Seleksi Tanaman Padi Transgenik Generasi T1 dan T2 yang Membawa Kandidat Gen Toleransi Aluminium
SELEKSI TANAMAN PADI TRANSGENIK GENERASI T1 DAN T2
YANG MEMBAWA KANDIDAT GEN TOLERANSI ALUMINIUM
FAIZAL KURNIA SYAVITRI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
ABSTRAK
FAIZAL KURNIA SYAVITRI. Seleksi Tanaman Padi Transgenik Generasi T1 dan T2 yang
Membawa Kandidat Gen Toleransi Aluminium. Di bawah bimbingan MIFTAHUDIN dan TATIK
CHIKMAWATI.
Penggunaan varietas padi toleran aluminium (Al) merupakan salah satu pemecahan
masalah yang dihadapai oleh pertanian tanaman pangan di tanah masam. Pengembangan varietas
padi toleran Al dapat dilakukan melalui rekayasa genetika. Tanaman padi transgenik generasi T1
dan T2 telah diperoleh dari hasil transformasi gen B11, suatu kandidat gen toleransi Al ke tanaman
padi T309 akan tetapi sampai saat ini belum diketahui kebenaran tanaman transgenik tersebut.
Oleh karena itu penelitian ini bertujuan untuk melakukan seleksi dan verifikasi tanaman padi
transgenik generasi T1 dan T2 yang membawa kandidat gen toleransi Al. Hasil seleksi tanaman
padi transgenik generasi T1 dan T2 pada media seleksi antibiotik paromomisin diperoleh beberapa
nomor tanaman padi transgenik yang lolos seleksi. Penggunaan media seleksi paromomisin dapat
menyeleksi tanaman transgenik dari tanaman non transgenik tanpa menyebabkan efek albino
seperti yang terjadi pada seleksi menggunakan antibiotik kanamisin. Hasil analisis PCR
menggunakan primer dari gen nptII menunjukkan adanya pita DNA berukuran 600 pb pada
tanaman transgenik, tetapi tidak dihasilkan pita ukuran tersebut pada non transgeniknya. Karakter
tinggi tanaman dan jumlah anakan dari tanaman non transgenik dan tanaman transgenik tidak
berbeda secara nyata.
Kata kunci: Tanah masam, Toleran aluminium, Padi transgenik.
ABSTRACT
FAIZAL KURNIA SYAVITRI. The Selection of T1 and T2 Generation of Transgenic Rice
Carrying Aluminium Tolerant Gene Candidate. Supervised by MIFTAHUDIN and TATIK
CHIKMAWATI.
The use of aluminum (Al) tolerant rice variety is one of the alternative solutions to solve
the food crop production problem in acid soils. The Al tolerant rice variety can be developed by
genetic engineering. The T1 and T2 generation of transgenic rice has been developed from the
transformation of rice using B11 gene, which was an Al tolerance gene candidate. However the
true transgenic rice carrying the B11 gene has not been confirmed yet. This research was
conducted to select and verify the T1 and T2 transgenic rice which contained the Al tolerant gene
candidate. The result showed that the selection media containing paromomycin antibiotic could
select the putatif transgenic rice without albinism effect that appeared in selection using canamycin
antibiotic. The selection obtained true transgenic lines. The PCR analysis using the primers
developed from nptII gene showed a 600 bp DNA band in the transgenic plant, but it was none in
the wild type. The plant height and number of tiller characters were not significantly different
between the wild type and the transgenic plant.
Keyword: Acid soil, Aluminium tolerant, Transgenic rice
SELEKSI TANAMAN PADI TRANSGENIK GENERASI T1 DAN T2
YANG MEMBAWA KANDIDAT GEN TOLERANSI ALUMINIUM
FAIZAL KURNIA SYAVITRI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Judul Skripsi : Seleksi Tanaman Padi Transgenik Generasi T1 dan T2 yang
Membawa Kandidat Gen Toleransi Aluminium
Nama
: Faizal Kurnia Syavitri
NIM
: G34070067
Disetujui:
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Ir. Miftahudin, M.Si
NIP 19620419 198903 1 001
Dr. Ir. Tatik Chikmawati, M.Si
NIP 19640306 199002 2 001
Diketahui,
Ketua Departemen Biologi
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si.
NIP 19641002 198903 1 002
Tanggal lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya, sehingga
karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Penelitian dengan judul “Seleksi Tanaman Padi Transgenik
Generasi T1 dan T2 yang Membawa Kandidat Gen Toleransi Aluminium” dilakukan mulai
Februari 2011 sampai dengan Juli 2012 di Laboratorium Fisiologi Tumbuhan, Departemen
Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Miftahudin, M.Si. dan Dr. Ir. Tatik
Chikmawati, M.Si. atas bimbingan dan pengarahan yang diberikan. Penulis juga mengucapkan
terima kasih kepada Dr. Ir. Sulistijorini, M.Si sebagai penguji wakil komisi pendidikan.
Selanjutnya ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan untuk Bapak, Ibu, Zakkie, serta Liba
Silvia atas segala do’a, pengertian serta kasih sayang yang tercurah untuk penulis. Terima kasih
kepada Kak Pam, Kak Andik, Ibu Dasum, Pak Pieter, Pak Aka, Mbak Winda, Mas Kifli, Mbak
Jumi, Sasti, Ari, Ikra, Eka, Adhi, Alma, Irfan, Fibo dan seluruh staf Laboratorium Fisiologi
Tumbuhan Departemen Biologi, serta teman-teman yang selama ini ikut membantu terlaksananya
penelitian ini khususnya di Biologi angkatan 44.
Penulis berharap semoga karya tulis ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu
pengetahuan.
Bogor, September 2012
Faizal Kurnia S
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bojonegoro Jawa Timur pada tanggal 4 Mei 1989 dari pasangan Drs.
Syafi’i dan Dra. Tri Asih W. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara. Penulis lulus
dari SMP Negeri 1 Kalitidu pada tahun 2004, kemudian melanjutkan pendidikan di SMA Negeri 2
Bojonegoro dan lulus tahun 2007. Pada tahun yang sama, penulis diterima di Departemen Biologi
Institut Pertanian Bogor melalui jalur USMI (Undangan Seleksi Masuk IPB).
Penulis mempunyai pengalaman sebagai asisten praktikum pada mata kuliah Biologi Dasar,
Fisiologi Tumbuhan Dasar dan Sistematika Tumbuhan Berpembuluh pada tahun 2010-2012. Pada
tahun 20120, penulis melakukan Praktik Lapang di Balai Penelitian Tanaman Serat dan tembakau
dengan topik Toksisitas Gula Hasil Ekstrak Tembakau Terhadap Serangga Hama Penggerek Buah
Kapas Dan Werang Kapas. Pada tahun 2010 penulis juga pernah mengikuti lomba karya tulis
ilmiah di UIN Malang serta lomba inovasi teknologi di ITS Surabaya.
Selama kuliah penulis menjadi anggota organisasi mahasiswa daerah Bojonegoro
“Paguyuban Angling Dharma” (PAD) IPB. Pengalaman kepanitiaan penulis antara lain sebagai
panitia Grand Biodiversity tahun 2010, sebagai pengisi acara pada “Pesta sains 2009”, pengisi
acara “Temu Alumni 2009”. panitia masa perkenalan departemen mahasiswa baru MPD, dan
sebagai ketua pelaksana “Biodiversity III Biologi 44 tahun 2010”.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL...........................................................................................................................viii
DAFTAR GAMBAR ..................................................................................................................... viii
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................................................. viii
PENDAHULUAN ............................................................................................................................ 1
Latar Belakang .............................................................................................................................. 1
Tujuan ........................................................................................................................................... 1
BAHAN DAN METODE ................................................................................................................. 2
Waktu dan Tempat ........................................................................................................................ 2
Bahan dan Alat ............................................................................................................................. 2
Metode .......................................................................................................................................... 2
Seleksi Tanaman Padi Transgenik pada Media Seleksi Antibiotik. ......................................... 2
Penanaman di Rumah Kaca. ..................................................................................................... 2
Isolasi DNA. ............................................................................................................................. 2
Analisis PCR dan Visualisasi Hasil PCR. ................................................................................ 2
Analisis Data. ........................................................................................................................... 3
HASIL ............................................................................................................................................... 3
Seleksi Tanaman Padi Transgenik pada Media Seleksi Antibiotik. ............................................ 3
Pertumbuhan Tanaman Transgenik. ............................................................................................ 4
Analisis PCR dan Visualisasi Hasil PCR. ................................................................................... 5
PEMBAHASAN ............................................................................................................................... 5
SIMPULAN DAN SARAN .............................................................................................................. 7
Simpulan ....................................................................................................................................... 7
Saran ............................................................................................................................................. 8
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................................................... 8
LAMPIRAN .................................................................................................................................... 10
DAFTAR TABEL
Halaman
1
2
3
4
Hasil perkecambahan biji dengan antibiotik higromisin, kanamisin dan paromomisin
pada dua jenis media berbeda ………………………………………………………….......... 4
Segregasi tanaman transgenik generasi T1 dan T2 yang diseleksi dengan 100 mg/L
kanamisin ………………………............................................................................................. 4
Segregasi tanaman transgenik generasi T1 dan T2 yang diseleksi dengan 25 mg/L
paromomisin ……………………............................................................................................. 5
Segregasi tanaman transgenik generasi T1 dan T2 yang diseleksi dengan antibiotik
5
kanamisin dan paromomisin....................................................................................................... 5
Karakter pertumbuhan tanaman non transgenik dan tanaman transgenik ………...…….......... 6
3
3
5
3
3
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
2
3
4
Perkecambahan pada media antibiotik kanamisin ………………………………………......... 3
Perkecambahan biji pada media seleksi antibiotik paromomisin.............................................. 4
Perbedaan pertumbuhan kecambah padi pada dua jenis antibiotik ………………………....... 5
Hasil amplifikasi DNA generasi T1 dengan menggunakan primer nptII …………………..... 6
3
3
3
3
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Konstruk pGWB5…………………………………………………………………..….......... 11
2 Konstruk pBIN11………………………………………………………………….....…....... 12
3 Komposisi media MS………………………………………………………………….......... 13
3
3
3
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tanaman padi (Oryza sativa L.) termasuk
tanaman pangan penting di Indonesia.
Produksi padi di Indonesia masih tergolong
rendah sebesar 67,31 ton gabah kering giling
(GKG) per hektar, atau jauh di bawah ratarata produksi negara lain seperti negara
Australia (BPS 2011). Salah satu upaya dapat
dilakukan untuk meningkatkan produksi padi
adalah dengan memanfaatkan lahan kering
yang tersedia cukup luas di luar Pulau Jawa.
Di Indonesia terdapat sekitar 47,6 juta hektar
(32,4%) lahan kering yang umumnya
didominasi oleh tanah masam podsolik merah
kuning (Karama & Abdurrachman 1993).
Usaha pertanian di tanah masam akan
mengalami banyak kendala, diantaranya
kelarutan aluminium (Al) yang tinggi
(Kochian et al. 1995) yang dapat menghambat
pertumbuhan akar. Ismunadji & Partohardjono
(1985) juga mengatakan akar akan menjadi
pendek dan tebal, percabangan tidak normal,
dan tudung akar rusak. Hal tersebut berakibat
akar padi tidak mampu menyerap air dan
nutrisi dengan baik.
Penggunaan varietas padi toleran terhadap
cekaman Al menjadi salah satu alternatif
pemecahan masalah pertanian pada tanah
masam. Perakitan tanaman padi toleran
cekaman Al dapat ditempuh melalui
persilangan
secara
konvensional,
memanfaatkan
keragaman
somaklonal,
induksi mutasi maupun rekayasa genetik
(Purwoko et al. 2000). Dalam rangka
mengembangkan galur padi toleran Al,
Miftahudin et al. (2010) telah melakukan
transformasi kandidat gen toleransi Al pada
padi varietas T309. Saat ini telah diperoleh
generasi T1 dan T2 (Miftahudin et al. 2010).
Karakterisasi tanaman T1 dan T2 perlu
dilakukan untuk memastikan bahwa tanaman
tersebut adalah tanaman transgenik yang
membawa gen toleran Al yang diinginkan.
Diharapkan tanaman transgenik yang telah
terbentuk
dapat
digunakan
untuk
mengembangkan galur padi toleran Al yang
adaptif terhadap tanah masam.
Dalam proses transformasi telah disisipkan
gen-gen yang memiliki ketahanan terhadap
antibiotik sebagai marka penyeleksi yaitu gen
yang umum digunakan adalah neomicin
fosfotransferase II (nptII) dan higromisin
fosfotransferase (hpt). Gen nptII digunakan
untuk
ketahanan
terhadap
antibiotik
kanamisin dan paromomisin. Pemakaian
antibiotik kanamisin atau paromomisin
sebagai agen penyeleksi pada proses seleksi
tanaman hasil transformasi didasarkan pada
asumsi bahwa gen penyandi ketahanan
terhadap
antibiotik
kanamisin
atau
paromomisin tersebut telah terintegrasi ke
dalam kromosom tanaman trnasgenik.
Kanamisin dan paromomisin merupakan
antibiotik aminoglikosida yang berasal dari
sumber yang berbeda. Kanamisin diproduksi
oleh Streptomyces kanamyceticus dan
paromomisisn diproduksi oleh Streptomyces
rimosus, sedangkan gen hpt merupakan gen
penyandi antibiotik higromisin. Higromisin
umumnya
lebih
toksik
dibandingkan
kanamisin.
Higromisin
mempunyai
kemampuan membunuh sel-sel peka lebih
cepat dan penyeleksi yang lebih disukai untuk
transformasi pada tanaman monokotiledon
terutama graminae (Bashir et al. 2004).
Higromisin
merupakan
antibiotik
aminoglikosida
yang
diproduksi
oleh
Streptomyces hygroscopicus dan merupakan
sistem marker penyeleksi yang sesuai untuk
sistem tanaman dan hewan. Antibiotik ini
menghambat sintesis protein dengan cara
menggangu translokasi dan menyebabkan
kesalahan translasi pada ribosom 80S (Bashir
et al. 2004).
Seleksi tanaman transgenik dilakukan
dengan menumbuhkan sel, jaringan atau
organ, seperti biji, pada media yang
mengandung antibiotik. Sel, jaringan atau
organ yang hidup atau lolos dari seleksi akan
merupakan
tanaman
yang
berpotensi
membawa gen yang ditransformasikan. Selain
dengan cara seleksi antiobiotik, seleksi
tanaman transgenik juga dapat dilakukan
dengan menggunakan teknik polymerase
chain reaction (PCR) menggunakan primer
yang didesain dari sekuen gen yang
ditransformasikan atau dari sekuen gen
antibiotik yang diintegrasikan bersama-sama
dengan gen interes tersebut (Amirhusin 2004).
Pada penelitian ini telah dilakukan seleksi
dan verifikasi tanaman transgenik generasi T1
dan T2 dengan menggunakan metode seleksi
antibiotik dan PCR.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan
seleksi dan verifikasi tanaman padi transgenik
generasi T1 dan T2 yang membawa kandidat
gen toleransi aluminium.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan
Februari 2011 sampai Juli 2012 di
Laboratorium
Fisiologi
Tumbuhan,
Departemen Biologi, Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB, Bogor.
Bahan
Bahan tanaman yang digunakan adalah biji
padi transgenik generasi T1 no 3.1; 4.1 dan
K4 yang telah ditransformasi dengan kandidat
gen toleransi Al yang dikonstruksi pada
plasmid pGWB5-B11 (Lampiran 1) dan biji
padi transgenik generasi T2 no. 39 dan 44
yang telah ditransfomrasi dengan kandidat gen
toleran Al yang dikonstruksi pada plasmid
pBIN-11 (Lampiran 2) dan biji tanaman non
transgenik.
Metode
Seleksi Tanaman Padi Transgenik pada
Media Seleksi Antibiotik.
Biji tanaman padi transgenik generasi T1
dan T2 diseleksi pada media seleksi antibiotik
secara aseptik pada media padat dan cair. Biji
disterilisasi dengan merendamnya dalam
larutan Bayclean (20% v/v) ditambah 2 tetes
Tween-80 selama 20 menit, kemudian
dilanjutkan dengan pembilasan dengan air
steril sebanyak 3 kali (Zainati 2010).
Selanjutnya biji ditanam pada media padat
Murashige and Skoog (Lampiran 3) ditambah
25-100 mg/L Kanamisin atau 20 mg/L
Higromisin selama 6 hari. Pada seleksi
menggunakan media cair percobaan dilakukan
dengan merendam biji padi dalam 20 ml
akuades steril ditambah 25mg/L Paromomisin
selama 6 hari. Kemudian biji diinkubasi pada
suhu ruang dengan kondisi pencahayaan 16
jam terang dan 8 jam gelap. Kemampuan
kecambah padi yang tahan terhadap antibiotik
diamati pada hari ke-6. Biji dari tanaman non
transgenik disertakan sebagai pembanding
dalam seleksi. Jumlah biji yang berkecambah
dan tumbuh normal serta biji yang tidak
berkecambah dihitung dan digunakan sebagai
kriteria keberhasilan integrasi kandidat gen
toleransi Al ke dalam tanaman transgenik
generasi T1dan T2.
Penanaman di Rumah Kaca
Sebanyak 31 kecambah tanaman T1 dan
T2 yang tahan antibiotik kemudian ditanam di
rumah kaca pada pot yang berisi media
tanah:kompos dengan perbandingan 3:1 (b/b).
Tanaman dipelihara dengan mengikuti praktek
pemeliharaan padi sawah. Pengamatan
karakter pertumbuhan dilakukan sejak
tanaman berumur 21 hari sampai minggu ke8. Peubah yang diamati meliputi tinggi
tanaman dan jumlah anakan.
Isolasi DNA
Isolasi DNA dilakukan dengan teknik
isolasi cepat (Miftahudin et al. 2004). Daun
padi muda dan segar berumur 4 minggu
digerus dalam N2-cair. Kemudian ditambah
buffer lisis ( SDS 2%, glisin 0.1M, NaCl
0.05M EDTA pH 8 0.01M) dan disentrifugasi
dengan kecepatan 13000 rpm selama 10
menit. Supernatan dipipet, ditambah PCIAA
(Phenol, Chloroform dan Iso Amyl Alchohol),
dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000
rpm selama 10 menit. Selanjutnya supernatan
dipipet, ditambah CIAA (Chloroform dan Iso
Amyl Alchohol), dan disentrifugasi dengan
kecepatan 13000 rpm selama 10 menit. Lalu
supernatan dipipet kembali dan ditambah
isopropanol, kemudian disentrifugasi dengan
kecepatan 15000 rpm selama 5 menit. Pelet
DNA dibilas dengan Etanol 70% dan
sentrifugasi kemudian dikeringanginkan.
Kuantitas
DNA diukur
menggunakan
spektrofotometer UV, sedangkan kualitas
DNA diamati dengan menggunakan teknik
elektroforesis pada 1% gel agarose dalam 1x
buffer TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8.0),
dengan tegangan 65 volt selama 30 menit.
Larutan DNA yang telah diperoleh disimpan
pada suhu -20 oC sampai saatnya digunakan
untuk analisis.
Analisis PCR dan Visualisasi Hasil PCR
Analisis PCR dilakukan untuk mengetahui
keberadaan sisipan gen toleran Al yang telah
diintroduksikan pada tanaman transgenik.
Keberadaan sisipan gen tersebut diidentifikasi
secara tidak langsung melalui keberadaan gen
nptII yang menyandikan ketahanan terhadap
kanamisin atau paromomisin. Primer-primer
forward
(5’-GAA-CAA-GAT-GGA-TTGCAC-GC-3’), reverse (5’-GAA-GAA-CTCGTC-AAG-AAG-GC-3’) dari gen nptII
digunakan untuk mengamplifikasi DNA
tanaman T1 dan T2. Reaksi PCR terdiri dari
100 ng DNA padi, 1x penyangga PCR, 0.2
mM masing-masing dNTPs, 0.4 μM masingmasing primer, 1 Unit Taq DNA Polymerase
dan dH2O sampai volume akhir reaksi 20 μl.
Program PCR yang digunakan adalah 94°C
selama 5 menit (pra-denaturasi), kemudian
dilanjutkan dengan 94°C selama 30 detik
(denaturasi), 56°C selama 30 detik
(penempelan primer), dan 72°C selama 1,5
menit (pemanjangan) yang diulang sebanyak
35 siklus dan diakhiri dengan 72°C selama 10
menit. Hasil PCR dielektroforesis pada 1% gel
agarose dalam 1x buffer TBE dengan
tegangan 70 volt selama 45 menit. Pita DNA
kemudian diwarnai dengan pewarna ethidium
bromide 5 μg/ml dan diamati di atas UV
transluminator.
Analisis Data
Data segregasi biji transgenik dianalisis
menggunakan uji khi-kuadrat pada taraf uji
α=5%
HASIL
Seleksi Tanaman Padi Transgenik pada
Media Seleksi Antibiotik.
Pada tahap seleksi dengan antibiotik
higromisin dengan menggunakan media padat
(media agar) dan cair, semua tanaman
transgenik dan tanaman non transgenik yang
ditumbuhkan pada media seleksi dengan
konsentrasi 20 mg/L, tidak mampu
berkecambah sampai hari ke 6.
Seleksi berikutnya dilakukan pada media
antibiotik kanamisin dengan menggunakan
media padat dan cair dengan beberapa
konsentrasi dimulai dari konsentrasi 25, 50,
dan 100 mg/L. Media seleksi kanamisin
dengan konsentrasi 25 mg/L dan 50 mg/L,
tidak mamu menyeleksi tanaman putatif
transgenik. Baik transgenik dan non
transgenik mampu berkecambah pada media
kanamisin dengan konsentrasi tersebut.
Peningkatan konsentrasi terus dilakukan
hingga konsentrasi 100 mg/L. Pada tingkat
konsentrasi 100 mg/L dari 364 benih padi
yang terdiri dari 115 tanaman nontransgenik
dan 249 tanaman transgenik terseleksi, namun
terjadi gejala albinisma, sehingga hasil seleksi
tidak dapat digunakan untuk analisis
selanjutnya. Hasil seleksi dengan antibiotik
kanamisin konsentrasi 100 mg/L disajikan
pada Tabel 1 dan 2.
Pada seleksi dengan antibiotik kanamisin
konsentrasi 100 mg/L, tanaman non
transgenik tidak menghasilkan akar (Gambar
1A),
sedangkan
tanaman
transgenik
menghasilkan kecambah normal tetapi
menunjukkan gejala albinisma (Gambar 1B).
Untuk menghindari albinisma pada hasil
seleksi antibiotik, digunakan antibiotik
alternatif yang memiliki fungsi yang sama
dengan kanamisin, yaitu paromomisin.
Tanaman putatif transgenik kemudian
diseleksi dengan antibiotik paromomisin
dengan konsentrasi 25 mg/L. Seleksi dengan
antibiotik paromomisin dilakukan dengan
media cair. Pada teknik ini selain
pertumbuhan kecambah lebih cepat, juga tidak
membutuhkan teknik aseptik. Hasil percobaan
pada media paromomisin menunjukkan bahwa
tanaman putatif transgenik dapat terseleksi
dengan baik. Hanya tanaman yang membawa
gen nptII yang tahan terhadap media seleksi
dan tumbuh normal (Tabel 1).
Sebanyak 74 benih padi yang terdiri dari
16 tanaman non transgenik dan 58 tanaman
transgenik diseleksi pada media cair dengan
menggunakan antibiotik paromomisin dengan
konsentrasi 25 mg/L. Hasil seleksi dengan
antibiotik paromomisin disajikan pada
Gambar 2 dan Tabel 3.
A
B
Gambar 1 Perkecambahan pada media antibiotik kanamisin: A. tanaman non transgenik hanya
muncul tunas, tetapi tidak berakar; B. tanaman transgenik menunjukkan kecambah
yang normal. Garis skala =1,5 cm untuk A dan 1 cm untuk B
4
Tabel 1 Hasil perkecambahan biji dengan antibiotik higromisin, kanamisin dan paromomisin pada
dua jenis media berbeda
Media
Higromisin
Antibiotik
Kanamisin
Paromomisin
Media padat
Tidak tumbuh
Tumbuh, albino
-
Media cair
Tidak tumbuh
Tumbuh, albino
Tumbuh, normal
Tabel 2 Segregasi tanaman transgenik generasi T1 dan T2 yang diseleksi dengan
100 mg/L Kanamisin
Non transgenik
∑ biji yang di
uji
115
∑ biji yang
tahan
0
T1-K4
99
84
15
T1-3.1
59
45
14
T1-4.1
55
41
18
T2-39
18
14
4
T2-44
18
14
4
No tanaman
A
∑ biji yang peka
115
B
Gambar 2 Perkecambahan biiji pada media seleksi antibiotik paromomisin: A. Non transgenik
tidak berkecambah B. Tanaman transgenik T1 berkecambah normal.
Biji tanaman non transgenik yang
dikecambahkan pada media yag diberi
perlakuan antibiotik paromomisin tidak
mampu berkecambah, sedangkan biji tanaman
transgenik generasi T1 dan T2 berkecambah
(Gambar 2). Pada Gambar 3 terlihat
perbedaan perkecambahan tanaman transgenik
dengan menggunakan antibiotik paromomisin
(Gambar 3A) dan kanamisin (Gambar 3B).
Pada media paromomisin hasil seleksi
menunjukkan perkecambahan normal dengan
tunas yang berwarna hijau, sedangkan pada
media kanamisin terjadi gejala albinisma pada
kecambah.
Hasil uji khi-kuadrat pada Tabel 4
menunjukkan bahwa tanaman T1 nomor 3.1
dan T2 nomor 39 menunjukkan segregasi
model pewarisan gen tunggal dengan rasio
kecambah tahan antibiotik terhadap peka
antibiotik 3:1 (nilai χ2 hitung lebih kecil dari
χ2 tabel).
Pertumbuhan Tanaman Transgenik.
Pertumbuhan tanaman transgenik di rumah
kaca tidak jauh berbeda dengan tanaman non
transgenik (Tabel 5). Data sampai minggu ke8 menunjukkan sebagian besar tanaman
transgenik memiliki tinggi tanaman yang tidak
jauh berbeda dari tanaman non transgenik,
meskipun sebagian besar tanaman ransgenik
lebih pendek dari tanaman non transgenik.
Selain itu, jumlah anakan tanaman transgenik
juga relatif sama dengan tipe non transgenik,
bahkan ada beberapa tanaman transgenik yang
memiliki jumlah anakan yang lebih banyak.
Tabel 3 Segregasi tanaman transgenik generasi T1 dan T2 yang diseleksi dengan
25 mg/L Paromomisin
No tanaman
∑ biji yang di
uji
∑ biji yang tahan
∑ biji yang peka
Non transgenik
T1-K4
T1-3.1
T1-4.1
T2-39
T2-44
16
16
5
5
16
16
0
10
4
2
10
5
16
6
1
3
6
11
Tabel 4 Segregasi tanaman transgenik generasi T1 dan T2 yang diseleksi dengan antibiotik
kanamisin dan paromomisin
∑ biji yang
∑ biji yang tahan
di uji
Non transgenik
131
0
T1-K4
115
94
T1-3.1
64
49
T1-4.1
60
43
T2-39
34
24
T2-44
34
19
Keterangan : χ 2 tabel(db) ; α= 5% ; χ2 (3) = 3.81
No tanaman
∑ biji yang peka
Chi-test (3:1)
131
21
15
21
10
15
393
6.41
0.11
4.21
1.96
16.96
A
B
Gambar 3 Perbedaan pertumbuhan kecambah padi pada dua jenis antibiotik. A Kecambah normal
pada media antibiotik paramomisin, B Kecambah albino pada media antibiotik
kanamisin. Garis skala =0,5 cm untuk A dan 1 cm untuk B
Analisis PCR dan Visualisasi Hasil PCR.
Hasil PCR padi transgenik generasi T1
dengan primer spesifik gen nptII disajikan
pada Gambar 4. Visualisasi dengan
elektroforesis menunjukkan pita DNA
tanaman transgenik memiliki posisi migrasi
sama atau sejajar dengan pita hasil PCR
plasmid rekombinan (kontrol positif). Pita
tersebut merupakan hasil amplifikasi gen nptII
dengan ukuran sesuai dengan yang
diharapkan, yaitu 600 pb. Dengan demikian
hasil tersebut menunjukkan bahwa gen nptII
telah berhasil disisipkan ke dalam kromosom
tanaman transgenik. Diharapkan gen toleransi
Al juga telah tersisipkan pada kromosom
tanaman tersebut.
PEMBAHASAN
Miftahudin et al (2010) telah melakukan
transformasi gen B11 (kandidat gen toleransi
Al) dengan metode biolistik (Particle
Bombardment) dan infeksi Agrobacterium
tumefaciens ke tanaman padi. Saat ini telah
mendapatkan generasi T1 dan T2 yang dalam
penelitian ini diseleksi dan diverifikasi
kebenaran tanaman transgenik tersebut.
Dengan
menggunakan
media
seleksi
antibiotik. Efektivitas penggunaan antibiotik
sebagai agen seleksi bergantung pada jenis
dan konsentrasi antibiotik serta tingkat
ketahanan tanaman yang diseleksi. Oleh
karena itu pada penelitian ini dilakukan
optimasi seleksi dengan beberapa jenis
antibiotik dan konsentrasinya
6
Tabel 5 Karakter pertumbuhan tanaman non transgenik dan tanaman transgenik
No tanaman
Tinggi tanaman
∑ anakan
Non transgenik
T1-K4
T1-3.1
T1-4.1
T2-39
T2-44
133
135
127
129
115
120
3
4
4
4
3
3
A
B
C
D
E
F
G
600bp
Gambar 4 Hasil amplifikasi DNA generasi T1 dengan menggunakan primer nptII : A. Kontrol
negatif; B. Tanaman non transgenik; C. Tanaman transgenik no T1- 3.1; D. T1-4.1; E.
T1-K4; F. Plasmid Pembawa Konstruk Gen; G. Penanda DNA 100 pb.
Dalam seleksi menggunakan antibiotik
higromisin hasil menunjukkan tidak adanya
tanaman yang mampu berkecambah baik
menggunakan media padat (agar) maupun
media cair. Ada beberapa hal yang
menyebabkan tidak terjadinya perkecambahan
biji pada media higromisin. Pertama, bisa
terjadi karena gen hpt, yaitu gen yang
menyandikan antibiotik higromisin tidak
masuk ke dalam tanaman pada saat proses
transformasi sehingga tidak ada gen yang
menyandikan
antibiotik
pada
saat
perkecambahan pada media seleksi. Dalam
proses transformasi ada tiga komponen
penting yang terlibat. Pertama adalah gen
virulen kromosom, yang terdapat pada
kromosom Agrobacterium dan berfungsi
dalam pelekatan bakteri dengan sel tanaman.
Kedua, gen virulen (vir) yang terdapat dalam
plasmid Ti dan menpunyai fungsi untuk
menginduksi
dan
integrasi
T-DNA.
Komponen ketiga adalah daerah T-DNA.
Daerah T-DNA, dibatasi oleh LB (left border)
dan RB (right border) yang mengandung gen
penting
bagi
Agrobacterium.
Proses
transformasi dimulai dengan melekatnya
Agrobacterium pada sel tanaman. Kemudian
gen-gen terinduksi pada daerah vir oleh suatu
signal yang spesifik di dalam sel bakteri
sehingga dihasilkan produk dari ekspresi gengen virulen untuk memproses T-DNA dan
mentransfernya dari dalam sel bakteri. Proses
dan transfer T-DNA dimediasi oleh berbagai
protein yang dikode oleh gen virulen.
Pembentukan T-kompleks berfungsi untuk
menjaga T-DNA dalam perjalanannya menuju
inti sel tanaman inang (Rahmawati 2006).
Kemungkinan hal yang dapat menyebabkan
kesalahan dalam proses transformasi adalah
pada daerah T-DNA yang dibatasi oleh LB
dan RB (daerah yang membawa gen) yang
tidak dapat masuk dalam tanaman sel inang.
Kedua, tanaman transgenik tidak tumbuh
pada media seleksi higromisin bisa
dikarenakan konsentrasi higromisin yang
terlalu tinggi. Faktor ketiga adalah adanya
pembungkaman gen. Pembungkaman gen
merupakan proses transkripsi sehingga
tanaman tidak mampu berkambah. Menurut
Rashid et al. (1996), pembungkaman gen
adalah
salah
satu
fenomena
yang
menyebabkan terjadinya kegagalan dalam
mengekspresikan gen. Namun hingga saat ini,
mekanisme yang menyebabkan terjadinya
ketidakstabilan integrasi dan ekspresi gen
masih belum dimengerti.
Pendapat lain juga menyatakan bahwa
tanaman transgenik yang tidak mampu
mengekspresikan ketahanan higromisin atau
terseleksi dalam media higromisin padahal
tanaman tersebut tidak membawa gen
penyandi hpt akan menunjukkan gejala
nekrotik, serupa dengan tanaman non
transgenik. Pada kasus yang demikian diduga
telah terjadi mekanisme pembungkaman gen
hpt. (Mulyaningsih et al. 2010). Mekanisme
pembungkaman
gen
dalam
proses
transformasi genetik dapat terjadi pada
berbagai proses. Pembungkaman gen dapat
terjadi pada fase transkripsi dan pasca
transkripsi. Pembungkaman pada tahap
transkripsi diidentifikasi oleh ketiadaan
transkrip dari gen tersebut. Sedangkan
pembungkaman gen pada pasca transkripsi
terjadi karena gen tersebut mengandung
sekuen yang homolog (Lucy et al.2000).
Berbeda dengan hasil dari Roslim (2009)
yang melakukan transformasi
plasmid
pGWB5-B11 ke tanaman tembakau tidak
menunjukkan adanya gejala albinisma pada
tanaman yang terseleksi. Pada tanaman padi
seleksi kanamisin dengan konsentrasi 100
mg/L memberikan gejala albinisma. Diduga
warna putih pada kecambah yang terseleksi
antibiotik
kanamisin
disebabkan
oleh
penghambatan
antibiotik
terhadap
metabolisme sel tumbuhan. Penghambatan
proses
metabolisme
oleh
antibiotik
disebabkan oleh pengikatan ribosom 30S yang
menyebabkan terjadinya kesalahan translasi
mRNA. Pada tumbuhan, ribosom 30S berada
pada organel kloroplas dan mitokondria. Pada
kloroplas pengikatan antibiotik
pada
ribososm 30S menyebabkan rusaknya klorofil
dan menghambat pembentukan asam amino
(Braun & Bennett 2001).
Beberapa faktor yang dapat mempengaruhi
kemampuan atau efektifitas bahan kimia yang
digunakan untuk seleksi tanaman adalah
bahan-bahan penyeleksi tersebut bersifat
toksik untuk sel tanaman, sehingga mungkin
hal inilah yang menyebabkan albinisma. Jadi
toksin yang paling efektif adalah toksin yang
menghambat
pertumbuhan
sel-sel
nontransforman
secara
berlahan-lahan.
Tekanan seleksi akan optimal apabila
menggunakan konsentrasi toksin yang paling
rendah yang mampu membunuh jaringan
nontransforman. Akan tetapi pada penelitian
ini, seleksi padi transgenik dengan konsentrasi
kanamisin yang rendah tidak mampu menekan
perkecambahan biji padi nontransgenik
(Mulyaningsih et al. (2010).
Daboussi et al. (1989) menyebutkan gen
tahansi antibiotik umumnya mengkode suatu
enzim yang dapat menginaktifkan suatu
antibiotik, sehingga tanaman transgenik yang
membawa gen tersebut menjadi tahan
terhadap antibiotik. Oleh karena itu, salah satu
ciri keberhasilan sisispan gen gen asing yang
umumnya dikombinasikan dengan gen
antibiotik sebagai alat seleksi pada tanaman
adalah apabila planlet atau biji hasil
transformasi menunjukkan tahansi terhadap
antibiotik.
Dalam penelitian ini ditunjukkan bahwa
antibiotik kanamisin tidak sesuai untuk seleksi
padi transgenik. Hail ini juga sesuai yang
dikatakan oleh Jefferson (1999) bahwa
antibiotik kanamisin tidak efektif sebagai
penanda untuk seleksi tanaman kacangkacangan dan famili Gramineae, seperti padi.
Seleksi dengan antibiotik paromomisin lebih
baik dalam menyeleksi tanaman transgenik.
Hal ini sesuai dengan Riva et al. (2006) yang
mengatakan bahwa hanya sel yang memiliki
kontruksi plasmid gen penyandi antibiotik
yang dapat tumbuh, sedangkan
sel
nontransforman yang tidak memiliki kontruksi
plasmid-gen penyandi antibiotik tidak dapat
tumbuh.
Hasil
uji
khi-kuadrat
(Tabel
4)
menunjukkan bahwa semua nomor tidak
bersegregasi pewarisan gen tunggal, kecuali
nomor T1-3.1 dan T2-39 yang bersegregasi
dengan perbandingan 3:1 untuk sifat tahan
dan peka terhadap antibiotik. Hal ini
mengindikasikan bahwa penyisisipan gen
nptII hanya terjadi satu copy gen dalam satu
tempat kromosom padi. Diharapkan nomor
T1-3.1 dan T2-39 tersebut juga hanya
membawa satu copy gen B11 dan dapat
digunakan untuk analisis selanjutnya sehingga
bisa dikembangkan menjadi galur padi
transgenik yang toleran Al
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Jenis antibiotik yang tepat pada media
seleksi tanaman padi transgenik generasi T1
dan T2 adalah antibiotik paromomisin. Seleksi
dengan
antibiotik paromomisin dengan
konsentrasi 25 mg/L menunjukkan hasil yang
lebih baik daripada seleksi dengan higromisin
dan kanamisin. Kandidat tanaman transgenik
yang diseleksi menunjukkan bahwa beberapa
merupakan tanaman transgenik, sedangkan
yang lainnya
bukan transgenik. Tanaman transgenik
generasi T1 nomor 3.1 membawa satu copy
gen nptII, dan diharapkan juga membawa satu
copy gen B11.
Lucy AP, Guo H, Li W, Ding SW. 2000.
Suppresion of post transcriptional gen
silencing by a plan viral protein localized
in nucleus. EMBO J 19:1672-1680
Saran
Miftahudin, Scoles GJ, Gustafson JP. 2004.
Development of PCR-based codominant
markers flanking the Alt3 gene in rye.
Genome 47:231-238.Roslim DI. 2009.
Isolasi dan karakterisasi kandidat gen
toleran aluminium pada padi. Makalah
Seminar Sekolah Pascasarjana. Institut
Pertanian Bogor.
Perlu dilakukan verifikasi sisipan gen pada
tanaman transgenik dengan menggunakan
kombinasi primer dari promotor 35S dan
primer dari toleran aluminium yang
dintroduksikan ke genom tanaman padi.
DAFTAR PUSTAKA
Amirhusin B. 2004. Perakitan Tanaman
Transgenik Tahan Hama. J Lit Per 23:1-7
Bashir K, Rafiq M, Fatima T, Husnain T, and
Riazuddin. 2004. Hygromycin based
selection of transformants in a local inbred
line of Zea mays (L). Pakistan J Biol Sci
7:318-323.
Braun R, Bennett DJ. 2001. Antibiotic tahance
in genetically modified (GM) crops. EFB
Task Group Pub Prec Biotec 10:1-4.
[BPS] Badan Pusat Statistik. Produksi Padi
Indonesia. 2011. Jakarta: Badan
pusat
statistika.
Daboussi MJ, Djeballi A, Gerlinger C,
Blaiseau PL,
Bouvier
I.
1989.
Transformation of seven species of
filamentous fungi using the nitrate
reductase gene of Aspergillus nidulans.
Curr Genet 15: 453-456.
Ismunadji M, Partohardjono S. 1985. Program
hasil penelitian pengapuran tanah masam
untuk peningkatan produksi tanaman
pangan. Balittan. Puslitbangtan.
Jefferson RA. 1999. Method for selecting
transformed cells. Australia: Patentlens
Kochian LV. 1995. Cellular mechanisms of
aluminum toxicity and resistance in plants.
Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 46:
237-260.
Karama AS dan Abdurachman A. 1993.
Optimasi pemanfaatan sumberdaya lahan
berwawasan
lingkungan.
Prosiding
Simposium Penelitian Tanaman Pangan.
III.
Puslitbangtan.
Badan
Litbang
pertanian, Departemen Pertanian. Bogor
23-25 Agustus. Hlm. 98-112
Miftahudin, Chikmawati T, dan Pardal SJ.
2010. Pengembangan galur padi toleran
aluminium melalui rekayasa genetika.
Laporan Penelitian Riset Insentif Terapan.
LPPM. IPB.
Mulyaningsih ES, Aswidinnoor H, Sopandie
D, Pieter BF Ouwerkerk dan Loedin IHS.
2010. Pewarisan gen hpt (Hygromycine
phosphotransferase) berdasarkan analisis
PCR dan ekspresinya pada populasi padi
transforman mengoverekpresikan gen HD
ZIP OSHOX-6. Berita Biologi 10: 59-66
Purwoko BS, Hanarida I, Dewi IS, and
Santosa E. 2000. Penggunaan poliamin
untuk meningkatkan regenerasi tanaman
hijau pada kultur antera padi dan
aplikasinya dalam program pemuliaan
padi. Laporan Hibah Bersaing VIII/I.
Depdiknas 23p.
Rahmawati H. 2006. Status Perkembangan
Perbaikan
Sifat
Genetik
Padi
Menggunakan
Transformasi
Agrobacterium. Jurnal Agro Biogen 2:3644.
Rashid H, Yokoi S, Toriyama K, and Hinata
K. 1996. Transgenic plant production
mediated by Agrobacterium in Indica rice.
Plant Cell 15:727-730.
Riva GA, Cabrera JG, Padron RV, and Pardo
CA. 2006. The Agrobacterium tumefasiens
gene Transfer to Plant Cell. [terhubung
berkala] www.ejbiotechnology.info, [26
Juni 2012].
Roslim DI. 2009. Isolasi dan karakterisasi
kandidat gen toleran aluminium pada padi.
Makalah Seminar Sekolah Pascasarjana.
Institut Pertanian Bogor.
9
Roslim DI. 2011. Isolasi dan karakterisasi gen
toleran aluminium dari tanaman padi
[disertasi]. Bogor: Sekolah Pascasarjana.
Insitut Pertanian Bogor.
Zainati F. 2010. Induksi Embriogenesis
somatik pada padi varietas IR64 dan Situ
Bagendit. [skripsi]. Bogor: Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam. Insitut Pertanian Bogor.
LAMPIRAN
13
Lampiran 3 Komposisi larutan MS (Murashige & Skoog) dan vitamin B5
Komposisi larutan MS
Kode
Senyawa
A
B
C
D
E
F
NH4NO3
KNO3
CaCl2.2H2O
H3BO3
KH2PO4
CoCl2.6H2O
Na2MoO4.2H2O
KI
MgSO4.7H2O
MnSO4.4H2O
ZnSO4.7H2O
CuSO4.5H2O
Na-EDTA
FeSO4.7H2O
Komposisi vitamin B5
Komponen
Myo-inositol
Thiamine-HCl
Nicotinic acid
Pyridoxine-HCl
Konsentrasi stok(mg/L)
82500
95000
88000
1240
34000
5.2
50
166
74000
3010.8
1720
5.2
74.4
5.56
Konsentrasi stok (mg/L)
10000
1000
100
100
Final konsentrasi(mg/L)
1650
1900
440
6.2
170
0.026
0.25
0.83
370
22.3
8.6
0.025
37.2
27.8
Final konsentrasi (mg/L)
100
10
1
1`
Lampiran 1 Konstruk vektor pGWB5-B11_573bp (Roslim, 2011)
GATEWAY Cassette
pGWB5
LB
35S CaMV
HPT
Tnos
Tnos
SacI
NptII
HPT
GFP
GFP
attB2
Gen B11_573 bp
attB1
XbaI
35S CaMV
Tnos
NptII
Pnos
RB
pGWB5
HindIII
: gen tahan kanamisin
: gen tahan Higromisin
: reporter green fluorescence protein
11
Lampiran 2 Konstruk vektor ekspresi pBIN F = pBIN HB_500bp (Pambudi, 2012)
BamHlI
XbaI
SalI
pBD80
RB
Tnos
ClaI
PmeI
HindIII
AscI
Gen B11_500 bp
DraIII
35S CaMV
ApaI
PspOMI
Acc65I
KpnI
EcoRI
Gen nptII
Pnos
Tg7
LB
pBD80
(tahansi kanamisin)
Bsu36I
VspI
PacI
12
YANG MEMBAWA KANDIDAT GEN TOLERANSI ALUMINIUM
FAIZAL KURNIA SYAVITRI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
ABSTRAK
FAIZAL KURNIA SYAVITRI. Seleksi Tanaman Padi Transgenik Generasi T1 dan T2 yang
Membawa Kandidat Gen Toleransi Aluminium. Di bawah bimbingan MIFTAHUDIN dan TATIK
CHIKMAWATI.
Penggunaan varietas padi toleran aluminium (Al) merupakan salah satu pemecahan
masalah yang dihadapai oleh pertanian tanaman pangan di tanah masam. Pengembangan varietas
padi toleran Al dapat dilakukan melalui rekayasa genetika. Tanaman padi transgenik generasi T1
dan T2 telah diperoleh dari hasil transformasi gen B11, suatu kandidat gen toleransi Al ke tanaman
padi T309 akan tetapi sampai saat ini belum diketahui kebenaran tanaman transgenik tersebut.
Oleh karena itu penelitian ini bertujuan untuk melakukan seleksi dan verifikasi tanaman padi
transgenik generasi T1 dan T2 yang membawa kandidat gen toleransi Al. Hasil seleksi tanaman
padi transgenik generasi T1 dan T2 pada media seleksi antibiotik paromomisin diperoleh beberapa
nomor tanaman padi transgenik yang lolos seleksi. Penggunaan media seleksi paromomisin dapat
menyeleksi tanaman transgenik dari tanaman non transgenik tanpa menyebabkan efek albino
seperti yang terjadi pada seleksi menggunakan antibiotik kanamisin. Hasil analisis PCR
menggunakan primer dari gen nptII menunjukkan adanya pita DNA berukuran 600 pb pada
tanaman transgenik, tetapi tidak dihasilkan pita ukuran tersebut pada non transgeniknya. Karakter
tinggi tanaman dan jumlah anakan dari tanaman non transgenik dan tanaman transgenik tidak
berbeda secara nyata.
Kata kunci: Tanah masam, Toleran aluminium, Padi transgenik.
ABSTRACT
FAIZAL KURNIA SYAVITRI. The Selection of T1 and T2 Generation of Transgenic Rice
Carrying Aluminium Tolerant Gene Candidate. Supervised by MIFTAHUDIN and TATIK
CHIKMAWATI.
The use of aluminum (Al) tolerant rice variety is one of the alternative solutions to solve
the food crop production problem in acid soils. The Al tolerant rice variety can be developed by
genetic engineering. The T1 and T2 generation of transgenic rice has been developed from the
transformation of rice using B11 gene, which was an Al tolerance gene candidate. However the
true transgenic rice carrying the B11 gene has not been confirmed yet. This research was
conducted to select and verify the T1 and T2 transgenic rice which contained the Al tolerant gene
candidate. The result showed that the selection media containing paromomycin antibiotic could
select the putatif transgenic rice without albinism effect that appeared in selection using canamycin
antibiotic. The selection obtained true transgenic lines. The PCR analysis using the primers
developed from nptII gene showed a 600 bp DNA band in the transgenic plant, but it was none in
the wild type. The plant height and number of tiller characters were not significantly different
between the wild type and the transgenic plant.
Keyword: Acid soil, Aluminium tolerant, Transgenic rice
SELEKSI TANAMAN PADI TRANSGENIK GENERASI T1 DAN T2
YANG MEMBAWA KANDIDAT GEN TOLERANSI ALUMINIUM
FAIZAL KURNIA SYAVITRI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Judul Skripsi : Seleksi Tanaman Padi Transgenik Generasi T1 dan T2 yang
Membawa Kandidat Gen Toleransi Aluminium
Nama
: Faizal Kurnia Syavitri
NIM
: G34070067
Disetujui:
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Ir. Miftahudin, M.Si
NIP 19620419 198903 1 001
Dr. Ir. Tatik Chikmawati, M.Si
NIP 19640306 199002 2 001
Diketahui,
Ketua Departemen Biologi
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si.
NIP 19641002 198903 1 002
Tanggal lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya, sehingga
karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Penelitian dengan judul “Seleksi Tanaman Padi Transgenik
Generasi T1 dan T2 yang Membawa Kandidat Gen Toleransi Aluminium” dilakukan mulai
Februari 2011 sampai dengan Juli 2012 di Laboratorium Fisiologi Tumbuhan, Departemen
Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Miftahudin, M.Si. dan Dr. Ir. Tatik
Chikmawati, M.Si. atas bimbingan dan pengarahan yang diberikan. Penulis juga mengucapkan
terima kasih kepada Dr. Ir. Sulistijorini, M.Si sebagai penguji wakil komisi pendidikan.
Selanjutnya ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan untuk Bapak, Ibu, Zakkie, serta Liba
Silvia atas segala do’a, pengertian serta kasih sayang yang tercurah untuk penulis. Terima kasih
kepada Kak Pam, Kak Andik, Ibu Dasum, Pak Pieter, Pak Aka, Mbak Winda, Mas Kifli, Mbak
Jumi, Sasti, Ari, Ikra, Eka, Adhi, Alma, Irfan, Fibo dan seluruh staf Laboratorium Fisiologi
Tumbuhan Departemen Biologi, serta teman-teman yang selama ini ikut membantu terlaksananya
penelitian ini khususnya di Biologi angkatan 44.
Penulis berharap semoga karya tulis ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu
pengetahuan.
Bogor, September 2012
Faizal Kurnia S
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bojonegoro Jawa Timur pada tanggal 4 Mei 1989 dari pasangan Drs.
Syafi’i dan Dra. Tri Asih W. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara. Penulis lulus
dari SMP Negeri 1 Kalitidu pada tahun 2004, kemudian melanjutkan pendidikan di SMA Negeri 2
Bojonegoro dan lulus tahun 2007. Pada tahun yang sama, penulis diterima di Departemen Biologi
Institut Pertanian Bogor melalui jalur USMI (Undangan Seleksi Masuk IPB).
Penulis mempunyai pengalaman sebagai asisten praktikum pada mata kuliah Biologi Dasar,
Fisiologi Tumbuhan Dasar dan Sistematika Tumbuhan Berpembuluh pada tahun 2010-2012. Pada
tahun 20120, penulis melakukan Praktik Lapang di Balai Penelitian Tanaman Serat dan tembakau
dengan topik Toksisitas Gula Hasil Ekstrak Tembakau Terhadap Serangga Hama Penggerek Buah
Kapas Dan Werang Kapas. Pada tahun 2010 penulis juga pernah mengikuti lomba karya tulis
ilmiah di UIN Malang serta lomba inovasi teknologi di ITS Surabaya.
Selama kuliah penulis menjadi anggota organisasi mahasiswa daerah Bojonegoro
“Paguyuban Angling Dharma” (PAD) IPB. Pengalaman kepanitiaan penulis antara lain sebagai
panitia Grand Biodiversity tahun 2010, sebagai pengisi acara pada “Pesta sains 2009”, pengisi
acara “Temu Alumni 2009”. panitia masa perkenalan departemen mahasiswa baru MPD, dan
sebagai ketua pelaksana “Biodiversity III Biologi 44 tahun 2010”.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL...........................................................................................................................viii
DAFTAR GAMBAR ..................................................................................................................... viii
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................................................. viii
PENDAHULUAN ............................................................................................................................ 1
Latar Belakang .............................................................................................................................. 1
Tujuan ........................................................................................................................................... 1
BAHAN DAN METODE ................................................................................................................. 2
Waktu dan Tempat ........................................................................................................................ 2
Bahan dan Alat ............................................................................................................................. 2
Metode .......................................................................................................................................... 2
Seleksi Tanaman Padi Transgenik pada Media Seleksi Antibiotik. ......................................... 2
Penanaman di Rumah Kaca. ..................................................................................................... 2
Isolasi DNA. ............................................................................................................................. 2
Analisis PCR dan Visualisasi Hasil PCR. ................................................................................ 2
Analisis Data. ........................................................................................................................... 3
HASIL ............................................................................................................................................... 3
Seleksi Tanaman Padi Transgenik pada Media Seleksi Antibiotik. ............................................ 3
Pertumbuhan Tanaman Transgenik. ............................................................................................ 4
Analisis PCR dan Visualisasi Hasil PCR. ................................................................................... 5
PEMBAHASAN ............................................................................................................................... 5
SIMPULAN DAN SARAN .............................................................................................................. 7
Simpulan ....................................................................................................................................... 7
Saran ............................................................................................................................................. 8
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................................................... 8
LAMPIRAN .................................................................................................................................... 10
DAFTAR TABEL
Halaman
1
2
3
4
Hasil perkecambahan biji dengan antibiotik higromisin, kanamisin dan paromomisin
pada dua jenis media berbeda ………………………………………………………….......... 4
Segregasi tanaman transgenik generasi T1 dan T2 yang diseleksi dengan 100 mg/L
kanamisin ………………………............................................................................................. 4
Segregasi tanaman transgenik generasi T1 dan T2 yang diseleksi dengan 25 mg/L
paromomisin ……………………............................................................................................. 5
Segregasi tanaman transgenik generasi T1 dan T2 yang diseleksi dengan antibiotik
5
kanamisin dan paromomisin....................................................................................................... 5
Karakter pertumbuhan tanaman non transgenik dan tanaman transgenik ………...…….......... 6
3
3
5
3
3
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
2
3
4
Perkecambahan pada media antibiotik kanamisin ………………………………………......... 3
Perkecambahan biji pada media seleksi antibiotik paromomisin.............................................. 4
Perbedaan pertumbuhan kecambah padi pada dua jenis antibiotik ………………………....... 5
Hasil amplifikasi DNA generasi T1 dengan menggunakan primer nptII …………………..... 6
3
3
3
3
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Konstruk pGWB5…………………………………………………………………..….......... 11
2 Konstruk pBIN11………………………………………………………………….....…....... 12
3 Komposisi media MS………………………………………………………………….......... 13
3
3
3
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tanaman padi (Oryza sativa L.) termasuk
tanaman pangan penting di Indonesia.
Produksi padi di Indonesia masih tergolong
rendah sebesar 67,31 ton gabah kering giling
(GKG) per hektar, atau jauh di bawah ratarata produksi negara lain seperti negara
Australia (BPS 2011). Salah satu upaya dapat
dilakukan untuk meningkatkan produksi padi
adalah dengan memanfaatkan lahan kering
yang tersedia cukup luas di luar Pulau Jawa.
Di Indonesia terdapat sekitar 47,6 juta hektar
(32,4%) lahan kering yang umumnya
didominasi oleh tanah masam podsolik merah
kuning (Karama & Abdurrachman 1993).
Usaha pertanian di tanah masam akan
mengalami banyak kendala, diantaranya
kelarutan aluminium (Al) yang tinggi
(Kochian et al. 1995) yang dapat menghambat
pertumbuhan akar. Ismunadji & Partohardjono
(1985) juga mengatakan akar akan menjadi
pendek dan tebal, percabangan tidak normal,
dan tudung akar rusak. Hal tersebut berakibat
akar padi tidak mampu menyerap air dan
nutrisi dengan baik.
Penggunaan varietas padi toleran terhadap
cekaman Al menjadi salah satu alternatif
pemecahan masalah pertanian pada tanah
masam. Perakitan tanaman padi toleran
cekaman Al dapat ditempuh melalui
persilangan
secara
konvensional,
memanfaatkan
keragaman
somaklonal,
induksi mutasi maupun rekayasa genetik
(Purwoko et al. 2000). Dalam rangka
mengembangkan galur padi toleran Al,
Miftahudin et al. (2010) telah melakukan
transformasi kandidat gen toleransi Al pada
padi varietas T309. Saat ini telah diperoleh
generasi T1 dan T2 (Miftahudin et al. 2010).
Karakterisasi tanaman T1 dan T2 perlu
dilakukan untuk memastikan bahwa tanaman
tersebut adalah tanaman transgenik yang
membawa gen toleran Al yang diinginkan.
Diharapkan tanaman transgenik yang telah
terbentuk
dapat
digunakan
untuk
mengembangkan galur padi toleran Al yang
adaptif terhadap tanah masam.
Dalam proses transformasi telah disisipkan
gen-gen yang memiliki ketahanan terhadap
antibiotik sebagai marka penyeleksi yaitu gen
yang umum digunakan adalah neomicin
fosfotransferase II (nptII) dan higromisin
fosfotransferase (hpt). Gen nptII digunakan
untuk
ketahanan
terhadap
antibiotik
kanamisin dan paromomisin. Pemakaian
antibiotik kanamisin atau paromomisin
sebagai agen penyeleksi pada proses seleksi
tanaman hasil transformasi didasarkan pada
asumsi bahwa gen penyandi ketahanan
terhadap
antibiotik
kanamisin
atau
paromomisin tersebut telah terintegrasi ke
dalam kromosom tanaman trnasgenik.
Kanamisin dan paromomisin merupakan
antibiotik aminoglikosida yang berasal dari
sumber yang berbeda. Kanamisin diproduksi
oleh Streptomyces kanamyceticus dan
paromomisisn diproduksi oleh Streptomyces
rimosus, sedangkan gen hpt merupakan gen
penyandi antibiotik higromisin. Higromisin
umumnya
lebih
toksik
dibandingkan
kanamisin.
Higromisin
mempunyai
kemampuan membunuh sel-sel peka lebih
cepat dan penyeleksi yang lebih disukai untuk
transformasi pada tanaman monokotiledon
terutama graminae (Bashir et al. 2004).
Higromisin
merupakan
antibiotik
aminoglikosida
yang
diproduksi
oleh
Streptomyces hygroscopicus dan merupakan
sistem marker penyeleksi yang sesuai untuk
sistem tanaman dan hewan. Antibiotik ini
menghambat sintesis protein dengan cara
menggangu translokasi dan menyebabkan
kesalahan translasi pada ribosom 80S (Bashir
et al. 2004).
Seleksi tanaman transgenik dilakukan
dengan menumbuhkan sel, jaringan atau
organ, seperti biji, pada media yang
mengandung antibiotik. Sel, jaringan atau
organ yang hidup atau lolos dari seleksi akan
merupakan
tanaman
yang
berpotensi
membawa gen yang ditransformasikan. Selain
dengan cara seleksi antiobiotik, seleksi
tanaman transgenik juga dapat dilakukan
dengan menggunakan teknik polymerase
chain reaction (PCR) menggunakan primer
yang didesain dari sekuen gen yang
ditransformasikan atau dari sekuen gen
antibiotik yang diintegrasikan bersama-sama
dengan gen interes tersebut (Amirhusin 2004).
Pada penelitian ini telah dilakukan seleksi
dan verifikasi tanaman transgenik generasi T1
dan T2 dengan menggunakan metode seleksi
antibiotik dan PCR.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan
seleksi dan verifikasi tanaman padi transgenik
generasi T1 dan T2 yang membawa kandidat
gen toleransi aluminium.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan
Februari 2011 sampai Juli 2012 di
Laboratorium
Fisiologi
Tumbuhan,
Departemen Biologi, Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB, Bogor.
Bahan
Bahan tanaman yang digunakan adalah biji
padi transgenik generasi T1 no 3.1; 4.1 dan
K4 yang telah ditransformasi dengan kandidat
gen toleransi Al yang dikonstruksi pada
plasmid pGWB5-B11 (Lampiran 1) dan biji
padi transgenik generasi T2 no. 39 dan 44
yang telah ditransfomrasi dengan kandidat gen
toleran Al yang dikonstruksi pada plasmid
pBIN-11 (Lampiran 2) dan biji tanaman non
transgenik.
Metode
Seleksi Tanaman Padi Transgenik pada
Media Seleksi Antibiotik.
Biji tanaman padi transgenik generasi T1
dan T2 diseleksi pada media seleksi antibiotik
secara aseptik pada media padat dan cair. Biji
disterilisasi dengan merendamnya dalam
larutan Bayclean (20% v/v) ditambah 2 tetes
Tween-80 selama 20 menit, kemudian
dilanjutkan dengan pembilasan dengan air
steril sebanyak 3 kali (Zainati 2010).
Selanjutnya biji ditanam pada media padat
Murashige and Skoog (Lampiran 3) ditambah
25-100 mg/L Kanamisin atau 20 mg/L
Higromisin selama 6 hari. Pada seleksi
menggunakan media cair percobaan dilakukan
dengan merendam biji padi dalam 20 ml
akuades steril ditambah 25mg/L Paromomisin
selama 6 hari. Kemudian biji diinkubasi pada
suhu ruang dengan kondisi pencahayaan 16
jam terang dan 8 jam gelap. Kemampuan
kecambah padi yang tahan terhadap antibiotik
diamati pada hari ke-6. Biji dari tanaman non
transgenik disertakan sebagai pembanding
dalam seleksi. Jumlah biji yang berkecambah
dan tumbuh normal serta biji yang tidak
berkecambah dihitung dan digunakan sebagai
kriteria keberhasilan integrasi kandidat gen
toleransi Al ke dalam tanaman transgenik
generasi T1dan T2.
Penanaman di Rumah Kaca
Sebanyak 31 kecambah tanaman T1 dan
T2 yang tahan antibiotik kemudian ditanam di
rumah kaca pada pot yang berisi media
tanah:kompos dengan perbandingan 3:1 (b/b).
Tanaman dipelihara dengan mengikuti praktek
pemeliharaan padi sawah. Pengamatan
karakter pertumbuhan dilakukan sejak
tanaman berumur 21 hari sampai minggu ke8. Peubah yang diamati meliputi tinggi
tanaman dan jumlah anakan.
Isolasi DNA
Isolasi DNA dilakukan dengan teknik
isolasi cepat (Miftahudin et al. 2004). Daun
padi muda dan segar berumur 4 minggu
digerus dalam N2-cair. Kemudian ditambah
buffer lisis ( SDS 2%, glisin 0.1M, NaCl
0.05M EDTA pH 8 0.01M) dan disentrifugasi
dengan kecepatan 13000 rpm selama 10
menit. Supernatan dipipet, ditambah PCIAA
(Phenol, Chloroform dan Iso Amyl Alchohol),
dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000
rpm selama 10 menit. Selanjutnya supernatan
dipipet, ditambah CIAA (Chloroform dan Iso
Amyl Alchohol), dan disentrifugasi dengan
kecepatan 13000 rpm selama 10 menit. Lalu
supernatan dipipet kembali dan ditambah
isopropanol, kemudian disentrifugasi dengan
kecepatan 15000 rpm selama 5 menit. Pelet
DNA dibilas dengan Etanol 70% dan
sentrifugasi kemudian dikeringanginkan.
Kuantitas
DNA diukur
menggunakan
spektrofotometer UV, sedangkan kualitas
DNA diamati dengan menggunakan teknik
elektroforesis pada 1% gel agarose dalam 1x
buffer TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8.0),
dengan tegangan 65 volt selama 30 menit.
Larutan DNA yang telah diperoleh disimpan
pada suhu -20 oC sampai saatnya digunakan
untuk analisis.
Analisis PCR dan Visualisasi Hasil PCR
Analisis PCR dilakukan untuk mengetahui
keberadaan sisipan gen toleran Al yang telah
diintroduksikan pada tanaman transgenik.
Keberadaan sisipan gen tersebut diidentifikasi
secara tidak langsung melalui keberadaan gen
nptII yang menyandikan ketahanan terhadap
kanamisin atau paromomisin. Primer-primer
forward
(5’-GAA-CAA-GAT-GGA-TTGCAC-GC-3’), reverse (5’-GAA-GAA-CTCGTC-AAG-AAG-GC-3’) dari gen nptII
digunakan untuk mengamplifikasi DNA
tanaman T1 dan T2. Reaksi PCR terdiri dari
100 ng DNA padi, 1x penyangga PCR, 0.2
mM masing-masing dNTPs, 0.4 μM masingmasing primer, 1 Unit Taq DNA Polymerase
dan dH2O sampai volume akhir reaksi 20 μl.
Program PCR yang digunakan adalah 94°C
selama 5 menit (pra-denaturasi), kemudian
dilanjutkan dengan 94°C selama 30 detik
(denaturasi), 56°C selama 30 detik
(penempelan primer), dan 72°C selama 1,5
menit (pemanjangan) yang diulang sebanyak
35 siklus dan diakhiri dengan 72°C selama 10
menit. Hasil PCR dielektroforesis pada 1% gel
agarose dalam 1x buffer TBE dengan
tegangan 70 volt selama 45 menit. Pita DNA
kemudian diwarnai dengan pewarna ethidium
bromide 5 μg/ml dan diamati di atas UV
transluminator.
Analisis Data
Data segregasi biji transgenik dianalisis
menggunakan uji khi-kuadrat pada taraf uji
α=5%
HASIL
Seleksi Tanaman Padi Transgenik pada
Media Seleksi Antibiotik.
Pada tahap seleksi dengan antibiotik
higromisin dengan menggunakan media padat
(media agar) dan cair, semua tanaman
transgenik dan tanaman non transgenik yang
ditumbuhkan pada media seleksi dengan
konsentrasi 20 mg/L, tidak mampu
berkecambah sampai hari ke 6.
Seleksi berikutnya dilakukan pada media
antibiotik kanamisin dengan menggunakan
media padat dan cair dengan beberapa
konsentrasi dimulai dari konsentrasi 25, 50,
dan 100 mg/L. Media seleksi kanamisin
dengan konsentrasi 25 mg/L dan 50 mg/L,
tidak mamu menyeleksi tanaman putatif
transgenik. Baik transgenik dan non
transgenik mampu berkecambah pada media
kanamisin dengan konsentrasi tersebut.
Peningkatan konsentrasi terus dilakukan
hingga konsentrasi 100 mg/L. Pada tingkat
konsentrasi 100 mg/L dari 364 benih padi
yang terdiri dari 115 tanaman nontransgenik
dan 249 tanaman transgenik terseleksi, namun
terjadi gejala albinisma, sehingga hasil seleksi
tidak dapat digunakan untuk analisis
selanjutnya. Hasil seleksi dengan antibiotik
kanamisin konsentrasi 100 mg/L disajikan
pada Tabel 1 dan 2.
Pada seleksi dengan antibiotik kanamisin
konsentrasi 100 mg/L, tanaman non
transgenik tidak menghasilkan akar (Gambar
1A),
sedangkan
tanaman
transgenik
menghasilkan kecambah normal tetapi
menunjukkan gejala albinisma (Gambar 1B).
Untuk menghindari albinisma pada hasil
seleksi antibiotik, digunakan antibiotik
alternatif yang memiliki fungsi yang sama
dengan kanamisin, yaitu paromomisin.
Tanaman putatif transgenik kemudian
diseleksi dengan antibiotik paromomisin
dengan konsentrasi 25 mg/L. Seleksi dengan
antibiotik paromomisin dilakukan dengan
media cair. Pada teknik ini selain
pertumbuhan kecambah lebih cepat, juga tidak
membutuhkan teknik aseptik. Hasil percobaan
pada media paromomisin menunjukkan bahwa
tanaman putatif transgenik dapat terseleksi
dengan baik. Hanya tanaman yang membawa
gen nptII yang tahan terhadap media seleksi
dan tumbuh normal (Tabel 1).
Sebanyak 74 benih padi yang terdiri dari
16 tanaman non transgenik dan 58 tanaman
transgenik diseleksi pada media cair dengan
menggunakan antibiotik paromomisin dengan
konsentrasi 25 mg/L. Hasil seleksi dengan
antibiotik paromomisin disajikan pada
Gambar 2 dan Tabel 3.
A
B
Gambar 1 Perkecambahan pada media antibiotik kanamisin: A. tanaman non transgenik hanya
muncul tunas, tetapi tidak berakar; B. tanaman transgenik menunjukkan kecambah
yang normal. Garis skala =1,5 cm untuk A dan 1 cm untuk B
4
Tabel 1 Hasil perkecambahan biji dengan antibiotik higromisin, kanamisin dan paromomisin pada
dua jenis media berbeda
Media
Higromisin
Antibiotik
Kanamisin
Paromomisin
Media padat
Tidak tumbuh
Tumbuh, albino
-
Media cair
Tidak tumbuh
Tumbuh, albino
Tumbuh, normal
Tabel 2 Segregasi tanaman transgenik generasi T1 dan T2 yang diseleksi dengan
100 mg/L Kanamisin
Non transgenik
∑ biji yang di
uji
115
∑ biji yang
tahan
0
T1-K4
99
84
15
T1-3.1
59
45
14
T1-4.1
55
41
18
T2-39
18
14
4
T2-44
18
14
4
No tanaman
A
∑ biji yang peka
115
B
Gambar 2 Perkecambahan biiji pada media seleksi antibiotik paromomisin: A. Non transgenik
tidak berkecambah B. Tanaman transgenik T1 berkecambah normal.
Biji tanaman non transgenik yang
dikecambahkan pada media yag diberi
perlakuan antibiotik paromomisin tidak
mampu berkecambah, sedangkan biji tanaman
transgenik generasi T1 dan T2 berkecambah
(Gambar 2). Pada Gambar 3 terlihat
perbedaan perkecambahan tanaman transgenik
dengan menggunakan antibiotik paromomisin
(Gambar 3A) dan kanamisin (Gambar 3B).
Pada media paromomisin hasil seleksi
menunjukkan perkecambahan normal dengan
tunas yang berwarna hijau, sedangkan pada
media kanamisin terjadi gejala albinisma pada
kecambah.
Hasil uji khi-kuadrat pada Tabel 4
menunjukkan bahwa tanaman T1 nomor 3.1
dan T2 nomor 39 menunjukkan segregasi
model pewarisan gen tunggal dengan rasio
kecambah tahan antibiotik terhadap peka
antibiotik 3:1 (nilai χ2 hitung lebih kecil dari
χ2 tabel).
Pertumbuhan Tanaman Transgenik.
Pertumbuhan tanaman transgenik di rumah
kaca tidak jauh berbeda dengan tanaman non
transgenik (Tabel 5). Data sampai minggu ke8 menunjukkan sebagian besar tanaman
transgenik memiliki tinggi tanaman yang tidak
jauh berbeda dari tanaman non transgenik,
meskipun sebagian besar tanaman ransgenik
lebih pendek dari tanaman non transgenik.
Selain itu, jumlah anakan tanaman transgenik
juga relatif sama dengan tipe non transgenik,
bahkan ada beberapa tanaman transgenik yang
memiliki jumlah anakan yang lebih banyak.
Tabel 3 Segregasi tanaman transgenik generasi T1 dan T2 yang diseleksi dengan
25 mg/L Paromomisin
No tanaman
∑ biji yang di
uji
∑ biji yang tahan
∑ biji yang peka
Non transgenik
T1-K4
T1-3.1
T1-4.1
T2-39
T2-44
16
16
5
5
16
16
0
10
4
2
10
5
16
6
1
3
6
11
Tabel 4 Segregasi tanaman transgenik generasi T1 dan T2 yang diseleksi dengan antibiotik
kanamisin dan paromomisin
∑ biji yang
∑ biji yang tahan
di uji
Non transgenik
131
0
T1-K4
115
94
T1-3.1
64
49
T1-4.1
60
43
T2-39
34
24
T2-44
34
19
Keterangan : χ 2 tabel(db) ; α= 5% ; χ2 (3) = 3.81
No tanaman
∑ biji yang peka
Chi-test (3:1)
131
21
15
21
10
15
393
6.41
0.11
4.21
1.96
16.96
A
B
Gambar 3 Perbedaan pertumbuhan kecambah padi pada dua jenis antibiotik. A Kecambah normal
pada media antibiotik paramomisin, B Kecambah albino pada media antibiotik
kanamisin. Garis skala =0,5 cm untuk A dan 1 cm untuk B
Analisis PCR dan Visualisasi Hasil PCR.
Hasil PCR padi transgenik generasi T1
dengan primer spesifik gen nptII disajikan
pada Gambar 4. Visualisasi dengan
elektroforesis menunjukkan pita DNA
tanaman transgenik memiliki posisi migrasi
sama atau sejajar dengan pita hasil PCR
plasmid rekombinan (kontrol positif). Pita
tersebut merupakan hasil amplifikasi gen nptII
dengan ukuran sesuai dengan yang
diharapkan, yaitu 600 pb. Dengan demikian
hasil tersebut menunjukkan bahwa gen nptII
telah berhasil disisipkan ke dalam kromosom
tanaman transgenik. Diharapkan gen toleransi
Al juga telah tersisipkan pada kromosom
tanaman tersebut.
PEMBAHASAN
Miftahudin et al (2010) telah melakukan
transformasi gen B11 (kandidat gen toleransi
Al) dengan metode biolistik (Particle
Bombardment) dan infeksi Agrobacterium
tumefaciens ke tanaman padi. Saat ini telah
mendapatkan generasi T1 dan T2 yang dalam
penelitian ini diseleksi dan diverifikasi
kebenaran tanaman transgenik tersebut.
Dengan
menggunakan
media
seleksi
antibiotik. Efektivitas penggunaan antibiotik
sebagai agen seleksi bergantung pada jenis
dan konsentrasi antibiotik serta tingkat
ketahanan tanaman yang diseleksi. Oleh
karena itu pada penelitian ini dilakukan
optimasi seleksi dengan beberapa jenis
antibiotik dan konsentrasinya
6
Tabel 5 Karakter pertumbuhan tanaman non transgenik dan tanaman transgenik
No tanaman
Tinggi tanaman
∑ anakan
Non transgenik
T1-K4
T1-3.1
T1-4.1
T2-39
T2-44
133
135
127
129
115
120
3
4
4
4
3
3
A
B
C
D
E
F
G
600bp
Gambar 4 Hasil amplifikasi DNA generasi T1 dengan menggunakan primer nptII : A. Kontrol
negatif; B. Tanaman non transgenik; C. Tanaman transgenik no T1- 3.1; D. T1-4.1; E.
T1-K4; F. Plasmid Pembawa Konstruk Gen; G. Penanda DNA 100 pb.
Dalam seleksi menggunakan antibiotik
higromisin hasil menunjukkan tidak adanya
tanaman yang mampu berkecambah baik
menggunakan media padat (agar) maupun
media cair. Ada beberapa hal yang
menyebabkan tidak terjadinya perkecambahan
biji pada media higromisin. Pertama, bisa
terjadi karena gen hpt, yaitu gen yang
menyandikan antibiotik higromisin tidak
masuk ke dalam tanaman pada saat proses
transformasi sehingga tidak ada gen yang
menyandikan
antibiotik
pada
saat
perkecambahan pada media seleksi. Dalam
proses transformasi ada tiga komponen
penting yang terlibat. Pertama adalah gen
virulen kromosom, yang terdapat pada
kromosom Agrobacterium dan berfungsi
dalam pelekatan bakteri dengan sel tanaman.
Kedua, gen virulen (vir) yang terdapat dalam
plasmid Ti dan menpunyai fungsi untuk
menginduksi
dan
integrasi
T-DNA.
Komponen ketiga adalah daerah T-DNA.
Daerah T-DNA, dibatasi oleh LB (left border)
dan RB (right border) yang mengandung gen
penting
bagi
Agrobacterium.
Proses
transformasi dimulai dengan melekatnya
Agrobacterium pada sel tanaman. Kemudian
gen-gen terinduksi pada daerah vir oleh suatu
signal yang spesifik di dalam sel bakteri
sehingga dihasilkan produk dari ekspresi gengen virulen untuk memproses T-DNA dan
mentransfernya dari dalam sel bakteri. Proses
dan transfer T-DNA dimediasi oleh berbagai
protein yang dikode oleh gen virulen.
Pembentukan T-kompleks berfungsi untuk
menjaga T-DNA dalam perjalanannya menuju
inti sel tanaman inang (Rahmawati 2006).
Kemungkinan hal yang dapat menyebabkan
kesalahan dalam proses transformasi adalah
pada daerah T-DNA yang dibatasi oleh LB
dan RB (daerah yang membawa gen) yang
tidak dapat masuk dalam tanaman sel inang.
Kedua, tanaman transgenik tidak tumbuh
pada media seleksi higromisin bisa
dikarenakan konsentrasi higromisin yang
terlalu tinggi. Faktor ketiga adalah adanya
pembungkaman gen. Pembungkaman gen
merupakan proses transkripsi sehingga
tanaman tidak mampu berkambah. Menurut
Rashid et al. (1996), pembungkaman gen
adalah
salah
satu
fenomena
yang
menyebabkan terjadinya kegagalan dalam
mengekspresikan gen. Namun hingga saat ini,
mekanisme yang menyebabkan terjadinya
ketidakstabilan integrasi dan ekspresi gen
masih belum dimengerti.
Pendapat lain juga menyatakan bahwa
tanaman transgenik yang tidak mampu
mengekspresikan ketahanan higromisin atau
terseleksi dalam media higromisin padahal
tanaman tersebut tidak membawa gen
penyandi hpt akan menunjukkan gejala
nekrotik, serupa dengan tanaman non
transgenik. Pada kasus yang demikian diduga
telah terjadi mekanisme pembungkaman gen
hpt. (Mulyaningsih et al. 2010). Mekanisme
pembungkaman
gen
dalam
proses
transformasi genetik dapat terjadi pada
berbagai proses. Pembungkaman gen dapat
terjadi pada fase transkripsi dan pasca
transkripsi. Pembungkaman pada tahap
transkripsi diidentifikasi oleh ketiadaan
transkrip dari gen tersebut. Sedangkan
pembungkaman gen pada pasca transkripsi
terjadi karena gen tersebut mengandung
sekuen yang homolog (Lucy et al.2000).
Berbeda dengan hasil dari Roslim (2009)
yang melakukan transformasi
plasmid
pGWB5-B11 ke tanaman tembakau tidak
menunjukkan adanya gejala albinisma pada
tanaman yang terseleksi. Pada tanaman padi
seleksi kanamisin dengan konsentrasi 100
mg/L memberikan gejala albinisma. Diduga
warna putih pada kecambah yang terseleksi
antibiotik
kanamisin
disebabkan
oleh
penghambatan
antibiotik
terhadap
metabolisme sel tumbuhan. Penghambatan
proses
metabolisme
oleh
antibiotik
disebabkan oleh pengikatan ribosom 30S yang
menyebabkan terjadinya kesalahan translasi
mRNA. Pada tumbuhan, ribosom 30S berada
pada organel kloroplas dan mitokondria. Pada
kloroplas pengikatan antibiotik
pada
ribososm 30S menyebabkan rusaknya klorofil
dan menghambat pembentukan asam amino
(Braun & Bennett 2001).
Beberapa faktor yang dapat mempengaruhi
kemampuan atau efektifitas bahan kimia yang
digunakan untuk seleksi tanaman adalah
bahan-bahan penyeleksi tersebut bersifat
toksik untuk sel tanaman, sehingga mungkin
hal inilah yang menyebabkan albinisma. Jadi
toksin yang paling efektif adalah toksin yang
menghambat
pertumbuhan
sel-sel
nontransforman
secara
berlahan-lahan.
Tekanan seleksi akan optimal apabila
menggunakan konsentrasi toksin yang paling
rendah yang mampu membunuh jaringan
nontransforman. Akan tetapi pada penelitian
ini, seleksi padi transgenik dengan konsentrasi
kanamisin yang rendah tidak mampu menekan
perkecambahan biji padi nontransgenik
(Mulyaningsih et al. (2010).
Daboussi et al. (1989) menyebutkan gen
tahansi antibiotik umumnya mengkode suatu
enzim yang dapat menginaktifkan suatu
antibiotik, sehingga tanaman transgenik yang
membawa gen tersebut menjadi tahan
terhadap antibiotik. Oleh karena itu, salah satu
ciri keberhasilan sisispan gen gen asing yang
umumnya dikombinasikan dengan gen
antibiotik sebagai alat seleksi pada tanaman
adalah apabila planlet atau biji hasil
transformasi menunjukkan tahansi terhadap
antibiotik.
Dalam penelitian ini ditunjukkan bahwa
antibiotik kanamisin tidak sesuai untuk seleksi
padi transgenik. Hail ini juga sesuai yang
dikatakan oleh Jefferson (1999) bahwa
antibiotik kanamisin tidak efektif sebagai
penanda untuk seleksi tanaman kacangkacangan dan famili Gramineae, seperti padi.
Seleksi dengan antibiotik paromomisin lebih
baik dalam menyeleksi tanaman transgenik.
Hal ini sesuai dengan Riva et al. (2006) yang
mengatakan bahwa hanya sel yang memiliki
kontruksi plasmid gen penyandi antibiotik
yang dapat tumbuh, sedangkan
sel
nontransforman yang tidak memiliki kontruksi
plasmid-gen penyandi antibiotik tidak dapat
tumbuh.
Hasil
uji
khi-kuadrat
(Tabel
4)
menunjukkan bahwa semua nomor tidak
bersegregasi pewarisan gen tunggal, kecuali
nomor T1-3.1 dan T2-39 yang bersegregasi
dengan perbandingan 3:1 untuk sifat tahan
dan peka terhadap antibiotik. Hal ini
mengindikasikan bahwa penyisisipan gen
nptII hanya terjadi satu copy gen dalam satu
tempat kromosom padi. Diharapkan nomor
T1-3.1 dan T2-39 tersebut juga hanya
membawa satu copy gen B11 dan dapat
digunakan untuk analisis selanjutnya sehingga
bisa dikembangkan menjadi galur padi
transgenik yang toleran Al
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Jenis antibiotik yang tepat pada media
seleksi tanaman padi transgenik generasi T1
dan T2 adalah antibiotik paromomisin. Seleksi
dengan
antibiotik paromomisin dengan
konsentrasi 25 mg/L menunjukkan hasil yang
lebih baik daripada seleksi dengan higromisin
dan kanamisin. Kandidat tanaman transgenik
yang diseleksi menunjukkan bahwa beberapa
merupakan tanaman transgenik, sedangkan
yang lainnya
bukan transgenik. Tanaman transgenik
generasi T1 nomor 3.1 membawa satu copy
gen nptII, dan diharapkan juga membawa satu
copy gen B11.
Lucy AP, Guo H, Li W, Ding SW. 2000.
Suppresion of post transcriptional gen
silencing by a plan viral protein localized
in nucleus. EMBO J 19:1672-1680
Saran
Miftahudin, Scoles GJ, Gustafson JP. 2004.
Development of PCR-based codominant
markers flanking the Alt3 gene in rye.
Genome 47:231-238.Roslim DI. 2009.
Isolasi dan karakterisasi kandidat gen
toleran aluminium pada padi. Makalah
Seminar Sekolah Pascasarjana. Institut
Pertanian Bogor.
Perlu dilakukan verifikasi sisipan gen pada
tanaman transgenik dengan menggunakan
kombinasi primer dari promotor 35S dan
primer dari toleran aluminium yang
dintroduksikan ke genom tanaman padi.
DAFTAR PUSTAKA
Amirhusin B. 2004. Perakitan Tanaman
Transgenik Tahan Hama. J Lit Per 23:1-7
Bashir K, Rafiq M, Fatima T, Husnain T, and
Riazuddin. 2004. Hygromycin based
selection of transformants in a local inbred
line of Zea mays (L). Pakistan J Biol Sci
7:318-323.
Braun R, Bennett DJ. 2001. Antibiotic tahance
in genetically modified (GM) crops. EFB
Task Group Pub Prec Biotec 10:1-4.
[BPS] Badan Pusat Statistik. Produksi Padi
Indonesia. 2011. Jakarta: Badan
pusat
statistika.
Daboussi MJ, Djeballi A, Gerlinger C,
Blaiseau PL,
Bouvier
I.
1989.
Transformation of seven species of
filamentous fungi using the nitrate
reductase gene of Aspergillus nidulans.
Curr Genet 15: 453-456.
Ismunadji M, Partohardjono S. 1985. Program
hasil penelitian pengapuran tanah masam
untuk peningkatan produksi tanaman
pangan. Balittan. Puslitbangtan.
Jefferson RA. 1999. Method for selecting
transformed cells. Australia: Patentlens
Kochian LV. 1995. Cellular mechanisms of
aluminum toxicity and resistance in plants.
Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 46:
237-260.
Karama AS dan Abdurachman A. 1993.
Optimasi pemanfaatan sumberdaya lahan
berwawasan
lingkungan.
Prosiding
Simposium Penelitian Tanaman Pangan.
III.
Puslitbangtan.
Badan
Litbang
pertanian, Departemen Pertanian. Bogor
23-25 Agustus. Hlm. 98-112
Miftahudin, Chikmawati T, dan Pardal SJ.
2010. Pengembangan galur padi toleran
aluminium melalui rekayasa genetika.
Laporan Penelitian Riset Insentif Terapan.
LPPM. IPB.
Mulyaningsih ES, Aswidinnoor H, Sopandie
D, Pieter BF Ouwerkerk dan Loedin IHS.
2010. Pewarisan gen hpt (Hygromycine
phosphotransferase) berdasarkan analisis
PCR dan ekspresinya pada populasi padi
transforman mengoverekpresikan gen HD
ZIP OSHOX-6. Berita Biologi 10: 59-66
Purwoko BS, Hanarida I, Dewi IS, and
Santosa E. 2000. Penggunaan poliamin
untuk meningkatkan regenerasi tanaman
hijau pada kultur antera padi dan
aplikasinya dalam program pemuliaan
padi. Laporan Hibah Bersaing VIII/I.
Depdiknas 23p.
Rahmawati H. 2006. Status Perkembangan
Perbaikan
Sifat
Genetik
Padi
Menggunakan
Transformasi
Agrobacterium. Jurnal Agro Biogen 2:3644.
Rashid H, Yokoi S, Toriyama K, and Hinata
K. 1996. Transgenic plant production
mediated by Agrobacterium in Indica rice.
Plant Cell 15:727-730.
Riva GA, Cabrera JG, Padron RV, and Pardo
CA. 2006. The Agrobacterium tumefasiens
gene Transfer to Plant Cell. [terhubung
berkala] www.ejbiotechnology.info, [26
Juni 2012].
Roslim DI. 2009. Isolasi dan karakterisasi
kandidat gen toleran aluminium pada padi.
Makalah Seminar Sekolah Pascasarjana.
Institut Pertanian Bogor.
9
Roslim DI. 2011. Isolasi dan karakterisasi gen
toleran aluminium dari tanaman padi
[disertasi]. Bogor: Sekolah Pascasarjana.
Insitut Pertanian Bogor.
Zainati F. 2010. Induksi Embriogenesis
somatik pada padi varietas IR64 dan Situ
Bagendit. [skripsi]. Bogor: Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam. Insitut Pertanian Bogor.
LAMPIRAN
13
Lampiran 3 Komposisi larutan MS (Murashige & Skoog) dan vitamin B5
Komposisi larutan MS
Kode
Senyawa
A
B
C
D
E
F
NH4NO3
KNO3
CaCl2.2H2O
H3BO3
KH2PO4
CoCl2.6H2O
Na2MoO4.2H2O
KI
MgSO4.7H2O
MnSO4.4H2O
ZnSO4.7H2O
CuSO4.5H2O
Na-EDTA
FeSO4.7H2O
Komposisi vitamin B5
Komponen
Myo-inositol
Thiamine-HCl
Nicotinic acid
Pyridoxine-HCl
Konsentrasi stok(mg/L)
82500
95000
88000
1240
34000
5.2
50
166
74000
3010.8
1720
5.2
74.4
5.56
Konsentrasi stok (mg/L)
10000
1000
100
100
Final konsentrasi(mg/L)
1650
1900
440
6.2
170
0.026
0.25
0.83
370
22.3
8.6
0.025
37.2
27.8
Final konsentrasi (mg/L)
100
10
1
1`
Lampiran 1 Konstruk vektor pGWB5-B11_573bp (Roslim, 2011)
GATEWAY Cassette
pGWB5
LB
35S CaMV
HPT
Tnos
Tnos
SacI
NptII
HPT
GFP
GFP
attB2
Gen B11_573 bp
attB1
XbaI
35S CaMV
Tnos
NptII
Pnos
RB
pGWB5
HindIII
: gen tahan kanamisin
: gen tahan Higromisin
: reporter green fluorescence protein
11
Lampiran 2 Konstruk vektor ekspresi pBIN F = pBIN HB_500bp (Pambudi, 2012)
BamHlI
XbaI
SalI
pBD80
RB
Tnos
ClaI
PmeI
HindIII
AscI
Gen B11_500 bp
DraIII
35S CaMV
ApaI
PspOMI
Acc65I
KpnI
EcoRI
Gen nptII
Pnos
Tg7
LB
pBD80
(tahansi kanamisin)
Bsu36I
VspI
PacI
12