Dugaan 4’-Hidroksi-6-C-xilofuranosil Flavanon dari Fraksi Polar Ekstrak Metanol Daun Ketepeng (Cassia alata)
DUGAAN 4’-HIDROKSI-6-C-XILOFURANOSIL FLAVANON
DARI FRAKSI POLAR EKSTRAK METANOL DAUN
KETEPENG (Cassia alata)
WAHYU YULY ANNAS
DEPARTEMEN KIMA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Dugaan 4’-Hidroksi-6C-Xilofuranosil Flavanon dari Fraksi Polar Ekstrak Metanol Daun Ketepeng
(Cassia alata) adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing
dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Desember 2013
Wahyu Yuly Annas
NIM G44090110
ABSTRAK
WAHYU YULY ANNAS. Dugaan 4’-Hidroksi-6-C-xilofuranosil Flavanon dari
Fraksi Polar Ekstrak Metanol Daun Ketepeng (Cassia alata). Dibimbing oleh
PURWANTININGSIH SUGITA dan BUDI ARIFIN.
Cassia alata yang dikenal sebagai ketepeng di Indonesia merupakan salah
satu tanaman obat tradisional yang telah lama digunakan daunnya sebagai obat
kulit. Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan mengidentifikasi senyawa dari
fraksi polar ekstrak metanol daun tersebut. Ekstrak metanol kasar daun ketepeng
difraksionasi secara kasar dengan kromatografi cair vakum. Eluat yang memiliki
pola pemisahan sama pada kromatografi lapis tipis (KLT) digabungkan dan
fraksi-fraksi dikelompokkan berdasarkan tingkat kepolarannya. Fraksi H yang
terelusi dengan eluen metanol difraksionasi lebih lanjut dengan kromatografi
kolom gravitasi dan diperoleh 21 fraksi. Fraksi H9 yang menunjukkan noda
tunggal KLT dengan 3 campuran eluen berbeda, dipartisi lebih lanjut, dan
kemudian dianalisis menggunakan spektrofotometer resonans magnet inti proton
(1H NMR) dan kromatograf cair-spektrometer massa (LC-MS). Kromatogram LCMS dengan eluen metanol-air 95:5 dan laju alir 1 mL/menit menunjukkan
keberadaan campuran 4 senyawa. Berdasarkan spektrum 1H NMR dan LC-MS,
fraksi dengan kelimpahan paling besar dalam kromatogram tersebut, dengan
waktu retensi 6.7 menit, diduga merupakan senyawa flavonoid C-glikosida, yaitu
4’-hidroksi-6-C-xilofuranosil flavanon.
Kata kunci: Cassia alata, flavanon, flavonoid, ketepeng
ABSTRACT
WAHYU YULY ANNAS. Prediction of 4’-Hydroxy-6-C-xylofuranosyl
Flavanone from Polar Fraction of Ketepeng (Cassia alata) Leaves Methanol
Extract. Supervised by PURWANTININGSIH SUGITA and BUDI ARIFIN.
Cassia alata, known as ketepeng in Indonesia, is an herb that has been
traditionally used as ointment. The purpose of this study is to isolate and to
identify compounds from polar fraction of the methanol extract from the leaves.
Crude methanol extract of ketepeng leaves was fractionated briefly by liquid vacuum chromatography. The eluates having the same separation pattern on thinlayer chromatography were combined and the fractions were grouped based on
their polarity. H fraction eluted with methanol as eluent was fractionated further
by gravitational column chromatography resulting 21 fractions. H9 fraction which
showed single TLC spot with 3 different eluent mixtures, was further partitioned
and then analyzed by using proton nuclear magnetic resonance (1H NMR)
spectrophotometer and liquid chromatograph-mass spectrometer (LC-MS). The
LC-MS chromatogram indicated a mixture of 4 compounds. Based on 1H NMR
and LC-MS spectrum, the most abundant fraction in the chromatogram was
predicted as a flavonoid C-glycoside compound, that is 4’-hydroxy-6-Cxylofuranosyl flavanone.
Key words: Cassia alata, flavanone, flavonoid, ketepeng
DUGAAN 4’-HIDROKSI-6-C-XILOFURANOSIL FLAVANON
DARI FRAKSI POLAR EKSTRAK METANOL DAUN
KETEPENG (Cassia alata)
WAHYU YULY ANNAS
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi : Dugaan 4’-Hidroksi-6-C-xilofuranosil Flavanon dari Fraksi Polar
Ekstrak Metanol Daun Ketepeng (Cassia alata)
Nama
: Wahyu Yuly Annas
NIM
: G44090110
Disetujui oleh
Prof Dr Dra Purwantiningsih Sugita, MS
Pembimbing I
Budi Arifin, SSi, MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Prof Dr Dra Purwantiningsih Sugita, MS
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
Judul Skripsi: Dugaan 4 '-Hidroksi-6-C-xilofuranosil Flavanon dari Fraksi Polar
Ekstrak Metanol Daun Ketepeng (Cassia alata)
Nama
: WahyU Yuly Annas
NIM
: G4409011 0
Disetujui oleh
ｮｾ
Prof Dr Dra Purwantin
Pembimblng I
MS
--,
Tanggal Lulus:
Budi Arifin, SSi, MSi
Pembimbing II
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Februari 2013 ini adalah
isolasi bahan alam, dengan judul Dugaan 4’-Hidroksi-6-C-xilofuranosil Flavanon
dari Fraksi Polar Ekstrak Metanol Daun Ketepeng (Cassia alata).
Terima kasih penulis ucapkan kepada Prof Dr Dra Purwantiningsih Sugita,
MS dan Budi Arifin, SSi, MSi selaku pembimbing yang telah banyak memberi
saran, perhatian, dan nasihat-nasihat yang tidak hanya mampu membuat penulis
dapat bertahan hingga terciptanya karya ilmiah ini, tetapi juga memahami arti
hidup untuk menghargai diri sendiri dan arti perjuangan yang sebenarnya. Di
samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Bapak Drs Muhammad Farid
dan Bapak Sabur yang memberikan saran terkait perihal teknis di Laboratorium
Kimia Organik, Mbak Deami dan Ibu Sofa yang membantu analisis NMR, dan
Ibu Puspa Dewi yang membantu analisis LC-MS. Ungkapan terima kasih juga
penulis sampaikan kepada Ibu, Bapak, Adikku, Aria Anggraini, yang tercinta dan
tiada henti-hentinya mendoakan dan memberikan kasih sayangnya. Rasa terima
kasih juga disampaikan untuk Sigit Eko Januar, Ichsan Irwanto, dan Selvia
Rahmawati sebagai sahabat bimbingan yang selalu menemani dalam penelitian
yang menyenangkan ini, Febrina Miharti, Nisfiyah Maftuhah, Sity Adhitia
Sarman, Rika Kurnia, dan teman-teman Kimia Organik 46 yang telah memberi
semangat, Muhammad Rizki Azima yang memberikan semangat dan ide-idenya,
Nurlia Damayanti yang dengan senyum sederhananya mampu memberikan
semangat baru untuk bangkit kembali, dan berbagai pihak yang telah ikut
berkontribusi dalam penulisan karya ilmiah ini.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Desember 2013
Wahyu Yuly Annas
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
PENDAHULUAN
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Metode
Determinasi Tumbuhan
Penentuan Kadar Air
Ekstraksi
Uji Fitokimia
Isolasi Senyawa Metabolit Sekunder
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Determinasi Tumbuhan, Kadar Air, Rendemen Ekstrak, dan
Fitokimia
Hasil Isolasi Komponen Kimia dalam Ekstrak
Dugaan Struktur Metabolit Sekunder Fraksi H9 dengan LC-MS
SIMPULAN DAN SARAN
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP
vii
vii
vii
1
2
2
2
2
2
3
3
4
4
4
5
7
14
14
16
21
DAFTAR TABEL
1 Hasil uji fitokimia ekstrak metanol daun C. alata
2 Fraksi-fraksi hasil KCV
5
7
DAFTAR GAMBAR
1 Kromatogram fraksi A–H KCV dengan eluen n-heksana-etil asetat- asam
asetat glasial 8:1.5:0.5
2 Spektrum 1H NMR fraksi H9 sebelum dipartisi dan setelah dipartisi
dengan n-heksana-metanol
3 Kromatogram LC fraksi H9 larut-metanol dengan eluen metanol-air 95:5
dan laju alir 1 mL/menit
4 Pola fragmentasi H94
5 Kerangka dasar flavonoid dan subgolongannya
6 Beberapa prediksi senyawa dengan bobot molekul 371 g·mol-1
7 Fragmen spektrum 1H NMR fraksi H9 yang mengindikasikan keberadaan
gugus gula
8 Senyawa turunan flavanon yang terglikosilasi gula pentosa (xilosa) di
posisi 6
9 Pola fragmentasi senyawa dugaan H94
10 Produk adisi yang terbentuk pada ESI-MS ion positif antara ion molekul,
fragmen, ion Na+, dan molekul pelarut
6
8
9
9
10
11
11
12
12
13
DAFTAR LAMPIRAN
1 Diagram alir penelitian
2 Hasil determinasi tanaman C. alata
3 Kadar air serbuk daun C. alata
4 Rendemen fraksi-fraksi hasil KKG fraksi H
5 Kromatogram fraksi H9 KKG dengan berbagai eluen campuran
16
17
18
19
20
1
PENDAHULUAN
Cassia merupakan genus utama dalam famili Fabaceae yang terdiri atas
sekitar 600 spesies. Beberapa di antaranya tersebar luas, khususnya di negaranegara tropis dan keberadaannya melimpah di India. Genus Cassia telah
digunakan dalam pengobatan tradisional masyarakat, antara lain untuk mengobati
demam dan malaria (Dave dan Ledwani 2012). Salah satunya adalah Cassia alata
yang umumnya dikenal masyarakat Indonesia sebagai ketepeng.
C. alata lazim digunakan sebagai obat tradisional terutama di daerah tropis
seperti Malaysia, Brasil, dan Indonesia. Masyarakat umum mengenal kegunaan
tumbuhan ini sebagai obat kulit baik pada manusia maupun ternak. Tumbuhan ini
juga dipercaya mampu mengobati konstipasi, hernia, sifilis, diabetes (Kochar
1981; Adjanahoun et al. 1991; Abo et al. 1998, diacu dalam Makinde et al. 2007),
malaria, influenza (Kusmardi et al. 2007), bronkitis, asma (Savithramma et al.
2007), sebagai antiobesitas (Hernandez dan Leonido 2011), pencahar yang kuat,
dan penolak serangga (Odunbaku dan Ilusanya 2011). Ekstrak metanol daun
tumbuhan ini terbukti memiliki aktivitas antijamur dan antibakteri (Makinde et al.
2007). Ekstrak etanol daun berpotensi sebagai obat untuk penyakit kulit ternak
(Emmanuel et al. 2003). Fraksi kloroform dari ekstrak metanol daun terbukti
memiliki aktivitas antimalaria (Kayembe et al. 2010). Selain itu, ekstrak metanol
daun juga memiliki aktivitas angiogenik dan sitotoksik terhadap sel kanker
payudara (Levy dan Lewis 2011). Hal ini menunjukkan potensi tumbuhan tersebut
untuk dikembangkan sebagai antikanker. Di Indonesia, salah satu produk tisu
pembersih yang berbahan baku tumbuhan ini diklaim dapat mencegah dan
mengobati keputihan (Yacob dan Endriani 2010).
Sebagian besar penelitian C. alata tertuju pada penentuan bioaktivitas dari
berbagai ekstrak tumbuhan ini. Masih sedikit penelitian yang berfokus pada
isolasi dan pencirian senyawa aktif dalam tumbuhan tersebut, khususnya di
Indonesia. Saito et al. (2012) telah mengisolasi astragalin dari ekstrak metanol
daun, Singh et al. (2012) mengisolasi rein dan kaemferol dari ekstrak
hidrometanol daun, serta Okwu dan Nnamdi (2011) mengisolasi alkaloid
kanabinoid dronabinol dari ekstrak etanol daun. Penelitian-penelitian di negara
lain juga telah menunjukkan kandungan senyawa golongan antrakuinon seperti
emodin aloe, krisofanol, isokrisofanol, rein, emodin, fision, dan alatonal (Dave
dan Ledwani 2012). Kandungan senyawa metabolit sekunder dalam suatu
tumbuhan dipengaruhi oleh tempat tumbuhnya sehingga C. alata di wilayah
Indonesia mungkin mengandung senyawa yang berbeda (Rachmat 2007). Oleh
karena itu, penelitian ini dilakukan untuk mengisolasi dan mencirikan kandungan
senyawa dalam fraksi polar C. alata yang tumbuh di wilayah Indonesia. Hasil
penelitian ini diharapkan dapat menambah basis data informasi mengenai senyawa
metabolit sekunder dalam tumbuhan C. alata yang kelak dapat berguna untuk
mengeksplorasi lebih jauh potensi tumbuhan ini.
2
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan meliputi alat-alat kaca, penguap putar, radas
kromatografi cair vakum (KCV), kromatografi kolom gravitasi (KKG),
kromatografi cair yang ditandem dengan spektrometer massa (LC-MS) dengan
modus ionisasi semprotan ion (ESI-MS) Mariner Biospectrometry di Lembaga
Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Serpong, dan spektrometer resonans magnet
inti (NMR) Agilent 500 MHz (1H) di Institut Teknologi Bandung.
Bahan yang digunakan meliputi daun ketepeng (C. alata), metanol teknis,
etil asetat, kloroform-amoniak, asam sulfat p.a, pereaksi Mayer, Wagner, dan
Dragendorf, dietil eter, asam asetat glasial, serbuk Mg, asam klorida p.a, FeCl3
1%, n-heksana, aseton, kloroform, silika gel KCV 60 G, silika gel kromatografi
kolom 60 (70–230 mesh), silika gel kromatografi lapis tipis (KLT) preparatif 60
PF254, dan pelat KLT silika gel GF254.
Metode
Penelitian ini terdiri atas beberapa tahap, yaitu determinasi tumbuhan C.
alata, preparasi simplisia, uji fitokimia, isolasi dan pemurnian, serta pencirian
komponen kimia. Penelitian dilaksanakan dari bulan Januari hingga Oktober 2013
di Laboratorium Kimia Organik, Departemen Kimia, Institut Pertanian Bogor.
Determinasi Tumbuhan
Daun ketepeng dikumpulkan dari Desa Cikasungka, Kecamatan Solear,
Tangerang pada bulan Maret–Juni 2012. Tumbuhan ini kemudian dideterminasi di
Herbarium Laboratorium Biologi, LIPI, Cibinong, Bogor.
Penentuan Kadar Air (AOAC 950.46 (B) 2005)
Daun ketepeng dikeringudarakan, kemudian digiling, sementara cawan
porselen dipanaskan dalam oven bersuhu 105 °C selama 30 menit hingga
bobotnya konstan. Sebanyak 2 g simplisia dimasukkan ke dalam cawan tersebut
dan dipanaskan kembali dalam oven bersuhu 105 °C selama 3 jam, lalu
didinginkan dalam deksikator dan ditimbang. Pemanasan dan penimbangan
diulangi hingga bobotnya konstan. Kadar air contoh ditentukan dengan persamaan
a a ai
Keterangan: A = bobot sampel basah (g)
B = bobot sampel kering (g)
3
Ekstraksi
Sebanyak 1 kg serbuk daun dimaserasi dalam metanol dengan nisbah 1:3
(b/v) pada suhu ruang selama 24 jam. Setelah itu, maserat dipisahkan dan residu
dimaserasi kembali dengan jumlah dan pelarut yang sama hingga 3 kali ulangan.
Semua maserat dikumpulkan, lalu dipekatkan dengan penguap putar. Bobot
ekstrak pekat ditimbang dan rendemennya dihitung dengan cara dibandingkan
dengan bobot sampel awal.
Uji Fitokimia
Uji fitokimia dilakukan untuk mengetahui jenis komponen kimia yang
terdapat dalam daun ketepeng khususnya senyawa golongan fenolik, flavonoid,
alkaloid, saponin, steroid, dan terpenoid. Pengujian dilakukan mengikuti prosedur
Harborne (1996).
Flavonoid dan Fenol. Sebanyak 2 g ekstrak daun diekstraksi dengan
beberapa mL metanol, kemudian dipanaskan sampai mendidih dan disaring.
Filtrat dibagi 2, bagian pertama ditambahkan NaOH 10% dan bagian kedua
ditambahkan H2SO4. Jika penambahan NaOH 10% menghasilkan warna merah,
berarti positif terdapat senyawa fenol hidrokuinon. Bagian kedua digunakan untuk
uji flavonoid: 5 mL filtrat dibagi ke dalam 3 tabung reaksi, lalu masing-masing
ditambahkan 0.1 g serbuk Mg, 1 mL alkohol klorhidrat (campuran HCl 37% dan
etanol 95% dengan volume yang sama), dan 5 mL amil alkohol, kemudian
dikocok dengan kuat. Hasil uji positif flavonoid secara berturut-turut ditunjukkan
oleh warna merah, kuning, atau jingga pada lapisan amil alkohol.
Alkaloid. Sebanyak 2 g ekstrak daun dilarutkan dalam kloroform, kemudian
ditambahkan 10 mL kloroform-amoniak dan disaring. Filtrat ditetesi dengan
H2SO4 2 M, lalu dikocok hingga terbentuk 2 lapisan. Lapisan asam (tidak
berwarna) dibagi ke dalam 3 tabung reaksi, untuk diuji dengan beberapa tetes
pereaksi Dragendorf, Mayer, dan Wagner. Hasil positif berturut-turut ditunjukkan
dengan munculnya endapan jingga, putih kekuningan, dan cokelat.
Saponin dan Tanin. Sebanyak 2–4 g ekstrak daun diekstraksi dengan
akuades panas, kemudian dipanaskan sampai mendidih dan disaring. Filtrat dibagi
ke dalam 2 tabung reaksi. Bagian pertama untuk uji saponin: larutan dibiarkan
agak dingin, kemudian dikocok tegak. Munculnya busa yang stabil setinggi lebih
kurang 1 cm selama 10 menit menandakan keberadaan terdapat saponin. Pada
tabung kedua, filtrat ditambahkan FeCl3 1%. Jika warna biru atau hitam muncul,
berarti terdapat tanin.
Triterpenoid dan Steroid. Sebanyak 2 g ekstrak daun ditambahkan 25 mL
etanol, kemudian dipanaskan dan disaring. Filtrat diuapkan, lalu ditambahkan eter.
Lapisan eter dipipet dan diuji pada lempeng tetes. Jika penambahan pereaksi
Lieberman-Buchard sebanyak 3 tetes membentuk warna merah/ungu, ekstrak
positif mengandung triterpenoid. Jika warna hijau yang muncul, sampel positif
mengandung steroid.
4
Isolasi Senyawa Metabolit Sekunder (modifikasi Hermawati 2009)
Proses isolasi dilakukan dalam 2 tahap, yaitu fraksionasi dan purifikasi.
Ekstrak pekat metanol dilarutkan dalam campuran metanol-air (1:1). Endapan
klorofil dipisahkan dengan penyaringan gravitasi, lalu filtrat dipartisi cair-cair
dengan etil asetat. Lapisan air (bawah) yang mengandung tanin dipisahkan,
sedangkan lapisan etil asetat dipekatkan, kemudian ditambahkan aseton untuk
mengendapkan sisa tanin. Tanin dipisahkan dengan penyaringan, lalu
penambahan aseton diulangi hingga tidak terlihat lagi tanin dalam filtrat. Setelah
itu, filtrat dipekatkan sehingga diperoleh ekstrak aseton bebas-tanin (BT).
Sebanyak 20 g ekstrak tersebut selanjutnya diimpregnasi dengan 40 g silika
gel KCV 60G (nisbah 1:2), dan difraksionasi kasar dengan KCV. Sistem eluen
yang digunakan ditentukan dengan menguji beberapa eluen tunggal, yaitu nheksana, kloroform, etil asetat, aseton, dan metanol. Eluen yang dapat menahan
noda dan yang mampu menggerakkan noda hingga ke garis batas pelarut pada
KLT dipilih sebagai sistem 2-eluen untuk mengelusi secara gradien berundak
(step gradient) ekstrak yang telah diimpregnasi. Kedua eluen tersebut kemudian
juga dikombinasikan untuk memperoleh sistem eluen campuran terbaik yang
menghasilkan noda terbanyak dan pola pemisahan paling baik. Eluat KCV
dianalisis pola pemisahannya dengan KLT menggunakan sistem eluen terbaik ini.
Eluat dengan pola pemisahan yang sama digabungkan menjadi 1 fraksi.
Fraksi polar yang dihasilkan difraksionasi lebih lanjut dengan kromatografi
kolom gravitasi (KKG) menggunakan sistem elusi gradien yang sama seperti pada
KCV. Fraksi yang diperoleh diuji pola pemisahannya dengan KLT menggunakan
3 sistem eluen berbeda. Jika diperoleh noda tunggal, maka senyawa dalam fraksi
kemungkinan telah murni. Fraksi yang masih berupa campuran dipartisi kembali
dengan memanfaatkan perbedaan kelarutan dan kepolarannya, lalu pola
pemisahannya diuji kembali dengan KLT untuk memastikan bahwa noda tunggal
telah diperoleh. Fraksi yang diduga merupakan senyawa tunggal dielusidasi
strukturnya menggunakan instrumen 1H NMR dan LC-MS. Diagram alir
penelitian selengkapnya diberikan di Lampiran 1.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Determinasi Tumbuhan, Kadar Air, Rendemen Ekstrak, dan Fitokimia
Daun yang digunakan terbukti merupakan daun ketepeng berdasarkan hasil
determinasi (Lampiran 2). Kadar airnya diperoleh sebesar 5.84% (Lampiran 3).
Kadar air ini digunakan untuk menentukan bobot daun yang diperlukan,
mengoreksi rendemen, dan sekaligus mengindikasikan ketahanan sampel selama
proses penyimpanan. Menurut Winarno (1992), sampel memiliki ketahanan yang
baik dalam proses penyimpanan jika kadar airnya
DARI FRAKSI POLAR EKSTRAK METANOL DAUN
KETEPENG (Cassia alata)
WAHYU YULY ANNAS
DEPARTEMEN KIMA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Dugaan 4’-Hidroksi-6C-Xilofuranosil Flavanon dari Fraksi Polar Ekstrak Metanol Daun Ketepeng
(Cassia alata) adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing
dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Desember 2013
Wahyu Yuly Annas
NIM G44090110
ABSTRAK
WAHYU YULY ANNAS. Dugaan 4’-Hidroksi-6-C-xilofuranosil Flavanon dari
Fraksi Polar Ekstrak Metanol Daun Ketepeng (Cassia alata). Dibimbing oleh
PURWANTININGSIH SUGITA dan BUDI ARIFIN.
Cassia alata yang dikenal sebagai ketepeng di Indonesia merupakan salah
satu tanaman obat tradisional yang telah lama digunakan daunnya sebagai obat
kulit. Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan mengidentifikasi senyawa dari
fraksi polar ekstrak metanol daun tersebut. Ekstrak metanol kasar daun ketepeng
difraksionasi secara kasar dengan kromatografi cair vakum. Eluat yang memiliki
pola pemisahan sama pada kromatografi lapis tipis (KLT) digabungkan dan
fraksi-fraksi dikelompokkan berdasarkan tingkat kepolarannya. Fraksi H yang
terelusi dengan eluen metanol difraksionasi lebih lanjut dengan kromatografi
kolom gravitasi dan diperoleh 21 fraksi. Fraksi H9 yang menunjukkan noda
tunggal KLT dengan 3 campuran eluen berbeda, dipartisi lebih lanjut, dan
kemudian dianalisis menggunakan spektrofotometer resonans magnet inti proton
(1H NMR) dan kromatograf cair-spektrometer massa (LC-MS). Kromatogram LCMS dengan eluen metanol-air 95:5 dan laju alir 1 mL/menit menunjukkan
keberadaan campuran 4 senyawa. Berdasarkan spektrum 1H NMR dan LC-MS,
fraksi dengan kelimpahan paling besar dalam kromatogram tersebut, dengan
waktu retensi 6.7 menit, diduga merupakan senyawa flavonoid C-glikosida, yaitu
4’-hidroksi-6-C-xilofuranosil flavanon.
Kata kunci: Cassia alata, flavanon, flavonoid, ketepeng
ABSTRACT
WAHYU YULY ANNAS. Prediction of 4’-Hydroxy-6-C-xylofuranosyl
Flavanone from Polar Fraction of Ketepeng (Cassia alata) Leaves Methanol
Extract. Supervised by PURWANTININGSIH SUGITA and BUDI ARIFIN.
Cassia alata, known as ketepeng in Indonesia, is an herb that has been
traditionally used as ointment. The purpose of this study is to isolate and to
identify compounds from polar fraction of the methanol extract from the leaves.
Crude methanol extract of ketepeng leaves was fractionated briefly by liquid vacuum chromatography. The eluates having the same separation pattern on thinlayer chromatography were combined and the fractions were grouped based on
their polarity. H fraction eluted with methanol as eluent was fractionated further
by gravitational column chromatography resulting 21 fractions. H9 fraction which
showed single TLC spot with 3 different eluent mixtures, was further partitioned
and then analyzed by using proton nuclear magnetic resonance (1H NMR)
spectrophotometer and liquid chromatograph-mass spectrometer (LC-MS). The
LC-MS chromatogram indicated a mixture of 4 compounds. Based on 1H NMR
and LC-MS spectrum, the most abundant fraction in the chromatogram was
predicted as a flavonoid C-glycoside compound, that is 4’-hydroxy-6-Cxylofuranosyl flavanone.
Key words: Cassia alata, flavanone, flavonoid, ketepeng
DUGAAN 4’-HIDROKSI-6-C-XILOFURANOSIL FLAVANON
DARI FRAKSI POLAR EKSTRAK METANOL DAUN
KETEPENG (Cassia alata)
WAHYU YULY ANNAS
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi : Dugaan 4’-Hidroksi-6-C-xilofuranosil Flavanon dari Fraksi Polar
Ekstrak Metanol Daun Ketepeng (Cassia alata)
Nama
: Wahyu Yuly Annas
NIM
: G44090110
Disetujui oleh
Prof Dr Dra Purwantiningsih Sugita, MS
Pembimbing I
Budi Arifin, SSi, MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Prof Dr Dra Purwantiningsih Sugita, MS
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
Judul Skripsi: Dugaan 4 '-Hidroksi-6-C-xilofuranosil Flavanon dari Fraksi Polar
Ekstrak Metanol Daun Ketepeng (Cassia alata)
Nama
: WahyU Yuly Annas
NIM
: G4409011 0
Disetujui oleh
ｮｾ
Prof Dr Dra Purwantin
Pembimblng I
MS
--,
Tanggal Lulus:
Budi Arifin, SSi, MSi
Pembimbing II
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Februari 2013 ini adalah
isolasi bahan alam, dengan judul Dugaan 4’-Hidroksi-6-C-xilofuranosil Flavanon
dari Fraksi Polar Ekstrak Metanol Daun Ketepeng (Cassia alata).
Terima kasih penulis ucapkan kepada Prof Dr Dra Purwantiningsih Sugita,
MS dan Budi Arifin, SSi, MSi selaku pembimbing yang telah banyak memberi
saran, perhatian, dan nasihat-nasihat yang tidak hanya mampu membuat penulis
dapat bertahan hingga terciptanya karya ilmiah ini, tetapi juga memahami arti
hidup untuk menghargai diri sendiri dan arti perjuangan yang sebenarnya. Di
samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Bapak Drs Muhammad Farid
dan Bapak Sabur yang memberikan saran terkait perihal teknis di Laboratorium
Kimia Organik, Mbak Deami dan Ibu Sofa yang membantu analisis NMR, dan
Ibu Puspa Dewi yang membantu analisis LC-MS. Ungkapan terima kasih juga
penulis sampaikan kepada Ibu, Bapak, Adikku, Aria Anggraini, yang tercinta dan
tiada henti-hentinya mendoakan dan memberikan kasih sayangnya. Rasa terima
kasih juga disampaikan untuk Sigit Eko Januar, Ichsan Irwanto, dan Selvia
Rahmawati sebagai sahabat bimbingan yang selalu menemani dalam penelitian
yang menyenangkan ini, Febrina Miharti, Nisfiyah Maftuhah, Sity Adhitia
Sarman, Rika Kurnia, dan teman-teman Kimia Organik 46 yang telah memberi
semangat, Muhammad Rizki Azima yang memberikan semangat dan ide-idenya,
Nurlia Damayanti yang dengan senyum sederhananya mampu memberikan
semangat baru untuk bangkit kembali, dan berbagai pihak yang telah ikut
berkontribusi dalam penulisan karya ilmiah ini.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Desember 2013
Wahyu Yuly Annas
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
PENDAHULUAN
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Metode
Determinasi Tumbuhan
Penentuan Kadar Air
Ekstraksi
Uji Fitokimia
Isolasi Senyawa Metabolit Sekunder
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Determinasi Tumbuhan, Kadar Air, Rendemen Ekstrak, dan
Fitokimia
Hasil Isolasi Komponen Kimia dalam Ekstrak
Dugaan Struktur Metabolit Sekunder Fraksi H9 dengan LC-MS
SIMPULAN DAN SARAN
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP
vii
vii
vii
1
2
2
2
2
2
3
3
4
4
4
5
7
14
14
16
21
DAFTAR TABEL
1 Hasil uji fitokimia ekstrak metanol daun C. alata
2 Fraksi-fraksi hasil KCV
5
7
DAFTAR GAMBAR
1 Kromatogram fraksi A–H KCV dengan eluen n-heksana-etil asetat- asam
asetat glasial 8:1.5:0.5
2 Spektrum 1H NMR fraksi H9 sebelum dipartisi dan setelah dipartisi
dengan n-heksana-metanol
3 Kromatogram LC fraksi H9 larut-metanol dengan eluen metanol-air 95:5
dan laju alir 1 mL/menit
4 Pola fragmentasi H94
5 Kerangka dasar flavonoid dan subgolongannya
6 Beberapa prediksi senyawa dengan bobot molekul 371 g·mol-1
7 Fragmen spektrum 1H NMR fraksi H9 yang mengindikasikan keberadaan
gugus gula
8 Senyawa turunan flavanon yang terglikosilasi gula pentosa (xilosa) di
posisi 6
9 Pola fragmentasi senyawa dugaan H94
10 Produk adisi yang terbentuk pada ESI-MS ion positif antara ion molekul,
fragmen, ion Na+, dan molekul pelarut
6
8
9
9
10
11
11
12
12
13
DAFTAR LAMPIRAN
1 Diagram alir penelitian
2 Hasil determinasi tanaman C. alata
3 Kadar air serbuk daun C. alata
4 Rendemen fraksi-fraksi hasil KKG fraksi H
5 Kromatogram fraksi H9 KKG dengan berbagai eluen campuran
16
17
18
19
20
1
PENDAHULUAN
Cassia merupakan genus utama dalam famili Fabaceae yang terdiri atas
sekitar 600 spesies. Beberapa di antaranya tersebar luas, khususnya di negaranegara tropis dan keberadaannya melimpah di India. Genus Cassia telah
digunakan dalam pengobatan tradisional masyarakat, antara lain untuk mengobati
demam dan malaria (Dave dan Ledwani 2012). Salah satunya adalah Cassia alata
yang umumnya dikenal masyarakat Indonesia sebagai ketepeng.
C. alata lazim digunakan sebagai obat tradisional terutama di daerah tropis
seperti Malaysia, Brasil, dan Indonesia. Masyarakat umum mengenal kegunaan
tumbuhan ini sebagai obat kulit baik pada manusia maupun ternak. Tumbuhan ini
juga dipercaya mampu mengobati konstipasi, hernia, sifilis, diabetes (Kochar
1981; Adjanahoun et al. 1991; Abo et al. 1998, diacu dalam Makinde et al. 2007),
malaria, influenza (Kusmardi et al. 2007), bronkitis, asma (Savithramma et al.
2007), sebagai antiobesitas (Hernandez dan Leonido 2011), pencahar yang kuat,
dan penolak serangga (Odunbaku dan Ilusanya 2011). Ekstrak metanol daun
tumbuhan ini terbukti memiliki aktivitas antijamur dan antibakteri (Makinde et al.
2007). Ekstrak etanol daun berpotensi sebagai obat untuk penyakit kulit ternak
(Emmanuel et al. 2003). Fraksi kloroform dari ekstrak metanol daun terbukti
memiliki aktivitas antimalaria (Kayembe et al. 2010). Selain itu, ekstrak metanol
daun juga memiliki aktivitas angiogenik dan sitotoksik terhadap sel kanker
payudara (Levy dan Lewis 2011). Hal ini menunjukkan potensi tumbuhan tersebut
untuk dikembangkan sebagai antikanker. Di Indonesia, salah satu produk tisu
pembersih yang berbahan baku tumbuhan ini diklaim dapat mencegah dan
mengobati keputihan (Yacob dan Endriani 2010).
Sebagian besar penelitian C. alata tertuju pada penentuan bioaktivitas dari
berbagai ekstrak tumbuhan ini. Masih sedikit penelitian yang berfokus pada
isolasi dan pencirian senyawa aktif dalam tumbuhan tersebut, khususnya di
Indonesia. Saito et al. (2012) telah mengisolasi astragalin dari ekstrak metanol
daun, Singh et al. (2012) mengisolasi rein dan kaemferol dari ekstrak
hidrometanol daun, serta Okwu dan Nnamdi (2011) mengisolasi alkaloid
kanabinoid dronabinol dari ekstrak etanol daun. Penelitian-penelitian di negara
lain juga telah menunjukkan kandungan senyawa golongan antrakuinon seperti
emodin aloe, krisofanol, isokrisofanol, rein, emodin, fision, dan alatonal (Dave
dan Ledwani 2012). Kandungan senyawa metabolit sekunder dalam suatu
tumbuhan dipengaruhi oleh tempat tumbuhnya sehingga C. alata di wilayah
Indonesia mungkin mengandung senyawa yang berbeda (Rachmat 2007). Oleh
karena itu, penelitian ini dilakukan untuk mengisolasi dan mencirikan kandungan
senyawa dalam fraksi polar C. alata yang tumbuh di wilayah Indonesia. Hasil
penelitian ini diharapkan dapat menambah basis data informasi mengenai senyawa
metabolit sekunder dalam tumbuhan C. alata yang kelak dapat berguna untuk
mengeksplorasi lebih jauh potensi tumbuhan ini.
2
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan meliputi alat-alat kaca, penguap putar, radas
kromatografi cair vakum (KCV), kromatografi kolom gravitasi (KKG),
kromatografi cair yang ditandem dengan spektrometer massa (LC-MS) dengan
modus ionisasi semprotan ion (ESI-MS) Mariner Biospectrometry di Lembaga
Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Serpong, dan spektrometer resonans magnet
inti (NMR) Agilent 500 MHz (1H) di Institut Teknologi Bandung.
Bahan yang digunakan meliputi daun ketepeng (C. alata), metanol teknis,
etil asetat, kloroform-amoniak, asam sulfat p.a, pereaksi Mayer, Wagner, dan
Dragendorf, dietil eter, asam asetat glasial, serbuk Mg, asam klorida p.a, FeCl3
1%, n-heksana, aseton, kloroform, silika gel KCV 60 G, silika gel kromatografi
kolom 60 (70–230 mesh), silika gel kromatografi lapis tipis (KLT) preparatif 60
PF254, dan pelat KLT silika gel GF254.
Metode
Penelitian ini terdiri atas beberapa tahap, yaitu determinasi tumbuhan C.
alata, preparasi simplisia, uji fitokimia, isolasi dan pemurnian, serta pencirian
komponen kimia. Penelitian dilaksanakan dari bulan Januari hingga Oktober 2013
di Laboratorium Kimia Organik, Departemen Kimia, Institut Pertanian Bogor.
Determinasi Tumbuhan
Daun ketepeng dikumpulkan dari Desa Cikasungka, Kecamatan Solear,
Tangerang pada bulan Maret–Juni 2012. Tumbuhan ini kemudian dideterminasi di
Herbarium Laboratorium Biologi, LIPI, Cibinong, Bogor.
Penentuan Kadar Air (AOAC 950.46 (B) 2005)
Daun ketepeng dikeringudarakan, kemudian digiling, sementara cawan
porselen dipanaskan dalam oven bersuhu 105 °C selama 30 menit hingga
bobotnya konstan. Sebanyak 2 g simplisia dimasukkan ke dalam cawan tersebut
dan dipanaskan kembali dalam oven bersuhu 105 °C selama 3 jam, lalu
didinginkan dalam deksikator dan ditimbang. Pemanasan dan penimbangan
diulangi hingga bobotnya konstan. Kadar air contoh ditentukan dengan persamaan
a a ai
Keterangan: A = bobot sampel basah (g)
B = bobot sampel kering (g)
3
Ekstraksi
Sebanyak 1 kg serbuk daun dimaserasi dalam metanol dengan nisbah 1:3
(b/v) pada suhu ruang selama 24 jam. Setelah itu, maserat dipisahkan dan residu
dimaserasi kembali dengan jumlah dan pelarut yang sama hingga 3 kali ulangan.
Semua maserat dikumpulkan, lalu dipekatkan dengan penguap putar. Bobot
ekstrak pekat ditimbang dan rendemennya dihitung dengan cara dibandingkan
dengan bobot sampel awal.
Uji Fitokimia
Uji fitokimia dilakukan untuk mengetahui jenis komponen kimia yang
terdapat dalam daun ketepeng khususnya senyawa golongan fenolik, flavonoid,
alkaloid, saponin, steroid, dan terpenoid. Pengujian dilakukan mengikuti prosedur
Harborne (1996).
Flavonoid dan Fenol. Sebanyak 2 g ekstrak daun diekstraksi dengan
beberapa mL metanol, kemudian dipanaskan sampai mendidih dan disaring.
Filtrat dibagi 2, bagian pertama ditambahkan NaOH 10% dan bagian kedua
ditambahkan H2SO4. Jika penambahan NaOH 10% menghasilkan warna merah,
berarti positif terdapat senyawa fenol hidrokuinon. Bagian kedua digunakan untuk
uji flavonoid: 5 mL filtrat dibagi ke dalam 3 tabung reaksi, lalu masing-masing
ditambahkan 0.1 g serbuk Mg, 1 mL alkohol klorhidrat (campuran HCl 37% dan
etanol 95% dengan volume yang sama), dan 5 mL amil alkohol, kemudian
dikocok dengan kuat. Hasil uji positif flavonoid secara berturut-turut ditunjukkan
oleh warna merah, kuning, atau jingga pada lapisan amil alkohol.
Alkaloid. Sebanyak 2 g ekstrak daun dilarutkan dalam kloroform, kemudian
ditambahkan 10 mL kloroform-amoniak dan disaring. Filtrat ditetesi dengan
H2SO4 2 M, lalu dikocok hingga terbentuk 2 lapisan. Lapisan asam (tidak
berwarna) dibagi ke dalam 3 tabung reaksi, untuk diuji dengan beberapa tetes
pereaksi Dragendorf, Mayer, dan Wagner. Hasil positif berturut-turut ditunjukkan
dengan munculnya endapan jingga, putih kekuningan, dan cokelat.
Saponin dan Tanin. Sebanyak 2–4 g ekstrak daun diekstraksi dengan
akuades panas, kemudian dipanaskan sampai mendidih dan disaring. Filtrat dibagi
ke dalam 2 tabung reaksi. Bagian pertama untuk uji saponin: larutan dibiarkan
agak dingin, kemudian dikocok tegak. Munculnya busa yang stabil setinggi lebih
kurang 1 cm selama 10 menit menandakan keberadaan terdapat saponin. Pada
tabung kedua, filtrat ditambahkan FeCl3 1%. Jika warna biru atau hitam muncul,
berarti terdapat tanin.
Triterpenoid dan Steroid. Sebanyak 2 g ekstrak daun ditambahkan 25 mL
etanol, kemudian dipanaskan dan disaring. Filtrat diuapkan, lalu ditambahkan eter.
Lapisan eter dipipet dan diuji pada lempeng tetes. Jika penambahan pereaksi
Lieberman-Buchard sebanyak 3 tetes membentuk warna merah/ungu, ekstrak
positif mengandung triterpenoid. Jika warna hijau yang muncul, sampel positif
mengandung steroid.
4
Isolasi Senyawa Metabolit Sekunder (modifikasi Hermawati 2009)
Proses isolasi dilakukan dalam 2 tahap, yaitu fraksionasi dan purifikasi.
Ekstrak pekat metanol dilarutkan dalam campuran metanol-air (1:1). Endapan
klorofil dipisahkan dengan penyaringan gravitasi, lalu filtrat dipartisi cair-cair
dengan etil asetat. Lapisan air (bawah) yang mengandung tanin dipisahkan,
sedangkan lapisan etil asetat dipekatkan, kemudian ditambahkan aseton untuk
mengendapkan sisa tanin. Tanin dipisahkan dengan penyaringan, lalu
penambahan aseton diulangi hingga tidak terlihat lagi tanin dalam filtrat. Setelah
itu, filtrat dipekatkan sehingga diperoleh ekstrak aseton bebas-tanin (BT).
Sebanyak 20 g ekstrak tersebut selanjutnya diimpregnasi dengan 40 g silika
gel KCV 60G (nisbah 1:2), dan difraksionasi kasar dengan KCV. Sistem eluen
yang digunakan ditentukan dengan menguji beberapa eluen tunggal, yaitu nheksana, kloroform, etil asetat, aseton, dan metanol. Eluen yang dapat menahan
noda dan yang mampu menggerakkan noda hingga ke garis batas pelarut pada
KLT dipilih sebagai sistem 2-eluen untuk mengelusi secara gradien berundak
(step gradient) ekstrak yang telah diimpregnasi. Kedua eluen tersebut kemudian
juga dikombinasikan untuk memperoleh sistem eluen campuran terbaik yang
menghasilkan noda terbanyak dan pola pemisahan paling baik. Eluat KCV
dianalisis pola pemisahannya dengan KLT menggunakan sistem eluen terbaik ini.
Eluat dengan pola pemisahan yang sama digabungkan menjadi 1 fraksi.
Fraksi polar yang dihasilkan difraksionasi lebih lanjut dengan kromatografi
kolom gravitasi (KKG) menggunakan sistem elusi gradien yang sama seperti pada
KCV. Fraksi yang diperoleh diuji pola pemisahannya dengan KLT menggunakan
3 sistem eluen berbeda. Jika diperoleh noda tunggal, maka senyawa dalam fraksi
kemungkinan telah murni. Fraksi yang masih berupa campuran dipartisi kembali
dengan memanfaatkan perbedaan kelarutan dan kepolarannya, lalu pola
pemisahannya diuji kembali dengan KLT untuk memastikan bahwa noda tunggal
telah diperoleh. Fraksi yang diduga merupakan senyawa tunggal dielusidasi
strukturnya menggunakan instrumen 1H NMR dan LC-MS. Diagram alir
penelitian selengkapnya diberikan di Lampiran 1.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Determinasi Tumbuhan, Kadar Air, Rendemen Ekstrak, dan Fitokimia
Daun yang digunakan terbukti merupakan daun ketepeng berdasarkan hasil
determinasi (Lampiran 2). Kadar airnya diperoleh sebesar 5.84% (Lampiran 3).
Kadar air ini digunakan untuk menentukan bobot daun yang diperlukan,
mengoreksi rendemen, dan sekaligus mengindikasikan ketahanan sampel selama
proses penyimpanan. Menurut Winarno (1992), sampel memiliki ketahanan yang
baik dalam proses penyimpanan jika kadar airnya