Ekspresi Gen Sintetik Penyandi Parasporin-2 yang Diklon pada Plasmid pJExpress dalam Sel Inang Escherichia coli Top 10 F.
EKSPRESI GEN SINTETIK PENYANDI PARASPORIN-2
YANG DIKLON PADA PLASMID pJExpress DALAM
SEL INANG Escherichia coli Top 10 F
FITRI HANDAYANI
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
ABSTRAK
FITRI HANDAYANI. Ekspresi Gen Sintetik Penyandi Parasporin-2 yang Diklon
pada Plasmid pJExpress dalam Sel Inang Escherichia coli Top 10 F. Dibimbing
oleh EDY DJAUHARI P dan EDDY JUSUF.
Protein parasporin secara alami adalah protein kristal yang dihasilkan oleh
galur-galur tertentu Bacillus thuringiensis. Parasporin-2 merupakan salah satu
jenis protein parasporin yang memiliki kemampuan membunuh sel kanker
tertinggi dibandingkan jenis parasporin lainnya. Akan tetapi, penggunaan galur
alami untuk menghasilkan parasporin-2 ini membutuhkan waktu yang lama dan
biaya operasional yang cukup mahal. Sehingga, gen sintetik penyandi parasporin2 terpotong disintesis, kemudian diklon pada plasmid pJExpress dalam sel inang
Escherichia coli 10 F. Penelitian ini bertujuan mendapatkan kondisi optimum
terekspresinya gen sintetik penyandi parasporin-2 terpotong yang diklon pada
plasmid pJExpress dalam sel inang Escherichia coli Top 10 F. Tingkat ekspresi
protein rekombinan pJExpress dilakukan dengan membandingkan optimasi
ekspresi protein yang dihasilkan pada induksi IPTG 100 mM dan 200 mM, serta
pengukuran nilai OD600 pada 0.4 dan 0.6. Hasil penelitian menunjukan ekspresi
gen sintetik penyandi parasporin-2 paling tinggi didapatkan pada nilai OD600 pada
0.4 dengan induksi IPTG 100 mM.
Kata kunci: parasporin-2, pJExpress, optical density, E.coli Top 10 F, IPTG.
ABSTRACT
FITRI HANDAYANI. Expression of Synthetic Gene Encoding Parasporin-2
Cloned on pJExpress Plasmid in Escherichia coli host cell Top 10 F. Under
direction of EDY DJAUHARI P and EDDY JUSUF.
Parasporin protein was produced by strains of Bacillus thuringiensis.
Parasporin-2 is one of some types of parasporin protein which has the highest
ability to kill cancer cells compared than the other types of parasporin. However,
the natural strains of producing parasporin-2 requires a lot of time and also the
operational cost was quite expensive. So, the synthetic gene encoder parasporin-2
should be created and cloned on pJExpress plasmid in Escherichia coli 10 F. The
purpose of this research was to determine the best value of Escherichia coli 10 F
optical density in order to get the optimal expression of recombinant protein of
parasporin-2. Expression of protein recombinant was comparing the optimization
of protein ekspression between IPTG 100 mM and 200 mM in induction and also
the measurement of OD600 value in 0.4 and 0.6. The best result of the expression
parasporin-2 sintetic gene was from OD600 0.4 with IPTG 100 mM.
Keywords: parasporin-2, pJExpress, optical density, E.coli Top 10 F, IPTG.
EKSPRESI GEN SINTETIK PENYANDI PARASPORIN-2
TERPOTONG YANG DIKLON PADA PLASMID pJExpress
DALAM SEL INANG Escherichia coli Top 10 F
FITRI HANDAYANI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi : Ekspresi Gen Sintetik Penyandi Parasporin-2 yang Diklon pada
Plasmid pJExpress dalam Sel Inang Escherichia coli Top 10 F.
Nama
: Fitri Handayani
NIM
: G84080013
Disetujui
Komisi Pembimbing
Drs. Edy Djauhari PK, M.Si.
Ketua
Drs. Eddy Jusuf, DES
Anggota
Diketahui
Dr.Ir. I Made Artika, M.App.Sc.
Ketua Departemen Biokimia
Tanggal Lulus :
PRAKATA
Assalamu’alaikum Warahmatullahi Wabarakatu
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadiran Allah SWT atas segala rahmat
dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penyusunan skripsi ini.
Skripsi yang berjudul Ekspresi Gen Sintetik Penyandi Parasporin-2 yang Diklon
pada Plasmid pJExpress dalam Sel Inang Escherichia coli Top 10 F.
Penulis mengucapkan terimakasih kepada Drs. Edy Djauhari PK, M.Si
selaku pembimbing utama, Drs. Eddy Jusuf, DES selaku pembimbing anggota
dan Ibu Rere, Bapak Ogi, Bapak Ridwan selaku staf di Laboratorium
Bioteknologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, yang telah banyak
memberikan bimbingan, bantuan, kritik dan saran selama penelitian. Penulis juga
mengucapkan terimakasih kepada kedua orang tua dan keluarga, Bhekti, Lega,
Amania, Lela, Niken, Nurina, Nia, Rahmi, Sari, serta teman-teman Biokimia
angkatan 45 atas doa dan dukungannya.
Penulis menyadari masih banyak kekurangan dan kesalahan yang harus
diperbaiki, namun penulis berharap semoga skripsi ini dapat memberikan manfaat
bagi yang membacanya.
Bogor, Februari 2013
Fitri Handayani
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Palembang pada tanggal 12 April 1991 dari pasangan
Yoyot Suryatna dan Iliarti. Penulis merupakan anak pertama dari 3 bersaudara.
Tahun 2008 penulis lulus SMU Negeri 1 Banjarsari kab. Ciamis dan pada
tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk
IPB (USMI). Penulis memilih program Biokimia, Departemen Biokimia, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi bendahara divisi
kajian strategi dan advokasi BEM FMIPA tahun 2010. Penulis juga pernah
menjadi pengajar dan kepala divisi akademik di bimbingan belajar Al-fattaah
tahun 2010-2012. Penulis melakukan praktik lapang di Laboratorium
Bioteknologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia dengan judul Identifikasi
Protein Parasporin Bacillus thuringiensis dengan Metode Lowry dan Teknik
Elektroforesis pada tahun 2011.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ................................................................................................ iii
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... ix
DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ ix
PENDAHULUAN ................................................................................................. 1
TINJAUAN PUSTAKA .......................................................................................
Parasporin ...................................................................................................
Susunan Asam Amino Parasporin-2 ..........................................................
Vektor ekspresi pJEkspress ........................................................................
Ekspresi Gen ..............................................................................................
Sodium dedocylsulfate-polyacrilamide gelelectrophoresis (SDS-PAGE) .
1
1
2
3
4
5
BAHAN DAN METODE ..................................................................................... 6
Alat dan Bahan ........................................................................................... 6
Metode Penelitian....................................................................................... 6
HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................... 8
Kultur E.coli Top 10 F ................................................................................. 8
Pita Ekspresi Protein Parasporin-2 ............................................................... 9
Konsentrasi Protein Parasporin-2................................................................. 9
Pita Ekspresi Protein Parasporin-2 Hasil Pemurnian ................................. 10
SIMPULAN DAN SARAN .................................................................................. 11
Simpulan ................................................................................................... 11
Saran .......................................................................................................... 11
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 11
LAMPIRAN .......................................................................................................... 13
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Pengukuran Nilai OD dan Penambahan IPTG .......................................................... 6
2 Konsentrasi Protein Parasporin-2.............................................................................10
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Sekuen Asam Amino Protein Parasporin-2 ............................................................... 3
2 Plasmid Vektor pJEkspress ........................................................................................ 3
3 Struktur Operon lac ...................................................................................................... 4
4 Ekspresi Operon lac pada Escherichia coli ............................................................... 5
5 Kultur E.coli Top 10 F ................................................................................................ 8
6 Elektroforegram Ekspresi Protein Parasporin-2 ....................................................... 9
7 Elektroforegram Ekspresi Protein Parasporin-2 Hasil pemurnian ...................... 10
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Diagram Alir Penelitian ............................................................................................. 14
2 Komposisi Running dan Stacking Gel pada Elektroforesis .................................. 15
3 Komposisi Larutan dan Buffer .................................................................................. 16
4 Sekuen Nukleotida Gen Penyandi Protein PS2Aa1 .......................................... 17
5 Hasil Ekspresi Sekuen yang Diharapkan ................................................................. 17
6 Hasil Elektroforegram menggunakan photo-capMw ............................................ 18
7 Marka Protein Bio-Rad ................................................................ ........................20
8 Perhitungan Konsentrasi Protein Parasporin-2…………...…................................21
PENDAHULUAN
Bacillus thuringiensis merupakan bakteri
yang memiliki sifat morfologi maupun
fisiologinya mirip dengan Bacillus aureus,
yang membedakannya adalah adanya kristal
protein yang bersifat toksin terhadap serangga
(Bernhard & Urtz 1993). Protein protoksin ini
pertama kali dikenal sebagai parasporal
crystalline inclusion selanjutnya disebut
sebagai δ-endotoksin atau Insecticidal
Crystalline Protein (ICP) yang dibagi dalam
dua katogori protein, yaitu protein Cry dan
protein Cyt (Jusuf 2009).
Awal abad 21, telah diketahui juga bahwa
beberapa tipe protein yang disintesis oleh
B.thuringiensis
memiliki
kemamapuan
menghambat tumbuh sel-sel kanker pada
manusia. Yokohama et al. (1988) pertama kali
melaporkan bahwa protein 25 kDa yang
diisolasi dari galur B.thuringiensis subs.
israelensis ONR-60A dapat menghambat
petumbuhan kultur sel leukemia tikus. Protein
Cry anti kanker manusia dari galur
B.thuringiensis ini kemudian diperkenalkan
pertama kali oleh Mizuki et al. (2000) sebagai
parasporin. Istilah parasporin didefinisikan
sebagai protein-protein δ-endotoksin yang
non-hemolitik tetapi memiliki kemampuan
preferensial membunuh sel kanker, sehingga
pada dasarnya parasporin merupakan protein
Cry, PS-1 adalah Cry 31, PS-2 adalah Cry 46,
PS-3 adalah Cry 41, dan PS-4 adalah Cry 45
(Ohba et al. 2009).
Sampai saat ini yang dikenal sebagai
parasporin terdiri atas 4 kelompok, masingmasing
adalah
parasporin-1
(PS-1),
parasporin-2 (PS-2), parasporin-3 (PS-3) dan
parasporin-4 (PS-4). Semuanya berjumlah 13
jenis, 8 jenis didapatkan di Jepang, 4 jenis di
Vietnam dan satu jenis di Kanada (Amano et
al. 2005).
Menurut Ohba et al. (2009) dari keempat
kelompok parasporin tersebut yang memiliki
aktivitas sitosidal paling besar dan sel kanker
sasaran yang lebih banyak adalah PS-2. Sel
kanker sasaran PS-2 tersebut diantaranya:
Sawano (Endometrial adenocarcinoma),
MOLT-4 (human leukemia T cell), HL-60
(human uterus cervix cancer cells), Jurkat,
HepG2 (Hepatocellular carcinoma), juga
terhadap sel limfosit T normal dan UtSMC
(uterine smooth muscle cells) dengan aktivitas
lebih rendah. PS-2 adalah protein Cry46Aa
atau disebut juga sebagai Mtx-like protein
dengan bentuk tidak beraturan, yang
ditunjukkan oleh protein PS2Aa1. Saat ini ada
2 jenis protein ini yaitu PS2Aa1 yang
diperoleh dari galur A1547 asal tanah di
Fukuoka dan PS2Ab1 dari galur TK-E6 dari
tanah di Ehime (Japan).
Protein
parasporin
tersebut
hanya
dihasilkan
dari
beberapa
isolat
B.thuringiensis. Menurut Jusuf (2009), dari
berbagai nomor B. thuringiensis yang telah
diisolasi dan dikarakterisasi diperoleh 100
nomor
isolat yang menunjukan adanya
protein Cry. Akan tetapi, baru teridentifikasi
11 nomor dari sejumlah nomor isolat tersebut
yang menghasilkan parasporin (Jusuf, tidak
dipublikasi). Bakteri B. thuringiensis mampu
memproduksi protein parasporin tersebut
setidaknya dalam waktu 3 hari. Protein
tersebut masih bercampur dengan spora serta
sulit dipisahkan dan dimurnikan. Selain itu,
protein tersebut baru memiliki aktivitas
sitosidal setelah perlakuan dengan enzimenzim proteolisis.
Hambatan tersebut yang menyebabkan
besarnya biaya operasional dan lamanya
waktu produksi protein parasporin yang akan
digunakan sebagai protein farmaseutika
terhadap terapi penyakit kanker. Oleh karena
itu, salah satu solusinya adalah membuat gen
sintetik yang mampu menyandi protein
parasporin-2 aktif siap pakai setelah
pemotongan oleh enzim protease (truncated
fragment), sehingga produksi protein tersebut
tidak memerlukan waktu yang lama
(maksimum 24 jam).
Penelitian ini bertujuan mendapatkan
kondisi optimum terekspresinya gen sintetik
penyandi parasporin-2 yang diklon pada
plasmid pJExpress dalam sel inang
Escherichia coli Top 10 F dengan cara
kuantitatif dan kualitatif. Penelitian ini juga
diharapkan dapat memberikan informasi
ilmiah
mengenai
kondisi
optimum
terekspresinya
gen
sintetik
penyandi
parasporin-2 yang diklon pada plasmid
pJExpress dalam sel inang Escherichia coli
Top 10 F, sehingga penelitian selanjutnya
dapat dillakukan hingga memperoleh protein
rekombinan yang berpotensi menghambat
tumbuh sel kanker. Hipotesis penelitian ini
adalah gen sintetik penyandi parasporin-2
yang diklon pada plasmid pJExpress dalam
sel inang Escherichia coli Top 10 F tersebut
dapat terekspresi.
TINJAUAN PUSTAKA
Parasporin
Parasporin (PS) merupakan protein Cry
yang memiliki kemampuan sitosidal terhadap
sel kanker. Akan tetapi aktifitas sitosidal
2
parasporin terhadap sel kanker hanya terjadi
bila protein tersebut telah didegradasi oleh
enzim-enzim protease menjadi satu molekul
protein kecil (Jusuf 2009). Sampai saat ini
telah dikenal empat kelompok parasporin,
yaitu PS-1, PS-2, PS-3 dan PS-4 semuanya
berjumlah 13 jenis (Amano et.al 2005).
PS-1 merupakan protein Cry31Aa/b/c
berbentuk speherical dengan struktur 3
domain seperti umumnya protein Cry. Saat ini
telah diidentifikasi 8 jenis parasporin-1 (Ohba
et.al 2009) yaitu PS1Aa1 didapat pada galur
A1190 yang diisolasi dari tanah Hiroshima,
PS1Aa2 pada galur M15 yang diisolasi dari
bangkai tungau di Kanada, PS1Aa3 dari galur
B0195 dari tanah di Fukuoka (Jepang),
PS1Aa4 (dari galur 79-25) dan PS1Aa5 (dari
galur 92-10) keduanya dari tanah di Hanoi.
PS1Ab1 atau Cry31Ab1 didapat pada galur
B0195 diisolasi dari tanah dik Fukuoka,
PS1Ab2 (dari galur 31-5) dan PS1Ac1 (dari
galur 87-29), keduanya berasal dari tanah di
Hanoi. Mizuki et.al 2000 mengisolasi protein
berukuran ± 81,045 kDa yang tersusun dari
723 asam amino dari B. thuringiensis nomor
isolate 84-HS-1-11 (selanjutnya disebut
sebagai galur A1190). Protein tersebut berasal
dari Hirosima yang disandi oleh satu gen
berukuran 2169 bp yang diidentifikasi sebagai
Cry31Aa1 atau disebut sebagai PS1Aa1.
Sekuen asam amino protein ini terdiri dari 5
conserved block seperti biasanya protein Cry,
tetapi homologinya dengan protein Cry
maupun Cyt sangat rendah (
YANG DIKLON PADA PLASMID pJExpress DALAM
SEL INANG Escherichia coli Top 10 F
FITRI HANDAYANI
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
ABSTRAK
FITRI HANDAYANI. Ekspresi Gen Sintetik Penyandi Parasporin-2 yang Diklon
pada Plasmid pJExpress dalam Sel Inang Escherichia coli Top 10 F. Dibimbing
oleh EDY DJAUHARI P dan EDDY JUSUF.
Protein parasporin secara alami adalah protein kristal yang dihasilkan oleh
galur-galur tertentu Bacillus thuringiensis. Parasporin-2 merupakan salah satu
jenis protein parasporin yang memiliki kemampuan membunuh sel kanker
tertinggi dibandingkan jenis parasporin lainnya. Akan tetapi, penggunaan galur
alami untuk menghasilkan parasporin-2 ini membutuhkan waktu yang lama dan
biaya operasional yang cukup mahal. Sehingga, gen sintetik penyandi parasporin2 terpotong disintesis, kemudian diklon pada plasmid pJExpress dalam sel inang
Escherichia coli 10 F. Penelitian ini bertujuan mendapatkan kondisi optimum
terekspresinya gen sintetik penyandi parasporin-2 terpotong yang diklon pada
plasmid pJExpress dalam sel inang Escherichia coli Top 10 F. Tingkat ekspresi
protein rekombinan pJExpress dilakukan dengan membandingkan optimasi
ekspresi protein yang dihasilkan pada induksi IPTG 100 mM dan 200 mM, serta
pengukuran nilai OD600 pada 0.4 dan 0.6. Hasil penelitian menunjukan ekspresi
gen sintetik penyandi parasporin-2 paling tinggi didapatkan pada nilai OD600 pada
0.4 dengan induksi IPTG 100 mM.
Kata kunci: parasporin-2, pJExpress, optical density, E.coli Top 10 F, IPTG.
ABSTRACT
FITRI HANDAYANI. Expression of Synthetic Gene Encoding Parasporin-2
Cloned on pJExpress Plasmid in Escherichia coli host cell Top 10 F. Under
direction of EDY DJAUHARI P and EDDY JUSUF.
Parasporin protein was produced by strains of Bacillus thuringiensis.
Parasporin-2 is one of some types of parasporin protein which has the highest
ability to kill cancer cells compared than the other types of parasporin. However,
the natural strains of producing parasporin-2 requires a lot of time and also the
operational cost was quite expensive. So, the synthetic gene encoder parasporin-2
should be created and cloned on pJExpress plasmid in Escherichia coli 10 F. The
purpose of this research was to determine the best value of Escherichia coli 10 F
optical density in order to get the optimal expression of recombinant protein of
parasporin-2. Expression of protein recombinant was comparing the optimization
of protein ekspression between IPTG 100 mM and 200 mM in induction and also
the measurement of OD600 value in 0.4 and 0.6. The best result of the expression
parasporin-2 sintetic gene was from OD600 0.4 with IPTG 100 mM.
Keywords: parasporin-2, pJExpress, optical density, E.coli Top 10 F, IPTG.
EKSPRESI GEN SINTETIK PENYANDI PARASPORIN-2
TERPOTONG YANG DIKLON PADA PLASMID pJExpress
DALAM SEL INANG Escherichia coli Top 10 F
FITRI HANDAYANI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi : Ekspresi Gen Sintetik Penyandi Parasporin-2 yang Diklon pada
Plasmid pJExpress dalam Sel Inang Escherichia coli Top 10 F.
Nama
: Fitri Handayani
NIM
: G84080013
Disetujui
Komisi Pembimbing
Drs. Edy Djauhari PK, M.Si.
Ketua
Drs. Eddy Jusuf, DES
Anggota
Diketahui
Dr.Ir. I Made Artika, M.App.Sc.
Ketua Departemen Biokimia
Tanggal Lulus :
PRAKATA
Assalamu’alaikum Warahmatullahi Wabarakatu
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadiran Allah SWT atas segala rahmat
dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penyusunan skripsi ini.
Skripsi yang berjudul Ekspresi Gen Sintetik Penyandi Parasporin-2 yang Diklon
pada Plasmid pJExpress dalam Sel Inang Escherichia coli Top 10 F.
Penulis mengucapkan terimakasih kepada Drs. Edy Djauhari PK, M.Si
selaku pembimbing utama, Drs. Eddy Jusuf, DES selaku pembimbing anggota
dan Ibu Rere, Bapak Ogi, Bapak Ridwan selaku staf di Laboratorium
Bioteknologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, yang telah banyak
memberikan bimbingan, bantuan, kritik dan saran selama penelitian. Penulis juga
mengucapkan terimakasih kepada kedua orang tua dan keluarga, Bhekti, Lega,
Amania, Lela, Niken, Nurina, Nia, Rahmi, Sari, serta teman-teman Biokimia
angkatan 45 atas doa dan dukungannya.
Penulis menyadari masih banyak kekurangan dan kesalahan yang harus
diperbaiki, namun penulis berharap semoga skripsi ini dapat memberikan manfaat
bagi yang membacanya.
Bogor, Februari 2013
Fitri Handayani
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Palembang pada tanggal 12 April 1991 dari pasangan
Yoyot Suryatna dan Iliarti. Penulis merupakan anak pertama dari 3 bersaudara.
Tahun 2008 penulis lulus SMU Negeri 1 Banjarsari kab. Ciamis dan pada
tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk
IPB (USMI). Penulis memilih program Biokimia, Departemen Biokimia, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi bendahara divisi
kajian strategi dan advokasi BEM FMIPA tahun 2010. Penulis juga pernah
menjadi pengajar dan kepala divisi akademik di bimbingan belajar Al-fattaah
tahun 2010-2012. Penulis melakukan praktik lapang di Laboratorium
Bioteknologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia dengan judul Identifikasi
Protein Parasporin Bacillus thuringiensis dengan Metode Lowry dan Teknik
Elektroforesis pada tahun 2011.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ................................................................................................ iii
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... ix
DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ ix
PENDAHULUAN ................................................................................................. 1
TINJAUAN PUSTAKA .......................................................................................
Parasporin ...................................................................................................
Susunan Asam Amino Parasporin-2 ..........................................................
Vektor ekspresi pJEkspress ........................................................................
Ekspresi Gen ..............................................................................................
Sodium dedocylsulfate-polyacrilamide gelelectrophoresis (SDS-PAGE) .
1
1
2
3
4
5
BAHAN DAN METODE ..................................................................................... 6
Alat dan Bahan ........................................................................................... 6
Metode Penelitian....................................................................................... 6
HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................... 8
Kultur E.coli Top 10 F ................................................................................. 8
Pita Ekspresi Protein Parasporin-2 ............................................................... 9
Konsentrasi Protein Parasporin-2................................................................. 9
Pita Ekspresi Protein Parasporin-2 Hasil Pemurnian ................................. 10
SIMPULAN DAN SARAN .................................................................................. 11
Simpulan ................................................................................................... 11
Saran .......................................................................................................... 11
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 11
LAMPIRAN .......................................................................................................... 13
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Pengukuran Nilai OD dan Penambahan IPTG .......................................................... 6
2 Konsentrasi Protein Parasporin-2.............................................................................10
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Sekuen Asam Amino Protein Parasporin-2 ............................................................... 3
2 Plasmid Vektor pJEkspress ........................................................................................ 3
3 Struktur Operon lac ...................................................................................................... 4
4 Ekspresi Operon lac pada Escherichia coli ............................................................... 5
5 Kultur E.coli Top 10 F ................................................................................................ 8
6 Elektroforegram Ekspresi Protein Parasporin-2 ....................................................... 9
7 Elektroforegram Ekspresi Protein Parasporin-2 Hasil pemurnian ...................... 10
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Diagram Alir Penelitian ............................................................................................. 14
2 Komposisi Running dan Stacking Gel pada Elektroforesis .................................. 15
3 Komposisi Larutan dan Buffer .................................................................................. 16
4 Sekuen Nukleotida Gen Penyandi Protein PS2Aa1 .......................................... 17
5 Hasil Ekspresi Sekuen yang Diharapkan ................................................................. 17
6 Hasil Elektroforegram menggunakan photo-capMw ............................................ 18
7 Marka Protein Bio-Rad ................................................................ ........................20
8 Perhitungan Konsentrasi Protein Parasporin-2…………...…................................21
PENDAHULUAN
Bacillus thuringiensis merupakan bakteri
yang memiliki sifat morfologi maupun
fisiologinya mirip dengan Bacillus aureus,
yang membedakannya adalah adanya kristal
protein yang bersifat toksin terhadap serangga
(Bernhard & Urtz 1993). Protein protoksin ini
pertama kali dikenal sebagai parasporal
crystalline inclusion selanjutnya disebut
sebagai δ-endotoksin atau Insecticidal
Crystalline Protein (ICP) yang dibagi dalam
dua katogori protein, yaitu protein Cry dan
protein Cyt (Jusuf 2009).
Awal abad 21, telah diketahui juga bahwa
beberapa tipe protein yang disintesis oleh
B.thuringiensis
memiliki
kemamapuan
menghambat tumbuh sel-sel kanker pada
manusia. Yokohama et al. (1988) pertama kali
melaporkan bahwa protein 25 kDa yang
diisolasi dari galur B.thuringiensis subs.
israelensis ONR-60A dapat menghambat
petumbuhan kultur sel leukemia tikus. Protein
Cry anti kanker manusia dari galur
B.thuringiensis ini kemudian diperkenalkan
pertama kali oleh Mizuki et al. (2000) sebagai
parasporin. Istilah parasporin didefinisikan
sebagai protein-protein δ-endotoksin yang
non-hemolitik tetapi memiliki kemampuan
preferensial membunuh sel kanker, sehingga
pada dasarnya parasporin merupakan protein
Cry, PS-1 adalah Cry 31, PS-2 adalah Cry 46,
PS-3 adalah Cry 41, dan PS-4 adalah Cry 45
(Ohba et al. 2009).
Sampai saat ini yang dikenal sebagai
parasporin terdiri atas 4 kelompok, masingmasing
adalah
parasporin-1
(PS-1),
parasporin-2 (PS-2), parasporin-3 (PS-3) dan
parasporin-4 (PS-4). Semuanya berjumlah 13
jenis, 8 jenis didapatkan di Jepang, 4 jenis di
Vietnam dan satu jenis di Kanada (Amano et
al. 2005).
Menurut Ohba et al. (2009) dari keempat
kelompok parasporin tersebut yang memiliki
aktivitas sitosidal paling besar dan sel kanker
sasaran yang lebih banyak adalah PS-2. Sel
kanker sasaran PS-2 tersebut diantaranya:
Sawano (Endometrial adenocarcinoma),
MOLT-4 (human leukemia T cell), HL-60
(human uterus cervix cancer cells), Jurkat,
HepG2 (Hepatocellular carcinoma), juga
terhadap sel limfosit T normal dan UtSMC
(uterine smooth muscle cells) dengan aktivitas
lebih rendah. PS-2 adalah protein Cry46Aa
atau disebut juga sebagai Mtx-like protein
dengan bentuk tidak beraturan, yang
ditunjukkan oleh protein PS2Aa1. Saat ini ada
2 jenis protein ini yaitu PS2Aa1 yang
diperoleh dari galur A1547 asal tanah di
Fukuoka dan PS2Ab1 dari galur TK-E6 dari
tanah di Ehime (Japan).
Protein
parasporin
tersebut
hanya
dihasilkan
dari
beberapa
isolat
B.thuringiensis. Menurut Jusuf (2009), dari
berbagai nomor B. thuringiensis yang telah
diisolasi dan dikarakterisasi diperoleh 100
nomor
isolat yang menunjukan adanya
protein Cry. Akan tetapi, baru teridentifikasi
11 nomor dari sejumlah nomor isolat tersebut
yang menghasilkan parasporin (Jusuf, tidak
dipublikasi). Bakteri B. thuringiensis mampu
memproduksi protein parasporin tersebut
setidaknya dalam waktu 3 hari. Protein
tersebut masih bercampur dengan spora serta
sulit dipisahkan dan dimurnikan. Selain itu,
protein tersebut baru memiliki aktivitas
sitosidal setelah perlakuan dengan enzimenzim proteolisis.
Hambatan tersebut yang menyebabkan
besarnya biaya operasional dan lamanya
waktu produksi protein parasporin yang akan
digunakan sebagai protein farmaseutika
terhadap terapi penyakit kanker. Oleh karena
itu, salah satu solusinya adalah membuat gen
sintetik yang mampu menyandi protein
parasporin-2 aktif siap pakai setelah
pemotongan oleh enzim protease (truncated
fragment), sehingga produksi protein tersebut
tidak memerlukan waktu yang lama
(maksimum 24 jam).
Penelitian ini bertujuan mendapatkan
kondisi optimum terekspresinya gen sintetik
penyandi parasporin-2 yang diklon pada
plasmid pJExpress dalam sel inang
Escherichia coli Top 10 F dengan cara
kuantitatif dan kualitatif. Penelitian ini juga
diharapkan dapat memberikan informasi
ilmiah
mengenai
kondisi
optimum
terekspresinya
gen
sintetik
penyandi
parasporin-2 yang diklon pada plasmid
pJExpress dalam sel inang Escherichia coli
Top 10 F, sehingga penelitian selanjutnya
dapat dillakukan hingga memperoleh protein
rekombinan yang berpotensi menghambat
tumbuh sel kanker. Hipotesis penelitian ini
adalah gen sintetik penyandi parasporin-2
yang diklon pada plasmid pJExpress dalam
sel inang Escherichia coli Top 10 F tersebut
dapat terekspresi.
TINJAUAN PUSTAKA
Parasporin
Parasporin (PS) merupakan protein Cry
yang memiliki kemampuan sitosidal terhadap
sel kanker. Akan tetapi aktifitas sitosidal
2
parasporin terhadap sel kanker hanya terjadi
bila protein tersebut telah didegradasi oleh
enzim-enzim protease menjadi satu molekul
protein kecil (Jusuf 2009). Sampai saat ini
telah dikenal empat kelompok parasporin,
yaitu PS-1, PS-2, PS-3 dan PS-4 semuanya
berjumlah 13 jenis (Amano et.al 2005).
PS-1 merupakan protein Cry31Aa/b/c
berbentuk speherical dengan struktur 3
domain seperti umumnya protein Cry. Saat ini
telah diidentifikasi 8 jenis parasporin-1 (Ohba
et.al 2009) yaitu PS1Aa1 didapat pada galur
A1190 yang diisolasi dari tanah Hiroshima,
PS1Aa2 pada galur M15 yang diisolasi dari
bangkai tungau di Kanada, PS1Aa3 dari galur
B0195 dari tanah di Fukuoka (Jepang),
PS1Aa4 (dari galur 79-25) dan PS1Aa5 (dari
galur 92-10) keduanya dari tanah di Hanoi.
PS1Ab1 atau Cry31Ab1 didapat pada galur
B0195 diisolasi dari tanah dik Fukuoka,
PS1Ab2 (dari galur 31-5) dan PS1Ac1 (dari
galur 87-29), keduanya berasal dari tanah di
Hanoi. Mizuki et.al 2000 mengisolasi protein
berukuran ± 81,045 kDa yang tersusun dari
723 asam amino dari B. thuringiensis nomor
isolate 84-HS-1-11 (selanjutnya disebut
sebagai galur A1190). Protein tersebut berasal
dari Hirosima yang disandi oleh satu gen
berukuran 2169 bp yang diidentifikasi sebagai
Cry31Aa1 atau disebut sebagai PS1Aa1.
Sekuen asam amino protein ini terdiri dari 5
conserved block seperti biasanya protein Cry,
tetapi homologinya dengan protein Cry
maupun Cyt sangat rendah (