Analisis Segregasi Gen hpt (Hygromisin Phosphotransferase) pada Tanaman Tembakau Transgenik Generasi T0
ANALISIS SEGREGASI GEN HPT (Hygromisin Phosphotransferase)
PADA TANAMAN TEMBAKAU TRANSGENIK GENERASI T0
NIKSON HALOMOAN
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
ABSTRAK
NIKSON HALOMOAN. Analisis Segregasi Gen hpt (hygromisin phosphotransferase) pada
Tanaman Tembakau Transgenik Generasi T0. Dibimbing oleh SUHARSONO dan UTUT
WIDYASTUTI.
Higromisin fosfotransferase yang disandi oleh gen hpt merupakan salah satu penanda seleksi
yang digunakan pada perakitan tanaman transgenik. Tanaman yang membawa gen hpt mampu
menghasilkan enzim higromisin fosfotransferase, sehingga toleran terhadap higromisin. Penelitian
ini bertujuan untuk melakukan analisis segregasi gen hpt pada tanaman tembakau transgenik
generasi T0. Tanaman T0 ditanam di pot dan diletakkan di rumah kaca. Biji yang dihasilkan
tanaman T0 dari penyerbukan sendiri ditanam di media MS0 yang mengandung 50mg/l higromisin
selama satu bulan. Perbandingan antara jumlah tanaman yang toleran dan sensitif terhadap
higromisin adalah 3:1 berdasarkan uji Khi-kuadrat. Hal ini menunjukkan bahwa gen hpt
terintegrasi di genom tanaman T0, diwariskan mengikuti hukum Mendel untuk satu gen dan
genotipe tanaman T0 adalah heterozigot untuk gen hpt. Gen hpt difusikan dengan gen MmCu-ZnSOD, maka tanaman T0 juga mengandung gen MmCu-Zn-SOD.
Kata kunci : segregasi, higromisin, analisis khi-kuadrat.
ABSTRACT
NIKSON HALOMOAN. Segregation Analysis of hpt (hygromycin phosphotransferase)
Gene in T0 Generation Transgenic Tobacco Plants. Supervised by SUHARSONO and UTUT
WIDYASTUTI.
Hygromycine phosphotransferase encoded by hpt gene is one of commonly used as a
selectable marker for the production of transgenic plants. The plants harbored the hpt gene were
able to synthesize hygromycine phosphotransferase enzymes, therefore they are tolerant to
higromicine.The objective of this research is to analyze the segregation of hpt gene in T0
generation transgenic tobacco plants. T0 transgenic plants were cultivated in the pot and placed in
the green house. The seeds produced by selfing of T0 plants were cultivated on the MS0 media
containing 50mg/l higromycine for one month. The rasio between the number of tolerant and
sensitive plants to higromycine is 3:1 based on Khi-square. This result indicated that hpt gene is
integrated in genom of T0 plants, inherited as Mendelian pattern for one gene, and the genotype of
T0 plants is heterozigous for hpt gene. As hpt gene linked to MmCuZn-SOD gene, so T0 plants
contain also MmCuZn-SOD gene.
Key words: segregation, hygromycin, khi-square analysis.
ANALISIS SEGREGASI GEN HPT (Hygromisin Phosphotransferase)
PADA TANAMAN TEMBAKAU TRANSGENIK GENERASI T0
NIKSON HALOMOAN
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Judul
Nama
NRP
: Analisis Segregasi Gen hpt (Hygromisin Phosphotransferase) pada
Tanaman Tembakau Transgenik Generasi T0
: Nikson Halomoan
: G34051052
Menyetujui :
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA
Dr. Ir. Utut Widyastuti, M. Si
NIP 196104281987031003
NIP 196405171989032001
Mengetahui :
Ketua Departemen Biologi
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M. Si
NIP 196410021989031002
Tanggal Lulus :
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Tuhan atas segala rahmat dan karunia-Nya
sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Penelitian ini berjudul Analisis Segregasi
Gen HPT (Hygromisin Phosphotransferase) pada Tanaman Tembakau Transgenik Generasi T0
yang dilaksanakan pada bulan Mei sampai bulan Desember 2011 bertempat di Laboratorium
BIORIN (Biotechnology Research Indonesia-The Netherlands) dan Biologi Sel dan Molekular
Tanaman, Pusat Penelitan Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB (PPSHB-IPB) kampus IPB
Dramaga, Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA dan Dr. Ir. Utut
Widyastuti, M. Si selaku pembimbing yang telah memberikan saran dan bimbingannya selama
melaksanakan penelitian serta kepada Dra. Hilda Akmal, M. Si sebagai penguji atas saran yang
telah diberikan. Terima kasih kepada Ditjen Dikti Depdiknas atas Hibah Kompetensi dengan judul:
“Isolasi dan ekspresi gen dalam rangka perakitan tanaman yang toleran terhadap cekaman asam
dan aluminium” an. Dr. Suharsono, DEA dengan nomor kontrak 039/HIKOM/DP2M/2008/
tanggal 13 Agustus 2008, 219/SP2H/PP/DP2M/V/2009 tanggal 30 Mei 2009, dan
224/SP2H/PP/DP2M/III/2010 tanggal 1 Maret 2010, terima kasih atas bantuannya dalam
menyediakan biaya pendidikan dan penelitian. Terima kasih penulis ucapkan juga kepada Bu
Hanum, Bu Ratna, Pak Ulung, Pak Muzuni, Pak Radit, Bu Srilis, Pak Mulya, Mbak Peppy, Mbak
Nia, Mbak Ara, Pak Adi, Pak Yusman, Kak Muchdar, Kak Nurul, Kak Anita, Kak Novi, Lulu,
Goto, Fajri, Lita, Indah, dan Ila yang telah banyak membantu dalam penelitian ini.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Ibuku Rolas Purba yang selalu sabar
mendidikku, Bapakku Jackson Anwar Hasudungan yang selalu menasihatiku, Abangku; Ruben
serta kedua adikku; Fandry dan Fransiskus yang selalu mendoakanku. Terima kasih penulis
ucapkan juga kepada sahabatku Henrikus, Budi dan Ayi yang selalu mengerti akan diriku, karibku
Yanto, Yono, Aldion, Leo, Robin, Hardi, Mulya, Agus dan Bonar yang selalu ada dan dekat.
Teman-teman Biologi angkatan 41, 42 dan 43 yang lain atas kebersamaan selama penelitian.
Teman-teman Perwira 99 dan Kartika yang selalu memberi semangat. Tak lupa penulis ucapkan
terimakasih kepada Bu Tri pembimbing akademikku, Bu Rita pembimbing Studi Lapanganku, Pak
Aris pembimbing Praktik Lapanganku, Pak Tri, Pak Ence, Bu Nissa, Bu Agustin, Bu Rini, Bu
Nunik, Bu Wita, Pak Achmad, Pak Bambang, Pak Alex, dan Bu Dorly. Keluarga Departemen
Biologi yang selalu membantu Bu Eti, Mbak Yenny, Mbak Yunny, Pak Rusna, dan Paman Jonny.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, 12 Juni 2012
Nikson Halomoan
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta tanggal 15 Juni 1987, putra kedua dari empat bersaudara dari
Bapak Jackson Anwar Hasudungan dan Ibu Rolas Purba. Pada tahun 2005 penulis lulus dari
SMUN 26 Jakarta dan pada tahun yang sama penulis melanjutkan kuliah di Institut Pertanian
Bogor melalui jalur PMDK (Penelusuran Minat dan Bakat). Tahun 2006 penulis masuk program
studi Biologi, Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut
Pertanian Bogor.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah mengikuti beberapa kegiatan ekstrakulikuler
sebagai staf Bioworld di HIMABIO tahun 2006-2007, sebagai panitia di Talk Show Lapangan
Kerja tahun 2007, sebagai panitia The 7th Asian Crop Science Association Conference tahun 2011.
Pada tahun 2009 penulis melaksanakan Praktik Lapang dengan judul Budidaya Tanaman Bayam
(Amaranthus sp.) dengan menggunakan Sistem Hidroponik di Parung Farm.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................................. viii
DAFTAR TABEL.................................................................................................................. viii
DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................................... viii
PENDAHULUAN .................................................................................................................. 1
Latar Belakang.................................................................................................................. 1
Tujuan ................................................................................................................................ 1
Waktu dan Tempat ............................................................................................................ 1
BAHAN DAN METODE ...................................................................................................... 1
Bahan dan Alat .................................................................................................................. 1
Metode Penelitian
Penyerbukan sendiri pada tanaman tembakau ................................................................... 1
Uji resistensi tanaman tembakau terhadap higromisin secara in vitro .............................. 1
Analisis Data ..................................................................................................................... 2
HASIL .................................................................................................................................... 2
PEMBAHASAN .................................................................................................................... 3
SIMPULAN ........................................................................................................................... 3
SARAN ................................................................................................................................... 3
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................................ 4
LAMPIRAN ........................................................................................................................... 5
viii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Kecambah dari tanaman transgenik dan non transgenik yang ditumbuhkan di media
seleksi. A. Tanaman transgenik B. Tanaman non transgenik..... ........ ................................ 2
2 Tanaman non transgenik yang ditumbuhkan di media MS0. A. Mengandung higromisin
50 mg/l dan B. Tanpa higromisin…………………………………………………………..3
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Hasil segregasi tanaman tembakau transgenik generasi T0 terhadap higromisin ............... 2
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Konstruksi plasmid biner yang membawa gen MmCuZn-SOD dan gen hpt……. ............. 6
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Hukum Mendel mengenai segregasi
menyatakan bahwa kedua alel dari masingmasing sifat individu terpisah selama
pembentukan gamet sehingga gamet masingmasing individu hanya mendapat satu dari dua
alel. Alel berpadu bebas pada saat pembuahan
(Mendel 1865). Ratio hasil persilangan
mengikuti hukum Mendel dapat dianalisis
dengan menggunakan sebaran khi-kuadrat (χ2)
(Mood et al. 1974). Untuk menguji hipotesis
hasil persilangan digunakan formula: H0: α1 =
α2 vs H1 : α1 ≠ α2; χ2 = Σ [(o i – e i )2/e i ]:
dimana o i : hasil observasi dan e i : nilai
harapan observasi. Jika χ2 hitung ≤ χ2 tabel
terima H0 dan χ2 hitung > χ2 tabel tolak H0.
Penerimaan H0 berarti hasil persilangan
mengikuti
hukum
Mendel,
sedangkan
penolakan H0 berarti tidak mengikuti hukum
Mendel (Winchester 1958; Mendenhall &
Scheaffer 1973).
Gen penanda hasil transformasi pada
tanaman Nicotiana tabacum yang berasal dari
daerah
pengkode
protein
pada
Tn5
aminoglikosida jenis phosphotransferase II
gen yang terdapat pada virus mosaik kembang
kol VI telah disisipkan ke dalam protoplas
tanaman sebagai bagian dari plasmid biner.
Gen tersebut stabil terintegrasi di dalam
genomik DNA dan terekspresi sebagai
penanda, serta dapat diturunkan pada klon sel.
Hasil analisis persilangan genetik pada
tanaman transformasi memiliki sifat resisten
terhadap kanamisin sebagai penanda seleksi
dan bersegregasi sesuai hukum Mendel pada
generasi F1 (Paszkowski et al. 1984).
Higromisin dihasilkan oleh Streptomyces
hygroscopicus, sebuah bakteri yang diisolasi
dari sampel tanah. Sejak penemuan pada tahun
delapan puluhan higromisin telah menjadi
agen seleksi standar dalam percobaan transfer
gen dalam berbagai sel prokariotik dan
eukariotik (Gritz & Davies 1983; Kaster et
al. 1983). Higromisin menghambat sintesis
protein pada proses penerjemahan mRNA
(Cabanas et al. 1987; Lacal & Carrasco 1983).
Higromisin
juga mempengaruhi proses
translokasi ribosom (Cabanas et al. 1987;
Gonzalez et al. 1978; Hausner et al. 1988).
Seperti antibiotik aminoglikosida lainnya,
higromisin menginduksi salah membaca
aminoasil-tRNA dengan mengikat situs
ribosom A (decoding site) (Cabanas et al.
1987; Davies & Davis 1968; Moazed & Noller
1987; Spahn & Prescott 1996).
Tujuan
Penelitian ini bertujuan melakukan
analisis segregasi gen hpt (hygromycin
phosphotransferase) pada tanaman tembakau
transgenik generasi T0.
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan pada bulan Mei
sampai dengan Desember 2011. Penelitian
dilaksanakan di laboratorium BIORIN
(Biotechnology
Research
Indonesia-The
Netherlands), Biologi Sel dan Molekular
Tanaman, Pusat Penelitan Sumberdaya Hayati
dan Bioteknologi (PPSHB) IPB Dramaga.
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan yaitu tanaman
tembakau transgenik yang mengandung gen
MmCuZn-SOD dan gen hpt yang resisten
terhadap higromisin sebagai penanda seleksi
(Hannum 2012), media tanam, media dasar
Murashige dan Skoog (MS0), dan antibiotik
higromisin. Cawan petri, timbangan analitik,
kotak pindah (Laminar Air Flow Cabinet) dan
alat laboratorium lainnya.
Metode Penelitian
Penyerbukan sendiri pada tanaman
tembakau
Tanaman
tembakau
transgenik
diperbanyak secara in vitro di dalam media
MS0 di ruang kultur dengan fotoperiode 16
jam pada suhu 25oC. Tanaman yang
mempunyai akar yang baik, dipindahkan ke
media sekam dalam ruang kultur selama
seminggu. Selanjutnya tanaman yang tumbuh
dengan baik dipindahkan ke media tanam
yang berisi campuran tanah, kompos, sekam
bakar (1:1:1) di dalam pot dan diletakkan di
luar ruangan selama seminggu. Selanjutnya
tanaman dipindahkan dan dipelihara di rumah
kaca sampai dewasa. Tanaman tembakau
dibiarkan melakukan penyerbukan sendiri
dengan ditutup pada bunganya sampai
menghasilkan biji.
Uji resistensi tanaman tembakau terhadap
higromisin secara in vitro
Biji-biji tanaman tembakau disterilisasi
dengan cara direndam dalam ethanol 70%
selama 1 menit, lalu direndam dalam larutan
Bayclin 20% (5.25% NaClO) selama 15 menit.
Biji-biji selanjutnya dibilas dengan air steril
sebanyak
empat
kali,
kemudian
dikeringanginkan di atas kertas tissue steril.
2
Sebanyak 40 biji tembakau steril
ditumbuhkan dalam media Murashige dan
Skoog yang mengandung garam-garam MS,
vitamin, 30 g/L sukrosa, 3 g/L agar, dan
antibiotik higromisin 50 mg/L di dalam cawan
petri yang berdiameter 10 cm, dan diletakkan di
ruangan gelap selama 3 hari dan kemudian
dipindahkan ke ruangan bercahaya, dengan suhu
25ºC selama satu bulan. Setelah berumur satu
bulan, tanaman yang hidup dan yang mati
dihitung. Tanaman yang hidup adalah tanaman
yang resisten terhadap higromisin dan yang mati
adalah yang sensitif terhadap higromisin.
Analisis Data
Segregasi gen hpt dianalisis dengan
menggunakan uji khi-kuadrat (χ2) dengan rumus
: χ2 = Σ [(o i – e i )2/e i ]. Adanya ekspresi gen hpt
menyebabkan tanaman resisten terhadap
higromisin dan tidak adanya ekspresi gen hpt
menyebabkan tanaman sensitif terhadap
higromisin sehingga gen hpt bersifat dominan
pada tanaman transgenik.
HASIL
Tanaman T0 menghasilkan biji generasi T1.
Pada penelitian ini empat galur T0 telah berhasil
ditumbuhkan sehingga mendapatkan biji T1.
Sebagian besar tanaman tembakau pada
penelitian ini menghasilkan biji yang
mempunyai daya kecambah yang rendah. Daya
kecambah tanaman tembakau transgenik T0
berkisar antara 11 sampai 87% dan tanaman
kontrol non transgenik 20-39% (Tabel 1).
Baik biji dari tanaman transgenik maupun
non transgenik dapat berkecambah di media
yang mengandung higromisin (Gambar 1).
Kecambah yang resisten higromisin dapat
tumbuh terus menghasilkan daun dan berwarna
hijau setelah kotiledon tumbuh sedangkan
kecambah
yang
sensitif
hanya
dapat
menghasilkan kotiledon, berhenti tumbuh dan
berwarna kuning keputih-putihan.
Empat
tanaman
transgenik
T0
menghasilkan keturunan tanaman resisten dan
sensitif
terhadap
higromisin
dengan
perbandingan sekitar 3 resisten dan 1 sensitif
dengan nilai (χ2) antara 0.0435 dan 0.2444.
Tanaman
non
transgenik
menghasilkan
keturunan yang tumbuh bagus di media tanpa
higromisin tetapi mati semua di media yang
mengandung higromisin (Gambar 2).
Tanaman transgenik hasil regenerasi dari
sel atau jaringan disebut dengan generasi T0.
Tabel 1 Hasil segregasi tanaman tembakau transgenik generasi T0 terhadap higromisin
Galur
Jumlah biji
Daya kecambah
ditanam berkecambah
(%)
S 9.9
240
69
29
S 4.2
280
244
87
S 1.1
200
165
83
S 15.1
200
22
11
K (MS0)
120
47
39
K (Hyg)
40
8
20
Keterangan : χ2 tabel(db) ; ά= 5 % ; χ2(3) = 7.82
Jumlah tanaman Segregasi
Hyg R Hyg S Hyg R :Hyg S
51
186
121
17
0
18
58
44
5
8
3:1
3:1
3:1
3:1
-
χ2 hitung
0.0435
0.1967
0.2444
0.0605
24
B
A
Gambar 1. Kecambah dari tanaman transgenik dan non transgenik yang ditumbuhkan di media seleksi
A. Tanaman transgenik B. Tanaman non transgenik.
3
B
A
Gambar 2. Tanaman non transgenik yang ditumbuhkan di media MS0. A. Mengandung higromisin
50 mg/l dan B. Tanpa higromisin.
PEMBAHASAN
Tanaman transgenik yang resisten terhadap
higromisin yang diperoleh melalui infeksi
Agrobacterium
tumefaciens
menghasilkan
keturunan tanaman yang resisten dan sensitif
terhadap higromisin. Hal ini menunjukkan
bahwa gen hpt yang menyandi sifat resisten
terhadap higromisin terintegrasi ke dalam
genom tanaman transgenik T0; karena tidak
semua
keturunannya
resisten
terhadap
higromisin, maka tanaman transgenik T0
mempunyai genotipe heterozigot untuk gen hpt.
Hasil analisis (χ2) terhadap keturunan dari empat
tanaman transgenik generasi T0 menunjukkan
bahwa populasi T1 terdiri dari tanaman yang
resisten dan sensitif terhadap higromisin dengan
perbandingan
3:1.
Perbandingan
ini
menunjukkan bahwa selain tanaman tetuanya
adalah heterozigot, tetapi juga tanaman tetuanya
mengandung 1 gen hpt fungsional. Umumnya
gen yang diintroduksikan ke tanaman dengan
perantara A. tumefaciens diwariskan ke generasi
berikutnya mengikuti pola pewarisan Mendel
monohibrid (Travella et al. 2005).
Warna putih pada kecambah yang
ditumbuhkan
di
media
seleksi
yang
mengandung antibiotik higromisin disebabkan
oleh adanya penghambatan metabolisme sel
tumbuhan oleh antibiotik (Braun & Bennett
2001) (Gambar 1 & 2 A dan B). Penghambatan
proses metabolisme oleh antibiotik higromisin
terjadi karena adanya pengikatan ribosom A
pada subunit 30S oleh antibiotik yang
menyebabkan terjadinya kesalahan membaca
oleh aminoasil-tRNA terhadap mRNA pada
proses translasi. Pada tumbuhan, ribosom
subunit 30S berada di organel kloroplas dan
mitokondria. Pada kloroplas pengikatan ribosom
A pada subunit 30S oleh antibiotik
menyebabkan
rusaknya
klorofil
dan
menghambat pembentukan asam amino
(Wajtania et al. 2005).
Tanaman transgenik yang membawa gen
hpt akan mampu menghasilkan enzim
hygromycin phosphotransferase, yaitu kinase
yang akan memfosforilasi higromisin sehingga
menjadi tidak toksik bagi tanaman tersebut
(Holme et al. 2008).
Gen hpt difusikan dengan gen MmCuZnSOD maka kedua gen ini mempunyai
kecenderungan
diwariskan
ke
generasi
berikutnya secara bersama-sama (Lampiran 1).
Gen hpt dan gen MmCuZn-SOD terletak
berdampingan, maka kedua gen tersebut sangat
kecil kemungkinannya untuk bersegregasi.
Untuk mengetahui peranan gen SOD pada
tanaman transgenik, maka genotipe tanaman
transgenik lebih baik dalam keadaan homozigot.
Untuk mendapatkan tanaman transgenik
homozigot, maka seleksi harus dilakukan
terhadap tanaman T1 karena tanaman T1 terdiri
dari tanaman homozigot dan heterozigot untuk
transgen dengan perbandingan 1:2.
SIMPULAN
Hasil segregasi pada tanaman tembakau
transgenik yang mengandung gen MmCuZnSOD dan gen hpt berdasarkan analisis khikuadrat mengikuti pola pewarisan Mendel
dengan hasil segregasi 3:1. Semua tanaman T1
adalah heterozigot dan mengandung 1 gen hpt.
SARAN
Tanaman T1 yang resisten higromisin perlu
ditanam dan dibiarkan menyerbuk sendiri untuk
menghasilkan biji T2. Biji T2 ditumbuhkan di
dalam media seleksi untuk mendapatkan
tanaman transgenik homozigot.
4
DAFTAR PUSTAKA
Braun R, Bennett DJ. 2001. Antibiotic
resistence in genetically modified (GM)
crops. EFB Task Group Pub Prec Biotec
10: 1-4.
Cabanas MJ, Vasquez D, Modelell J. 1987.
Dual interference of hygromycin B with
ribosomal
translocation and with
aminoacyl-tRNA recognition. Eur J
Biochem 87(1): 21-27.
Davies J, Davis BD. 1968. Misreading of
ribonucleic acid code words indiced by
aminoglycoside antibiotics. The effect of
drug concentration. J Biol Chem 243 (12):
3312-3316.
Gonzalez A, Jimenez A, Vazquez D, Davies JE,
Schindler D. 1978. Studies on the mode of
action of hygromycin B,an inhibitor of
translocation in eukaryotes. J Biochem
Biophys Act 521(2): 459-469.
Gritz L, Davies J. 1983. Plasmid-encoded
hygromycin B resistance : the sequence of
hygromycin B phosphotransferase gene
and its expression in Escherichia coli and
Saccharomyces cerevisiae. Gene 25(2-3):
179-188.
Hannum S. 2012. Isolasi, pengklonan dan
analisis ekspresi gen penyandi CopperZinc Superoxide Dismutase [disertasi].
Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut
Pertanian Bogor.
Hausner TP, Geigenmuller U, Nierhaus KH.
1988. The allosteric three-site model for
the ribosomal elongation cycle. New
insights into the inhibition mechanisms of
aminoglycosides,
hiostrepton,
and
viomycin. J Biol Chem 263(26): 1310313111.
Holme IB, Brinch-Pedersen H, Lange M, Holm
PB. 2008. Transformation of different
barley (Hordeum vulgare L.) Cultivars by
Agrobacterium tumefaciens infection of in
vitro cultured ovules. Plant Cell Rep 27:
1833-1840
Kaster KR, Burgett SG, Rao RN, Ingolia TD.
1983. Analysis of a bacterial hygromycin
B resistance gene by transcriptional and
translational fusions and by DNA
sequencing. Nucleic Acids Res 11(19):
6895-6911.
Lacal JC, Carrasco L. 1983. Antiviral effects of
hygromycin B, a translation inhibitor
nonpermeant to
uninfected
cells.
Antimicrobiol Agents Chemother 24(2):
273-275.
Mendel G. 1865. Mendel's paper in English:
Experiments in Plant Hybridization.
Druery CT, the translator; Great Britain:
the Royal Horticultural Society. translation
of Mendel's paper.
Mendenhall
W, Scheaffer
R. 1973.
Mathematical Statistics and Applications.
University of Florida. Massachusctts.
Duxbury Press Scituate. p. 501
Moazed D, Noller HF .1987. Interaction of
antibiotics with functional sites in 16S
ribosomal RNA. Nature 327(6121): 389394.
Mood AM, Graybill FA, Boes DC. 1974.
Introduction to the theory of statistics. 3nd.
MC Graw-Hill Kagarusha. Tokyo. LTD.
p. 107
Paszkowski J et al.1984. Direct gene transfer to
plant. EMBO J 3(12): 2717-2722
Spahn CM, Prescott CD.1996. Throwing a
spanner in the works: antibiotics and the
translation apparatus. J Mol Med 74(8):
423-439.
Travella S, Ross SM, Harden J, Everett C,
Snape JW, Harwood WA. 2005. A
comparison of transgenic barley lines
produced by particle bombardment and
Agrobacterium-mediated technique. Plant
Cell Rep 23: 780-789.
Wajtania A, Pulawka J, Gabryszewska E. 2005.
Identification and elimination of bacterial
contaminants from Pelargonium tissue
cultures. J Fruit and Ornamental Plant Res
13: 101-108.
Winchester AM. 1958. Genetics A Survey of
the Principles of Heredity. Second Edition.
Stetson University. Cambridge. The
Riberside Press. p.65
5
LAMPIRAN
6
RB
NosP
NPT
II
NosT
35S P
MmCu/ZnSOD
GFP
NosT
HPT
35 S P
LB
Lampiran 1 Konstruksi plasmid biner yang membawa gen MmCuZn-SOD dan gen hpt (Hannum 2012)
ABSTRAK
NIKSON HALOMOAN. Analisis Segregasi Gen hpt (hygromisin phosphotransferase) pada
Tanaman Tembakau Transgenik Generasi T0. Dibimbing oleh SUHARSONO dan UTUT
WIDYASTUTI.
Higromisin fosfotransferase yang disandi oleh gen hpt merupakan salah satu penanda seleksi
yang digunakan pada perakitan tanaman transgenik. Tanaman yang membawa gen hpt mampu
menghasilkan enzim higromisin fosfotransferase, sehingga toleran terhadap higromisin. Penelitian
ini bertujuan untuk melakukan analisis segregasi gen hpt pada tanaman tembakau transgenik
generasi T0. Tanaman T0 ditanam di pot dan diletakkan di rumah kaca. Biji yang dihasilkan
tanaman T0 dari penyerbukan sendiri ditanam di media MS0 yang mengandung 50mg/l higromisin
selama satu bulan. Perbandingan antara jumlah tanaman yang toleran dan sensitif terhadap
higromisin adalah 3:1 berdasarkan uji Khi-kuadrat. Hal ini menunjukkan bahwa gen hpt
terintegrasi di genom tanaman T0, diwariskan mengikuti hukum Mendel untuk satu gen dan
genotipe tanaman T0 adalah heterozigot untuk gen hpt. Gen hpt difusikan dengan gen MmCu-ZnSOD, maka tanaman T0 juga mengandung gen MmCu-Zn-SOD.
Kata kunci : segregasi, higromisin, analisis khi-kuadrat.
ABSTRACT
NIKSON HALOMOAN. Segregation Analysis of hpt (hygromycin phosphotransferase)
Gene in T0 Generation Transgenic Tobacco Plants. Supervised by SUHARSONO and UTUT
WIDYASTUTI.
Hygromycine phosphotransferase encoded by hpt gene is one of commonly used as a
selectable marker for the production of transgenic plants. The plants harbored the hpt gene were
able to synthesize hygromycine phosphotransferase enzymes, therefore they are tolerant to
higromicine.The objective of this research is to analyze the segregation of hpt gene in T0
generation transgenic tobacco plants. T0 transgenic plants were cultivated in the pot and placed in
the green house. The seeds produced by selfing of T0 plants were cultivated on the MS0 media
containing 50mg/l higromycine for one month. The rasio between the number of tolerant and
sensitive plants to higromycine is 3:1 based on Khi-square. This result indicated that hpt gene is
integrated in genom of T0 plants, inherited as Mendelian pattern for one gene, and the genotype of
T0 plants is heterozigous for hpt gene. As hpt gene linked to MmCuZn-SOD gene, so T0 plants
contain also MmCuZn-SOD gene.
Key words: segregation, hygromycin, khi-square analysis.
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Hukum Mendel mengenai segregasi
menyatakan bahwa kedua alel dari masingmasing sifat individu terpisah selama
pembentukan gamet sehingga gamet masingmasing individu hanya mendapat satu dari dua
alel. Alel berpadu bebas pada saat pembuahan
(Mendel 1865). Ratio hasil persilangan
mengikuti hukum Mendel dapat dianalisis
dengan menggunakan sebaran khi-kuadrat (χ2)
(Mood et al. 1974). Untuk menguji hipotesis
hasil persilangan digunakan formula: H0: α1 =
α2 vs H1 : α1 ≠ α2; χ2 = Σ [(o i – e i )2/e i ]:
dimana o i : hasil observasi dan e i : nilai
harapan observasi. Jika χ2 hitung ≤ χ2 tabel
terima H0 dan χ2 hitung > χ2 tabel tolak H0.
Penerimaan H0 berarti hasil persilangan
mengikuti
hukum
Mendel,
sedangkan
penolakan H0 berarti tidak mengikuti hukum
Mendel (Winchester 1958; Mendenhall &
Scheaffer 1973).
Gen penanda hasil transformasi pada
tanaman Nicotiana tabacum yang berasal dari
daerah
pengkode
protein
pada
Tn5
aminoglikosida jenis phosphotransferase II
gen yang terdapat pada virus mosaik kembang
kol VI telah disisipkan ke dalam protoplas
tanaman sebagai bagian dari plasmid biner.
Gen tersebut stabil terintegrasi di dalam
genomik DNA dan terekspresi sebagai
penanda, serta dapat diturunkan pada klon sel.
Hasil analisis persilangan genetik pada
tanaman transformasi memiliki sifat resisten
terhadap kanamisin sebagai penanda seleksi
dan bersegregasi sesuai hukum Mendel pada
generasi F1 (Paszkowski et al. 1984).
Higromisin dihasilkan oleh Streptomyces
hygroscopicus, sebuah bakteri yang diisolasi
dari sampel tanah. Sejak penemuan pada tahun
delapan puluhan higromisin telah menjadi
agen seleksi standar dalam percobaan transfer
gen dalam berbagai sel prokariotik dan
eukariotik (Gritz & Davies 1983; Kaster et
al. 1983). Higromisin menghambat sintesis
protein pada proses penerjemahan mRNA
(Cabanas et al. 1987; Lacal & Carrasco 1983).
Higromisin
juga mempengaruhi proses
translokasi ribosom (Cabanas et al. 1987;
Gonzalez et al. 1978; Hausner et al. 1988).
Seperti antibiotik aminoglikosida lainnya,
higromisin menginduksi salah membaca
aminoasil-tRNA dengan mengikat situs
ribosom A (decoding site) (Cabanas et al.
1987; Davies & Davis 1968; Moazed & Noller
1987; Spahn & Prescott 1996).
Tujuan
Penelitian ini bertujuan melakukan
analisis segregasi gen hpt (hygromycin
phosphotransferase) pada tanaman tembakau
transgenik generasi T0.
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan pada bulan Mei
sampai dengan Desember 2011. Penelitian
dilaksanakan di laboratorium BIORIN
(Biotechnology
Research
Indonesia-The
Netherlands), Biologi Sel dan Molekular
Tanaman, Pusat Penelitan Sumberdaya Hayati
dan Bioteknologi (PPSHB) IPB Dramaga.
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan yaitu tanaman
tembakau transgenik yang mengandung gen
MmCuZn-SOD dan gen hpt yang resisten
terhadap higromisin sebagai penanda seleksi
(Hannum 2012), media tanam, media dasar
Murashige dan Skoog (MS0), dan antibiotik
higromisin. Cawan petri, timbangan analitik,
kotak pindah (Laminar Air Flow Cabinet) dan
alat laboratorium lainnya.
Metode Penelitian
Penyerbukan sendiri pada tanaman
tembakau
Tanaman
tembakau
transgenik
diperbanyak secara in vitro di dalam media
MS0 di ruang kultur dengan fotoperiode 16
jam pada suhu 25oC. Tanaman yang
mempunyai akar yang baik, dipindahkan ke
media sekam dalam ruang kultur selama
seminggu. Selanjutnya tanaman yang tumbuh
dengan baik dipindahkan ke media tanam
yang berisi campuran tanah, kompos, sekam
bakar (1:1:1) di dalam pot dan diletakkan di
luar ruangan selama seminggu. Selanjutnya
tanaman dipindahkan dan dipelihara di rumah
kaca sampai dewasa. Tanaman tembakau
dibiarkan melakukan penyerbukan sendiri
dengan ditutup pada bunganya sampai
menghasilkan biji.
Uji resistensi tanaman tembakau terhadap
higromisin secara in vitro
Biji-biji tanaman tembakau disterilisasi
dengan cara direndam dalam ethanol 70%
selama 1 menit, lalu direndam dalam larutan
Bayclin 20% (5.25% NaClO) selama 15 menit.
Biji-biji selanjutnya dibilas dengan air steril
sebanyak
empat
kali,
kemudian
dikeringanginkan di atas kertas tissue steril.
2
Sebanyak 40 biji tembakau steril
ditumbuhkan dalam media Murashige dan
Skoog yang mengandung garam-garam MS,
vitamin, 30 g/L sukrosa, 3 g/L agar, dan
antibiotik higromisin 50 mg/L di dalam cawan
petri yang berdiameter 10 cm, dan diletakkan di
ruangan gelap selama 3 hari dan kemudian
dipindahkan ke ruangan bercahaya, dengan suhu
25ºC selama satu bulan. Setelah berumur satu
bulan, tanaman yang hidup dan yang mati
dihitung. Tanaman yang hidup adalah tanaman
yang resisten terhadap higromisin dan yang mati
adalah yang sensitif terhadap higromisin.
Analisis Data
Segregasi gen hpt dianalisis dengan
menggunakan uji khi-kuadrat (χ2) dengan rumus
: χ2 = Σ [(o i – e i )2/e i ]. Adanya ekspresi gen hpt
menyebabkan tanaman resisten terhadap
higromisin dan tidak adanya ekspresi gen hpt
menyebabkan tanaman sensitif terhadap
higromisin sehingga gen hpt bersifat dominan
pada tanaman transgenik.
HASIL
Tanaman T0 menghasilkan biji generasi T1.
Pada penelitian ini empat galur T0 telah berhasil
ditumbuhkan sehingga mendapatkan biji T1.
Sebagian besar tanaman tembakau pada
penelitian ini menghasilkan biji yang
mempunyai daya kecambah yang rendah. Daya
kecambah tanaman tembakau transgenik T0
berkisar antara 11 sampai 87% dan tanaman
kontrol non transgenik 20-39% (Tabel 1).
Baik biji dari tanaman transgenik maupun
non transgenik dapat berkecambah di media
yang mengandung higromisin (Gambar 1).
Kecambah yang resisten higromisin dapat
tumbuh terus menghasilkan daun dan berwarna
hijau setelah kotiledon tumbuh sedangkan
kecambah
yang
sensitif
hanya
dapat
menghasilkan kotiledon, berhenti tumbuh dan
berwarna kuning keputih-putihan.
Empat
tanaman
transgenik
T0
menghasilkan keturunan tanaman resisten dan
sensitif
terhadap
higromisin
dengan
perbandingan sekitar 3 resisten dan 1 sensitif
dengan nilai (χ2) antara 0.0435 dan 0.2444.
Tanaman
non
transgenik
menghasilkan
keturunan yang tumbuh bagus di media tanpa
higromisin tetapi mati semua di media yang
mengandung higromisin (Gambar 2).
Tanaman transgenik hasil regenerasi dari
sel atau jaringan disebut dengan generasi T0.
Tabel 1 Hasil segregasi tanaman tembakau transgenik generasi T0 terhadap higromisin
Galur
Jumlah biji
Daya kecambah
ditanam berkecambah
(%)
S 9.9
240
69
29
S 4.2
280
244
87
S 1.1
200
165
83
S 15.1
200
22
11
K (MS0)
120
47
39
K (Hyg)
40
8
20
Keterangan : χ2 tabel(db) ; ά= 5 % ; χ2(3) = 7.82
Jumlah tanaman Segregasi
Hyg R Hyg S Hyg R :Hyg S
51
186
121
17
0
18
58
44
5
8
3:1
3:1
3:1
3:1
-
χ2 hitung
0.0435
0.1967
0.2444
0.0605
24
B
A
Gambar 1. Kecambah dari tanaman transgenik dan non transgenik yang ditumbuhkan di media seleksi
A. Tanaman transgenik B. Tanaman non transgenik.
3
B
A
Gambar 2. Tanaman non transgenik yang ditumbuhkan di media MS0. A. Mengandung higromisin
50 mg/l dan B. Tanpa higromisin.
PEMBAHASAN
Tanaman transgenik yang resisten terhadap
higromisin yang diperoleh melalui infeksi
Agrobacterium
tumefaciens
menghasilkan
keturunan tanaman yang resisten dan sensitif
terhadap higromisin. Hal ini menunjukkan
bahwa gen hpt yang menyandi sifat resisten
terhadap higromisin terintegrasi ke dalam
genom tanaman transgenik T0; karena tidak
semua
keturunannya
resisten
terhadap
higromisin, maka tanaman transgenik T0
mempunyai genotipe heterozigot untuk gen hpt.
Hasil analisis (χ2) terhadap keturunan dari empat
tanaman transgenik generasi T0 menunjukkan
bahwa populasi T1 terdiri dari tanaman yang
resisten dan sensitif terhadap higromisin dengan
perbandingan
3:1.
Perbandingan
ini
menunjukkan bahwa selain tanaman tetuanya
adalah heterozigot, tetapi juga tanaman tetuanya
mengandung 1 gen hpt fungsional. Umumnya
gen yang diintroduksikan ke tanaman dengan
perantara A. tumefaciens diwariskan ke generasi
berikutnya mengikuti pola pewarisan Mendel
monohibrid (Travella et al. 2005).
Warna putih pada kecambah yang
ditumbuhkan
di
media
seleksi
yang
mengandung antibiotik higromisin disebabkan
oleh adanya penghambatan metabolisme sel
tumbuhan oleh antibiotik (Braun & Bennett
2001) (Gambar 1 & 2 A dan B). Penghambatan
proses metabolisme oleh antibiotik higromisin
terjadi karena adanya pengikatan ribosom A
pada subunit 30S oleh antibiotik yang
menyebabkan terjadinya kesalahan membaca
oleh aminoasil-tRNA terhadap mRNA pada
proses translasi. Pada tumbuhan, ribosom
subunit 30S berada di organel kloroplas dan
mitokondria. Pada kloroplas pengikatan ribosom
A pada subunit 30S oleh antibiotik
menyebabkan
rusaknya
klorofil
dan
menghambat pembentukan asam amino
(Wajtania et al. 2005).
Tanaman transgenik yang membawa gen
hpt akan mampu menghasilkan enzim
hygromycin phosphotransferase, yaitu kinase
yang akan memfosforilasi higromisin sehingga
menjadi tidak toksik bagi tanaman tersebut
(Holme et al. 2008).
Gen hpt difusikan dengan gen MmCuZnSOD maka kedua gen ini mempunyai
kecenderungan
diwariskan
ke
generasi
berikutnya secara bersama-sama (Lampiran 1).
Gen hpt dan gen MmCuZn-SOD terletak
berdampingan, maka kedua gen tersebut sangat
kecil kemungkinannya untuk bersegregasi.
Untuk mengetahui peranan gen SOD pada
tanaman transgenik, maka genotipe tanaman
transgenik lebih baik dalam keadaan homozigot.
Untuk mendapatkan tanaman transgenik
homozigot, maka seleksi harus dilakukan
terhadap tanaman T1 karena tanaman T1 terdiri
dari tanaman homozigot dan heterozigot untuk
transgen dengan perbandingan 1:2.
SIMPULAN
Hasil segregasi pada tanaman tembakau
transgenik yang mengandung gen MmCuZnSOD dan gen hpt berdasarkan analisis khikuadrat mengikuti pola pewarisan Mendel
dengan hasil segregasi 3:1. Semua tanaman T1
adalah heterozigot dan mengandung 1 gen hpt.
SARAN
Tanaman T1 yang resisten higromisin perlu
ditanam dan dibiarkan menyerbuk sendiri untuk
menghasilkan biji T2. Biji T2 ditumbuhkan di
dalam media seleksi untuk mendapatkan
tanaman transgenik homozigot.
ANALISIS SEGREGASI GEN HPT (Hygromisin Phosphotransferase)
PADA TANAMAN TEMBAKAU TRANSGENIK GENERASI T0
NIKSON HALOMOAN
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
4
DAFTAR PUSTAKA
Braun R, Bennett DJ. 2001. Antibiotic
resistence in genetically modified (GM)
crops. EFB Task Group Pub Prec Biotec
10: 1-4.
Cabanas MJ, Vasquez D, Modelell J. 1987.
Dual interference of hygromycin B with
ribosomal
translocation and with
aminoacyl-tRNA recognition. Eur J
Biochem 87(1): 21-27.
Davies J, Davis BD. 1968. Misreading of
ribonucleic acid code words indiced by
aminoglycoside antibiotics. The effect of
drug concentration. J Biol Chem 243 (12):
3312-3316.
Gonzalez A, Jimenez A, Vazquez D, Davies JE,
Schindler D. 1978. Studies on the mode of
action of hygromycin B,an inhibitor of
translocation in eukaryotes. J Biochem
Biophys Act 521(2): 459-469.
Gritz L, Davies J. 1983. Plasmid-encoded
hygromycin B resistance : the sequence of
hygromycin B phosphotransferase gene
and its expression in Escherichia coli and
Saccharomyces cerevisiae. Gene 25(2-3):
179-188.
Hannum S. 2012. Isolasi, pengklonan dan
analisis ekspresi gen penyandi CopperZinc Superoxide Dismutase [disertasi].
Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut
Pertanian Bogor.
Hausner TP, Geigenmuller U, Nierhaus KH.
1988. The allosteric three-site model for
the ribosomal elongation cycle. New
insights into the inhibition mechanisms of
aminoglycosides,
hiostrepton,
and
viomycin. J Biol Chem 263(26): 1310313111.
Holme IB, Brinch-Pedersen H, Lange M, Holm
PB. 2008. Transformation of different
barley (Hordeum vulgare L.) Cultivars by
Agrobacterium tumefaciens infection of in
vitro cultured ovules. Plant Cell Rep 27:
1833-1840
Kaster KR, Burgett SG, Rao RN, Ingolia TD.
1983. Analysis of a bacterial hygromycin
B resistance gene by transcriptional and
translational fusions and by DNA
sequencing. Nucleic Acids Res 11(19):
6895-6911.
Lacal JC, Carrasco L. 1983. Antiviral effects of
hygromycin B, a translation inhibitor
nonpermeant to
uninfected
cells.
Antimicrobiol Agents Chemother 24(2):
273-275.
Mendel G. 1865. Mendel's paper in English:
Experiments in Plant Hybridization.
Druery CT, the translator; Great Britain:
the Royal Horticultural Society. translation
of Mendel's paper.
Mendenhall
W, Scheaffer
R. 1973.
Mathematical Statistics and Applications.
University of Florida. Massachusctts.
Duxbury Press Scituate. p. 501
Moazed D, Noller HF .1987. Interaction of
antibiotics with functional sites in 16S
ribosomal RNA. Nature 327(6121): 389394.
Mood AM, Graybill FA, Boes DC. 1974.
Introduction to the theory of statistics. 3nd.
MC Graw-Hill Kagarusha. Tokyo. LTD.
p. 107
Paszkowski J et al.1984. Direct gene transfer to
plant. EMBO J 3(12): 2717-2722
Spahn CM, Prescott CD.1996. Throwing a
spanner in the works: antibiotics and the
translation apparatus. J Mol Med 74(8):
423-439.
Travella S, Ross SM, Harden J, Everett C,
Snape JW, Harwood WA. 2005. A
comparison of transgenic barley lines
produced by particle bombardment and
Agrobacterium-mediated technique. Plant
Cell Rep 23: 780-789.
Wajtania A, Pulawka J, Gabryszewska E. 2005.
Identification and elimination of bacterial
contaminants from Pelargonium tissue
cultures. J Fruit and Ornamental Plant Res
13: 101-108.
Winchester AM. 1958. Genetics A Survey of
the Principles of Heredity. Second Edition.
Stetson University. Cambridge. The
Riberside Press. p.65
5
LAMPIRAN
6
RB
NosP
NPT
II
NosT
35S P
MmCu/ZnSOD
GFP
NosT
HPT
35 S P
LB
Lampiran 1 Konstruksi plasmid biner yang membawa gen MmCuZn-SOD dan gen hpt (Hannum 2012)
PADA TANAMAN TEMBAKAU TRANSGENIK GENERASI T0
NIKSON HALOMOAN
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
ABSTRAK
NIKSON HALOMOAN. Analisis Segregasi Gen hpt (hygromisin phosphotransferase) pada
Tanaman Tembakau Transgenik Generasi T0. Dibimbing oleh SUHARSONO dan UTUT
WIDYASTUTI.
Higromisin fosfotransferase yang disandi oleh gen hpt merupakan salah satu penanda seleksi
yang digunakan pada perakitan tanaman transgenik. Tanaman yang membawa gen hpt mampu
menghasilkan enzim higromisin fosfotransferase, sehingga toleran terhadap higromisin. Penelitian
ini bertujuan untuk melakukan analisis segregasi gen hpt pada tanaman tembakau transgenik
generasi T0. Tanaman T0 ditanam di pot dan diletakkan di rumah kaca. Biji yang dihasilkan
tanaman T0 dari penyerbukan sendiri ditanam di media MS0 yang mengandung 50mg/l higromisin
selama satu bulan. Perbandingan antara jumlah tanaman yang toleran dan sensitif terhadap
higromisin adalah 3:1 berdasarkan uji Khi-kuadrat. Hal ini menunjukkan bahwa gen hpt
terintegrasi di genom tanaman T0, diwariskan mengikuti hukum Mendel untuk satu gen dan
genotipe tanaman T0 adalah heterozigot untuk gen hpt. Gen hpt difusikan dengan gen MmCu-ZnSOD, maka tanaman T0 juga mengandung gen MmCu-Zn-SOD.
Kata kunci : segregasi, higromisin, analisis khi-kuadrat.
ABSTRACT
NIKSON HALOMOAN. Segregation Analysis of hpt (hygromycin phosphotransferase)
Gene in T0 Generation Transgenic Tobacco Plants. Supervised by SUHARSONO and UTUT
WIDYASTUTI.
Hygromycine phosphotransferase encoded by hpt gene is one of commonly used as a
selectable marker for the production of transgenic plants. The plants harbored the hpt gene were
able to synthesize hygromycine phosphotransferase enzymes, therefore they are tolerant to
higromicine.The objective of this research is to analyze the segregation of hpt gene in T0
generation transgenic tobacco plants. T0 transgenic plants were cultivated in the pot and placed in
the green house. The seeds produced by selfing of T0 plants were cultivated on the MS0 media
containing 50mg/l higromycine for one month. The rasio between the number of tolerant and
sensitive plants to higromycine is 3:1 based on Khi-square. This result indicated that hpt gene is
integrated in genom of T0 plants, inherited as Mendelian pattern for one gene, and the genotype of
T0 plants is heterozigous for hpt gene. As hpt gene linked to MmCuZn-SOD gene, so T0 plants
contain also MmCuZn-SOD gene.
Key words: segregation, hygromycin, khi-square analysis.
ANALISIS SEGREGASI GEN HPT (Hygromisin Phosphotransferase)
PADA TANAMAN TEMBAKAU TRANSGENIK GENERASI T0
NIKSON HALOMOAN
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Judul
Nama
NRP
: Analisis Segregasi Gen hpt (Hygromisin Phosphotransferase) pada
Tanaman Tembakau Transgenik Generasi T0
: Nikson Halomoan
: G34051052
Menyetujui :
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA
Dr. Ir. Utut Widyastuti, M. Si
NIP 196104281987031003
NIP 196405171989032001
Mengetahui :
Ketua Departemen Biologi
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M. Si
NIP 196410021989031002
Tanggal Lulus :
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Tuhan atas segala rahmat dan karunia-Nya
sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Penelitian ini berjudul Analisis Segregasi
Gen HPT (Hygromisin Phosphotransferase) pada Tanaman Tembakau Transgenik Generasi T0
yang dilaksanakan pada bulan Mei sampai bulan Desember 2011 bertempat di Laboratorium
BIORIN (Biotechnology Research Indonesia-The Netherlands) dan Biologi Sel dan Molekular
Tanaman, Pusat Penelitan Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB (PPSHB-IPB) kampus IPB
Dramaga, Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA dan Dr. Ir. Utut
Widyastuti, M. Si selaku pembimbing yang telah memberikan saran dan bimbingannya selama
melaksanakan penelitian serta kepada Dra. Hilda Akmal, M. Si sebagai penguji atas saran yang
telah diberikan. Terima kasih kepada Ditjen Dikti Depdiknas atas Hibah Kompetensi dengan judul:
“Isolasi dan ekspresi gen dalam rangka perakitan tanaman yang toleran terhadap cekaman asam
dan aluminium” an. Dr. Suharsono, DEA dengan nomor kontrak 039/HIKOM/DP2M/2008/
tanggal 13 Agustus 2008, 219/SP2H/PP/DP2M/V/2009 tanggal 30 Mei 2009, dan
224/SP2H/PP/DP2M/III/2010 tanggal 1 Maret 2010, terima kasih atas bantuannya dalam
menyediakan biaya pendidikan dan penelitian. Terima kasih penulis ucapkan juga kepada Bu
Hanum, Bu Ratna, Pak Ulung, Pak Muzuni, Pak Radit, Bu Srilis, Pak Mulya, Mbak Peppy, Mbak
Nia, Mbak Ara, Pak Adi, Pak Yusman, Kak Muchdar, Kak Nurul, Kak Anita, Kak Novi, Lulu,
Goto, Fajri, Lita, Indah, dan Ila yang telah banyak membantu dalam penelitian ini.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Ibuku Rolas Purba yang selalu sabar
mendidikku, Bapakku Jackson Anwar Hasudungan yang selalu menasihatiku, Abangku; Ruben
serta kedua adikku; Fandry dan Fransiskus yang selalu mendoakanku. Terima kasih penulis
ucapkan juga kepada sahabatku Henrikus, Budi dan Ayi yang selalu mengerti akan diriku, karibku
Yanto, Yono, Aldion, Leo, Robin, Hardi, Mulya, Agus dan Bonar yang selalu ada dan dekat.
Teman-teman Biologi angkatan 41, 42 dan 43 yang lain atas kebersamaan selama penelitian.
Teman-teman Perwira 99 dan Kartika yang selalu memberi semangat. Tak lupa penulis ucapkan
terimakasih kepada Bu Tri pembimbing akademikku, Bu Rita pembimbing Studi Lapanganku, Pak
Aris pembimbing Praktik Lapanganku, Pak Tri, Pak Ence, Bu Nissa, Bu Agustin, Bu Rini, Bu
Nunik, Bu Wita, Pak Achmad, Pak Bambang, Pak Alex, dan Bu Dorly. Keluarga Departemen
Biologi yang selalu membantu Bu Eti, Mbak Yenny, Mbak Yunny, Pak Rusna, dan Paman Jonny.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, 12 Juni 2012
Nikson Halomoan
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta tanggal 15 Juni 1987, putra kedua dari empat bersaudara dari
Bapak Jackson Anwar Hasudungan dan Ibu Rolas Purba. Pada tahun 2005 penulis lulus dari
SMUN 26 Jakarta dan pada tahun yang sama penulis melanjutkan kuliah di Institut Pertanian
Bogor melalui jalur PMDK (Penelusuran Minat dan Bakat). Tahun 2006 penulis masuk program
studi Biologi, Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut
Pertanian Bogor.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah mengikuti beberapa kegiatan ekstrakulikuler
sebagai staf Bioworld di HIMABIO tahun 2006-2007, sebagai panitia di Talk Show Lapangan
Kerja tahun 2007, sebagai panitia The 7th Asian Crop Science Association Conference tahun 2011.
Pada tahun 2009 penulis melaksanakan Praktik Lapang dengan judul Budidaya Tanaman Bayam
(Amaranthus sp.) dengan menggunakan Sistem Hidroponik di Parung Farm.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................................. viii
DAFTAR TABEL.................................................................................................................. viii
DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................................... viii
PENDAHULUAN .................................................................................................................. 1
Latar Belakang.................................................................................................................. 1
Tujuan ................................................................................................................................ 1
Waktu dan Tempat ............................................................................................................ 1
BAHAN DAN METODE ...................................................................................................... 1
Bahan dan Alat .................................................................................................................. 1
Metode Penelitian
Penyerbukan sendiri pada tanaman tembakau ................................................................... 1
Uji resistensi tanaman tembakau terhadap higromisin secara in vitro .............................. 1
Analisis Data ..................................................................................................................... 2
HASIL .................................................................................................................................... 2
PEMBAHASAN .................................................................................................................... 3
SIMPULAN ........................................................................................................................... 3
SARAN ................................................................................................................................... 3
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................................ 4
LAMPIRAN ........................................................................................................................... 5
viii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Kecambah dari tanaman transgenik dan non transgenik yang ditumbuhkan di media
seleksi. A. Tanaman transgenik B. Tanaman non transgenik..... ........ ................................ 2
2 Tanaman non transgenik yang ditumbuhkan di media MS0. A. Mengandung higromisin
50 mg/l dan B. Tanpa higromisin…………………………………………………………..3
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Hasil segregasi tanaman tembakau transgenik generasi T0 terhadap higromisin ............... 2
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Konstruksi plasmid biner yang membawa gen MmCuZn-SOD dan gen hpt……. ............. 6
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Hukum Mendel mengenai segregasi
menyatakan bahwa kedua alel dari masingmasing sifat individu terpisah selama
pembentukan gamet sehingga gamet masingmasing individu hanya mendapat satu dari dua
alel. Alel berpadu bebas pada saat pembuahan
(Mendel 1865). Ratio hasil persilangan
mengikuti hukum Mendel dapat dianalisis
dengan menggunakan sebaran khi-kuadrat (χ2)
(Mood et al. 1974). Untuk menguji hipotesis
hasil persilangan digunakan formula: H0: α1 =
α2 vs H1 : α1 ≠ α2; χ2 = Σ [(o i – e i )2/e i ]:
dimana o i : hasil observasi dan e i : nilai
harapan observasi. Jika χ2 hitung ≤ χ2 tabel
terima H0 dan χ2 hitung > χ2 tabel tolak H0.
Penerimaan H0 berarti hasil persilangan
mengikuti
hukum
Mendel,
sedangkan
penolakan H0 berarti tidak mengikuti hukum
Mendel (Winchester 1958; Mendenhall &
Scheaffer 1973).
Gen penanda hasil transformasi pada
tanaman Nicotiana tabacum yang berasal dari
daerah
pengkode
protein
pada
Tn5
aminoglikosida jenis phosphotransferase II
gen yang terdapat pada virus mosaik kembang
kol VI telah disisipkan ke dalam protoplas
tanaman sebagai bagian dari plasmid biner.
Gen tersebut stabil terintegrasi di dalam
genomik DNA dan terekspresi sebagai
penanda, serta dapat diturunkan pada klon sel.
Hasil analisis persilangan genetik pada
tanaman transformasi memiliki sifat resisten
terhadap kanamisin sebagai penanda seleksi
dan bersegregasi sesuai hukum Mendel pada
generasi F1 (Paszkowski et al. 1984).
Higromisin dihasilkan oleh Streptomyces
hygroscopicus, sebuah bakteri yang diisolasi
dari sampel tanah. Sejak penemuan pada tahun
delapan puluhan higromisin telah menjadi
agen seleksi standar dalam percobaan transfer
gen dalam berbagai sel prokariotik dan
eukariotik (Gritz & Davies 1983; Kaster et
al. 1983). Higromisin menghambat sintesis
protein pada proses penerjemahan mRNA
(Cabanas et al. 1987; Lacal & Carrasco 1983).
Higromisin
juga mempengaruhi proses
translokasi ribosom (Cabanas et al. 1987;
Gonzalez et al. 1978; Hausner et al. 1988).
Seperti antibiotik aminoglikosida lainnya,
higromisin menginduksi salah membaca
aminoasil-tRNA dengan mengikat situs
ribosom A (decoding site) (Cabanas et al.
1987; Davies & Davis 1968; Moazed & Noller
1987; Spahn & Prescott 1996).
Tujuan
Penelitian ini bertujuan melakukan
analisis segregasi gen hpt (hygromycin
phosphotransferase) pada tanaman tembakau
transgenik generasi T0.
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan pada bulan Mei
sampai dengan Desember 2011. Penelitian
dilaksanakan di laboratorium BIORIN
(Biotechnology
Research
Indonesia-The
Netherlands), Biologi Sel dan Molekular
Tanaman, Pusat Penelitan Sumberdaya Hayati
dan Bioteknologi (PPSHB) IPB Dramaga.
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan yaitu tanaman
tembakau transgenik yang mengandung gen
MmCuZn-SOD dan gen hpt yang resisten
terhadap higromisin sebagai penanda seleksi
(Hannum 2012), media tanam, media dasar
Murashige dan Skoog (MS0), dan antibiotik
higromisin. Cawan petri, timbangan analitik,
kotak pindah (Laminar Air Flow Cabinet) dan
alat laboratorium lainnya.
Metode Penelitian
Penyerbukan sendiri pada tanaman
tembakau
Tanaman
tembakau
transgenik
diperbanyak secara in vitro di dalam media
MS0 di ruang kultur dengan fotoperiode 16
jam pada suhu 25oC. Tanaman yang
mempunyai akar yang baik, dipindahkan ke
media sekam dalam ruang kultur selama
seminggu. Selanjutnya tanaman yang tumbuh
dengan baik dipindahkan ke media tanam
yang berisi campuran tanah, kompos, sekam
bakar (1:1:1) di dalam pot dan diletakkan di
luar ruangan selama seminggu. Selanjutnya
tanaman dipindahkan dan dipelihara di rumah
kaca sampai dewasa. Tanaman tembakau
dibiarkan melakukan penyerbukan sendiri
dengan ditutup pada bunganya sampai
menghasilkan biji.
Uji resistensi tanaman tembakau terhadap
higromisin secara in vitro
Biji-biji tanaman tembakau disterilisasi
dengan cara direndam dalam ethanol 70%
selama 1 menit, lalu direndam dalam larutan
Bayclin 20% (5.25% NaClO) selama 15 menit.
Biji-biji selanjutnya dibilas dengan air steril
sebanyak
empat
kali,
kemudian
dikeringanginkan di atas kertas tissue steril.
2
Sebanyak 40 biji tembakau steril
ditumbuhkan dalam media Murashige dan
Skoog yang mengandung garam-garam MS,
vitamin, 30 g/L sukrosa, 3 g/L agar, dan
antibiotik higromisin 50 mg/L di dalam cawan
petri yang berdiameter 10 cm, dan diletakkan di
ruangan gelap selama 3 hari dan kemudian
dipindahkan ke ruangan bercahaya, dengan suhu
25ºC selama satu bulan. Setelah berumur satu
bulan, tanaman yang hidup dan yang mati
dihitung. Tanaman yang hidup adalah tanaman
yang resisten terhadap higromisin dan yang mati
adalah yang sensitif terhadap higromisin.
Analisis Data
Segregasi gen hpt dianalisis dengan
menggunakan uji khi-kuadrat (χ2) dengan rumus
: χ2 = Σ [(o i – e i )2/e i ]. Adanya ekspresi gen hpt
menyebabkan tanaman resisten terhadap
higromisin dan tidak adanya ekspresi gen hpt
menyebabkan tanaman sensitif terhadap
higromisin sehingga gen hpt bersifat dominan
pada tanaman transgenik.
HASIL
Tanaman T0 menghasilkan biji generasi T1.
Pada penelitian ini empat galur T0 telah berhasil
ditumbuhkan sehingga mendapatkan biji T1.
Sebagian besar tanaman tembakau pada
penelitian ini menghasilkan biji yang
mempunyai daya kecambah yang rendah. Daya
kecambah tanaman tembakau transgenik T0
berkisar antara 11 sampai 87% dan tanaman
kontrol non transgenik 20-39% (Tabel 1).
Baik biji dari tanaman transgenik maupun
non transgenik dapat berkecambah di media
yang mengandung higromisin (Gambar 1).
Kecambah yang resisten higromisin dapat
tumbuh terus menghasilkan daun dan berwarna
hijau setelah kotiledon tumbuh sedangkan
kecambah
yang
sensitif
hanya
dapat
menghasilkan kotiledon, berhenti tumbuh dan
berwarna kuning keputih-putihan.
Empat
tanaman
transgenik
T0
menghasilkan keturunan tanaman resisten dan
sensitif
terhadap
higromisin
dengan
perbandingan sekitar 3 resisten dan 1 sensitif
dengan nilai (χ2) antara 0.0435 dan 0.2444.
Tanaman
non
transgenik
menghasilkan
keturunan yang tumbuh bagus di media tanpa
higromisin tetapi mati semua di media yang
mengandung higromisin (Gambar 2).
Tanaman transgenik hasil regenerasi dari
sel atau jaringan disebut dengan generasi T0.
Tabel 1 Hasil segregasi tanaman tembakau transgenik generasi T0 terhadap higromisin
Galur
Jumlah biji
Daya kecambah
ditanam berkecambah
(%)
S 9.9
240
69
29
S 4.2
280
244
87
S 1.1
200
165
83
S 15.1
200
22
11
K (MS0)
120
47
39
K (Hyg)
40
8
20
Keterangan : χ2 tabel(db) ; ά= 5 % ; χ2(3) = 7.82
Jumlah tanaman Segregasi
Hyg R Hyg S Hyg R :Hyg S
51
186
121
17
0
18
58
44
5
8
3:1
3:1
3:1
3:1
-
χ2 hitung
0.0435
0.1967
0.2444
0.0605
24
B
A
Gambar 1. Kecambah dari tanaman transgenik dan non transgenik yang ditumbuhkan di media seleksi
A. Tanaman transgenik B. Tanaman non transgenik.
3
B
A
Gambar 2. Tanaman non transgenik yang ditumbuhkan di media MS0. A. Mengandung higromisin
50 mg/l dan B. Tanpa higromisin.
PEMBAHASAN
Tanaman transgenik yang resisten terhadap
higromisin yang diperoleh melalui infeksi
Agrobacterium
tumefaciens
menghasilkan
keturunan tanaman yang resisten dan sensitif
terhadap higromisin. Hal ini menunjukkan
bahwa gen hpt yang menyandi sifat resisten
terhadap higromisin terintegrasi ke dalam
genom tanaman transgenik T0; karena tidak
semua
keturunannya
resisten
terhadap
higromisin, maka tanaman transgenik T0
mempunyai genotipe heterozigot untuk gen hpt.
Hasil analisis (χ2) terhadap keturunan dari empat
tanaman transgenik generasi T0 menunjukkan
bahwa populasi T1 terdiri dari tanaman yang
resisten dan sensitif terhadap higromisin dengan
perbandingan
3:1.
Perbandingan
ini
menunjukkan bahwa selain tanaman tetuanya
adalah heterozigot, tetapi juga tanaman tetuanya
mengandung 1 gen hpt fungsional. Umumnya
gen yang diintroduksikan ke tanaman dengan
perantara A. tumefaciens diwariskan ke generasi
berikutnya mengikuti pola pewarisan Mendel
monohibrid (Travella et al. 2005).
Warna putih pada kecambah yang
ditumbuhkan
di
media
seleksi
yang
mengandung antibiotik higromisin disebabkan
oleh adanya penghambatan metabolisme sel
tumbuhan oleh antibiotik (Braun & Bennett
2001) (Gambar 1 & 2 A dan B). Penghambatan
proses metabolisme oleh antibiotik higromisin
terjadi karena adanya pengikatan ribosom A
pada subunit 30S oleh antibiotik yang
menyebabkan terjadinya kesalahan membaca
oleh aminoasil-tRNA terhadap mRNA pada
proses translasi. Pada tumbuhan, ribosom
subunit 30S berada di organel kloroplas dan
mitokondria. Pada kloroplas pengikatan ribosom
A pada subunit 30S oleh antibiotik
menyebabkan
rusaknya
klorofil
dan
menghambat pembentukan asam amino
(Wajtania et al. 2005).
Tanaman transgenik yang membawa gen
hpt akan mampu menghasilkan enzim
hygromycin phosphotransferase, yaitu kinase
yang akan memfosforilasi higromisin sehingga
menjadi tidak toksik bagi tanaman tersebut
(Holme et al. 2008).
Gen hpt difusikan dengan gen MmCuZnSOD maka kedua gen ini mempunyai
kecenderungan
diwariskan
ke
generasi
berikutnya secara bersama-sama (Lampiran 1).
Gen hpt dan gen MmCuZn-SOD terletak
berdampingan, maka kedua gen tersebut sangat
kecil kemungkinannya untuk bersegregasi.
Untuk mengetahui peranan gen SOD pada
tanaman transgenik, maka genotipe tanaman
transgenik lebih baik dalam keadaan homozigot.
Untuk mendapatkan tanaman transgenik
homozigot, maka seleksi harus dilakukan
terhadap tanaman T1 karena tanaman T1 terdiri
dari tanaman homozigot dan heterozigot untuk
transgen dengan perbandingan 1:2.
SIMPULAN
Hasil segregasi pada tanaman tembakau
transgenik yang mengandung gen MmCuZnSOD dan gen hpt berdasarkan analisis khikuadrat mengikuti pola pewarisan Mendel
dengan hasil segregasi 3:1. Semua tanaman T1
adalah heterozigot dan mengandung 1 gen hpt.
SARAN
Tanaman T1 yang resisten higromisin perlu
ditanam dan dibiarkan menyerbuk sendiri untuk
menghasilkan biji T2. Biji T2 ditumbuhkan di
dalam media seleksi untuk mendapatkan
tanaman transgenik homozigot.
4
DAFTAR PUSTAKA
Braun R, Bennett DJ. 2001. Antibiotic
resistence in genetically modified (GM)
crops. EFB Task Group Pub Prec Biotec
10: 1-4.
Cabanas MJ, Vasquez D, Modelell J. 1987.
Dual interference of hygromycin B with
ribosomal
translocation and with
aminoacyl-tRNA recognition. Eur J
Biochem 87(1): 21-27.
Davies J, Davis BD. 1968. Misreading of
ribonucleic acid code words indiced by
aminoglycoside antibiotics. The effect of
drug concentration. J Biol Chem 243 (12):
3312-3316.
Gonzalez A, Jimenez A, Vazquez D, Davies JE,
Schindler D. 1978. Studies on the mode of
action of hygromycin B,an inhibitor of
translocation in eukaryotes. J Biochem
Biophys Act 521(2): 459-469.
Gritz L, Davies J. 1983. Plasmid-encoded
hygromycin B resistance : the sequence of
hygromycin B phosphotransferase gene
and its expression in Escherichia coli and
Saccharomyces cerevisiae. Gene 25(2-3):
179-188.
Hannum S. 2012. Isolasi, pengklonan dan
analisis ekspresi gen penyandi CopperZinc Superoxide Dismutase [disertasi].
Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut
Pertanian Bogor.
Hausner TP, Geigenmuller U, Nierhaus KH.
1988. The allosteric three-site model for
the ribosomal elongation cycle. New
insights into the inhibition mechanisms of
aminoglycosides,
hiostrepton,
and
viomycin. J Biol Chem 263(26): 1310313111.
Holme IB, Brinch-Pedersen H, Lange M, Holm
PB. 2008. Transformation of different
barley (Hordeum vulgare L.) Cultivars by
Agrobacterium tumefaciens infection of in
vitro cultured ovules. Plant Cell Rep 27:
1833-1840
Kaster KR, Burgett SG, Rao RN, Ingolia TD.
1983. Analysis of a bacterial hygromycin
B resistance gene by transcriptional and
translational fusions and by DNA
sequencing. Nucleic Acids Res 11(19):
6895-6911.
Lacal JC, Carrasco L. 1983. Antiviral effects of
hygromycin B, a translation inhibitor
nonpermeant to
uninfected
cells.
Antimicrobiol Agents Chemother 24(2):
273-275.
Mendel G. 1865. Mendel's paper in English:
Experiments in Plant Hybridization.
Druery CT, the translator; Great Britain:
the Royal Horticultural Society. translation
of Mendel's paper.
Mendenhall
W, Scheaffer
R. 1973.
Mathematical Statistics and Applications.
University of Florida. Massachusctts.
Duxbury Press Scituate. p. 501
Moazed D, Noller HF .1987. Interaction of
antibiotics with functional sites in 16S
ribosomal RNA. Nature 327(6121): 389394.
Mood AM, Graybill FA, Boes DC. 1974.
Introduction to the theory of statistics. 3nd.
MC Graw-Hill Kagarusha. Tokyo. LTD.
p. 107
Paszkowski J et al.1984. Direct gene transfer to
plant. EMBO J 3(12): 2717-2722
Spahn CM, Prescott CD.1996. Throwing a
spanner in the works: antibiotics and the
translation apparatus. J Mol Med 74(8):
423-439.
Travella S, Ross SM, Harden J, Everett C,
Snape JW, Harwood WA. 2005. A
comparison of transgenic barley lines
produced by particle bombardment and
Agrobacterium-mediated technique. Plant
Cell Rep 23: 780-789.
Wajtania A, Pulawka J, Gabryszewska E. 2005.
Identification and elimination of bacterial
contaminants from Pelargonium tissue
cultures. J Fruit and Ornamental Plant Res
13: 101-108.
Winchester AM. 1958. Genetics A Survey of
the Principles of Heredity. Second Edition.
Stetson University. Cambridge. The
Riberside Press. p.65
5
LAMPIRAN
6
RB
NosP
NPT
II
NosT
35S P
MmCu/ZnSOD
GFP
NosT
HPT
35 S P
LB
Lampiran 1 Konstruksi plasmid biner yang membawa gen MmCuZn-SOD dan gen hpt (Hannum 2012)
ABSTRAK
NIKSON HALOMOAN. Analisis Segregasi Gen hpt (hygromisin phosphotransferase) pada
Tanaman Tembakau Transgenik Generasi T0. Dibimbing oleh SUHARSONO dan UTUT
WIDYASTUTI.
Higromisin fosfotransferase yang disandi oleh gen hpt merupakan salah satu penanda seleksi
yang digunakan pada perakitan tanaman transgenik. Tanaman yang membawa gen hpt mampu
menghasilkan enzim higromisin fosfotransferase, sehingga toleran terhadap higromisin. Penelitian
ini bertujuan untuk melakukan analisis segregasi gen hpt pada tanaman tembakau transgenik
generasi T0. Tanaman T0 ditanam di pot dan diletakkan di rumah kaca. Biji yang dihasilkan
tanaman T0 dari penyerbukan sendiri ditanam di media MS0 yang mengandung 50mg/l higromisin
selama satu bulan. Perbandingan antara jumlah tanaman yang toleran dan sensitif terhadap
higromisin adalah 3:1 berdasarkan uji Khi-kuadrat. Hal ini menunjukkan bahwa gen hpt
terintegrasi di genom tanaman T0, diwariskan mengikuti hukum Mendel untuk satu gen dan
genotipe tanaman T0 adalah heterozigot untuk gen hpt. Gen hpt difusikan dengan gen MmCu-ZnSOD, maka tanaman T0 juga mengandung gen MmCu-Zn-SOD.
Kata kunci : segregasi, higromisin, analisis khi-kuadrat.
ABSTRACT
NIKSON HALOMOAN. Segregation Analysis of hpt (hygromycin phosphotransferase)
Gene in T0 Generation Transgenic Tobacco Plants. Supervised by SUHARSONO and UTUT
WIDYASTUTI.
Hygromycine phosphotransferase encoded by hpt gene is one of commonly used as a
selectable marker for the production of transgenic plants. The plants harbored the hpt gene were
able to synthesize hygromycine phosphotransferase enzymes, therefore they are tolerant to
higromicine.The objective of this research is to analyze the segregation of hpt gene in T0
generation transgenic tobacco plants. T0 transgenic plants were cultivated in the pot and placed in
the green house. The seeds produced by selfing of T0 plants were cultivated on the MS0 media
containing 50mg/l higromycine for one month. The rasio between the number of tolerant and
sensitive plants to higromycine is 3:1 based on Khi-square. This result indicated that hpt gene is
integrated in genom of T0 plants, inherited as Mendelian pattern for one gene, and the genotype of
T0 plants is heterozigous for hpt gene. As hpt gene linked to MmCuZn-SOD gene, so T0 plants
contain also MmCuZn-SOD gene.
Key words: segregation, hygromycin, khi-square analysis.
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Hukum Mendel mengenai segregasi
menyatakan bahwa kedua alel dari masingmasing sifat individu terpisah selama
pembentukan gamet sehingga gamet masingmasing individu hanya mendapat satu dari dua
alel. Alel berpadu bebas pada saat pembuahan
(Mendel 1865). Ratio hasil persilangan
mengikuti hukum Mendel dapat dianalisis
dengan menggunakan sebaran khi-kuadrat (χ2)
(Mood et al. 1974). Untuk menguji hipotesis
hasil persilangan digunakan formula: H0: α1 =
α2 vs H1 : α1 ≠ α2; χ2 = Σ [(o i – e i )2/e i ]:
dimana o i : hasil observasi dan e i : nilai
harapan observasi. Jika χ2 hitung ≤ χ2 tabel
terima H0 dan χ2 hitung > χ2 tabel tolak H0.
Penerimaan H0 berarti hasil persilangan
mengikuti
hukum
Mendel,
sedangkan
penolakan H0 berarti tidak mengikuti hukum
Mendel (Winchester 1958; Mendenhall &
Scheaffer 1973).
Gen penanda hasil transformasi pada
tanaman Nicotiana tabacum yang berasal dari
daerah
pengkode
protein
pada
Tn5
aminoglikosida jenis phosphotransferase II
gen yang terdapat pada virus mosaik kembang
kol VI telah disisipkan ke dalam protoplas
tanaman sebagai bagian dari plasmid biner.
Gen tersebut stabil terintegrasi di dalam
genomik DNA dan terekspresi sebagai
penanda, serta dapat diturunkan pada klon sel.
Hasil analisis persilangan genetik pada
tanaman transformasi memiliki sifat resisten
terhadap kanamisin sebagai penanda seleksi
dan bersegregasi sesuai hukum Mendel pada
generasi F1 (Paszkowski et al. 1984).
Higromisin dihasilkan oleh Streptomyces
hygroscopicus, sebuah bakteri yang diisolasi
dari sampel tanah. Sejak penemuan pada tahun
delapan puluhan higromisin telah menjadi
agen seleksi standar dalam percobaan transfer
gen dalam berbagai sel prokariotik dan
eukariotik (Gritz & Davies 1983; Kaster et
al. 1983). Higromisin menghambat sintesis
protein pada proses penerjemahan mRNA
(Cabanas et al. 1987; Lacal & Carrasco 1983).
Higromisin
juga mempengaruhi proses
translokasi ribosom (Cabanas et al. 1987;
Gonzalez et al. 1978; Hausner et al. 1988).
Seperti antibiotik aminoglikosida lainnya,
higromisin menginduksi salah membaca
aminoasil-tRNA dengan mengikat situs
ribosom A (decoding site) (Cabanas et al.
1987; Davies & Davis 1968; Moazed & Noller
1987; Spahn & Prescott 1996).
Tujuan
Penelitian ini bertujuan melakukan
analisis segregasi gen hpt (hygromycin
phosphotransferase) pada tanaman tembakau
transgenik generasi T0.
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan pada bulan Mei
sampai dengan Desember 2011. Penelitian
dilaksanakan di laboratorium BIORIN
(Biotechnology
Research
Indonesia-The
Netherlands), Biologi Sel dan Molekular
Tanaman, Pusat Penelitan Sumberdaya Hayati
dan Bioteknologi (PPSHB) IPB Dramaga.
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan yaitu tanaman
tembakau transgenik yang mengandung gen
MmCuZn-SOD dan gen hpt yang resisten
terhadap higromisin sebagai penanda seleksi
(Hannum 2012), media tanam, media dasar
Murashige dan Skoog (MS0), dan antibiotik
higromisin. Cawan petri, timbangan analitik,
kotak pindah (Laminar Air Flow Cabinet) dan
alat laboratorium lainnya.
Metode Penelitian
Penyerbukan sendiri pada tanaman
tembakau
Tanaman
tembakau
transgenik
diperbanyak secara in vitro di dalam media
MS0 di ruang kultur dengan fotoperiode 16
jam pada suhu 25oC. Tanaman yang
mempunyai akar yang baik, dipindahkan ke
media sekam dalam ruang kultur selama
seminggu. Selanjutnya tanaman yang tumbuh
dengan baik dipindahkan ke media tanam
yang berisi campuran tanah, kompos, sekam
bakar (1:1:1) di dalam pot dan diletakkan di
luar ruangan selama seminggu. Selanjutnya
tanaman dipindahkan dan dipelihara di rumah
kaca sampai dewasa. Tanaman tembakau
dibiarkan melakukan penyerbukan sendiri
dengan ditutup pada bunganya sampai
menghasilkan biji.
Uji resistensi tanaman tembakau terhadap
higromisin secara in vitro
Biji-biji tanaman tembakau disterilisasi
dengan cara direndam dalam ethanol 70%
selama 1 menit, lalu direndam dalam larutan
Bayclin 20% (5.25% NaClO) selama 15 menit.
Biji-biji selanjutnya dibilas dengan air steril
sebanyak
empat
kali,
kemudian
dikeringanginkan di atas kertas tissue steril.
2
Sebanyak 40 biji tembakau steril
ditumbuhkan dalam media Murashige dan
Skoog yang mengandung garam-garam MS,
vitamin, 30 g/L sukrosa, 3 g/L agar, dan
antibiotik higromisin 50 mg/L di dalam cawan
petri yang berdiameter 10 cm, dan diletakkan di
ruangan gelap selama 3 hari dan kemudian
dipindahkan ke ruangan bercahaya, dengan suhu
25ºC selama satu bulan. Setelah berumur satu
bulan, tanaman yang hidup dan yang mati
dihitung. Tanaman yang hidup adalah tanaman
yang resisten terhadap higromisin dan yang mati
adalah yang sensitif terhadap higromisin.
Analisis Data
Segregasi gen hpt dianalisis dengan
menggunakan uji khi-kuadrat (χ2) dengan rumus
: χ2 = Σ [(o i – e i )2/e i ]. Adanya ekspresi gen hpt
menyebabkan tanaman resisten terhadap
higromisin dan tidak adanya ekspresi gen hpt
menyebabkan tanaman sensitif terhadap
higromisin sehingga gen hpt bersifat dominan
pada tanaman transgenik.
HASIL
Tanaman T0 menghasilkan biji generasi T1.
Pada penelitian ini empat galur T0 telah berhasil
ditumbuhkan sehingga mendapatkan biji T1.
Sebagian besar tanaman tembakau pada
penelitian ini menghasilkan biji yang
mempunyai daya kecambah yang rendah. Daya
kecambah tanaman tembakau transgenik T0
berkisar antara 11 sampai 87% dan tanaman
kontrol non transgenik 20-39% (Tabel 1).
Baik biji dari tanaman transgenik maupun
non transgenik dapat berkecambah di media
yang mengandung higromisin (Gambar 1).
Kecambah yang resisten higromisin dapat
tumbuh terus menghasilkan daun dan berwarna
hijau setelah kotiledon tumbuh sedangkan
kecambah
yang
sensitif
hanya
dapat
menghasilkan kotiledon, berhenti tumbuh dan
berwarna kuning keputih-putihan.
Empat
tanaman
transgenik
T0
menghasilkan keturunan tanaman resisten dan
sensitif
terhadap
higromisin
dengan
perbandingan sekitar 3 resisten dan 1 sensitif
dengan nilai (χ2) antara 0.0435 dan 0.2444.
Tanaman
non
transgenik
menghasilkan
keturunan yang tumbuh bagus di media tanpa
higromisin tetapi mati semua di media yang
mengandung higromisin (Gambar 2).
Tanaman transgenik hasil regenerasi dari
sel atau jaringan disebut dengan generasi T0.
Tabel 1 Hasil segregasi tanaman tembakau transgenik generasi T0 terhadap higromisin
Galur
Jumlah biji
Daya kecambah
ditanam berkecambah
(%)
S 9.9
240
69
29
S 4.2
280
244
87
S 1.1
200
165
83
S 15.1
200
22
11
K (MS0)
120
47
39
K (Hyg)
40
8
20
Keterangan : χ2 tabel(db) ; ά= 5 % ; χ2(3) = 7.82
Jumlah tanaman Segregasi
Hyg R Hyg S Hyg R :Hyg S
51
186
121
17
0
18
58
44
5
8
3:1
3:1
3:1
3:1
-
χ2 hitung
0.0435
0.1967
0.2444
0.0605
24
B
A
Gambar 1. Kecambah dari tanaman transgenik dan non transgenik yang ditumbuhkan di media seleksi
A. Tanaman transgenik B. Tanaman non transgenik.
3
B
A
Gambar 2. Tanaman non transgenik yang ditumbuhkan di media MS0. A. Mengandung higromisin
50 mg/l dan B. Tanpa higromisin.
PEMBAHASAN
Tanaman transgenik yang resisten terhadap
higromisin yang diperoleh melalui infeksi
Agrobacterium
tumefaciens
menghasilkan
keturunan tanaman yang resisten dan sensitif
terhadap higromisin. Hal ini menunjukkan
bahwa gen hpt yang menyandi sifat resisten
terhadap higromisin terintegrasi ke dalam
genom tanaman transgenik T0; karena tidak
semua
keturunannya
resisten
terhadap
higromisin, maka tanaman transgenik T0
mempunyai genotipe heterozigot untuk gen hpt.
Hasil analisis (χ2) terhadap keturunan dari empat
tanaman transgenik generasi T0 menunjukkan
bahwa populasi T1 terdiri dari tanaman yang
resisten dan sensitif terhadap higromisin dengan
perbandingan
3:1.
Perbandingan
ini
menunjukkan bahwa selain tanaman tetuanya
adalah heterozigot, tetapi juga tanaman tetuanya
mengandung 1 gen hpt fungsional. Umumnya
gen yang diintroduksikan ke tanaman dengan
perantara A. tumefaciens diwariskan ke generasi
berikutnya mengikuti pola pewarisan Mendel
monohibrid (Travella et al. 2005).
Warna putih pada kecambah yang
ditumbuhkan
di
media
seleksi
yang
mengandung antibiotik higromisin disebabkan
oleh adanya penghambatan metabolisme sel
tumbuhan oleh antibiotik (Braun & Bennett
2001) (Gambar 1 & 2 A dan B). Penghambatan
proses metabolisme oleh antibiotik higromisin
terjadi karena adanya pengikatan ribosom A
pada subunit 30S oleh antibiotik yang
menyebabkan terjadinya kesalahan membaca
oleh aminoasil-tRNA terhadap mRNA pada
proses translasi. Pada tumbuhan, ribosom
subunit 30S berada di organel kloroplas dan
mitokondria. Pada kloroplas pengikatan ribosom
A pada subunit 30S oleh antibiotik
menyebabkan
rusaknya
klorofil
dan
menghambat pembentukan asam amino
(Wajtania et al. 2005).
Tanaman transgenik yang membawa gen
hpt akan mampu menghasilkan enzim
hygromycin phosphotransferase, yaitu kinase
yang akan memfosforilasi higromisin sehingga
menjadi tidak toksik bagi tanaman tersebut
(Holme et al. 2008).
Gen hpt difusikan dengan gen MmCuZnSOD maka kedua gen ini mempunyai
kecenderungan
diwariskan
ke
generasi
berikutnya secara bersama-sama (Lampiran 1).
Gen hpt dan gen MmCuZn-SOD terletak
berdampingan, maka kedua gen tersebut sangat
kecil kemungkinannya untuk bersegregasi.
Untuk mengetahui peranan gen SOD pada
tanaman transgenik, maka genotipe tanaman
transgenik lebih baik dalam keadaan homozigot.
Untuk mendapatkan tanaman transgenik
homozigot, maka seleksi harus dilakukan
terhadap tanaman T1 karena tanaman T1 terdiri
dari tanaman homozigot dan heterozigot untuk
transgen dengan perbandingan 1:2.
SIMPULAN
Hasil segregasi pada tanaman tembakau
transgenik yang mengandung gen MmCuZnSOD dan gen hpt berdasarkan analisis khikuadrat mengikuti pola pewarisan Mendel
dengan hasil segregasi 3:1. Semua tanaman T1
adalah heterozigot dan mengandung 1 gen hpt.
SARAN
Tanaman T1 yang resisten higromisin perlu
ditanam dan dibiarkan menyerbuk sendiri untuk
menghasilkan biji T2. Biji T2 ditumbuhkan di
dalam media seleksi untuk mendapatkan
tanaman transgenik homozigot.
ANALISIS SEGREGASI GEN HPT (Hygromisin Phosphotransferase)
PADA TANAMAN TEMBAKAU TRANSGENIK GENERASI T0
NIKSON HALOMOAN
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
4
DAFTAR PUSTAKA
Braun R, Bennett DJ. 2001. Antibiotic
resistence in genetically modified (GM)
crops. EFB Task Group Pub Prec Biotec
10: 1-4.
Cabanas MJ, Vasquez D, Modelell J. 1987.
Dual interference of hygromycin B with
ribosomal
translocation and with
aminoacyl-tRNA recognition. Eur J
Biochem 87(1): 21-27.
Davies J, Davis BD. 1968. Misreading of
ribonucleic acid code words indiced by
aminoglycoside antibiotics. The effect of
drug concentration. J Biol Chem 243 (12):
3312-3316.
Gonzalez A, Jimenez A, Vazquez D, Davies JE,
Schindler D. 1978. Studies on the mode of
action of hygromycin B,an inhibitor of
translocation in eukaryotes. J Biochem
Biophys Act 521(2): 459-469.
Gritz L, Davies J. 1983. Plasmid-encoded
hygromycin B resistance : the sequence of
hygromycin B phosphotransferase gene
and its expression in Escherichia coli and
Saccharomyces cerevisiae. Gene 25(2-3):
179-188.
Hannum S. 2012. Isolasi, pengklonan dan
analisis ekspresi gen penyandi CopperZinc Superoxide Dismutase [disertasi].
Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut
Pertanian Bogor.
Hausner TP, Geigenmuller U, Nierhaus KH.
1988. The allosteric three-site model for
the ribosomal elongation cycle. New
insights into the inhibition mechanisms of
aminoglycosides,
hiostrepton,
and
viomycin. J Biol Chem 263(26): 1310313111.
Holme IB, Brinch-Pedersen H, Lange M, Holm
PB. 2008. Transformation of different
barley (Hordeum vulgare L.) Cultivars by
Agrobacterium tumefaciens infection of in
vitro cultured ovules. Plant Cell Rep 27:
1833-1840
Kaster KR, Burgett SG, Rao RN, Ingolia TD.
1983. Analysis of a bacterial hygromycin
B resistance gene by transcriptional and
translational fusions and by DNA
sequencing. Nucleic Acids Res 11(19):
6895-6911.
Lacal JC, Carrasco L. 1983. Antiviral effects of
hygromycin B, a translation inhibitor
nonpermeant to
uninfected
cells.
Antimicrobiol Agents Chemother 24(2):
273-275.
Mendel G. 1865. Mendel's paper in English:
Experiments in Plant Hybridization.
Druery CT, the translator; Great Britain:
the Royal Horticultural Society. translation
of Mendel's paper.
Mendenhall
W, Scheaffer
R. 1973.
Mathematical Statistics and Applications.
University of Florida. Massachusctts.
Duxbury Press Scituate. p. 501
Moazed D, Noller HF .1987. Interaction of
antibiotics with functional sites in 16S
ribosomal RNA. Nature 327(6121): 389394.
Mood AM, Graybill FA, Boes DC. 1974.
Introduction to the theory of statistics. 3nd.
MC Graw-Hill Kagarusha. Tokyo. LTD.
p. 107
Paszkowski J et al.1984. Direct gene transfer to
plant. EMBO J 3(12): 2717-2722
Spahn CM, Prescott CD.1996. Throwing a
spanner in the works: antibiotics and the
translation apparatus. J Mol Med 74(8):
423-439.
Travella S, Ross SM, Harden J, Everett C,
Snape JW, Harwood WA. 2005. A
comparison of transgenic barley lines
produced by particle bombardment and
Agrobacterium-mediated technique. Plant
Cell Rep 23: 780-789.
Wajtania A, Pulawka J, Gabryszewska E. 2005.
Identification and elimination of bacterial
contaminants from Pelargonium tissue
cultures. J Fruit and Ornamental Plant Res
13: 101-108.
Winchester AM. 1958. Genetics A Survey of
the Principles of Heredity. Second Edition.
Stetson University. Cambridge. The
Riberside Press. p.65
5
LAMPIRAN
6
RB
NosP
NPT
II
NosT
35S P
MmCu/ZnSOD
GFP
NosT
HPT
35 S P
LB
Lampiran 1 Konstruksi plasmid biner yang membawa gen MmCuZn-SOD dan gen hpt (Hannum 2012)