromosom homolog yang berderet di bidang
ekuator serta MII ditandai dengan adanya badan kutub I dan susunan kromosom yang sama dengan tahap MI. Oosit dikategorikan sebagai oosit yang telah matur
jika telah berada pada tahap Metaphase II.
II. Tingkat Fertilisasi In Vitro IVF Oosit Domba pada Berbagai Suhu dan
Waktu Penyimpanan
Kompetensi oosit domba yang dikoleksi dari ovarium yang disimpan pada suhu dan waktu penyimpanan yang berbeda diuji hingga tahap fertilisasi in vitro.
17
Fertilisasi dilakukan terhadap oosit yang dikoleksi dari setiap kelompok perlakuan penyimpanan ovarium pada suhu dan waktu penyimpanan yang berbeda. Tahap
fertilisasi dilakukan pada oosit yang berasal dari setiap kelompok perlakuan setelah sebelumnya dimaturasi. Tahap proses maturasi oosit dilakukan mengikuti prosedur
yang sama seperti pada penelitian tahap pertama.
Penyiapan Spermatozoa
Fertilisasi in vitro menggunakan semen beku domba garut yang berasal dari satu individu yang sama pada setiap kali IVF. Proses thawing dilakukan dengan
menempatkan semen beku domba dalam air bersuhu 37°C selama 30 detik. Selanjutnya semen disentrifugasi dengan 1600 rpm selama 5 menit dalam medium
fertilisasi. Setelah disentrifugasi, supernatan dibuang kemudian dilakukan penghitungan konsentrasi sperma. Tahap selanjutnya adalah menambahkan medium
fertilisasi hingga mencapai konsentrasi spermatozoa yang digunakan untuk keperluan IVF yaitu sebesar 5.10
6
spermatozoaml.
Fertilisasi In Vitro
Spermatozoa yang telah disiapkan kemudian ditempatkan dalam bentuk drop masing-masing sebanyak 100 µl pada cawan petri. Kemudian persiapan juga
dilakukan pada oosit yang akan difertilisasi. Oosit yang telah dimaturasi selama 24 jam kemudian dicuci dalam medium fertilisasi sebanyak dua kali. Oosit kemudian
dipindahkan ke dalam drop spermatozoa, masing-masing drop untuk 10-15 oosit dan kemudian diinkubasi selama 14 jam dalam inkubator CO
2
5, 38,5°C.
Evaluasi Tingkat Fertilisasi In Vitro
Pengamatan tingkat fertilisasi dilakukan dengan membuat preparat oosit seperti pada penelitian tahap maturasi oosit. Tingkat fertilisasi diamati dengan
melihat terjadinya pembentukan pronukleus PN. Oosit yang telah mengalami fertilisasi ditandai dengan terbentuknya dua pronukleus jantan dan betina, 2 PN
atau lebih 2 PN dalam sitoplasma oosit. Tingkat fertilisasi merupakan perbandingan antara jumlah sel telur yang dibuahi membentuk dua atau lebih
pronukleus dengan jumlah keseluruhan sel telur yang difertilisasi.
18
Analisis Data
Penelitian ini dirancang dengan rancangan acak lengkap RAL faktorial. Tingkat maturasi inti oosit pada masing-masing perlakuan diulang sebanyak 5 kali,
sedangkan perlakuan pada tingkat fertilisasi diulang sebanyak 4 kali. Data status inti oosit yaitu tahap GV, GVBD, MI, AT dan MII yang diperoleh dianalisis
dengan analysis of variance ANOVA dan dilanjutkan dengan uji Duncan. Begitu pula dengan data tingkat fertilisasi yang didapatkan yaitu jumlah oosit dengan
status 1 PN, 2 PN dan 2PN yang diperoleh juga dianalisis dengan ANOVA dan kemudian diuji lanjut dengan uji Duncan Steel Torrie, 1993.
19
HASIL DAN PEMBAHASAN HASIL
I.
Tingkat maturasi oosit domba dalam suhu dan waktu penyimpanan yang berbeda
Tahapan pematangan inti yang diamati pada penelitian ini dikelompokkan menjadi 5 tahap yaitu GV Germinal Vesicle, GVBD Germinal Vesicle Break
Down , M-I Metafase I, AT AnafaseTelofase dan M-II Metafase II. Status
inti maturasi oosit domba yang dikoleksi dari ovarium yang disimpan dengan suhu dan waktu penyimpanan yang berbeda seperti terlihat pada gambar 3.
Gambar 3 . Status inti sel oosit setelah maturasi in vitro: A. Germinal
Vesicle GV, B. Metaphase I MI, C. Anaphase-Telophase AT, D. Metaphase II MII, Pb: Polar body
Cromosome Plate
Pb
C B
D A
20
Hasil tingkat maturasi oosit domba yang disimpan pada suhu dan waktu penyimpanan yang berbeda disajikan pada tabel 1. Penyimpanan ovarium selama 2-
4 jam tidak menunjukkan perbedaan dalam kemampuan oosit untuk mencapai tahap metaphase II antara oosit yang berasal dari ovarium yang disimpan pada suhu 27-
28°C dengan suhu 36-37°C. Tingkat maturasi oosit yang koleksi dari ovarium yang disimpan pada suhu 27-28°C adalah sebesar 69,23 dan 70,83 untuk oosit yang
berasal dari ovarium yang disimpan pada suhu 36-37°C P0,05. Akan tetapi hasil sebaliknya ditunjukkan oleh tingkat maturasi oosit domba yang disimpan pada suhu
4°C yang secara signifikan lebih rendah dibandingkan tingkat maturasi oosit yang disimpan pada kedua kelompok suhu lainnya yaitu sebesar 45,65 P0,05.
Fenomena yang sama juga terlihat pada waktu penyimpanan ovarium selama 5-7 jam. Tingkat maturasi oosit domba yang disimpan pada suhu 27-28°C 59,61
dan 36-37°C 64,58 lebih tinggi bila dibandingkan dengan tingkat maturasi oosit domba yang disimpan pada suhu 4°C 36,36 P0,05.
Tabel 1. Status inti maturasi oosit domba secara in vitro yang dikoleksi dari
ovarium yang disimpan pada suhu dan waktu penyimpanan yang berbeda.
Kelompok jlh
oosit Status inti
Waktu jam
Suhu °C GV
GVBD MI
AT MII
2-4 36-37
48 1 2,08
a
2 4,16
a
10 20,83
abc
1 2,08
a
34 70,83
a
27-28 52 1 1,92
a
1 1,92
a
12 23,07
abc
0,00
a
36 69,23
ab
4 46
4 8,69
a
4 8,69
a
13 28,26
bc
0,00
a
21 45,65
c
5-7 36-37
48 1 2,08
a
3 6,25
a
8 16,66
ab
1 2,08
a
31 64,58
abcd
27-28 52 4 7,69
a
2 3,84
a
9 17,30
ab
0,00
a
31 59,61
abcd
4 55
6 10,90
a
8 14,54
ab
14 25,45
bc
0,00
a
20 36,36
ce
8-10 36-37 51 20 39,21
b
17 33,33
b
4 7,84
a
0,00
a
4 7,84
cf
27-28 43 15 40,54
b
11 29,72
b
7 18,91
abc
1 2,70
a
9 24,32
f
4 42
2 4,76
a
6 14,28
ab
14 33,33
c
0,00
a
19 45,23
ce
Ket: Germinal vesicle GV, Germinal Vesicle Breakdown GVBD, Metafase I MI, Metafase II MII, AnafaseTelofase AT, Metafase II MII. Angka dengan
hurup kecil superskrip berbeda dalam kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata pada tiap perlakuan P 0,05.
Proporsi tingkat maturasi oosit domba yang disimpan selama 8-10 jam setelah pemotongan secara signifikan mulai mengalami penurunan. Tingkat
21
maturasi oosit yang berasal dari ovarium yang disimpan pada suhu 27-28°C dan 36- 37°C masing-masing sebesar 24,32 dan 7,48 P0,05. Hasil yang menarik
ditunjukkan oleh tingkat oosit yang diperoleh dari ovarium yang disimpan pada suhu 4°C yang justru menunjukkan tingkat maturasi yang lebih tinggi dibandingkan
dua kelompok penyimpanan suhu yang lain. Tingkat maturasi oosit yang berasal dari ovarium yang disimpan selama 8-10 jam pada suhu 4°C mencapai 45,23.
II. Tingkat fertilisasi oosit domba dengan suhu dan waktu penyimpanan yang berbeda
