Pengklonan gen-gen yang diinduksi oleh aluminium pada kedelai [Glycine max. (L) Merryl]

PENGKLONAN GEN-GEN YANG DIINDUKSI
OLEH ALUMINIUM PADA KEDELAI
[Glycinemax (L.) Merryl]

Oleh :

SYAIPUL ANWAR

PROGRAM PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
1999

MOTTO :
Kebenaran tidaklah tunggal dan cara mencapainyajuga tidak satu. Realitas &ah h d
konstruksi Rita. Ada kebenaranyang dipemleh dengan Iogika (maternafiRa),eksprerimentasi
Cfmika),permaan, situasi lapanagan (antropologi), m u riyadhah (tashawufl. Kita tidak
akan pernah mencapai k e b e n m yang sesungguhnya untuk menjehkan sduruh fenomena
(Alqw'an 17~85)dan kebenaran mutlak itu hanyalah berasal dari A M (Alqw'an 2:14I).
Oleh karena itu kriteria qu'rani d h pencapaian kebenaranpenelitian iCmiah antam fain
menyebutkan bahwa :
Peneliti harus bebas dari segala kecenderungan (bias) dan hawa nafsu karena

kecenderungan itu dapat menyimpang dari metode i l d (Ar-Rum.29; Shaad.26; AlKahji:28; dun Al-Maidah:8).
Sebelrun i t t e t t t b e ~ i k ~ pdnlam
t ? ~ keputusan
~~
ilmiah, harus ada konfvmasi &ulu
(Al-Hujuraaf:6,12; Ymm:39; An-Najx28 dan AC-Haryr:2).
Harm difahami bet& antarn sebab dan indikator agar seorangpeneliti ti&& mudah
terpaku pada gejala-gejala lahiriah, gejala yang sudah m u m atau hal-hal yang konstras,
karena sering kali menipu peneliti (Al-Baqorah: 8,204,216; Al-Munafiqun:4; dan ArRuum:7).
Perlu diperhafianh a d kualitm daripada kuantitar (Al-Baqorah:249; At-Taubah:25,85;
dun Saba':35,37).
Wajib menjauhi sifat menipu dan maniprrlasi (An-NCc49; Faathic8; AC-Israa':85;
dun YmuP 76).
Hasil-hasilpenelitian harm diperhatikan sedemikian rupa sebelwn disajikan (A&
Qmherlr:83; Thaahna:I4;Al-1sraa':II; Yunus:II; AI-Anbjac37; dan Yusu$IOZ).
D h t m syarat metode ilmiahyaitu memilikipengumtan yang t a j m dnn selalu
diulang-dung cialam berbagai keadaan (Al-An'm73-79.
Sesungguhnya pengumtan yang cermad menhrong mwrculnya percobaan-percobaan
baru yang faktuaL
Analogi merupakan salah satu wasilah terpenting untuk ntemproleh pengetahunn, baik

yang menyangkutpers0alan indrawi rnaupun maknawi (FaathicZ2; A I - M ~ : I O O ;
Fushshilat:34; AsSajdah:I8; Alr4n'am.-122; Ar-Ra'd. 19; Az-Zukhrufi 31-32; Ali
Zmmn:Z91; dan YusufilO$).
Dalam etikapenelithn ilmiah, seorangpeneliti harus bekerja sesm' dengan spesialbmi
ilmunya (AI-Baqarah:32,146; A&'Araa$l87-188; Al-Maidah:lZ6; Ali-Znuan:Z35; AlHyr:I4-I5 danAl-KahfcI I).
Orangyang sukses :(1) selalu berpikir posit& (2) tahu cara mngatasi kegagalan,
(3) memiiiki visi dun menentukan sasman, (4) m ~ ~ mengeloh
p u
waktu
sebaik mungkin, (5) tahu menghargm' hubungan baik dan s&u
mengembangkan komunikasi~silaturahim,(6) percaya akan motivasi
dan ( I ) &iki
jika kepemimpinan.

Dipersembahkan kepada :

1. 1 . i dun a n a k ~ n a k k u :Amin Retnoningsih, Carlina Nurul Fithria, Dianthi
Nurul Fadhilah dan Abdurrakhman Hamid Al-Azhar,.
2. Keenam orang tuaku,
3. Guru-guruku, dun

4. Persada bumipertiwiku Indonesia

ABSTRACT

SYAIFUL ANWAR Cloning of Aluminium Induced Genes in Soybean [Gbcine
m a (L.) Merryl].

(Supervised by ED1 GUHARDJA,

as chairman, and

MUHAMMAD JUSUF, SUHARSONO, DIDY SOPANDIE, and RICHARD C.
GARDNER as members of commitfee).

Aluminium toxicity is a major factor limiting world agricultural production,
particularly in the tropics such as Indonesia that has over 47,6 millions hectare of acidic
soil. Aluminium (AI) comprises 8% of the earth's crust and is present in most soil as
insoluble precipitates. However, under acid conditions (pH < S), soluble AI~+ions are
released and are potent inhibitors of root growth. This research was conducted to
support soybean breeding programmes by molecular approach. The aim of the current

research is to identity Al-tolerant soybean varieties, to obtain Al induced genes and to
increase our understanding of the nature of A1 toxicity.
The research was divided into four experiments : (1) setting up the appropriate
of soybean genotype and assay for A1 induced genes, (2) cloning/isolation of aluminium
induced genes from cDNA libraries, (3) sequencing of the clone genes and (4)
preliminary study of expression of the clone genes in ficherichia wli.
To set up the appropriate of soybean genotype and assay for A1 induced genes.
the effect of aluminium on relative yield of seedling was dettnnined for eight soybean
varietieflmes (Genjah Jepang, Sriyono, Sicinang, Yellow Biloxy, Slamet, Sindoro,

Lumut and Arksoy),

using low ionic strength solution culture technique and were

subjected to A1 stress (0; 0,4; 0,s; 1

1,6; 2,O; 2,4; 2,s and 3,2 mM) for four days.

Based on the fifty percent reduction of root length andlor mass of root plant (Alu-sm),

Lumut was the most sensitive variety with 0,s mM A1 stress, while Yellow Biloxy,
Sicinang, Slamet and Sindoro were most tolerant with A1 stress 2,4 m . .

Using differential screening of the root tips cDNA library prepared from a
soybean Lumut that was exposed to 0,s rnM A1 for 24 h, we have isolated several
Glycine
-

aluminium induced (gmali) cDNAs. Meanwhile, by PCR (Polymerase

Chain Reaction) we have isolated one soybean -arninoacyl peptidase aluminium induced
(sapali) as well. The partial cDNA sequencing of these aluminium induced genes was
determined.
Sequence comparison revealed that the genes are induced by aluminium
correspond to : Plasma membrane p - ~ ~ ~ (Gamlil,
a s e GeneBank accession no.
AF091303)-that triggered for creating an electrochemical

I
f gradient across plasma

membrane; Aminoacyl peptidase (sapali, GeneBanR accession no. AF091304)-which

has serine protease activity; Histone H3 (grnalil4)-whose expressed in metaphase of
cell divition points;

Catalase (gnrali20)-which function as antioxidant;

NADH

Dehydrogenase (gmali49) activity; and Auxin induced protein (gmali50)-suggesting a
possible role of auxin in the regulation of Al tolerance.
Expression of the clone genes to A1 toxic level on Escherichia coli suggested
that all of the clones were involved in Al tolerance.

SYAIFUL ANWAR. Pengklonan Gen-Gen yang Diinduksi oleh Aluminium pada
Kedelai [Gfycine mar (L.) Merryl].

@i bawah bimbingan ED1 GUHARDJA

sebagai Ketua, dan MUHAMMAD JUSUF, SUHARSONO, DIDY SOPANDIE
serta RICHARD C. GARDNER masing-masing sebagai Anggota Komisi).
Keracunan aluminium merupakan %or

pembatas utama produksi pertanian di

dunia, dan khususnya di daerah tropik seperti Indonesia, yang mempunyai areal tanah
podzolik merah b i g bersifat masam sekitar 47.6 juta hektar atau 32% dari total tanah
masam di Indonesia.

Sekitar 8% kandungan kerakllapisan bumi adalah logam

aluminium dan pada umumnya berada &lam bentuk tidak larut (tidak tersedia) bagi

tanaman. Tetapi, di bawah kondisi tanah masam (pH< 5), ion aluminium (Al) menjadi
larut dan berpotensi sebagai penghambat bagi pertumbuhan tanaman khususnya
organljaringan akar.

Sebagai salah satu pendekatan untuk menunjang program

pemuliaan kedelai terhadap agrockologi tanah masam dengan kelarutan A1 tinggi
melalui pendekatan molekuler, maka penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk
mengisolasi, mengidentifikasi sckaligus mendapatkan gen-gen yang diinduksi oleh
aluminium yang terlibat dalam sifat toleransi terhadap cekaman Al.
Penelitian dilaksanakan dalam empat tahap yakni: (1) p e m i l i i galur kedelai
dan penentuan kadar aluminium untuk induksi gen, (2) pengklonan/isolasi gen-gen yang

diinduksi aluminium pa& pustaka cDNA, (3) perunutan kandidat klon cDNA clan (4)
studi permulaan ekspresi klon cDNA di Escherichia coli.
Untuk percobaan p e m i l i i galur kedelai dan penentuan kadar A1 untuk induksi
pen, pengaruh A1 terhadap hasil diamati pada delapan galur kedelai (Genjah Jepang,
Sriyono, Sicinang, Yellow BiloxylYBL, Slamet, Sindoro, Lumut dan Arksoy), dengan

menggunakan kultur air yang berkekuatan ionik rendah dan cekaman A1 dari 0; 0,4;
0,s; 1,2;

1,6; 2,O; 2,4; 2,8 dan 3,2 mM, dalam rancangan Acak Lengkap pola

faktorial tiga ulangan. Berdasarkan peubah persen penghambatan dan bobot kering akar
relatif terhadap kontrol (tanpa cekaman), dihasilkan bahwa Lumut sebagai galur paling

konsisten peka dengan p e n m a n mencapai 50% hasil relatif (AlYPsrrh)
terjadi pada
cekaman 0,8 mM Al. Sedangkan Yellow Biloxy, Sicinang, Slamet dan Sindoro sebagai
galur-galur konsisten toleran dengan Aly-5~-terjadi pada cekaman 2,4 mM Al.
Dengan tehnik penapisan diferensial dan penapisan pita melalui teknik PCR
(F'olymerase Chain Reaction) telah berhasil diisolasi dan dirunut beberapa gen yang
diinduksi oleh aluminium pada kedelai galur Lumut dengan cekaman 0,8 mM Al selama
24 jam melalui pembuatan pustaka cDNA. Dengan tehnik penapisan diferensial telah
diisolasi lhna klon gen masing-masing dinamai gmalil, gmalil4, gmalz20, gmali49, dan
gmali50 (gmali = @cine gax &miniurn induced). Sedangkan melalui penapisan pita
dengan teknii PCR menghasilkan satu klon sapali untuk soybean -arninoacyl pptidase
aluminium hduced.
-

Klon-klon gen tersebut ada yang menyandikam ATPase-proton

Membran Plasma (gmalil, terdaftar di Bank Gen dengan nomor akses AF091303)-yang
mengatur perbedaan konsentrasi H? antara di luar dan di dalam sel;

Peptidase

aminoacyl (sapali, terdaftar di Bank Gen dengan nomor akses AF091304)-yang
mempunyai aktivitas protease; Histone H3 (gmalil4)-berperan penting dalam proses
pembelahan sel; Catalase (gmaIz20)-berfungsi sebagai antioksidan, Dehydrogensse
NADH Cgmali49); dan Auxin induced protein (gmali50)-yang m e n g i n d i i adanya
peran auksin dalam proses toleransi aluminium. Studi permulaan ekspresi klon gen

pada taraf aluminium yang toksii untuk Escherichia coli, menunjukkan adanya indikasi
sitkt toleransi dari semua klon gen dalam mendetoksihkasi Al, sehingga Escherichia
coli tetap tumbuh normal selama 48 jam.

PENGKLONAN GEN-GENYANG DIINDUKSI
OLEH ALUMINIUM PADA KEDELAI
[GCycine mux (L.) Merryl]

Oleh:
SYAIPUL ANWAR
9559 1-AGR

DISERTASI

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor
pada
Program Pascasarjana, Institut pertanian Bogor

PROGRAM PASCASARJANA
INSTITUT PERTANLAN BOGOR
1999

Judul Disertasi

: PENGKLONAN GEN-GEN YANG DIINDUKSI

OLEH ALUMINIUM PADA KEDELAI
[Glycine mar (L.) Merryl]

Nama mahasiswa

: SYAIFUL ANWAR

Nomor Pokok

: 95 591/AGR

Menyetujui :

1. Komisi Pembimbing

Prof. Dr. Ir. H. Edi Guhardia. MSc.
Ketua

Dr.
D

Anggota
r
k

k

Dr. Ir. Didv Soaandie. MAP^.
Anggota

Ikarsono
Anggota

DEA.

ProtDr. Richard C. Gardner
Anggota

2. Ketua Program Studi
ascasarjana IPB

J$fLDr. Ir. Sudirman Yahva. MSc.
Tanggal Lulus : 24 Juli 1999

RIWAYAT HIDUP

Penulis adalah putra kedua Ibunda Djuhariah dan Ayahanda Moch. Taroen,
dilahirkan pada tanggal 10 Mei 1960 di Sumenep Madura.

Pada tahun 1979 penulis lulus dari SMA Negeri Sumenep dan mulai menimba
ilmu di Institut Pertanian Bogor QPB)pada tahun 1979. Gelar Sajana Pertanian bidang
keahlian Agronomi diperoleh pada tahun 1983 dan pada tahun 1995 memperoleh gelar
Magister Sains bidang keahlian Agronomi dari Pascasajana IPB. Sejak Pebruari 1996
diterima sebagai karyasiswa S3 pada Program Studi Agronomi IPB.

Mulai tahun 1982penulis mengamalkan ilmunya di bidang agroindustri dan pada
tahun 1990 sarnpai sekarang bekerja sebagai staf pengajar di Bagian Ilmu Tanaman

Makanan Temak Fakultas Pete-

Universitas Diponegoro (UNDIP) Semarang.

Penulis menikah dengan gadis yang dicintainya 11. Amin Retnoningsih pada

tahun 1984 dan telah d i i a i dua orang putri dan seorang putra, yaitu: Carlina Nurul
Fithria, Dianthi N u d Fadhilah clan Abdurrakhman Hamid Al-Azhari.

KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Ilahi Robbi, karena hanya atas perkenan
dan limpahan rahmat dan karunia-NYA, pertanggungiawaban clisertasi ini &pat
diselesaikan setelah melalui serangkaian proses clan perjalanan panjang yang penuh
tantangan.
Penelitian tentang identifikasi dan analisis genetik ketahanan terhadap cekaman
aluminium jarang dilakukan. Sementara itu, pengetahuan tentang dasar fisiologi dan
molekuler toleransi tanaman terhadap cekaman Al, terlebii lagi pada tanaman-tanaman
penting seperti kedelai, akan memberikan peluang untuk lebii memahami mekanisme
dasar toleransi tanaman terhadap cekaman itu untuk selanjutnya dapat menyediakan
bahan dasar dalam mengembangkan tanaman-tanaman bernilai ekonomis yang toleran
terhadap aluminium.

Pada kesempatan ini, penulis ingin menyampaikan beberapa ucapan terima kasih
kepada yang telah banyak berjasa kepada penulis. Namun, terus terang penulis sulit

untuk membuat prioritas. Pertama, kami menyampaikan penghargaan dan terimakasih
yang tulus kepada Bapak Prof. Dr. Ir. H. Edi Guhardja, MSc., selaku ketua komisi
pembimbiig, serta Bapak Dr. Ir. Muhammad Jusuf, Bapak Dr. Ir. Suharsono, DEA,
Bapak Dr. Ir. Didy Sopandie, M.Agr, dan Bapak Prof. Dr. Richard C. Gardner, selaku
anggota komisi pembimbing, atas segala jerih payah dan waktu yang telah disediakan
dengan penuh keikhlasan, kesabaran dan kelembutan hati dalam memberi birnbiigan,
nasehat, arahan dan dorongan; mulai dari tahap perencanaan, pelaksanaan sampai
penulisan hasil penelitian ini.

Kepada Bapak Dr. Ir. Hajrial Aswidinnoor, MSc. dan

Bapak Dr. Ir. Sumarno, selaku penguji luar komisi, karena kemurahan hati dan
kecendekiannya telah memperkaya bobot dan khasanah tulisan ini, untuk itu penulis
menyampaikan rasa hormat dan banyak terima kasii.

Ucapan terima kasih juga kami sampaikan kepada Rektor Institut Pertanian
Bogor (IPB), Direktur Program Pascasajana (PPs) IPB dan Ketua Program Studi
Agronomi PPs IPB, Rektor Universitas Diponegoro (UNDIP) Semarang, Dekan
Fakultas Petemakan UNDIP Semarang, atas kesempatan yang diberikan kepada penulis
untuk mengikuti pendidikan pascasarjana di IPB Bogor.

Pendidikan

Pasca

Sarjana (BPPS)

Direktorat

Jenderal

Kepada Ti Bantuan
Pendidikan

Tiggi

@IRJENDMTr) Departemen Pendidikan dan Kebudayaan, Tim Hibah URGE Batch I1
a.n. Dr. Ir. Muhammad Jusuf dan Tim Program Sandwich Batch I1 DIRJENDIKTI
Depertemen Pendidikan dan Kebudayaan, Pusat Antar Universitas Bioteknologi (PAU-

BT) IPB dan Center of Gene Technology The University of Auckland; terima kasih atas
bantuannya dalam menyediakan biaya pendidikan dan fasilitas penelitian.
Secara khsusus penulis sampaikan terima kasih yang tulus ikhlas kepada istri
tercinta, Ir. Amin Retnoningsih, atas segala bentuk pengorbanan, kesetiaan, pengertian.
dorongan moril, dan sekaligus bertindak sebagai Bapak bagi putri-putra kami selama ini,
yang sejak tahun 1992 penulis mengikuti program pascasarjana S2 sampai S3 saat ini,
sehingga penulis mampu menyelesaikan tahapan ini.

Ucapan terima kasih yang

mendalam penulis sampaikan kepada putri-putraku tersayang: Carlina Nurul Fithria,
Dianthi Nurul Fadhilah dan Abdwakbman Hamid Al-Azhari, yang sering terabaikan
selama kami menempuh studi sekaligus sebagai pengobar semangat kerja penulis, atas
pengertian, doa dan pengorbanan kalian. Kepada keenam orang tua kami: Ibunda
Djuhariah dan Ayahanda Moch. Taroen, Ibunda Hj. Sangadah clan Ayahanda Hj.
Masroeri, Ibu dan Bapak Ajib Mulyana; yang tanpa mengenal lelah selalu memanjatkan
doa demi keberhasilan putranya, kami menyampailcan m a hormat dan terima kasih
yang setulusnya, Semoga Allah SWT menyayanginya sebagaimana menyayangi kami.

Kepada semua kakak dan adik, terima kasih atas segala perhatian, kasih sayang dan
simpati yang kami rasakan selama ini.
Kepada rekan-rekan sejawat di Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler
Tanaman (Genetika Terapan) PAU-BT IPB: Ir. Elfawati M.Si., Dm. Vivi Anggraini
M.Si., Dra.Ratna Yuniati M.Si., Ir. Nurliia Kasim M.Si., Ir. Muhidi M.Si., Ir. Ence
Darmo Jaya Supena M.Si., Dr. Aris Cahyoleksono, Abdul Mulya, Adi Supardi, dan
rekan-rekan sejawat lainnya yang tidak dapat penuiis sebutkan satu per satu; dan rekanrekan di Laboratorium Plant Molecular Biology, School of Biological Science, The
University of Auckland: Keith D. Richards, Jeanette Kealing, Y i u Dong, Joe Li,
Caroline clan Anna Tuton; penulis mengucapkan salam kompak dan tcrima kasih
sebesar-besamya atas dukungan dan kerjasamanya selama ini.
Akhirnya, semoga apa yang telah penulis susun dalam disertasi ini bermanfaat
bagi khasanah ilmu pengetahuan dan mampu memberikan sedikit sumbangsih dalarn
mengatasi persoalan rendahnya produksi kedelai.

Bogor, Juli 1999

Penulis

DAFTAR SINGKATAN

ADR

auxin down regulated

A1

aluminium

ATP

adenosine triphosphate

BBPI

bowman b i k proteinase inhibitors

BCB

blue copper biding protein

bp

base pair

cDNA

complementary DNA

DEPC

diethyl pyrocarbonate

DNA

deoxyribonucleic acid

DTT

dietrithiol

EDTA

ethylen diamine tetraacetic acid

EB

elution buffer

g

gram

GDI

GDP dissociation proteinase inhibitors

GDP

:

guanidie diphosphate

GST

:

glutathion s-transferase

HSB

:

high salt buffer

hnRNA

:

heterogeneous RNA

IPTG

:

isopropyl-P-D-thiogalactoside

k ~ b

:

kilo pb

LSB

:

low salt buffer

LB

:

luria bertani

ml

:

mili liter

mg

mili gram

M-MLV

moloney murine leukimia virus

mRNA

messenger RNA

MT

metallothionein like protein

PAL

phenyl alanine ammonia lyase

pb

pasangan basa

PCR

polymerase chain reaction

PEG

polyethylene glycol

PER

peroxidase

PPm

part per million

pH

- log [PI

PR2

pathogenesis related 2

RNA

ribonucleic acid

RNAse

ribonuclease

rPm

revolutions per minute

rRNA

ribosomal RNA

SB

sample buffer

SDS

sodium dodecyl sulphate

snRNA

small nuclear RNA

SOD

superoxide dismutase

TBE

tris borate EDTA

TE

tris EDTA

TEN

tris EDTA NaOH

Tris

tris (hydrOxymethy1)-aminomeae

tRNA

transfer RNA

:

mikro

:

unit

:

uItra violet

:

UV-visible

:

volume/volume

:

weight/volume

:

5-bromo-4-chloro-3-indoyl-~-galactoside

:

gravitasi

:

degrees celcius

Halaman
RINGKASAN

......................................................................

KATA PENGANTAR

............................................................

DAFTAR SINGKATAN

viii

.........................................................

..................................................................
DAFTAR GAMBAR ...............................................................
PENDAHULUAN ................................................................
DAFTAR TABEL

..............................................................
Tujuan Penelitian ...........................................................
Hipotesis .....................................................................
Kontribusi Penelitian ......................................................
Latar Belakang

...........................................................
DNA Genom Kedelai ......................................................
Kimiawi Aluminium ......................................................

TINJAUAN PUSTAKA

........................
Toksisitas A1 .......................................................
Toleransi A1 ........................................................
Respon Molekuler Terhadap Cekaman Aluminium ...................
Pengurutan DNA (DNA Sequencing ) ...................................
Regulasi Gen ...............................................................
Fisiologi Toksisitas dan Toleransi Aluminium

..........................................................
Tempat dan Waktu .........................................................
Bahan Tanaman .............................................................
Metode Penelitian ..........................................................
I. Pemilihan Genotipe clan Penentuan Kadar A1 Untuk
Induksi Gen .....................................................................
I1.Pengklonan Gen-Gen (Genes Cloning)yang Diiduksi
oleh A1 ............................................................

BAHAN DAN METODE

iii

xvi
xvii

1. Konstruksi Pustaka cDNA

...........................

...........................
3. Konfirmasi Kandidat cDNA Sasaran ..............
I11. Pengurutan cDNA .............................................
IV. Studi Permulaan Ekspresi Klon cDNA di Escherichia
coli ..............................................................
2 . Penapisan Pustaka cDNA

HASIL DAN PEMBAHASAN

...................................................

I. P e m i l i i Genotipe clan Penentuan Kadar Al Untuk Induksi Gen
I1. Pengklonan Gen-Gen yang Diiduksi oleh Aluminium

...........

...................................
2. Penapisan Pustaka cDNA ....................................
3. Konfirmasi Klon cDNA Sasaran ............................
111.Pengurutan cDNA Klon ...............................................
IV. Studi Permulaan Ekspresi Klon cDNA di Escherichia coli ......
1. Konstruksi Pustaka cDNA

KESIMPULAN DAN SARAN
DAFTAR PUSTAKA

....................................................

..............................................................

DAFTAR TABEL
Teks
Nomor

1. Spesies di dalam genus Glycine Wild, jumlah kromosom somatik,
simbol genom dan daerah penyebarannya ..............................
2. Gen-gen yang diiduksi oleh aluminium pada tanaman

...............

3. Toleransi relatif beberapa galw kedelai berdasarkan beberapa
teknii evaluasi .............................................................
4. Disain primer P 1, P2 d m P3
5.

........................................ :. ...

Perbandingan rataan panjmg dan bobot kering mutlak akar (YO)
relatif terhadap kontrol pada beberapa galur kedelai oleh cekaman
aluminium ..................................................................

6 . Hasil ekstraksi RNA total, mRNA dan cDNA ujung akar kedelai ...
7. Hasil transformasi pustaka cDNA ujung akar kedelai Lumut

8. Karakteristik klon gen hasil isolasi clan i d e n t i f h i

........

..................

Nomor

Halamnn

1. Hubungan antara kelarutan A1 dengan pH media. pH=-log[p]

dan pAl = log [spesies All

..............................................

2. Ilustrasi biologis pengurutan DNA secara emhatis
3. Alur penelitian

4.

..................

............................................................

Peta plasmid pSPORT I (A) dan pBluescript 11SK(+/-)...........

5. h t r a s i biologis penapisan diferensial pustaka cDNA
6. Peta plasmid pGEM-T

.................................................

7. Penarnpilan bibit kedelai hasil cekaman aluminium
8.

9.

.............

................

8

17
19
29

32
34
38

Ringkasan konstruksi pustaka cDNA. A =total RNA, B = utas
pertama dan kedua cDNA dari galur YBL dan Lumut,
C = f r a k s i i i cDNA dan Demokrasi = variasi ukuran sisipan
klon cDNA ................................................................

40

Penapisan diferensial pertama pustaka cDNA yang dilacak
dengan pelacak cDNA yang mendapat cekaman A1 (A) dan
cDNA kontrol (B). Terlihat beberapa kandidat cDNA target

42

......

10. Penapisan diferensial kedua pustaka cDNA yang dilacak

dengan pelacak cDNA yang mendapat cekaman A1 (A) dan
cDNA kontrol (B) .......................................................

43

11. Hasil amplifikasi pustaka cDNA dengan primer P1, m e n g h a s i i
dua pita masing-rnasing be*
a = 850 bp dan b 4 5 0 bp (A).
Reamplifikasi pita berkuran 650 bp (B) serta 850 bp (C).
M = penanda ukuran DNA. 1,2, .,6 = contoWsampe1

............

44

12. Hasil amplifikasi pustaka cDNA dengan primer P2, menghasilkau
satu pita b e d w a n sekitar 850 bp. M = penanda ukuran DNA.
1,2, .,6 = wntoh.sampe1

..............................................

45

13. Hasil amplifikasi pustaka cDNA dengan primer P3, menghasilkan
satu pita berukuran sekitar 1100 bp. M = penanda ukuran DNA.
1,2, ...,6 = wntoWsampe1

45

14. Hibridisasi southern kandidat klon cDNA dengan pelacak cDNA
perlakuan (A) dan cDNA kontrol (B). Hibridisasi diferensial
tq-adi pada klon no. 14,20,49 dan 50

46

..

..

.............................................

..............................

15.

..........
....................................

Induksi gen gmalil selama cekaman 0.8 mM A1 24 jam

16. Pola pita gen sapalzkasil PCR (2)

a
w oleh cekaman A1 selama 24 jam
17. Induksi gen s

...............

18. Susunan nukleotida dan asam amino klon gmalil yang
menyandikan ATPase-proton Mernbran Plasma. Asam amino
terletak di bawah susunan nukleotida. Susunan nukleotida ini
&pat diakses pada Bank Gen Data dengan nomor AF091303 .....
19. Perbandingan asam amino ATPase-proton Membran Plasma
kedelai terhadap ATPase-proton Mernbran Plasma tanaman
lainnya ...................................................................
20. Susunan nukleotida dan asam amino klon gmalil4 yang
menyandikan Histone H3. Kode asam amino terletak di bawah
susunan nukleotida ......................................................
21. Perbanclingan asam amino Histon H3 kedelai terhadap Histon
H3 tanaman lainnya .....................................................
22.

Susunan nukleotida dan asam amino klon gmali20 yang
menyandikan Catalase. Kode asam amino terletak di bawah
susunan nukleotida ......................................................

23. Perbandingan asam amino Catalase kedelai terhadap Catalase
Tanaman jagung .........................................................
24.

Susunan nuklwtida dan asam amino klon gmaIi49 yang
menyandikan NADH Dehydrogenase. Kode asam amino
terletak di bawah susunan nukleotida .................................

25. Perbandingan asam amino NADH Dehydrogenase kedelai
NADH Dehydrogenase FIexamiapicta ................................
26. Susunan nukleotida dan asam amino klongmali50 yang
menyandikan Auxin induced protein. Kode asam amino
terletak di bawah susunan nukleotida .................................
27. Perbandingan asam amino Auxin Induced Protein kedelai
Terhadap Auxin Induced Protein tanaman lainaya ..................
28. Susunan nuklwtida dan asam amino klon sapali yang
menyandikan Aminoacyl peptidase. Asam amino terletak
di bawah susunan nukleotida. Susunan nukleotida ini &pat
diakses pada Bank Gen Data dengan nomor AF091304 ............
29. Perbandingan asam amino Aminwyl peptidase kedelai denAminoacyl peptidase Arabidopsi fhaliana ............................

30. Pertumbuhan E. coli DHlOB (kontrol dan transfonnan) terhadap
cekaman aluminium selama 24 jam ...................................

61

31. Ekspresi klon gmalil (PMA) selama 48 jam oleh cekaman
300 ppm A1 di Escherichia coli DHlOB .............................

62

32. Ekspresi klon gmalil4 (Histone H3) selama 48 jam oleh cekaman
300 ppm A1 di Escherichia coli DHlOB .............................

62

33. Ekspresi klon gmalr20 (Catalase) selama 48 jam oleh cekaman
300 ppm A1 di Escherichia coli DHlOB .............................

63

34 . Ekspresi klon gmali49 (NADH Dehydrogenase) selama 48 jam
oleh cekaman 300 ppm A1 di Escherichia coli DHlOB ............

63

35. Ekspresi klongmali50 (Auxin induced protein) selama 48 jam
oleh cekaman 300 ppm A1 di Escherichia coli DHlOB ............

64

36. Ekspresi klon sapali (soybean aminoacyl peptidase) selama
48 jam oleh cekaman 300 ppm A1 di Escherichia coli DHlOB

64

...

Latar Belakang
Tanaman dihadapkan pada berbagai cekaman (abiotik danlatau biotik) dalam
hidupnya, baik yang bersifat kronis maupun akut. Cekarnan biotik dapat berupa hama,
penyakit, dan gulma; sedangkan kekeringan, saliiitas, kernasaman, logam berat, dan
suhu merupakan sebagian dari bentuk cekaman abiotik. Sekitar 47,6 juta hektar lahan
pertanian Indonesia b e ~ p atanah podzolik merah kunimg yang bersifat masam
(Syarifuddin dan Abdurachman, 1993), clan jenis lahan ini akan banyak dirambah oleh
program ekstensifikasi tanaman pangan termasuk di dalamnya tanaman kedelai. Oleh
karenanya, upaya pengkajian adaptasi kedelai terhadap agroekologi tanah masam sangat
penting artinya dalarn menunjang program swasembada kedelai.

Penelitian ini

difokuskan kepada respon molekuler tanaman kedelai terhadap cekaman aluminium.
Aluminium (Al) diketahui sebagai salah satu faktor utama penyebab keracunan
bagi tanaman yang tumbuh di tanah yang bersifat masam, dengan potensi luasan di
dunia sekitar 1x10~
hektar, mencakup daerah tropis dan subtropis (VanWambeke, 1976;
Haug, 1984; Moller et al., 1984). Walaupun telah banyak dilaporkan pengaruh A1
terhadap pertumbuhan dan perkembangan tanaman (Wagatsuma et al., 1987; Hoa Le
Van et al., 1994; Ryan et al., 1994; clan Sasaki et al., 1994), tetapi masih belum banyak
mengungkap mekanisme dasar tentang toleransi tanaman terhadap cekaman Al.

Gejala pertama yang tampak pada tanaman akibat cekaman a l d u m adalah
pa& akar, d i i akar menjadi pendek dan menebal khususnya akar utama (Sasaki et

al.. 1992, 1994; Ryan et al., 1993, 1994; clan Prihadi et al., 1995). Hal ini karena
proses pembelahan clan pemanjangan sel terganggu.

Akibatnya, pextumbuhaa dm

perkembangan akar terhambat, dan daiam jangka panjang akan mempengaruhi
pertumbuhan dan perkembangan bagian tajuk tanaman (Yamamoto et al., 1992).
Penggunaan kedelai yang toleran di lahan yang bersifat masam dengan kelarutan
aluminium (Al) tinggi merupakan salah satu alternatif terbaik dalam pengembangan clan
peningkatan pertanaman kedelai.

Bagian terpenting dari pendekatan ini adalah

bagaimana menentukan faktor-faktor fisiologi, biokiiia, genetika dan molekder
tanaman yang berkaitan dengan toleransi terhadap cekaman Al. Dengan mengetahui
sifat-sifat tanaman yang demikian dapat berguna dalam penapisan pada populasi
tanaman yang besar, disamping bemanfaat sebagai indikator ada atau tidaknya
potensial keracunan A1 pa& tanah, sekaligus dapat mempelajari mekanisme dasar
tentang adaptasi tanaman terhadap keracunan Al.
Taylor (199 1) memberikan dua postulasi mekanisme toleransi tanaman terhadap
aluminium. Pertama, mekanisme eksternal (A1 exclusion) seperti imrnobilisasi A1 di
diiding sel, selektifitas plasma membran terhadap Al, induksi pH di daerah perakaran
atau apoplas akar, eksudasi senyawa-senyawa kelat dan Al-eflux. Kedua, mekanisme
internal (A1 inclusion) mencakup kelatisasi A1 di sitosol, kompartementasi A1 di
vakuola, pengikatan Al oleh protein (A1 binding-protein), penurunan aktivitas beberapa
enzirn tertentu dan induksi sintesis protein spesifik.
Beberapa postulasi di atas sebagian telah dibuktikan kebenarannya oleh beberapa
peneliti, antara lain menyatakan bahwa tanaman yang toleran A1 mempunyai
kemampuan: (a) mensekresikan senyawa-senyawa organik seperti asam sitrat, asam
malat, asam oksalat, asam fulvat (Ojima et al., 1984; Ryan et al., 1995 a,b; Sopandie et
al., 1996; Ma et al., 1998 dan Zheng, 1998) dan senyawa fenilpropanoid seperti asam
kafeat dan asam klorogenat (Yamamoto et aL, 1998) ke dalam daerah perakaran
membentuk kompleks dengan A1 dan mencegah serapan A1 oleh tanaman; @)

meningkatkan kapasitas tukar kation dinding sel (HOIS~,
1996) dan, potensial listrik
(depolarisasi) dindiig sel

(Papemik dan

Kochian, 1997) serta menginduksi pH

perakaran dan apoplas akar (Sopandie et al., 1996) sehingga A1 menjadi bentuk tidak
toksik bagi tanaman; dan (c) menstimulir peningkatan aktifitas senyawa antioksidan
seperti peroksidase (PER), superoxide dismutase (SOD), glutathion s-transferase (GST)
dan catalase (Richard et at., 1998) sexta M ~ + i*n j h melalui peningkatan aktifitas Mgtransporter (MacDiarmid clan Gardner, 1998).
Dibandiigkan dengan perkembangan fisiologi/biokirnia mekanisme toleransi
tanarnan terhadap cekaman Al, masih sangat sediit studi yang terkait dengan genetika
molekdernya.

Beberapa studi genetika telah dilaporkan khususnya pada tanaman

monokotil seperti gandum (Aniol, 1990; Gourley et a[., 1990; dan Delhaize et al.,
1993) dan jagung ( Rhue et al., 1978) serta tanaman dikotil seperti kedelai (Jusuf et al.,
1997), dimana gen yang mengontrol karakter toleransi terhadap A1 bersifat poligenik
dan dominan.

Sampai saat ini beberapa gen yang diinduksi oleh A1 telah berhasil diisolasi dari
tanaman gandum dan Arabidopsis, diantaranya menyandikan Metallothionein Like
Protein (MT), Bowman Birk Proteinase Inhibitors (BBPI), GST, Blue Copper Binding
Protein (BCB), SOD dan Reticuline Oxygen Oxidoreductase (Snowden dan Gardner,
1993; Richard dan Gardner, 1994; Richard et al., 1994; Snowden et al., 1995 dan
Richard et el., 1998).
Dengan cara yang sama Ezaki et al. (1995, 1996 dan 1997) berhasil mengisolasi
gen-gen tembakau yang menyandikan GST, PER dan GDP Dissociation Proteinase
Inhibitors (GDI), yang terinduksi oleh cekaman Al. Sedangkan Joe et al. (1997) mampu
mengklon gen dari mikroba tanah Arthrobacter vbcosus yang tumbuh di lmgkungan

tanah masam, dinamai dengan ALUZ-P, yang mempunyai aktifitas terhadap sifat

toleransi terhadap aluminium. Dari organisme yeast dihasilkan dua geq, masing-masing
ALRl dan ALR2, dengan fungsi sebagai Mg transporter (McDiannid dan Gardner, 1998)

yang terinduksi oleh cekaman Al.

Dalam ekspresinya, semua gen di atas selain

diinduksi oleh Al juga terinduksi oleh beberapa stres lain seperti logam (Cu,Fe, Zn, Ga,
La), cekaman osmotik, cekaman oksidasi, ozon, pelukaan, clan suhu. Fenomena ini
menunjukkan bahwa gen-gen tersebut tergolong kepada gen-gen stres dan tidak bersifat
spesifik terhadap cekaman Al.
Pengklonan (cloning) merupakan suatu upayatusaha (dari kumpulan teknikteknik eksperimental) untuk mengisolasi, mengidentifikasi dan mdipatgandakan suatu
fiagmen dari materi genetik (DNA) dalam bentuk askya. Melalui analisis kinetik
DNA, diketahui bahwa genom kedelai (Glycine max) mengandung sekitar 1.55 x106 kpb
(Goldberg, 1978; Gurley et al., 1979). Karena genom diploid kedelai memilii
kromosom 2n=40 (Ha~dlydan Hymowitz, 1973), maka setiap DNA kromosomnya
memiliki rata-rata panjang sekitar 77.5 x lo3 kpb. Disamping itu, diketahui pula bahwa
kedelai ini mempunyai sekitar 60% urutan basanya sebagai basa berulang, baik terdapat
secara mengelompok maupun terpisah (Pellegrini dan Goldberg, 1979).

Tujuan Penelitian
Berdasarkan pennasalahan seperti yang diuraikan di atas, maka penelitian
pengklonan gen-gen (genes cloning) yang diiiduksi oleh A1 pada kedelai ini sangat
penting dan bertujuan untuk: (1) mengklon dan mengoleksi gen-gen yang diinduksi oleh
A].; (2) mengi&ntiNcasi/mengwut gen-gen yang diiiduksi oleh Al.; dan (3) studi
permulaan ekspresi dari gen-gen yang diiduksi oleh A1 pada Escherichia coli.

Hipotesis
Hipotesis yang diajukan adalah:
1. Gen-gen yang terkait dengan sifat toleransi terhadap cekaman A1 dapat
diinduksi keberadaannya dengan perlakuan cekaman A1 tertentu, sekaligus
&pat diisolasi dan diidentifikasi.
2. Klon gen yang terkait dengan sifat toleransi terhadap cekaman Al, dapat

terekspresi di Escherichia coli.

Kontribusi Penelitian
Kontribusi Penelitian yang &pat disumbangkan oleh penelitian ini antara lain
adalah :
1. Dapat memahami mekanisme dasar proses metabolisme tanaman khususnya

t o l e m i Al, melalui analisis gen-gen hasil pengurutan DNA (DNA

sequencing) yang terkait dengan sifat toleransi.

2. Dapat mengembangkan tanaman pertanian dengan sifat unggul, dengan
memanfaatkan klon gen yang terkait dengan sifat toleransi, melalui proses
tranfer gen, pada tamman-tanamanbemilai ekonomis.

3. Dapat memanfaatan klon gen sebagai penanda molekular clan pemetaan
genetik.

TINJAUAN PUSTAKA

DNA Genom Kedelai
Kedelai Glycine mar (L.) Merry1 termasuk kelas Diotiledon, ordo Polypetales,
famili Legurninosae, sub-famili Papilionoidae, genus Glycine, sub-genus Soja dan
spesies mar. Menurut Hyrnowitz (l970), Glycine max me~pakanhasil domestikasi

dari jenis liar Glycine soja atau Glycine ururiensis yang menurut k l a s i f i i n y a
termasuk subgenus Soja. Keduanya merupakan tanaman semusim dan memiliki jumlah
kromosom yang sama yaitu 2n=40 dengan simbol genom GG.
Spesies Glycine mar terdii dari beribu-ribu varietas. Koleksi terbesar dipunyai
oleh Amerika Serikat (Bernard clan Hittle, 1976), dimana antara varietas yang satu
dengan yang lain dibedakan oleh, antara lain: sifat morfologi, sifat kimia biji, respon
terhadap hama dan penyakit, reaksi terhadap lingkungan tumbuh khusus, dan sifat
agronomi. Lebii dari sepuluh jenis kerabat liar kedelai telah berhasil diidentifiii dan
ditentukan simbol genomnya (Tabel 1) berdasarkan pada analisis sitogenetik dari hasil
persilangan interspesifik.

.

Melalui analisis kinetik DNA, diketahui bahwa genom kedelai (Glycine mar)

mengandung sekitar 1.55 x106 kpb (Goldberg, 1978; Gurley et al., 1979). Karena
genom diploid kedelai m e m i l i kromosom 2n=40 (Hardly clan Hymowitz, 1973), maka
setiap DNA kromosomnya memiliki rata-rata panjang sekitar 77.5 x lo3 kpb.
Disamping itu, diietahui pula bahwa kedelai ini mempunyai sekitar 60% urutan basanya
sebagai basa berulang, baik terdapat secara mengelompok maupun terpisah (Pellegrini

clan Goldberg, 1979).

Tabel 1. Spesies di dalam genus Glycine Wild, jumlah kromosom somatik,
simbol genom dan daerah penyebarannya*)
.
Table I .

Species in Glycine Wild, amount of somatic chromosome, symbol ofgenome and
distribution zone7

*) Adaptasi dari Hymowitz (1970); Sing dan Hymowitz (1985); Sing et al. (1988);
Tindale dan Craven (1988) dan Hymowitz (1991).
*)Adaptationfrom Hymowih (1970); Sing dan Hymowitz (1985); Sing el al. (1988); Tindale dan
Craven (1988) don Hymowih (1991)

Kimiawi Aluminium

Terdapat berbagai bentuk aluminium di dalam suatu media tanah atau larutan
hara dan secara relatif kelarutan aneka bentuk A1 ini tergantung pada pH media.
Sebagaimana terliit pada Garnbar 1 menunjukkan bahwa pada pH < 5, ~ 1merupakan
+ ~
bentuk paling dominan disamping bentuk lainnya seperti AI(OH)+~
dan Al(OH)2'.

Pada

kondisi pH netral aluminium menjadi bentuk tidak larut Al(OH),, dan pada kondisi
allcalin, aluminium berubah bentuk menjadi AI(0H);

Garnbar 1. Hubungan antara kelarutan Al dengan pH media.
pH = - log [PI,dan pAl = log [spesies All
(Adaptasi dari Snowden, 1994).
Figure I . Correlation between solubility of A1 and pH solution.
pH = - log
dan pAI = log [spesies Al]
(Adaptationfrom Snowden, 1994)

[a

Aluminium dapat berinteraksi baik dengan senyawa organik maupun anorganik.
Interaksi dengan senyawa (anion) organik paling kuat tejadi dengan asam-asam
dikarboksiiat seperti sitrat dan malat (Jackson, 1982; Suhayda dan Haug, 1984). Dan
asam-asam dikarboksilat tersebut sangat efektif sebagai bahan amelioran untuk

m e n d e t o k s i i i A1 (Neet et al., 1982; Conner dan Meredith, 1985). Sedangkan
interaksi A1 dengan senyawa (anion) anorganik seperti sulfat, fosfat, nor dan silikat
membentuk suatu kompleks yang mempunyai affinitas tinggi terhadap oksigen atau air
(Konishi dan Miyamoto, 1983; Hodson dan Evans, 1995: Haug, 1984). Interaksi A1
dengan anion tersebut berpotensi untuk meningkatkan pH perakaran sekaligus &pat
membuat rancu pengaruh toksisitas A1 dengan defisiensi unsw tertentu seperti fosfat,
karcna terbentuknya kompleks AI-P yang tidak tersedia bagi tanaman. Oleh karenanya,
penggunaan konsentrasi anion yang tidak tinggi sekaligus mencegah interaksinya
dengan A1 dapat membantu melihat pengaruh toksisitas A1 yang sebenarnya.

Fisiologi Toksisitas dan Toleransi Aluminium
Toksisitas Al. Gejala pertama yang paling mudah diienali pada tanaman akibat
cekaman A1 adalah pada akar, dimana akar menjadi pendek dan menebal (stubby,
thickenned, coralloid) khususnya akar utama (Sasaki et al., 1992, 1994; Ryan et al.,

1993, 1994; dan Prihadi et a[., 1995). Hal ini tejadi karena proses pembelahan dan
pemanjangan sel terganggu. Akibatnya, pertumbuhan dan perkembangan akar tanaman
terhambat, dan dalam jangka panjang dapat menimbulkan kemampuan tanaman
menyerap unsur hara berkurang (tanaman seolah-olah menderita defisiensi unsw hara
seperti P, Ca, Mg, Ca, atau Fe) dan tanaman menjadi peka terhadap kekeringan sehingga
berakibat pada pertumbuhan dan perkembangan bagian tajuk tanaman (Yamamoto et al.,
1992).
Untuk &pat memahami mekanisme toleransi Al, sangatlah penting untuk
mengetahui: (i) bentuk aluminium yang menjadi toksii bagi tanaman (fitotoksik) dan
(ii) sasaran utarna dari bagian tanaman yang mengalami kerusakan akibat cekaman
aluminium.

Bentuk-bentuk aluminium di dalam tanah dapat berupa ion trivalen (AI'~),
bentuk hidroksida seperti AI(OH)+~,AI(OH)2+, AI(OH)3, AI(OH)4', atau berasosiasi
dengan berbagai senyawa organik dan inorganik seperti PO>,

sod-*,F,asam-asam

organik, protein dan lipids sebagaimana diilustrasikan pada Gambar 1 (Haug, 1984;
Marschner, 1991; DeIhaize dan Ryan, 1995).

Diantara bentuk-bentuk A1 tersebut,

A I + ~m e ~ p a k a nbentuk yang paling toksik bagi tanaman dan kelarutannya sangat
dipengaruhi oleh pH medialtanah. Dari gambar 1 tersebut nampak bahwa pada pH = 4
kelarutan A I +tertinggi
~
dan menurun seiring dengan peningkatan pH media.
Sementara itu, tanah masam dapat tejadi karena banyaknya kation tercuci dari
tanah, yang disebabkan antara lain oleh praktek budidaya tanaman yang intensif clan
atau hujan. Oleh karena itu, untuk melihat pengaruh fitotoksik Al, sebaiknya digunakan
aluminium dalam bentuk A I + ~pH
, media = 4 dan kekuatan ioniknya rendah (Kinraide,
1991).
Untuk kepentingan pengklonan gen yang dilakukan dengan cara induksi atau
memberikan cekarnan pada tanaman, periu dicari pada bagian jaringan tanaman mana
cekaman tersebut pertarna kali menampakkan responlgejalanya. Dari bagian jaringan

tanaman itulah nantinya akan diisolasi gen-gen hasil induksi oleh cekaman tersebut.
Beberapa hasil penelitian menunjukkan bahwa ekspresi gen-gen yang induksi oleh A1

(pada tanaman Jagung) berada pada ujung akamya (di belakang tudung akar atau daerah
pembelahan dan pemanjangan sel), berjarak

* 3-5 mm (Bennet dan Breen, 1991;

Ryan

et al., 1993; Jones dan Kochian, 1995). Di samping itu, agar ekspresi gen hasil induksi
menampakkan hasil atau ada perbedaan dengan yang tidak diinduksi, maka respon
bagian tanaman yang mengalami induksi atau menampakkan gejala cekaman harus
mempunyai perbedaan yang cukup jelas, misalnya minimal berbeda setengah dari yang
tanpa cekaman (Basu et al., 1994; Hoa Le Van et al., 1994; Ryan et al., 1994; dan

Samuel et al., 1997). Dari fenomena ini, maka ujung akar tanaman sepanjang i=
3-5 mm
merupakan sasaran utama toksisitas A1 sekaligus sebagai dasar untuk mempelajari lebii
jauh mekanisme toleransi (fisiologi, biokimia, genetika dan molekular) tanaman
terhadap cekaman Al.
Toleransi Al. Sesuatu unsur yang berkebiian pada media tumbuh tanaman,
dapat mengganggu metabolisme melalui: (i) kompetisi dengan unsur esensial lain
&lam penyerapan, (ii) menonaktifkan suatu enzim, (iii) menggantikan unsur-unsur
esensial dari tempat berfungsinya, atau (iv) mengubah struktur air. Oleh karena itu,
tanaman yang toleran terhadap kelebihan A1 pada media turnbuhnya, harm rnarnpu

mengurangi absorpsi ion A1 oleh aka atau mempunyai berbagai cara menetralh
pengaruh A1 setelah diserap tanaman. Bagian terpenting dari pendekatan ini adalah
bagaimana menentukan respon-respon fisiologi, biokimia, genetika, seluler clan
molekuler tanaman yang berkaitan dengan toleransi terhadap cekaman Al. Dengan
mengetahui sifat-sifat tanaman yang demikian dapat berguna dalam penapisan pada
populasi tanaman yang besar, disamping bermanfaat sebagai indikator ada atau tidaknya
potensial keracunan A1 pada tanah, sekaligus dapat mempelajari mekanisme dasar
tentang adaptasi tanaman terhadap keracunan Al.
Beberapa karakter fisiologi toleransi tanaman terhadap A1 menunjukkan bahwa
sifat tanaman yang lebii toleran terhadap cekaman A1 mampu: (I) mengakumulasi A1
lebii sedikit sehingga toksisitas A1 relatif kecil (Sasaki et al., 1994; Delhaize dan Ryan,
1995; Lazof et al., 1994; Sopandie et aL, 1996); (2) mengakumulasi anion nitrat lebih
tinggi dibandingkan kation amonium dan menginduksi pH risosfir lebih tinggi
mendekati pH optimal untuk pertumbuhan tanaman (Miyasaka el al., 1989; Anwar et

al., 1996; Degenhard, 1998); (3) mensintesis senyawa-senyawa asam dikarboksilat
seperti malat, oksalat, sitrat, dan fulvat serta senyawa fenil propanoat seperti kaffeat,

sebagai pengkelat A1 sehingga toksisitasnya menjadi rendah (Ojima et al., 1984; Ryan et
al., 1995 a,b; Sopandie et al., 1996; de la Funte et al., 1997; Ma et al.. 1998 dan Zheng,

1998);

(4) meningkatkan aktifitas H + - A T P ~membran
~~
plasma, yang mengatur

keseimbangan ion proton antara di dalam dan di luar plasma membran sel, sehingga
terjadi depolarisasi di membran plasma dan secara berantai mempengaruhi aktifitas
metabolisme turunannya seperti aktifitas K-channel dan Ca-transporter yang masingmasing berperan di dalam proses detoksifikasi Al (Kasai et al., 1993, 1995; Kinraide et
al., 1994; Sasaki et al., 1995; Huang et al., 1996; Kumar, 1996; Larsen et al., 1998;

Maathuis et al., 1998); (5) mensintesis protein spesifik pada membran (Picton et al..
1991; Basu et al., 1997) dan protein tertentu dari ujung akar (Marzuki et al., 1997),
yang tidak ditemukan pada genotipe peka; serta (6) meningkatkan aktifitas enzim
tertentu seperti reduktase nitrat (Anwar et al., 1996).

Respon Molekuler Terhadap Cekaman Aluminium
Salah satu peran penting dari studi mengenai respon molekuler terhadap
cekaman A1 adalah untuk dapat lebih memahami mekanisme toieransi A1 baik yang
terjadi pada organisme eukariot maupun prokariot. Pengklonan gen-gen yang responsif
terhadap cekaman aluminium merupakan langkah awal yang dapat ditempuh untuk
dapat memahami mekanisme tersebut.
Mekanisme toleransi tanaman terhadap cekaman aluminium, terutama pada
tingkat molekuler, belum sepenuhnya diietahui dengan jelas.

Pada tingkat

perkembangan tanaman, mekanisme tersebut sangat kompleks dan melibatkan banyak
gen (Jusuf et al., 1997); tetapi pada tingkat biokirnia sel, mekanisme yang terjadi bisa
sederhana dan mungkin hanya melibatkan satu gen (de la Funte et al., 1997; Ma et al.,
1998 dan Zheng, 1998). Biosintesis suatu senyawa, sebagai respon terhadap kondisi

cekaman, mungkin hanya membutuhkan lintasan biokimia yang sederhana dengan
sejumlah kecil enzim yang terlibat, sehingga hanya melibatkan sejumlah kecil gen.
Namun dernikian, pengetahuan tentang litasan biokimia clan gen-gen yang terlibat di
&lam mekanisme toleransi serta fungsi dari protein spesifik hasil ekspresi dari gen-gen
tersebut, sampai saat ini masih amat terbatas.
Strategi pengklonan gen dimulai dari suatu upaya mengisolasi suatu fragmen
DNAIgen dari dari suatu pustaka DNA. Terdapat dua jenis pustaka DNA, yaitu: (1)
pustaka cDNA, yang merupakan kumpulan potongan DNA sebagai duplikat dari suatu
populasi mRNA sehiigga hanya terdiri dari populasi sekuens DNA aktif pengkode
protein, dan (2) pustaka genom, sebagai kumpulan dari potongan DNA yang terdiri dari
klon-klon gen dari semua genom yang disamping mengandung urutan DNA yang
berekspresi, di dalamnya juga tardapat urutan-urutan DNA lain seperti urutan DNA kopi
berulang, d i i a pada tanaman tingkat tinggi porsinya sangat besar.

Pembuatan

pustaka cDNA dalam program pengklonan suatu gen aktif, memberikan keuntungan
dibandingkan dengan pembuatan pustaka genom. Sebab, dengan pustaka cDNA yang
hanya terdiri dari urutan DNA yang &if berekspresi, proses seleksi untuk mendapatkan
gen yang menjadi sasaran menjadi jauh lebii ringan. Jadi, dari asal fragmen DNA yang
berbeda akan berbeda pula pendekatan strategi pengklonan yang digunakan (Brown,
1991).
Untuk menyusun kepustakaan DNA yang lengkap atau hampir lengkap, Clark

dan Carbon (1976) telah menurunkan suatu rumus yang berkaitan dengan probabilitas
(P) untuk memasukkan suatu urutanlfragmen (F) DNA tunggal terklon dari G ukuran

genom di darn kepustakaan acak dari N r e k o m b i i bebas, yaitu:
N = [ ln (1-P):ln (I-FIG) 1.

Fragmen DNA yang diiiginkan tersebut dapat bempa suatu gen yang aktif
mengendalikan sifat tertentu atau klon-klon DNA lain yang akan digunakan sebagai
penanda molekular. Jika DNA yang ingin diklon berupa gen aktif pengkode suatu
proteinlenzim, maka ada beberapa altematif pendekatan dalam penentuan strategi
pengklonan yang akan dilakukan:
A. Bila DNA atau produk dari gen sasaran (protein atau enzim) telah diketahui, maka

yang umum dilakukan adalah : (1) bila berupa suatu urutan DNA yang diketahui,
maka dapat memanfaatkan urutan DNA yang telah diketahui itu (baik yang berasal
dari satu spesieslhomologous maupun berbeda spesieslheterologous) untuk melacak
suatu pustaka DNA;

(2) bila berupa suatu proteidenzim yang diketahui, maka

dapat menganalisa urutan asam amino dari proteidenzim tersebut kemudian
mendeduksi dan mensintesis oligonukleotida kodonnya untuk kemudian dipakai
sebagai pelacak dalam menyeleksi pustaka DNA yang dibuat (pendekatan
heterologous bila DNA tersebut berasal dari lain spesies, atau pendekatan
homologous bila DNA tersebut berasal dari spesies yang sama), atau melalui teknik
a d i s a imunokimia, dengan jalan membuat antibodi dari proteinlenzim dimaksud
untuk selanjutnya antibodi ini dipakai untuk menyeleksi pustaka DNA yang dibuat.
B. Bila DNA atau protein/enzim dari gen sasaran belum diketahui, maka pendekatan
yang dapat dilakukan, yakni: (1) menggunakan teknik induksi terhadap gen sasaran
dengan cekaman A1 tertentu, baik dilakukan pada organisme yang toleran maupun
yang peka A1 dan dilacak dengan tehnik penapisan diferensial (Mundy dan Chua,
1988 dalam Aswidinnoor, 1991), dengan prinsip bahwa gen yang menjadi sasaran
diiiduksi untuk berekspresi, kemudian mRNA diisolasi untuk membuat pustaka
cDNA, clan cDNA yang terbentuk diseleksi untuk mendapatkan gen khsusus yang
berekspresi oleh induksi tadi (oleh pelacak baik dari tanaman yang diiiduksi

maupun dari yang tidak diinduksi) atau melalui penapisan pita dengan teknik PCR
(Polymerase Chaii Reaction); (2) mengisolasi gen A1 yang berasal dari organisme
toleran Al; dan (3) mengisolasi gen A1 menggux&an organisme model seperti
yeast atau Arabidopsis thaliana bahkan organisme isogenik.
Berdasarkan pendekatan-pendekatan sebagaimana tersebut di atas, maka sampai
saat ini telah ditemukan paling tidak dua belas gen-gen hasil induksi A1 pada tanaman
seperti yang tercantum pada Tabel 2. Tetapi, keduabelas gen tersebut belum spesifik
terhadap cekaman Al, karena dengan cekaman lain seperti logam berat (MT, BCB, PAL,
dan BPPI), pelukaan (MT, BCB, PAL, dan BPPI), ozon (SOD) dan oksidasi (SOD, BCB
dan BBPI) juga terinduksi.

Tabel 2. Gen-gen yang induksi oleh aluminium pa& tanaman
Table 2.

Plant's aluminium induced genes

N