Isolation and Cloning of Cellulase Gene from Bovine Rumen Bacteria.

ISOLASI DAN KLONING GEN SELULASE
DARI BAKTERI RUMEN SAPI

Rahadian Pratama

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul “Isolasi dan
Kloning Gen Selulase dari Bakteri Rumen Sapi” merupakan karya saya dengan
arahan dari komisi pembimbing dan belum pernah dipublikasikan dalam bentuk
apapun kepada perguruan tinggi mana pun. Tesis ini merupakan bagian dari
proyek penelitian Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia (BPBPI).
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, September 2013

Rahadian Pratama
G851110031

RINGKASAN

RAHADIAN PRATAMA. Isolasi dan Kloning Gen Selulase dari Bakteri Rumen
Sapi. Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan TETTY CHAIDAMSARI.
Selulase adalah enzim yang dapat menghidrolisis biomassa selulosa dan
dihasilkan oleh mikroorganisme yang tumbuh dengan menggunakan selulosa
sebagai sumber karbonnya. Tujuan dari penelitian ini adalah mengisolasi dan
melakukan kloning gen selulase dari bakteri penghasil selulosa berasal dari rumen
sapi. Bakteri pemecah selulosa diisolasi dari cairan rumen menggunakan media
selektif. RNA total diisolasi dari koloni yang memiliki aktivitas enzim selulase
dan digunakan sebagai cetakan untuk konstruksi cDNA menggunakan teknik
Reverse Transcriptase–Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Teknik tersebut
menghasilkan cDNA sebagai produk dan digunakan sebagai cetakan untuk
amplifikasi gen selulase menggunakan teknik PCR dengan primer spesifik.
Kandidat gen selulosa yang diperoleh dikloning ke dalam vektor pGEM-T Easy,

dilanjutkan dengan penentuan urutan nukleotida nya. Urutan sekuen nukleotida
yang dihasilkan lalu dibandingkan dengan urutan gen selulase yang ada pada
database GenBank.
Beberapa isolat bakteri rumen menunjukkan aktivitas selulase dan isolat
CR-8 menunjukkan aktivitas selulase yang paling baik sehingga dipilih untuk
analisis lebih lanjut. RNA total berhasil diisolasi dari isolat CR-8 yang
ditunjukkan dengan adanya dua pita RNA ribosom yang cukup tebal (23S dan
16S). Proses transkripsi balik berhasil dilakukan dan amplifikasi gen selulase
menggunakan primer spesifik F1 dan R1 menghasilkan kandidat gen selulase
dengan ukuran sekitar 1900 bp. Kandidat tersebut berhasil disisipkan ke dalam
vektor pGEM-T Easy dan plasmid rekombinan ini berhasil ditransformasikan ke
dalam sel E. coli. Analisis bioinformatika urutan nukleotida menunjukkan bahwa
kandidat gen selulase yang diisolasi memiliki tingkat homologi mencapai 99%
dengan endo-1,6-beta-glukanase dari fungi T. harzianum.

SUMMARY
RAHADIAN PRATAMA. Isolation and Cloning of Cellulase Gene from Bovine
Rumen Bacteria. Under the direction of I MADE ARTIKA and TETTY
CHAIDAMSARI.
Cellulases are the enzymes that hydrolize cellulosic biomass and are

produced by the microorganisms that grow over cellulosic matters. The objective
of this research was to isolate and clone cellulase gene from cellulose-degrading
bacteria of bovine rumen. Cellulose-degrading bacteria were isolated from rumen
fluid using a selective medium. Total RNA was isolated from selected colony
having cellulose degrading activity and it was used as a template for cDNA
construction using reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
technique. The resulted cDNA was used as a template for PCR amplification of
cellulose gene using specific primers. The cellulose gene candidate obtained was
cloned into the pGEM-T-Easy vector followed by determination of its nucleotide
sequence. The nucleotide sequence generated was aligned with sequences of
cellulase genes from GenBank.
A number of isolates of rumen bacteria showed cellulase activity and the
isolate CR-8 was selected for further analysis. Total RNA was successfully
isolated from isolate CR-8 indicated by the presence of two intense bands of
ribosomal RNA (23S and 16S). The reverse transcription process was successful
and amplification of cellulase gene using the specific primer F1 and R1 resulted in
a DNA fragment of 1900 bp as a candidate of cellulase gene. The fragment was
successfuly cloned into the pGEM-T-Easy vector, and the resulted recombinant
plasmid was successfully introduced into the E. coli cells. Nucleotide sequence
analysis suggested that the isolated cellulase gene shares 99% homology with the

endo-1,6-beta-glucanase of T. harzianum.
Key words: cellulase, clone, GenBank, rumen bacteria

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2013
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

ISOLASI DAN KLONING GEN SELULASE
DARI BAKTERI RUMEN SAPI

Rahadian Pratama

Tesis

sebagai salah sat u syarat unt uk memperoleh gelar
M agist er Sains pada
Program St udi Biokimia

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

Penguji pada Ujian Tertutup: Dr Suryani, MSc

Judul Tesis
Nama
NRP

: Isolasi dan Kloning Gen Selulase dari Bakteri Rumen Sapi
: Rahadian Pratama
: G851110031

Disetujui oleh

Komisi Pembimbing

Dr I Made Artika, MAppSc
Ketua

Dr Tetty Chaidamsari, MSi
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Biokimia

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof Dr Drh Maria Bintang, MS

Dr Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 24 Agustus 2013

Tanggal lulus:

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan khadirat Allah SWT atas segala rahmat
dan karunia-Nya sehingga penulisan tesis yang berjudul “Isolasi dan Kloning Gen
Selulase dari Bakteri Rumen Sapi” dapat diselesaikan. Tesis ini merupakan salah
satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Biokimia,
Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr I Made Artika, MAppSc
dan Ibu Dr Tetty Chaidamsari, Msi selaku pembimbing atas bimbingan dan
arahannya yang diberikan selama ini. Disamping itu, penulis sampaikan terima
kasih kepada Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia yang mendanai
proyek penelitian ini.
Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Ibu dan Bapak tercinta,
serta seluruh keluarga atas doa dan kasih sayangnya. Semoga Allah senantiasa
membalas kebaikan semuanya dengan pahala yang berlipat ganda, amin.
Semoga hasil penelitian ini bermanfaat.
Bogor, September 2013

Rahadian Pratama

DAFTAR ISI

DAFTAR GAMBAR

Halaman
vi

DAFTAR LAMPIRAN

vi

1

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Hipotesis

1
1
2
2

2

BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu
Bahan
Metode
Isolasi Bakteri Rumen Sapi
Uji Aktivitas Enzim Selulase
Isolasi RNA
Sintesis cDNA
Desain Primer Selulase
Amplifikasi Gen Selulase
Recovery DNA
Pembuatan Sel Kompeten
Ligasi

Transformasi
Seleksi Transforman
Analisis Sekuen Kandidat Gen Selulase

2
2
3
3
3
4
4
4
4
4
5
5
5
5
6
6

3

HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolat Bakteri Rumen Penghasil Selulase
Kandidat Gen Selulase
Data Bioinformatika Gen Selulase

6
6
8
10

4

SIMPULAN DAN SARAN

12

DAFTAR PUSAKA

13

LAMPIRAN

15

RIWAYAT HIDUP

24

DAFTAR GAMBAR

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Bagan alir kegiatan penelitian
Pertumbuhan isolat CR-8 dalam media CCRA
Mekanisme hidrolisis selulosa
Hasil isolasi RNA dan amplifikasi gen selulase
Hasil PCR koloni menunjukkan amplifikasi gen sisipan
Kromatogram sekuen gen selulase
Perakitan DNA contig
Conserved domain selulase dari DNA contig

Halaman
4
9
10
11
13
14
15
16

DAFTAR LAMPIRAN

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

Inkubasi kultur bakteri pada inkubator anaerob
Seleksi bakteri pada media CCRA
Tabel nilai absorbansi larutan standar glukosa
Grafik linear kurva standar
Uji aktivitas selulase CR-8 (kualitatif)
DNA komplemen (cDNA) CR-8 (volume cDNA 2 µL)
Seleksi hasil transformasi (White/Blue Screen)
Hasil BLASTx gen selulase dari bakteri rumen sapi
Pensejajaran sekuen gen selulase asal bakteri rumen sapi dengan
endoglukanase T. harzianum

Halaman
22
23
24
25
26
27
28
29
30

1

PENDAHULUAN
Latar Belakang

Kehidupan manusia di bumi ini tidak terlepas dari peran tumbuhan sebagai
penghasil oksigen bagi manusia untuk bertahan hidup. Tumbuhan hijau maupun
non-hijau menempati hampir setengah dari daratan dengan beragam jenis.
Sebagian besar tumbuhan dapat dimanfaatkan oleh manusia sebagai persediaan
kayu untuk bahan bangunan, bahan bakar, pangan, obat, dan untuk keperluan
lainnya. Namun ada juga sampah tumbuhan (biomass) yang belum dapat
dimanfaatkan sepenuhnya oleh manusia.
Penyusun utama tumbuhan ialah selulosa dan hemi-selulosa. Selulosa
merupakan senyawa organik polisakarida yang terdiri atas rantai linier dari
beberapa ratus hingga lebih dari sepuluh ribu ikatan unit D-glukosa. Selulosa
menjadi komponen utama penyusun dinding sel tumbuhan, bersama dengan
senyawa lain seperti lignin yang menopang kekuatan dinding sel tumbuhan
sehingga menjadi rigid dan kokoh. Tumbuhan menjadi sumber selulosa yang
paling berlimpah di bumi namun pemanfaatannya belum maksimal sehingga
masih banyak biomassa tumbuhan yang berakhir sebagai sampah. Pada zaman
modern ini manusia dihadapkan pada krisis energi akibat kurangnya cadangan
minyak bumi, sedangkan permintaan semakin meningkat. Berbagai sumber
energi alternatif terus dicari dan banyak inovasi bermunculan seperti bioetanol,
biosolar, dan sebagainya. Bahan-bahan tersebut umumnya berasal dari tumbuhan
seperti jarak, dan sebagainya. Selulosa sebagai salah satu sumber karbohidrat
yang paling berpotensi untuk dijadikan sumber energi alternatif belum banyak
dikembangkan. Mengingat kelimpahan selulosa yang sangat tinggi di alam,
selulosa cocok untuk dijadikan sebagai sumber energi alternatif, tetapi masih
harus dikembangkan metode pemanfaatannya.
Salah satu kendala yang ditemui ialah cara memecah selulosa menjadi unit
penyusunnya, D-glukosa, sehingga dapat dimanfaatkan untuk berbagai macam
keperluan manusia. Metode degradasi selulosa yang paling aman, cepat, dan tidak
memerlukan energi yang besar ialah dengan menggunakan bio-katalis atau enzim,
yaitu enzim selulase.
Selulase ialah suatu grup enzim yang berkerja secara bersama-sama untuk
menghidrolisis selulosa. Selulase terdiri atas eksoglukanase, endoglukanase dan βglukosidase (kompleks selulase). Lebih detilnya, selulase dibagi menjadi β-1,4endoglukanase (EG I, II, III dan V), β-1,4-selobiohidrolase (CBH I dan II),
xilanase (XYN I dan II), β-glukosidase, α-L-arabinofuranosidase, asetil xilan
esterase, β-mannase dan α-glukuronidase (Lenting and Warmoeskerken 2001).
Molekul selulosa umumnya memiliki struktur yang mirip, seperti domain
katalitik, domain pengikatan selulosa dan jembatan penghubungnya (linker).
Dampaknya, selulosa dapat didegradasi menjadi glukosa secara sinergis dengan
kompleks enzim ini. Sejumlah besar bakteri, fungi dan actinomycetes diketahui
memiliki kemampuan untuk mendegradasi selulosa (Nagaraju et al. 2009).
Selulase tidak hanya menguntungkan dalam degradasi selulosa sebagai
sumber bahan bakar alternatif, namun industri dari sektor lain pun dapat
memanfaatkan selulase, contoh nya dari industri tekstil seperti Jeans. Selulase
dapat dijadikan sebagai agen biostoning (metode pencucian khusus pada bahan

2

jeans), yang dapat memberikan warna khas pada bahan jeans. Penggunaan
selulase menghilangkan polusi lingkungan yang terjadi akibat penggunaan asam
pada teknik pencucian jeans secara tradisional (Bai et al. 2012).
Para peneliti akhirnya mencoba untuk memproduksi enzim selulase dalam
jumlah besar agar dapat digunakan untuk memecah selulosa dalam skala industri.
Salah satu caranya ialah dengan kloning dan ekspresi gen penyandi selulase.
Sumber selulase bisa berasal dari lambung sapi atau hewan pemakan rumput
lainnya, bakteri dan fungi. Walaupun enzim selulase dari berbagai bakteri dan
fungi telah diteliti, namun kemampuan selulase dari berbagai sumber isolasi dapat
berbeda-beda. Oleh karena itu, diperlukan penelitian terhadap enzim selulase yang
diisolasi dari isolat lokal Indonesia. Pada penelitian ini sumber enzim selulase
diperoleh dari isolasi bakteri selulolitik yang terdapat dalam caian rumen sapi.
Beberapa penelitian terdahulu sudah meneliti enzim selulase yang dihasilkan dari
hewan ruminansia lainnya seperti pada kerbau yang sudah diakukan oleh
Sapi memiliki kemampuan untuk mencerna dan bertahan hidup dengan
mengkonsumsi diet tinggi serat tetapi rendah protein. Kemampuan sapi tersebut
dimungkinkan berkat adanya bakteri selulolitik, fibrolitik fungi dan protozoa
(Chen et al. 2008: Lee et al. 2004). Gen penyandi enzim selulase yang diisolasi
dapat diklon dan diekspresikan pada sel mikroba seperti Eschericia coli untuk
produksi enzim selulase dalam skala besar.

Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan:
1. Mengisolasi gen penyandi selulase dari bakteri selulolitik yang hidup di dalam
rumen sapi.
2. Mengklon gen penyandi selulase yang telah diisolasi ke dalam sel E. coli.
3. Menentukan gen penyandi selulase yang telah diisolasi apakah berupa gen
utuh atau fragmen.

Hipotesis
Hipotesis pada penelitian ini yaitu:
1. Gen penyandi selulase dari bakteri selulolitik dapat diisolasi dan diklon ke
bakteri E. coli.
2. Gen yang didapat berupa gen utuh sehingga dapat diaplikasikan langsung.

2

BAHAN DAN METODE

Tempat dan Waktu
Penelitian dilaksanakan mulai bulan Juli 2012 sampai dengan Maret 2013
di Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia (BPBPI), Jl. Taman
Kencana No. 1, Bogor 16151.

3

Bahan
Sumber bakteri selulolitik berasal dari rumen sapi segar yang diperoleh di
rumah potong hewan. Bakteri inang E. coli XL1-Blue merupakan milik BPBPI.
Kit yang digunakan pada penelitian berupa kit komersil yang diperoleh dari
masing-masing vendor (Invitrogen, Promega).

Metode
Penelitian terdiri atas beberapa tahapan seperti pada Gmbar 1. Tahap
pertama ialah skrining bakteri penghasil enzim selulase dari cairan rumen sapi
(media selektif CCRA), tahap kedua ialah pengujian aktivitas enzim selulase
(metode DNS dan substrat CMC), tahap ketiga ialah isolasi RNA total bakteri,
tahap keempat ialah studi bioinformatika dan desain primer spesifik selulase,
tahap kelima ialah amplifikasi dan kloning gen selulase, tahap keenam ialah
sekuensing kandidat gen selulase, tahap terakhir ialah analisis bioinformatika
kandidat gen selulase (DNASTAR, Bioedit, BLAST)
Skrining

Uji
Aktivitas
Studi
Bioinformatika

Isolasi
RNA

Desain
Primer

PCR &
Kloning

Sekuensing

Analisis
Bioinformatika
Kandiddat Gen
Selulase

Gambar 1 Bagan alir kegiatan penelitian

Isolasi Bakteri Rumen Sapi
Rumen sapi diperoleh dari rumah potong hewan (RPH). Rumen sapi yang
masih segar diambil cairannya menggunakan syringe yang sudah disiapkan
sebelumnya dan cairan segera dimasukkan ke dalam tabung koleksi anaerob
(berisi resazurin agar). Tabung koleksi anaerob kemudian dimasukkan ke dalam
anaerobic gloves box (85% N2, 5% CO2, 10% H2, dan kurang dari 10 ppm O2)
(Dowell 1972). Cairan rumen sapi tersebut kemudian ditumbuhkan dalam media
agar selektif (Cellulose Congo-Red Agar, CCRA) sehingga yang tumbuh ialah
bakteri yang memiliki kemampuan mendegradasi selulosa. Komposisi CCRA
yaitu: KH2PO4 0.5 g, MgSO4 0.25 g, Congo-Red 0.2 g, agar 7.5 g, gelatin 2 g,
carboxymethyl cellulose 1.88 g; akuades1 L dan pH 6.8 – 7.2 (Gupta et al. 2012).

4

Bakteri yang ditumbuhkan dalam cawan petri media CCRA diberi kode CR.
Koloni bakteri yang menghasilkan zona bening atau pertanda memiliki aktivitas
selulase, diisolasi dan ditumbuhkan pada media Luria Broth (LB) dan disimpan
untuk uji selanjutnya.
Uji Aktivitas Enzim Selulase
Kultur bakteri dipipet 50 µl ke dalam tabung reaksi, kemudian
ditambahkan bufer sitrat 950 µl, dan substrat CMC 1%. CMC merupakan substrat
yang baik untuk menginduksi produksi enzim selulase pada bakteri (Ahmad et al.
2003: Dashtban et al. 2011). Campuran kemudian dikocok lalu diinkubasi 50oC
selama 10 menit, kemudian dididihkan selama 15 menit. Ke dalam tabung reaksi
ditambahkan larutan DNS sebanyak 3 ml. Campuran kemudian di-vortex dan
dididihkan selama 10 menit lalu diukur absorban pada λ540 nm. Sebagai standar,
digunakan glukosa dengan komposisi glukosa-akuades, CMC dan DNS dengan
perbandingan 1:1:1. Konsentrasi standar yang digunakan ialah 100, 200, 400, 800
dan 1600 ppm.
Isolasi RNA
Isolasi RNA dilakukan menggunakan peqGOLD Bacterial RNA Kit dari
Invitrogen. Setelah bakteri hasil isolasi ditumbuhkan pada media LB, RNA
diisolasi dan dilanjutkan dengan elektroforesis gel terhadap hasil isolasi RNA
dengan konsentrasi agarosa 1%.

Sintesis cDNA
Sintesis cDNA (transkripsi balik) dilakukan menggunakan kit
Superscripttm First-Strand dari Invitrogen dan sistem PCR. Setelah cDNA di
sintesis, kemudian dilakukan elektroforesis terhadap cDNA dengan kepadatan gel
0.8%. Sebagai marker digunakan 1Kb DNA Ladder dari Invitrogen.

Desain Primer Selulase
Primer selulase didesain menggunakan cetakan dari sekuen selulase yang
telah ada di website National Center for Biotechnology Information
(www.ncbi.nlm.nih.gov). Beberapa sekuen selulase dipilih (exoglucanase,
endoglucanase, cellobiase) sebagai referensi. Sekuen selulase bersumber dari
Trichoderma reesei. Desain primer menggunakan bantuan software Lasergene
DNASTAR versi 7.

Amplifikasi Gen Selulase
Amplifikasi gen penyandi selulase dilakukan dengan metode Polymerase
Chain Reaction (PCR) dengan menggunakan primer spesifik hasil desain

5

berdasarkan cetakan gen selulase. Enzim yang digunakan dalam PCR ialah Taq
DNA polymerase dari Invitrogen beserta kit PCR seperti bufer dan dNTP. Untuk
Mix PCR 1X berisi bufer Taq Polimerase 2,5 µl, dNTP 1 µl, Primer forward 1 µl,
primer reverse 1 µl, Taq polimerase 1 µl dan molecular water (akuades steril,
MW) 13,5 µl. Untuk amplifikasi gen selulase, komposisi pereaksi adalah cDNA
target 1 µl, MW 4 µl dan Mix 20 µl. PCR dilakukan sebanyak 35 siklus dengan
setiap siklus diatur suhu denaturasi 94 oC, suhu annealing dibuat bervariasi untuk
mencari suhu annealing yang tepat, dan suhu elongasi 72 oC. setelah PCR,
hasilnya diuji dengan elektroforesis gel 0,8% dan marker 1 Kb DNA Ladder.

Recovery DNA
DNA yang telah di elektroforesis dan menghasilkan pita yang cukup tebal
dipulihkan kembali (recovery). Pemulihan DNA menggunakan kit Quick Gel
Extraction dari Invitrogen. DNA yang telah dipulihkan kemudian dielektroforesis
kembali sebanyak 1 µl untuk memastikan keberadaan DNA tersebut.

Pembuatan Sel Kompete
n
Sel kompeten yang digunakan ialah bakteri E.coli strain XL1-blue. Bakteri
dikulturkan pada media SOB + tetrasiklin pada suhu 37oC hingga mencapai
OD600=0.6. Lalu didinginkan dalam es selama 10 menit, disentrifugasi 4000 rpm
2oC 10 menit, diresuspensi dalam bufer TB, lalu didiamkan dalam es selama 10
menit. Selanjutnya kultur disentrifugasi kembali 3000 rpm 2oC 10 menit,
resuspensi kembali dalam TB buffer, ditambahkan DMSO dalam es selama 10
menit lalu dibekukan dengan nitrogen cair dan disimpan dalam suhu -70oC.

Ligasi
Kandidat gen selulase kemudian diligasikan dengan vektor pGEM-T-Easy
dari Invitrogen. cDNA dicampurkan dengan komponen ligasi (buffer, vektor,
enzim ligasi, kontrol DNA) dan dibiarkan selama satu jam pada suhu ruang (25
o
C). Hasil ligasi lalu digunakan untuk mentranformasi sel bakteri kompeten.

Transformasi
DNA plasmid (10 µl) hasil ligasi ditambahkan ke dalam sel kompeten
(200 µl) di dalam es. Lalu diberikan kejutan panas (heat shock) pada sel
kompeten, dan segera dimasukkan kembali dalam es. Media LB + glukosa (20
mM) ditambahkan ke dalam campuran ligasi, lalu diinkubasi selama 2 jam pada
suhu 37oC. Sebanyak 100 µl campuran diratakan pada petri agar padat LA yang
ditambahkan ampisilin 100 ppm, X-Gal 20 ppm dan IPTG 200 ppm, sisanya
disentrifus dan supernatan disisakan sedikit, lalu resuspensi dan diratakan pada

6

cawan petri lain. Petri diinkubasi semalam dan dicek koloni yang tumbuh
keesokan paginya.

Seleksi Transforman
Seleksi transforman dilakukan menggunakan metode PCR Koloni. Koloni
berwarna putih yang tumbuh setelah transformasi kemudian diuji dengan PCR
koloni menggunakan primer khusus (M13). Produk PCR lalu dielektroforesis.
Teknik PCR koloni digunakan untuk mendeteksi koloni yang membawa DNA
insert dengan cara mengamplifikasi DNA insert tersebut. Koloni yang membawa
DNA insert akan menunjukkan pita yang jelas pada gel elektroforesis dengan
ukuran yang telah diketahui.

Analisis Sekuen Kandidat Gen Selulase
Kandidat gen selulase yang telah disekuen kemudian di analisis dengan
program Bioedit (www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html) dan DNASTAR
untuk menentukan kualitas sekuen DNA dengan memeriksa grafik kromatogram.
Selanjutnya sekuen DNA dibersihkan dari sisa primer dan vektor lalu diperiksa
secara keseluruhan untuk melihat kesatuan DNA nya (DNA contig). Setelah
dikonfirmasi apakah sekuen DNA contig yang didapat berupa fragmen DNA atau
DNA utuh, dilakukan pencarian sekuen terhadap database DNA dengan program
BLASTx (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

3

HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolat Bakteri Rumen Penghasil Selulase
Isolasi gen penyandi selulase yang didahului dengan isolasi bakteri
penghasil selulase telah berhasil dilakukan. Bakteri rumen sapi berhasil
dikulturkan dalam anaerobic jar dan inkubator anaerob buatan yang menjaga
kondisi lingkungan kultur mendekati lingkungan di rumen sapi (suhu, dan
sebagainya). Penentuan bakteri pendegradasi selulosa yang dilakukan dengan cara
seleksi menggunakan media CCRA (Hendricks et al. 1995) berhasil menseleksi
hanya bakteri yang dapat memanfaatkan selulosa yang tumbuh dan menghasilkan
zona bening. Beberapa cawan Petri CCRA yang dikulturkan, cawan Petri dengan
kode CR-8 menunjukkan hasil optimal dengan zona bening yang jelas,
ditunjukkan pada Gambar 2 dibawah.

7

Zona bening yang
dihasilkan karena
degradasi selulosa

Gambar 2 Pertumbuhan isolat CR-8 menghasilkan zona bening dalam media CCRA.

Beberapa isolat lain menunjukkan zona bening namun tidak sejelas zona
bening dari isolat CR-8. Beberapa bakteri selulolitik yang berhasil diidentifikasi
dari rumen sapi ialah Fibrobacter Succinogenes, Ruminococcus albus dan
Ruminococcus flavefaciens (Koike and Kobayashi 2001: Deng et al. 2007).
Bakteri Fibrobacter sp yang telah diisolasi mengindikasikan terdapat dua spesies
yang berbeda, F. succinogenes S85 dan F. intestinalis NR9 dengan tingkat
homologi yang rendah diantara spesies tersebut (Qi et al. 2004: Bera-Maillet et al.
2004). Selain bakteri selulolitik, beberapa bakteri yang ditemukan dalam jumlah
besar pada cairan rumen ialah Prevotella sp dan Eubacterium sp, diikuti dengan
Ruminococcus sp, Clostridium sp, Roseburia sp dan beberapa bakteri lain hingga
mencapai total 25 bakteri yang diketahui (Broadway et al. 2012). Hasil penelitian
tersebut sedikit berbeda dengan yang dilaporkan oleh Ozutsumi et al. (2005) yang
menyebutkan bahwa bakteri terbanyak pada cairan rumen sapi ialah Bacteroides
sp dan Prevotella sp. Wang et al. (2011) mengisolasi dan mengkarakterisasi
enzim glikosil hidrolase dari Neocallimastix patriciarum, semacam fungi yang
hidup di rumen sapi. Penelitian tersebut menunjukkan bahwa selain bakteri, fungi
juga membentuk simbiosis mutualisme dengan sapi.
Enzim selulase terdiri dari beberapa jenis yang ditandai dengan di bagian
mana enzim tersebut memotong ikatan beta 1-4 pada selulosa. endoselulase (EC
3.2.1.4), memotong ikatan beta secara acak pada bagian dalam rantai polimer
selulosa, menghasilkan ujung rantai yang baru. Eksoselulase (EC 3.2.1.91),
memotong dua sampai empat unit ikatan beta dari ujung rantai polimer yang
dihasilkan oleh endoselulase, menghasilkan tetrasakarida, disakarida maupun
selobiosa. Selobiase (EC 3.2.1.21) atau beta-glukosidase menghidrolisis produk
eksoselulase menjadi unit-unit monosakarida (Zverlov et al. 2005). Mekanisme
hidrolisis selulosa menjadi monomer monosakaridanya diilustrasikan seperti pada
gambar 3 di bawah.

8

Gambar 3 Mekanisme hidrolisis selulosa
(Sumber: http://en.wikipedia.org/wiki/File:Types_of_Cellulase2.png)

Beberapa bakteri rumen yang dapat mendegradasi selulola meliputi
Fibrobacter sp, Ruminococcus sp, Clostridium sp, dan bakteri lainnya. Selain
memiliki fungsi selulolitik, bakteri rumen juga memiliki beberapa fungsi
hidrolisis lainnya seperti xilanolitik, amilolitik, lipolitik, degradasi oksalat, dan
beberapa fungsi lainnya (Chiba 2009). Isolat CR-8 selanjutnya ditumbuhkan
dalam media LB untuk keperluan analisis selanjutnya.
Isolat CR-8 yang diduga menghasilkan enzim selulase, dalam uji aktivitas
enzim juga memperlihatkan aktivitas selulase dengan memecah CMC menjadi
glukosa-glukosa bebas yang ditandai dengan perubahan warna larutan DNS.
Berdasarkan kurva standar glukosa yang dibuat dan pengukuran nilai absorbansi
sampel CR-8, diketahui konsentrasi glukosa yang dihasilkan dari pemecahan
CMC 1% ialah 2432 ppm. Nilai tersebut cukup tinggi mengingat batas atas
konsentrasi standar glukosa ialah 1600 ppm.

Kandidat Gen Selulase
Kandidat gen penyandi selulase bakteri CR-8 diperoleh dari isolasi RNA
total bakteri tersebut. Isolasi RNA bakteri rumen isolat CR-8 yang dilakukan
dengan kit peqGOLD Bacterial RNA dari peqlab berhasil dilakukan dengan
volume RNA total sebanyak 30 µL. Keberadaan RNA ditunjukkan dengan adanya
pita pada hasil elektroforesis gel (Gambar 4A).

9

23 S
16 S

A

2000 bp
1650 bp

B

Gambar 4 Hasil isolasi RNA dan amplifikasi gen selulase, (A) dua pita RNA, 23S dan
16S, (B) amplifikasi menggunakan cetakan cDNA dan pasangan primer F1-R1.

Pada Gambar 4A hasil elektroforesis, terlihat dua pita, pita tersebut
menunjukkan subunit 23S dan 16 dari 70S RNA ribosom bakteri. RNA ribosom
merupakan jenis RNA yang jumlahnya paling besar, sehingga bila kedua pita
tersebut terdeteksi menunjukkan kualitas isolasi yang cukup baik. RNA
selanjutnya diubah menjadi cDNA melalui proses transkripsi balik menggunakan
kit Superscripttm First-Strand dari Invitrogen. Hasil yang didapat ialah cDNA
dengan volume total 20 µL.
Untuk mengamplifikasi sekuen cDNA penyandi selulase, primer khusus
didesain berdasarkan cetakan gen enzim selulase dari fungi Trichoderma reesei.
T. reesei dipilih karena enzim selulase fungi tersebut sudah umum diteliti
sehingga diharapkan primer yang didesain khusus tersebut dapat mengamplifikasi
gen penyandi selulase pada bakteri dengan baik. T. reesei banyak dimanfaatkan
dalam industri karena kemampuannya untuk mensekresikan selulase dan hemiselulase dalam jumlah besar (Oinonen 2004). Pembuatan primer mengacu pada
kriteria yang ditetapkan oleh Rozen & Skaletsky (1999). Cetakan gen selulase T.
reesei didapatkan dari bank gen digital di situs NCBI. Primer didesain
menggunakan bantuan program primerselect (Lasergene DNASTAR v7). Karena
muncul berbagai open reading frame (ORF) dari cetakan DNA, maka disiapkan
dua set primer, F1-R1 dan F2-R2. Untuk meminimalisir keambiguan karena
beberapa reading frame, dilakukan perbandingan beberapa sekuen penyandi
selulase dari spesies kerabat T. reesei seperti T. virens, T. harzianum, dan
beberapa bakteri pendegradasi selulosa lainnya. ORF yang paling sering muncul
dijadikan dasar dalam mendesain primer. Persentase GC dan melting point (Tm)
diatur agar dapat seefisien mungkin menempel pada cetakan (Dieffenbach et al.
1993). Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen selulase tercantum dalam
Tabel 1.
Tabel 1 Primer yang didesain dari cetakan sekuen DNA penyandi selulase T.reesei.
Primer

Sekuen (5’  3’)

Tm (oC)

F1

AAG AGG ACC TCG ATA TGA TCT GGA CAC T

62.6

R1

TCA TCC CAC ATT CTA ATG CCT GTA GGT A

61.6

F2

ATG ATC TGG ACA CTC GCT CCC TTT GTG G

67.4

R2

CTA ATG CCT GTA GGT AGA TCC AAT ATC T

58.3

10

Amplifikasi cDNA dilakukan menggunakan pasangan primer F1 dan R1,
F2 dan R2. Data menunjukkan bahwa pasangan primer F1-R1 berhasil
mengamplifikasi gen penyandi selulase, sedangkan kombinasi primer lainnya
gagal mengamplifikasi. Kegagalan kombinasi primer lainnya dalam proses
amplifikasi diduga karena proses annealing primer tidak cukup baik, sehingga
proses amplifikasi tidak berjalan.
Hasil amplifikasi gen selulase menggunakan pasangan primer F1-R1
dikonfirmasi menggunakan gel elektroforesis. Hasil yang didapat ialah pita DNA
dengan ukuran sekitar 1800 – 1900 pasang basa (bp, Gambar 4B). Sebagai
referensi, gen cellobiohydrolase I (eksoglukanase) T. reesei memiliki ukuran 2220
bp (NCBI 2005). Selulase pada sel eukariot (dalam hal ini fungi T.reesei)
umumnya memiliki sistem yang lebih kompleks dibanding selulase pada bakteri,
sehingga perbedaan ukuran sekuen DNA penyandi umum terjadi.
Kandidat gen selulase yang telah dipurifikasi dari gel elektroforesis dan
diklon ke dalam vektor pGEM-T-Easy. Plasmid rekombinan yang dihasilkan
digunakan untuk mentransformasi sel kompeten E. coli strain XL1-Blue.
Penggunaan E. coli strain XL1-Blue sebagai sel kompeten dikarenakan strain
tersebut yang paling optimal dalam transformasi plasmid ke dalam sel (Zhiming et
al. 2005). Strain XL1-Blue memiliki efisiensi transformasi dan colony forming
unit (cfu) paling tinggi dibanding strain DH5α dan TG1. Hasil PCR koloni
mempertegas keberhasilan transformasi sel E. coli. Pita yang cukup intens pada
hasil elektroforesis PCR koloni (Gambar 5) menandakan koloni E. coli membawa
gen target. Sekuensing gen kandidat selulase yang berhasil di klon dilakukan oleh
perusahaan 1st Base di Singapura.
K oloni K oloni K oloni K oloni K oloni K oloni M a rk e r
1
2
3
6
4
5

2000 bp
1650 bp

Gen sisipan yang
diamplifikasi ±1900 bp

Gambar 5 Hasil PCR koloni menunjukkan amplifikasi gen sisipan (selulase).

Data Bioinformatika Kandidat Gen Selulase
Hasil sekuensing kandidat gen selulase dari 1st Base berupa file sekuen
(*.seq) dan file kromatogram (*.ab1). Hasil sekuensing yang baik dapat dilihat
dari grafik kromatogram yang bagus, yaitu puncak setiap basa terlihat jelas dan
berjarak sama dari satu basa ke basa lainnya.

11

Kualitas profil kromatogram sekuen DNA hasil 1st Base secara
keseluruhan terlihat baik dengan noise yang rendah dan puncak yang jelas.
Namun pada beberapa sekuen, kekuatan sinyal kromatogram terlihat rendah. Hal
tersebut dapat terjadi salah satunya karena jumlah DNA sampel yang kurang,
adanya kontaminan, atau proses annealing primer yang kurang (Kingdon et al.
2010).
Kromatogram yang dihasilkan dari proses sekuensing terlihat bersih dari
noise sehingga data sekuen yang dikirim dapat digunakan untuk analisis DNA
(Gambar 6). Namun masih terlihat beberapa bagian dari sekuen DNA yang
merupakan sekuen dari vektor maupun primer yang digunakan saat sekuensing.
Analisis sekuen DNA dapat dilakukan setelah arah dari sekuen tersebut diketahui
sebelum dilanjutkan dengan pensejajaran (Chenna et al. 2003). Untuk mengetahui
arah dari sekuen DNA dan mensejajarkan beberapa sekuen dalam satu waktu,
digunakan sub-program seqman dari program DNASTAR. Seqman mendata arah
dari setiap sekuen dan melakukan analisis terhadap keseluruhan sekuen DNA
untuk menemukan urutan sekuen DNA yang contiguous (DNA contig) dari
gabungan keseluruhan fragmen (overlapping sequence, Gambar 7). Analisis DNA
contig juga berguna untuk menentukan apakah gen yang didapat merupakan
fragmen atau sudah berupa satu gen utuh. Gen yang menyandikan satu enzim
fungsional dari satu sekuen disebut satu gen utuh, sedangkan bila dalam sekuen
tersebut hanya menyandikan sebagian dari enzim yang fungsional maka gen
tersebut masih berupa fragmen. Berdasarkan analisis DNA contig, diketahui
bahwa sekuen-sekuen DNA tersebut membentuk satu kesatuan DNA penyandi
yang utuh.

Gambar 6 Kromatogram sekuen gen selulase.

Gambar 7 Perakitan DNA contig.

Hasil dari analisis DNA contig yang membentuk satu DNA utuh
dikonfirmasi dengan menggunakan program Basic Local Alignment Search Tool
(BLAST) dari NCBI. Program BLAST ialah program yang mencari kemiripan

12

suatu region dalam beberapa sekuen. BLAST membandingkan sekuen nukelotida
atau protein target dengan database yang dimiliki NCBI dan menghitung
persamaan yang dimiliki secara statistik. Jenis BLAST yang digunakan ialah
BLASTx, yaitu program BLAST yang akan menerjemahkan input sekuen DNA
target ke dalam sekuen protein lalu membandingkannya dengan database protein
yang dimilikinya. Berdasarkan hasil pencarian BLASTx, sekuen DNA contig
memiliki kemiripan dengan sekuen glucan endo-1,6-beta-glucanase
[Trichoderma harzianum] (Cruz et al. 1995) dengan tingkat kemiripan mencapai
99%. Sekuen glucan endo-1,6-beta-glucanase tersebut terdiri atas 430 asam
amino, bits score 722 dan E-value 0 yang menunjukkan sekuen DNA contig
memiliki kemiripan yang tinggi dengan sekuen pada database GenBank (Claverie
& Notredame 2007: Davidson and Blaxter 2005).
Sebagai perbandingan, enzim selulase yang dihidrolisis dari rumen kerbau
(famili glikosil hidrolase, GHF), memiliki ukuran sekitar 1200 bp dan masih
berupa fragmen gen (Rungrattanakasin et al. 2011). Enzim serupa lainnya yang
berhasil diisolasi dari rumen ialah GHF 45 dari Fibrobacter succinogenes,
sayangnya gen yang didapat belum utuh karena terdapat beberapa domain yang
absen (Park JS et al. 2007).
Pada sekuen DNA contig juga ditemukan conserved domain yaitu domain
selulase, sehingga menegaskan bahwa sekuen DNA contig menyandi enzim
selulase (Gambar 8).

Gambar 8 Conserved domain selulase dari sekuen DNA contig.

4

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan

Gen penyandi selulase dari rumen sapi berhasil diisolasi dan telah diklon
ke dalam vektor pGEM-T-easy dan dimasukkan ke dalam sel E. coli strain XL1Blue. Sekuen-sekuen DNA yang didapat merupakan satu kesatuan DNA utuh
yang menyandikan enzim endoglukanase yang berdasarkan hasil BLASTx,
memiliki kemiripan mencapai 99% dengan endoglukanase T. harzianum, dan
terbukti mengandung conserved domain enzim selulase pada sekuennya.

Saran
Bakteri penghasil enzim selulase yang diisolasi pada penelitian ini dapat
tumbuh pada kondisi fakultatif anaerobik sehingga bakteri tersebut perlu
diidentifikasi lebih lanjut. Gen selulase yang berhasil diisolasi, perlu
diekspresikan menggunakan vektor ekspresi dan dilakukan karakterisasi enzim
agar sifat dan kemampuan degradasi selulosa enzim tersebut dapat diketahui.

13

DAFTAR PUSTAKA
Ahmad S, Qurrat-ul-Ain N, Aslam S, Naeem S, Rahman, Jamil A. 2003.
Induction of Xylanase and Cellulase genes from Trichoderma harzianum
with different carbon sources. Pak. Jour. Biol. Sci. 6(22): 1912-1916.
Bai S, Kumar MR, Kumar DJM, Balashanmugam P, Balakumaran MD,
Kalaichelvan PT. 2012. Cellulase production by Bacillus subtilis isolated
from cow dung. Archives of Applied Science Research 4(1): 269-279.
Bera-Maillet C, Ribot Y, Forano E. 2004. Fiber-degrading systems of different
strains of the genus Fibrobacter. Appl. Environ. Microb. 70: 2172–2179.
Broadway PR, Callaway TR, Carroll JA, Donaldson JR, Rathmann RJ, Johnson
BJ, Cribbs JT, Durso LM, Nisbet DJ, Schmidt TB. 2012. Evaluation of the
ruminal bacterial diversity of cattle fed diets containing citrus pulp pellets.
Agric. Food Anal. Bacteriol. 2(4): 297-308.
Chenna R, Sugawara H, Koike T, Lopez R, Gibson TJ, Higgins DG, Thompson
JD. 2003. Multiple sequence alignment with the Clustal series of
programs.
Nucleic
Acid
Research.
131(13):3497-3500.
DOI:10.1093/nar/gkg500.
Chen XL, Wang JK, Wu YM, Liu JX. 2008. Effects of chemical treatments of rice
straw on rumen fermentation characteristics, fibrolytic enzyme activities
and populations of liquid-and solid associated ruminal microbes in vitro.
Animal Feed Sci. Technol. 141: 1-14.
Claverie JM, Notredame C. 2007. Bioinformatics for Dummies, 2nd Edition. USA:
Wiley Publishing, Inc.
Cruz J, Toro JAP, Benitez T, Llobell A. 1995. Purification and characterization of
an endo-beta-1,6-glucanase from Trichoderma harzianum that is related to
its mycoparasitism. J Bacteriol. 177(7):1864-1871.
Dashtban M, Buchkowski R, Qin W. 2011. Effect of different carbon sources on
cellulase production by Hypocrea jecorina (Trichoderma reesei) strains.
Int. J. Biochem Mol. Biol. 2(3): 274-286.
Davidson A, Blaxter M. 2005. Ancient origin of glycosyl hydrolase family 9
cellulase gene. Molecular Biology and Evolution 22(5): 1273-1284.
Deng W, Wang L, Ma S, Jin B, Bao He T, Yang Z, Mao H, Wanapat M. 2007.
Comparison of Gayal (Bos frontalis) and Yunnan Yellow cattle (Bos
taurus): rumen function, digestibilities and nitrogen balance during
feeding of pelleted lucerne (Medicago sativum). Asian-Aust. J. Anim. Sci.
20: 900-907.
Dowel VR. 1972. Comparison of techniques for isolation and identification of
anaerobic bacteria. The American Journal of Clinical Nutrition 25: 13351343.
Gupta P, Samant K, Sahu A. 2011. Isolation of cellulose-degrading bacteria and
determination of their cellulolytic potential. International Journal of
Microbiology. 2012:1-5. doi:10.1155/2012/578925.
Hendricks CW, Doyle JD, Hugley B. 1995. A new solid medium for enumerating
cellulose-utilizing bacteria in soil. Applied and Environmental
Microbiology 61(5): 2016 – 2019.

14

Kingdon PG, Gedge F, Donahue WW, Schrijver I, Weck KE, Kant JA, Oglesbee
D, Toydemir PB, Lyon E. 2012. Design and analytical validation of
clinical DNA sequencing assays. Arch Pathol Lab Med. 136: 41-46.
doi:10.5858/arpa.2010-0623-OA.
Koike, S. and Y. Kobayashi. 2001. Development and use of competitive PCR
assays for the rumen cellulolytic bacteria: Fibrobacter succinogenes,
Ruminococcus albus and Ruminococcus flavefaciens. FEMS Microbiol.
Lett. 204: 361-366.
Lee SS, Choi CK, Ahn BH, Moon YH, Kim CH, Ha JK. 2004. In vitro stimulation
of rumen microbial fermentation by a rumen anaerobic fungal culture.
Animal Feed Sci. Technol. 115: 215-226.
Lenting HBM, Warmoeskerken MMCG. 2001. Mechanism of interaction between
cellulase action and applied shear force, an hypothesis. J Biotechnol. 89:
217-226.
Nagaraju M, Narasimha G, Rangaswamy V. 2009. Impact of sugar industry
effluents on soil cellulase activity. Int Biodeter Biodegr. 63:1088-1092.
Oinonen AM. 2004. Trichoderma reesei Strains for Production of Cellulases for
the Textile Industry. Helsinki: VTT Publications 550.
Ozutsumi Y, Tajima K, Takenaka A, Itabashi H. 2005. The effect of protozoa on
the composition of rumen bacteria in cattle using 16S rRNA gene clone
libraries. Biosci. Biotechnol. Biochem. 69(3): 499-506.
Park JS, Russel JB, Wilson DB. 2007. Characterization of a family 45 glycosyl
hydrolase from Fibrobacter succinogenes S85. Anaerobe 13: 83-88.
Qi M, Nelson KE, Daugherty SC, Nelson WC, Hance IR, Morrison M, Forsberg
CW. 2004. Novel molecular features of the fibrolytic intestinal bacterium
Fibrobacter intestinalis not shared with Fibrobacter succinogenes as
determined by suppressive subtractive hybridization. J. Bacteriol 187:
3739–3751.
Rozen S, Skaletsky H. 1999. Primer3 on the www for general users and for
biologist programmers. Method In Mol Biol. 132:365-385.
Rungrattanakasin B, Jirajaroenrat K, Maneewan K, Chaowarat M. 2011.
Molecular cloning of glycoside hydrolase family 9 cellulase gene from
buffalo rumen. 2011 International Conference on Bioscience,
Biochemistry and Bioinformatics Vol.5. Singapore: IACSIT Press.
Wang TY, et al. 2011. Functional characterization of cellulases identified from
the cow rumen fungus Neocallimastix patriciarum W5 by transcriptomic
and secretomic analyses. Biotechnology for Biofuels 4:24.
doi:10.1186/1754-6834-4-24.
Zverlov VV, Schantz N, Schwarz WH. 2005. A major new component in the
cellulosome of Clostridium thermocellum is a processive endo-beta-1,4glucanase producing cellotetraose. FEMS Microbiol. Lett 249: 353-358.

Lampiran 1 Inkubasi kultur bakteri pada inkubator anaerob.

16

Lampiran 2 Seleksi bakteri pada media CCRA.

CR-1

CR-2

CR-3

CR-4

CR-5

CR-6

CR-7

CR-9

17

Lampiran 3 Tabel nilai absorbansi larutan standar glukosa.
Konsentrasi
Absorbansi
(ppm)
100
0.053
200
0.254
400
0.798
800
1.586
1600
1.954

18

Lampiran 4 Grafik linear kurva standar.

Y = 0,1412 + 1,2x10-3X
R = 0,9393
R2 = 0,88

19

Lampiran 5 Uji aktivitas selulase CR-8 (kualitatif).
Ulangan keA
1
2.432
2
2.432
3
1.931
4
1.920
5
1.931

20

Lampiran 6 DNA komplemen (cDNA) CR-8 (volume cDNA 2 µL).

2000 bp
1000 bp

400 bp

cDNA CR-8

21

Lampiran 7 Seleksi hasil transformasi (White/Blue Screen).

22

Lampiran 8 Hasil BLASTx gen selulase dari bakteri rumen sapi.

23

Lampiran 9 Alignment sekuen gen selulase bakteri rumen sapi dengan
endoglukanase T. harzianum.

24

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bogor 5 Februari 1989 dari pasangan Prasodjo
Waluyo dan Iis Arifiantini. Penulis merupakan putra ke 1 dari 4 bersaudara.
Tahun 2006 penulis lulus dari SMA Negeri 7 Bogor dan pada tahun yang
sama melanjutkan ke Institut Pertanian Bogor, penulis memilih Mayor Biokimia
dan lulus tahun 2010. Pada tahun 2011 penulis diterima di Program Studi
Biokimia Program Pascasarjana IPB melalui sponsor Beasiswa Unggulan DIKTI.
Pada tahun 2010 penulis bekerja sebagai tenaga honorer di kantor Program
Internasional (International Collaboration Office), IPB hingga saat ini.

Bogor, September 2013
Penulis