Molecular Identification of Mutant Candidate of Gα Gene from Soybean cv. Slamet Based on mRNA

IDENTIFIKASI SECARA MOLEKULAR KANDIDAT MUTAN Gα DARI
KEDELAI KULTIVAR SLAMET BERDASARKAN mRNA

HAYATUL FAJRI

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011

ABSTRAK
HAYATUL FAJRI. Identifikasi Secara Molekular Kandidat Mutan Gen Gα dari Kedelai Kultivar
Slamet berdasarkan mRNA. Dibimbing oleh UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO dan ARIS
TJAHJOLEKSONO.
Protein heterotrimerik G terdiri atas tiga subunit yaitu α, , dan (Gα, G dan G ) yang
terletak di membran internal sel. Protein Gα teraktivasi ketika adanya cekaman biotik atau abiotik
dari luar sel. Protein Gα diduga berperan terhadap ketahanan cekaman Aluminium (Al). Kedelai
kultivar Slamet merupakan kedelai toleran Al yang memiliki satu kopi gen Gα. Irradiasi sinar
gamma pada biji kedelai kultivar Slamet menyebabkan mutasi random pada kedelai kultivar
Slamet generasi M2. Kandidat mutan Gα M2 diseleksi berdasarkan keadaan stomata menutup pada

siang hari dan tinggi tanaman. Mutan Gα M4 nomor 338 dan 103 mengalami kerusakan jaringan
sel akar lebih besar dibandingkan tanaman non mutan. Tanaman nomor 338/3S1.174/12/14 (M4)
dan 103/3S3.103/8/5/1/4 (M5) mengalami mutasi gen Gα pada ruas U3-L4 (ekson 5 – ekson 11).
Sedangkan tanaman nomor 344/3S1.196/14/1/8 (M4) diduga mutan gen Gα. Ketiga nomor
tersebut ditanam kembali sampai generasi ke 6 dan diseleksi kandidat mutan Gα berdasarkan
fenotipe lebih pendek dari pada Slamet non mutan dan stomata menutup >50%. Dipilih empat
nomor dari M5 dan tiga nomor dari M6 untuk diidentifikasi mutan Gα bedasarkan mRNA.
Tanaman M5 nomor 344/3S1.196/14/1/8/7 mengalami penurunan ekspresi gen Gα pada
ruas L5-L4 (ekson 7- ekson 11). Generasi selanjutnya (M6) yaitu nomor 344/3S1.196/14/1/8/7/5
mengalami mutasi gen Gα pada ruas L1 sampai L3 (ekson 2 – ekson 6). Penurunan ekspresi gen
Gα dapat terjadi karena adanya mutasi pada promotor gen Gα. Tiga tanaman M5 lain diduga
mengalami mutasi gen Gα. Dua tanaman M6 yaitu nomor 103/3S3.103/8/5/1/4/8 mengalami
mutasi pada ruas L3-L2 (ekson 6 – ekson 15) dan nomor 103/3S3.103/8/5/1/4/9 pada ruas U3-L4
(ekson 5 – ekson 11). Mutasi yang terjadi pada dua nomor ini adalah penurunan ekspresi gen yang
ditandai dengan lebih tipisnya pita gen Gα dibandingan tanaman Slamet non mutan.

ABSTRACT
HAYATUL FAJRI. Molecular Identification of Mutant Candidate of Gα Gene from Soybean cv.
Slamet Based on mRNA. Supervised by UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO and ARIS
TJAHJOLEKSONO.

Heterotrimeric G proteins composed of α, , and subunits, are bound to the inside surface
of the cell membrane. Gα proteins will be activated by extracellular stimuli (biotic or abiotic
stress). It is presumably Gα proteins playing an important role in aluminum (Al)-stress tolerance.
Soybean cv. Slamet was considered as a tolerant plant to Al and has a single copy of Gα gene.
Gamma irradiation to soybean cv. Slamet seeds caused a random chromosomal mutation of second
generation plants (designated as M2). The Gα mutant candidates were selected based on stomatal
closure in the daylight and dwarf. Gα mutant candidates M4, number 338 and 103 have severe
root cell tissues damage compared to non mutant ones. Plant number 338/3S1.174/12/14 (M4) and
103/3S3.103/8/5/1/4 (M5) have a Gα gene mutation at the U3-L4 sequences (exon 5 – exon 11).
Whereas, plant number 344/3S1.196/14/1/8 (M4) is assumed as Gα gene mutant. All of those
plants were replanted until sixth generation. The candidates of Gα mutant selected have more than
fifty percent of closed stomata and dwarf. Four number of M5 plants and three number of M6
plants were selected for Gα mutant identification based on mRNA analysis.
The fifth generation plant number 344/3S1.196/14/1/8/7 were decreased its Gα gene
expression at L5-L4 sequences (exon 7 – exon 11). The M6 generation plant number
344/3S1.196/14/1/8/7/5 have mutation in Gα gene at L1-L3 sequences (exon 2 – exon 6). A major
contributing factor to decreased expression levels of Gα gene may be due to mutation of Gα gene
promotor. Three other of M5 plants were assumed as Gα mutant. M6 plant number
103/3S3.103/8/5/1/4/8 has mutation at L3-L2 sequences (exon 6 – exon 15) and number
103/3S3.103/8/5/1/4/9 has mutation at U3-L4 sequences (exon 5 – exon 11). The decreasing of

gene expression caused by mutation in those plants was indicated by the less pronounced DNA
bands on agarose gel than that of non mutant plants.

IDENTIFIKASI SECARA MOLEKULAR KANDIDAT MUTAN Gα DARI
KEDELAI KULTIVAR SLAMET BERDASARKAN mRNA

HAYATUL FAJRI

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011

: Identifikasi Secara Molekular Kandidat Mutan Gα dari Kedelai Kultivar

Slamet Berdasarkan mRNA
Nama : Hayatul Fajri
NIM : G34062152

Judul

Disetujui,
Pembimbing I

Pembimbing II

Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si
NIP. 19640517 198903 2 001

Dr. Ir. Aris Tjahjoleksono, DEA
NIP. 19611120 198703 2 001

Diketahui,
Ketua Departemen Biologi

Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si
NIP. 19641002 198903 1 002

Tanggal Lulus :

KATA PENGANTAR
Puji serta syukur penulis ucapkan kepada Allah SWT, atas Rahmat dan HidayahNya penulis
dapat menyelesaikan laporan penelitian yang berjudul Identifikasi Secara Molekular Kandidat
Mutan Gα dari Kedelai Kultivar Slamet Berdasarkan mRNA.
Penulis menyampaikan ucapan terima kasih kepada Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si dan Dr. Ir.
Aris Tjahjoleksono, DEA sebagai pembimbing atas bimbingan, waktu, nasehat dan sarana yang
telah diberikan. Terima kasih kepada Hibah Bersaing Dikti atas nama Dr. Utut Widyastuti yang
telah memberikan dana penelitian. Terima kasih kepada kepala Pusat Pengembangan Sumber
Daya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) beserta seluruh staf Labolatorium Biotechnological
Research Indonesia Netherland (BIORIN) atas sarana, prasarana dan bantuan selama penulis
melakukan penelitian. Terima kasih kepada Dr. Ir. Tatik Chikmawati, M.Si atas saran yang
diberikan sehingga tulisan ini menjadi lebih baik. Terima kasih kepada Bapak Abdul Mulya, Mbak
Pepi Elvavina dan Bapak Adi atas bantuan, nasehat dan kerjasamanya.
Penulis juga menyampaikan ungkapan terima kasih kepada Ibu penulis yang selalu
mencurahkan doa, kasih sayang, perhatian dan harapan sehingga penulis mampu menyelesaikan

tulisan ini. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada kakak: Del Yuza, Ardiansyah, Yulfi
Zawarnis dan Hidayatunnismah serta adik Rahma atas dukungan dan perhatiannya. Terima kasih
untuk teman-teman Biologi 43 dan Biorin Crews: Bapak Yustinus Ulung, Bapak Muzuni, Ibu
Saleha Hanum, Ibu Ratna Yuniati, Ibu Sri Listiyowati, Mbak Ika Atifah Zahro, Mbak Ulfah
Mushofa, Mbak Anita Theresia, Mbak Novi, Mbak Nurul, Mbak Medikca, Kak Luria, Kak
Muchdar Davis, Indah, Laila, Lita dan Iin atas kerjasama, bantuan, saran, dan kebersamaannya.
Karya ilmiah ini penulis persembahkan untuk Almarhum Ayah tercinta.
Bogor, Juli 2011
Hayatul Fajri

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan pada tanggal 10 Januari 1988 di Bukittingi. Penulis merupakan anak
kelima dari Zuwirda dan Almarhum Yusran. Penulis lulus dari SMA Negeri 6 Kota Bogor pada
tahun 2006. Pada tahun yang sama penulis diterima sebagai mahasiswa IPB melalui jalur Ujian
Seleksi Masuk IPB (USMI) dan tahun berikutnya diterima di Mayor Biologi.
Selama kuliah penulis aktif diberbagai kegiatan kemahasiswaan sebagai panitia
pelakasana kegiatan seperti Seminar Nasional Revolusi sains dan Masa Pengenalan Departemen
Biologi 2009. Penulis pernah menjabat sebagai sekretaris Badan Semi Otonom Paguyuban
Mahasiswa Biologi (BSO Pamabi) pada tahun 2008-2009 dan pada tahun berikutnya menjabat
sebagai Ketua BSO Pamabi. Selain itu penulis juga aktif sebagai asisten praktikum beberapa mata

kuliah, yaitu Perkembangan Hewan (2008), Sistematika Tumbuhan Berpembuluh (2009 dan
2010), Biologi Dasar (2009-2010), Genetika Molekuler (2010), Genetika Dasar (2010),
Pertumbuhan dan Perkembangan Tumbuhan (2010) dan Anatomi dan Morfologi Tumbuhan
(2010). Penulis melaksanakan praktik lapangan di Perusahaan Daerah Air Minum Tirta Pakuan
kota Bogor pada tahun 2009 dengan topik Proses Pengolahan Air di PDAM Tirta Pakuan Kota
Bogor.

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR................................................................................................................ viii
DAFTAR TABEL....................................................................................................................

viii

DAFTAR LAMPIRAN............................................................................................................

viii

PENDAHULUAN....................................................................................................................

1

Latar belakang penelitian.................................................................................................

1

Tujuan penelitian..............................................................................................................

1

BAHAN DAN METODE.........................................................................................................

1

Waktu dan tempat............................................................................................................

1

Bahan dan alat.................................................................................................................

1

Metode penelitian.............................................................................................................

2

Penanaman biji dan seleksi kandidat mutan gen Gα..............................................

2

Isolasi RNA Total....................................................................................................

2

Sintesis cDNA.........................................................................................................

2

Identifikasi kandidat mutan dengan PCR................................................................

2

HASIL.......................................................................................................................................

3

PEMBAHASAN.......................................................................................................................

4

SIMPULAN..............................................................................................................................

5

SARAN.....................................................................................................................................

5

DAFTAR PUSTAKA...............................................................................................................

5

LAMPIRAN.............................................................................................................................

7

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Panjang basa nitrogen antar primer cDNA heterotrimerik Gα...............................................

4

2 Ekspresi gen Gα dan aktin generasi M5 pada kandidat mutan Slm1-5, Slm2-5, Slm3-5,
dan Slm4-5..............................................................................................................................

4

3 Ekspresi gen Gα dan aktin generasi M6 pada kandidat mutan Slm1-6..................................

4

4 Ekspresi gen Gα dan aktin generasi M6 pada kandidat mutan Slm3-6 dan Slm2-6..............

4

DAFTAR TABEL
1 Sekuen basa nitrogen pada primer yang digunakan...............................................................

3

2 Keadaan stomata menutup dan tinggi tanaman......................................................................

3

DAFTAR LAMPIRAN
1 Hasil seleksi kandidat mutan berdasarkan persentase stomata menutup >50% dan tanaman
pendek.....................................................................................................................................

8

2 Komposisi buffer MOPS dan gel agarosa 1% (b/v)................................................................

9

3 Tanaman kandidat mutan Slm1-6 (kanan) dan Slamet non mutan (kiri)................................

10

PENDAHULUAN
Latar belakang penelitian
Protein G berdasarkan komposisi dan
fungsinya diklasifikasikan menjadi protein G
kecil dan protein heterotrimerik G (Ma 1994).
Protein heterotrimerik G terdiri atas tiga
subunit yaitu α, dan (Gα, G dan G )
(Ma 1994) dan dapat diaktifasi dengan adanya
sinyal ekstraseluler (Albert et al. 2002).
Protein heterotrimerik G adalah mediator yang
mengirimkan sinyal ekstraseluler melalui
molekul reseptor ke molekul efektor
(Fujisawa et al. 2001). Sinyal ekstraseluler
menyebabkan protein heterotrimerik G aktif
dan akan mengubah Guanin Diphospat (GDP)
yang berlekatan dengan Gα menjadi Guanin
Triphospat (GTP). Terikatnya GTP pada Gα
menyebabkan Gα berpisah dari dimer G
dan kembali membentuk trimer saat inaktif
(Perfush-Barbeoch et al. 2004).
Kedelai kultivar Slamet merupakan
tanaman toleran aluminium (Al) (Jusuf &
Suharsono 2006). Salah satu sinyal
ekstraseluler yang dapat mempengaruhi
regulasi seluler pada tanaman adalah cekaman
Al. Kedelai kultivar Slamet memiliki satu
kopi gen Gα (Suharsono & Suharsono 2004).
Mastoparan berperan sebagai aktivator protein
Gα dan dapat meningkatkan sistem
pertahanan tanaman kedelai kultivar Lumut
yang peka terhadap cekaman Al (Jusuf &
Suharsono 2006), melalui pertambahan
panjang akar, penurunan kandungan Al dan
kalosa, dan peningkatan integritas membran
(Srimulyati 2007).
Hartini (2008) telah melakukan induksi
dengan menggunakan irradiasi sinar gamma
dosis 0.1 dan 0.3 kGy pada kedelai kultivar
Slamet dan Lumut untuk mendapatkan mutan
Gα. Irradiasi tersebut menghasilkan sepuluh
kandidat mutan Gα generasi ke-2 (M2)
dengan ciri kondisi stomata menutup.
Kandidat mutan dari kultivar lumut dihasilkan
dari dosis irradiasi 0.3kGy, sedangkan
kandidat mutan dari kultivar Slamet
dihasilkan dari dosis irradiasi 0.1 dan 0.3 kGy.
Dari sepuluh tanaman tersebut, baru satu
kandidat mutan yang telah dianalisis secara
molekular dan menunjukkan adanya mutasi
gen Gα.
Selanjutnya kesepuluh kandidat mutan
generasi M2 tersebut ditanam masing-masing
sebanyak 10-15 tanaman dan dilakukan
seleksi berdasarkan kondisi stomata yang
menutup (Perfush-Barbeoch et al. 2004) dan
kerdil (Fujisawa et al. 1999; Ma 2001) pada
generasi M3. Biji dari kandidat mutan

generasi M3 selanjutnya ditanam untuk
mendapatkan tanaman generasi M4. Kandidat
mutan M4 untuk setiap nomor dipilih
berdasarkan kondisi stomata yang menutup
>50% dan pendek. Limbong (2010) telah
berhasil menseleksi tiga generasi (M2 sampai
M4) dan mendapatkan 26 tanaman yang
diduga merupakan kandidat mutan Gα dengan
ciri stomata menutup >50%. Identifikasi
mutan berdasarkan keberadaan gen Gα telah
dilakukan berdasarkan DNA genom dari
tanaman kandidat mutan.
Dua tanaman M4 yaitu nomor
338/3S1.174/12/1/4 dan 103/3S3.103/8/5/1/4
merupakan mutan Gα pada ruas U3-L4.
Tanaman nomor 344/3S1.196/14/1/8 diduga
mengalami mutan gen Gα. Identifikasi mutan
Gα berdasarkan DNA genom tersebut
menghasilkan fragmen (bukan gen utuh) gen
Gα. Oleh karena itu, perlu dilakukan
identifikasi Gα berdasarkan mRNA sehingga
dapat diketahui adanya mutasi pada ruas utuh
(full lenght) gen Gα dari ketiga tanaman
kandidat mutan tersebut.

Tujuan penelitian
Tujuan penelitian ini adalah untuk
mengidentifikasi kandidat mutan protein
heterotrimerik Gα dari kedelai toleran Al
kultivar Slamet berdasarkan hasil analisis
mRNA.

BAHAN DAN METODE
Waktu dan tempat
Penelitian dilaksanakan mulai bulan
Februari 2010 sampai dengan bulan Mei 2011
di Laboratorium Biotechnological Research
Indonesia-Netherland
(BIORIN),
Pusat
Penelitian Sumber Daya Hayati dan
Bioteknologi (PPSHB), Institut Pertanian
Bogor.

Bahan dan alat
Bahan tanaman yang digunakan dalam
penelitian ini antara lain yaitu biji kedelai
kultivar Slamet yang merupakan kandidat
mutan heterotrimerik Gα (Limbong 2010).
Biji tersebut adalah kandidat mutan generasi
ke-5 (M5) dari tanaman generasi ke-4 (M4)
nomor
338/3S1.174/12/1/4,
344/3S1.196/14/1/8, dan generasi ke-6 (M6)
dari tanaman M5 nomor 103/3S3.103/8/5/1/4,
serta kedelai kultivar Slamet non mutan.
Alat yang digunakan antara lain yaitu 4 in
1 environment tester, penggaris, kamera
digital, mikroskop cahaya, mortar, sudip, tip
berbagai ukuran, tube 1.5 ml, autoklaf, pipet

mikro, sentrifus Jouan BRi, vacuum dryer,
perangkat elektroforesis, UV transluminator,
spektrofotometer, dan perangkat PCR
(Polymerase Chain Reaction).

Metode penelitian
Penanaman biji dan seleksi kandidat mutan
gen Gα
Biji kedelai ditanam pada lahan seluas 4 x
7 meter, dengan media tanam tanah yang
dicampur kompos. Masing-masing nomor
ditanam pada sepuluh lubang (satu biji/
lubang) dengan jarak tanam 20 x 40 cm.
Pemupukan dilakukan dua minggu setelah
tanam
dengan
dosis
Urea/TSP/KCL:
50/100/50 kg/ha. Hama diatasi dengan
Acodan dosis 0.5ml/l. Penyemprotan Acodan
dilakukan tiga kali selama masa tanam, yaitu
1 kali perbulan. Setelah tanaman memiliki
cukup daun (± 3 minggu setelah tanam),
dilakukan pengamatan kondisi stomata pada
saat pukul 12.00 dengan metode nail polish
swath. Selain itu, juga diamati suhu dan
kelembaban pada saat pengamatan stomata
(Lampiran 1). Pengamatan tinggi tanaman
dilakukan pada saat muncul bunga. Tanaman
yang tingginya lebih rendah dari pada Slamet
non mutan dan jumlah stomata menutup
>50% dipilih untuk diisolasi RNAnya.
Isolasi RNA total
Isolasi RNA menggunakan Kit Trizol
Invitrogen. Langkah-langkah isolasi yaitu:
500-1000
mg
daun
segar
digerus
menggunakan nitrogen cair dan dicampur
dengan 800µl Kit Trizol invitrogen. Campuran
diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit
dan ditambah dengan 200µl kloroform.
Campuran dikocok selama 30 detik dan
disentrifus dengan kecepatan 9000rpm,
selama 15 menit pada suhu 6ºC. Supernatan
diambil dan ditambah 500µl isopropanol dan
diinkubasi kembali selama 10 menit pada
suhu ruang, kemudian disentrifus dengan
kecepatan 9000rpm selama 10 menit pada
suhu 6ºC. Pelet diambil dan dicuci
menggunakan alkohol-DEPC 70% dengan
sentrifugasi 5700 rpm selama 5 menit pada
suhu 6ºC. Pelet dikeringkan menggunakan
vacuum dryer dan dilarutkan dalam 30 µl
ddH2O-DEPC
1%,
kemudian
RNA
dikuantifikasi menggunakan spektrofotometer
pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.
Keutuhan RNA di cek dengan elektroforesis
agarosa 1% (b/v) menggunakan buffer MOPS
1x (Lampiran 2). Langkah-langkah elektroforesis yaitu 10µg RNA dicampur dengan 12
µl premix (formamid, formaldehid, MOPS
20x dan ddH2O-DEPC 1%) dan dipanaskan

pada suhu 65ºC selama 10 menit, kemudian
didinginkan di dalam es selama 5 menit. RNA
dicampur dengan loading dye, dimasukan ke
dalam gel dan dimigrasikan menggunakan
buffer MOPS selama 30 menit dengan
tegangan 100 volt. Selanjutnya gel direndam
dalam larutan ethidium bromida 0.5 µg/ml
selama 10 menit, dibilas dengan akuades,
kemudian pita RNA dilihat menggunakan UV
transluminator.
Sintesis cDNA
Sebelum sintesis cDNA, dilakukan
pemurnian RNA dari DNA yaitu dengan
mencampur 5µg RNA dengan 1.1 µl buffer
DNase dan 1 unit enzim DNase. Campuran di
inkubasi pada suhu 25ºC selama 8 menit.
Selanjutnya dicampur dengan 1µl EDTA
25mM dan diinkubasi pada suhu 65ºC selama
10 menit. RNA murni didinginkan dalam es
selama 5 menit. Sintesis cDNA dilakukan
dengan metode Suharsono et al. (2002). Lima
µl RNA murni dicampur dengan 4µl 5x buffer
reaksi, 2 µl primer oligo dT, 1.6 µl dNTP 2.5
mM, 1 unit enzim reverse transcriptase III
(Invitrogen), 1 µl dTT (0.1 M) dan ddH20DEPC 1% steril sampai volume akhir 20 µl.
Reaksi transkripsi balik (RT) dilakukan pada
suhu 30ºC selama 10 menit, 42ºC selama 50
menit, 95ºC selama 5 menit sebanyak satu
siklus. Untuk mengetahui keberhasilan
sintesis cDNA dilakukan amplifikasi cDNA
melalui PCR menggunakan primer aktin yang
didesain dari kedelai (Accession V00450)
dengan primer forward tepat dikodon awal
dari ekson 1 (5’ATGGCAGATGCCGAGGγ’)
dan primer reverse tepat pada daerah ekson 2
(5’CAGTTGTGCGACCACTTGCAγ’). PCR
dilakukan dengan mencampur 1 µl hasil RT
dengan 1 µl buffer taq 10x, 1 µl dNTP 2.5
mM, 10 pmol primer forward, 10 pmol
primer reverse, 0.4 µl DMSO, 1 unit enzim
taq polymerase dan ddH20 sampai volume
akhir 10 µl. Kondisi PCR untuk aktin adalah:
denaturasi pra-PCR 95ºC selama 5 menit,
denaturasi 94ºC selama 30 detik, penempelan
primer 54ºC selama 1 menit, pemanjangan
DNA 72ºC selama 1 menit, siklus diulangi
sebanyak 35 kali, pemanjangan pasca PCR
72ºC selama 5 menit dan proses pendinginan
dilakukan pada suhu 15ºC selama 15 menit.
Identifikasi kandidat mutan dengan PCR
Identifikasi kandidat mutan dilakukan
berdasarkan keberadaan dan ukuran gen Gα
pada cDNA murni hasil RT. PCR
menggunakan 6 kombinasi primer yang
didesain dari kedelai kultivar Slamet
(Accession L27418) dan padi (Accession

Tabel 1 Sekuen basa nitrogen pada primer yang digunakan
Nama primer

Asal

Sekuen basa nitrogen(5' - '3)

Posisi nukleotida

L27418SOYGALP1 (L1)

cDNA Gen Gα Kedelai
(Accession: L27418)

GCTTCACACTTCACACTTAACACT (F)

111 nukleotida
sebelum ATG

L27418SOYGALP3 (L3)

cDNA Gen Gα Kedelai
(Accession: L27418)

GCGCAGAATGACTTTGATTCTT (F)

309 nukleotida
sesudah ATG

L27418SOYGALP4 (L4)

cDNA Gen Gα Kedelai
(Accession: L27418)

CTTAGGACCCACTCAAAAACGTTCC (R)

358 nukleotida
sebelum TGA

L27418SOYGALP5 (L5)

cDNA Gen Gα Kedelai
(Accession: L27418)

GTTTACCCGCGTCTTACCAA (F)

361 nukleotida
sesudah ATG

RGA-U3

DNA Genom Gen Gα
Padi (Accession:
L35844)

CTGGCTTTGATGAGGCAGAAC (F)

775 nukleotida
sesudah ATG

L35844) (Limbong 2010). Kombinasi primer
tersebut yaitu L1-L2, L3-L2, L3-L4, U3-L4,
L1-L4 dan L5-L4 (Tabel 1). Komposisi PCR
sama dengan komposisi PCR aktin. Kondisi
PCR juga sama dengan PCR aktin, tetapi
dengan suhu penempelan primer 52ºC.
Identifikasi
mutan
dilakukan
dengan
membandingkan pita gen pada gel agarosa 2%
(b/v).

HASIL
Dua puluh delapan nomor tanaman
kandidat mutan M5 dan M6 berhasil ditanam,
diamati keadaan stomata dan diukur tingginya
(Lampiran 1). Enam tanaman diseleksi
berdasarkan keadaan stomata menutup >50%
dan lebih pendek dari pada Slamet non mutan
(Tabel 2).
RNA total dari tanaman yang terseleksi
berhasil diisolasi dan integritasnya dianalisis
dengan elektroforesis. RNA total digunakan
sebagai cetakan untuk mensintesis cDNA
melalui RT-PCR. Identifikasi mutan Gα pada
kandidat mutan menggunakan cDNA sebagai
cetakan dan lima kombinasi primer yaitu L1L2, L3-L2, L3-L4, U3-L4, dan L5-L4
(Gambar 1).

Keberhasilan sintesis cDNA dapat
diketahui dengan mengamplifikasi gen aktin
melalui PCR. Hasil PCR aktin yaitu pita DNA
berukuran 450pb sesuai dengan ukuran ekson
1 dan ekson 2 dari gen aktin (Gambar 2, 3
dan 4). Hasil tersebut juga menunjukkan
bahwa cDNA yang diperoleh murni tidak
terkontaminasi DNA genom.
Kandidat mutan M5 dengan kode Slm1-5,
Slm2-5,
Slm3-5, dan Slm4-5 telah
diidentifikasi secara molekular. Kandidat
mutan Slm4-5 mengalami mutasi pada ruas
L5-L4 berupa penurunan ekspresi gen, namun
pada tiga nomor yang lain tidak mengalami
mutasi gen Gα (Gambar 2). Kandidat mutan
Slm4-5 ditanam kembali sehingga didapatkan
kandidat mutan generasi ke-6 yaitu Slm1-6.
Kandidat mutan Slm1-6 mengalami mutasi
gen Gα pada ruas L1 sampai L3 (Gambar 3).
Tanaman Slm1-6 memiliki stomata menutup
>50% (Tabel 2) dan lebih pendek dari pada
Slamet non mutan (Lampiran 3). Dua kandidat
mutan lainnya mengalami mutasi gen Gα
dengan penurunan ekspresi gen pada ruas U3L4 yaitu tanaman Slm3-6 dan pada ruas L3L2 yaitu Slm2-6. Hal tersebut dapat dilihat
dari ketebalan pita dua kandidat tersebut yang
lebih tipis dari tanaman non mutan (Gambar
4).

Tabel 2 Keadaan stomata menutup dan tinggi tanaman
Kode

Nomor tanaman

% Stomata
menutup

Slm1-5
Slm2-5
Slm3-5
Slm4-5
Slm2-6
Slm3-6
Sl
Slm1-6
Sl

338/3S1.174/12/1/4/2
338/3S1.174/12/1/4/7
344/3S1.196/14/1/8/5
344/3S1.196/14/1/8/7
103/3S3.103/8/5/1/4/8
103/3S3.103/8/5/1/4/9
Slamet non mutan
344/3S1.196/14/1/8/7/5
Slamet non mutan

30,8±30,4
11,3±6,8
90,7±5,0
77,6±2,2
76,1±16,1
66,6±15,7
9,5±7,8
85,0±11,0
34,0±19,0

Tinggi
tanaman
berbunga (cm)
36,0
34,0
36,1
38,5
39,0
35,5
43,7
50,0
65,0

Keterangan

RH 54%,
suhu 34o C

RH 42%,
suhu 32o C

Gambar 1 Panjang basa nitrogen antar primer cDNA heterotrimerik Gα
M

P

Sl

Slm1-5 Slm2-5 Slm3-5 Slm4-5

1650pb

L1-L2

1000pb
1000pb

L1-L4

850pb
700pb

L3-L4

600pb
500pb

L5-L4

400pb
500pb

Aktin

400pb

Gambar 2 Ekspresi gen Gα dan aktin generasi M5 pada kandidat mutan Slm1-5, Slm2-5, Slm3-5,
dan Slm4-5. Marker (M), kontrol positif plasmid SL16 (P), dan kontrol non mutan
kedelai kultivar Slamet (Sl).
M

P

Sl

M

Slm1-6

600pb

600pb

500pb

L3-L4

850pb
650pb

U3-L4

1000pb

L1-L4

850pb
500pb

Slm2-6

Slm3-6
U3-L4

L1L4
L5-L4

400pb
1000pb
850pb

500pb

Aktin

400pb

Gambar

Sl

500pb
1000pb

850pb

P

3 Ekspresi gen Gα dan aktin
generasi M6 pada kandidat
mutan Slm1-6. Marker (M),
kontrol positif plasmid SL16
(P), dan kontrol non mutan
kedelai kultivar Slamet (Sl).

PEMBAHASAN
RNA dari tanaman kandidat mutan yang
terseleksi berdasarkan keadaan stomata
menutup dan lebih pendek dari pada Slamet
non mutan telah berhasil diisolasi. RNA dapat
dibagi menjadi dua kelompok yaitu yang
berhubungan dengan ekspresi gen (mRNA,
tRNA dan rRNA) dan yang tidak
berhubungan dengan proses tersebut (RNA

500pb
400pb

L3-L2

Aktin

Gambar 4 Ekspresi gen Gα dan aktin generasi
M6 pada kandidat mutan Slm2-6 dan
Slm3-6. Marker (M), kontrol positif
plasmid SL16 (P), dan kontrol non
mutan kedelai kultivar Slamet (Sl).
primer). Dari ketiga jenis RNA yang berperan
pada ekspresi gen, rRNA memiliki jumlah
yang terbesar (83%) di dalam sel (Jusuf
2001). Oleh karena itu, rRNA digunakan
sebagai indikator keberhasilan isolasi RNA
total. PCR gen aktin dengan cDNA sebagai
cetakan menghasilkan pita sebesar 450pb
(Gambar 2, 3 dan 4). Kontaminasi cDNA oleh
DNA genom ditandai dengan adanya pita
yang ukurannya lebih besar (550pb). cDNA

murni digunakan untuk mengidentifikasi
keberadaan gen Gα dengan menggunakan
PCR. PCR gen Gα dilakukan dengan beberapa
kombinasi primer yang menghasilkan ukuran
pita DNA yang berbeda (Gambar 1).
Keracunan Al pada tanaman kandidat
mutan nomor 338/3S1.174/12/1 menyebabkan
kerusakan jaringan akar sampai ke kortek dan
pertumbuhan ujung akar menjadi bengkok
(Giok 2010). Mutasi gen Gα dapat
menyebabkan perubahan fenotipe tanaman
mutan. Kandidat mutan memiliki persentase
stomata menutup >50% dan lebih pendek dari
pada Slamet non mutan. Penutupan dan
pembukaan stomata merupakan akibat dari
aktifitas hormon tumbuh seperti asam absisat
(ABA) yang menyebabkan stomata menutup
pada tanaman (Mishra et al. 2006). Empat
kandidat mutan gen Gα generasi M5 yang
berhasil diseleksi yaitu Slm1-5, Slm2-5,
Slm3-5, dan Slm4-5 (Tabel 2). Tanaman
Slm4-5 mengalami mutasi gen Gα pada ruas
L5-L4 berupa penurunan ekspresi gen,
sedangkan tiga nomor lainnya diduga
mengalami mutasi gen Gα (Gambar 2). Hasil
identifikasi menggunakan lima kombinasi
primer pada dua kandidat mutan, juga
menunjukkan adanya penurunan ekspresi gen
Gα pada dua kandidat mutan yaitu Slm3-6
pada ruas U3-L4 dan Slm2-6 pada ruas L3-L2
(Gambar 4). Penurunan ekspresi gen dapat
dilihat dari ketebalan pita gen yang lebih tipis
dari pita kultivar Slamet non mutan. Tingkat
ekspresi gen ditentukan oleh promotor. Mutasi
pada promotor dapat menyebabkan penurunan
ekspresi gen. Berdasarkan hasil identifikasi
Limbong (2010) kandidat mutan nomor
103/3S3.103/8/5/1/4 mengalami mutasi gen
Gα pada ruas U3 dan L4. Hal ini dapat terjadi
karena kemungkinan adanya perubahan
beberapa basa nitrogen pada situs penempelan
primer U3. Mutasi terjadi pada kandidat
mutan Slm1-6 yaitu pada ruas L1 sampai L3
(Gambar 4). Tanaman kandidat mutan Slm1-6
memiliki fenotipe lebih pendek dari pada
Slamet non mutan dan stomata menutup
>50%. Mutasi pada nomor ini diketahui
setelah dilakukan pengecekan dengan tiga
kombinasi primer yaitu L3-L4, L1-L4 dan U3L4. Mutasi yang terjadi pada nomor ini adalah
hilangnya sebagian atau seluruh sekuen L1
dan L3, sehingga primer L1 dan U3 yang
berada di ruas L1 sampai L3 tidak dapat
menempel, sedangkan primer yang berada di
ruas setelah U3 dapat menempel, sehingga
ruas L3-L4 dapat teramplifikasi. Hasil
penelitian Limbong (2010) menunjukkan
bahwa kandidat mutan M4 dengan nomor

344/3S1.196/14/1/8 tidak mengalami mutasi
gen Gα. Hal tersebut menunjukkan bahwa
kandidat nomor 344/3S1.196/14/1/8 (M4)
memiliki alel gen Gα yang heterozigot
terhadap mutan Gα.

SIMPULAN
Tiga nomor tanaman kandidat mutan
generasi M6 yang diidentifikasi berdasarkan
mRNA, mengalami mutasi gen Gα, yaitu
nomor 103/3S3.103/8/5/1/4/9 pada ruas U3L4, nomor 103/3S3.103/8/5/1/4/8 pada ruas
L3-L2 dan nomor 344/3S1. 196/14/1/8/7/5
pada ruas L1 sampai L3.

SARAN
Untuk mendapatkan kandidat mutan
perlu dilakukan seleksi dari seluruh biji yang
berhasil dipanen. Hal ini dilakukan agar
didapatkan kandidat mutan yang memiliki
tingkat segregasi lebih kecil. Selain itu, perlu
dilakukan sekuensing untuk membuktikan
mutasi yang terjadi pada sekuen gen Gα.

DAFTAR PUSTAKA
Alberts et al. 2002. Molecular biology of the
cell. New York: Garlan science.
Fujisawa et al. 1999. Supression of
heterotrimeric
G
protein
causes
abnormal
morphology
including
dwarfism in rice. Proc Natl Acad Sci
96:7575-7580
Fujisawa, Kato, Iwasaki . 2001. Structure and
function of heterotrimeric G proteins in
plants. Plant Cell Physiol 42(8):789-794
Giok G. 2010. Studi anatomi dan histokimia
pada akar kedelai (Glycine max (L)
Merr) kandidat mutan Gα terhadap
cekaman aluminium [Skripsi]. Bogor:
Fakultas
Matematika
dan
Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor
Hartini S. 2008. Induksi mutasi dengan
irradiasi sinar gamma pada kedelai
(Glycine max (L) Merrill) kultivar
Slamet dan Lumut [Tesis]. Bogor:
Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian
Bogor.
Jusuf M. 2001. Genetika I: Struktur dan
Ekspresi Gen. Jakarta: Sagung Seto.
Jusuf M, Suharsono. 2006. Perbaikan Genetik
Tanaman Kedelai Untuk Produktivitas dan
Adaptasi Terhadap pH Rendah [Laporan
akhir hibah bersaing XII]. Bogor:
Lembaga Penelitian dan Pengembangan
Masyarakat, Institut Pertanian Bogor.

Limbong LM. 2010. Identifikasi molekular
kandidat mutan protein heterotimerik G
subunit α (Gα) dari kedelai (Glycine max
(L) Merrill) toleran aluminium kultivar
Slamet [Skripsi]. Bogor: Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam, Institut Pertanian Bogor.
Ma H. 1994. GTP binding proteins in plants:
new members of an old family. Plant
Mol Biol 26:1611-1636.
Ma H. 2001. Plant G proteins: the different
faces of GPA1. Curr Biol 11:R869R871.
Mishra G, Zhang W, Deng F, Zhao J, Wang
Z. 2006. A bifurcating pathway direct
abscisic acid effects on stomatal closure
and opening in Arabidopsis. Science
312: 264-266.
Perfush-Barbeoch L, Jones AM, Assman SM.
2004. Plant heterotrimeric G protein
function: Insight from Arabidopsis and
rice mutants. Plant Biol 7:719-731.
Srimulyati T. 2007. Keterlibatan protein
heterotrimerik Gα terhadap cekaman
aluminium pada kedelai (Glycine max
(L.) Merril) melalui studi histokimia
[Skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut
Pertanian Bogor.
Suharsono U, Fujisawa Y, Kawasaki T,
Iwasaki Y, Satoh H, Shimamoto K.
2002. The heterotrimeric G protein 
subunit acts upstream of the small
GTPase Rac in disease resistance of rice.
Proc Natl Acad Sci USA 99: 1330713312.
Suharsono U, Suharsono. 2004. Analisis gen
penyandi protein heterotrimerik G
subunit α yang terlibat dalam system
toleransi tanaman kedelai terhadap
cekaman aluminium. [Laporan penelitian
Hibah Bersaing Perguruan Tinggi XII].
Institut Pertanian Bogor.

LAMPIRAN

Lampiran 1 Hasil seleksi tanaman kandidat mutan berdasarkan persentase stomata menutup >50%
dan tanaman pendek
Nomor tanaman

Stomata
menutup (%)

Tinggi
tanaman (cm)

338/3S1.174/12/1/4/1
338/3S1.174/12/1/4/2
338/3S1.174/12/1/4/3
338/3S1.174/12/1/4/4
338/3S1.174/12/1/4/5
338/3S1.174/12/1/4/6
338/3S1.174/12/1/4/7
338/3S1.174/12/1/4/8
344/3S1.196/14/1/8/2
344/3S1.196/14/1/8/3
344/3S1.196/14/1/8/4
344/3S1.196/14/1/8/5
344/3S1.196/14/1/8/6
344/3S1.196/14/1/8/7
344/3S1.196/14/1/8/8
103/3S3.103/8/5/1/4/1
103/3S3.103/8/5/1/4/2
103/3S3.103/8/5/1/4/4
103/3S3.103/8/5/1/4/6
103/3S3.103/8/5/1/4/7
103/3S3.103/8/5/1/4/8
103/3S3.103/8/5/1/4/9
103/3S3.103/8/5/1/4/10
103/3S3.103/8/5/1/4/11
103/3S3.103/8/5/1/4/12
slamet wild type

4.3±4.6
30.8±30.4
10.3±5.9
13.4±8.00
21.6±5.7
57.4±11.7
11.3±6.8
0.0±0.0
72.3±26.6
100.0±0.0
91.4±3.4
90.7±5.0
85.0±3.5
77.6±2.2
88.3±1.6
19.6±11.4
27.4±11.5
95.7±4.0
70.4±26.8
54.1±14.4
76.1±16.1
66.6±15.7
70.2±26.0
93.6±5.8
87.9±11.1
7.1±7.9

38.5
36.0
46.0
48.3
40.0
41.0
34.0
48.6
29.0
40.6
41.0
36.1
35.6
38.5
41.1
31.0
30.0
34.0
37.5
38.0
39.0
35.5
31.0
33.0
34.5
40.0±5.0

Umur
berbunga
(HST)
37.0
37.0
35.0
35.0
37.0
37.0
37.0
35.0
40.0
40.0
40.0
40.0
40.0
40.0
40.0
40.0
41.0
40.0
40.0
40.0
43.0
41.0
40.0
41.0
43.0
38.6±1.1

Jumlah
biji
0
0
0
0
0
0
0
0
133
53
166
100
120
169
128
0
33
115
36
70
12
68
21
79
0

*suhu : 34oc
RH : 54%

Lampiran 2 Komposisi buffer MOPS 20x dan gel agarosa 1%
A. Buffer MOPS 20x
Morpholino propano sulfonic acid (MOPS): 42 gram
Natrium asetat pekat
: 4.1 gram
EDTA (Tritriplex)
: 3.7 gram
Aquades
: 1 liter
B. Komposisi gel agarosa 1% (b/v)
Agarosa
: 0. 25 gr
20x MOPS
: 1.25 ml
Formaldehid
: 1.35 ml
ddH2O-DEPC 0.1%
: 22. 4 ml

Lampiran 3 Tanaman kandidat mutan Slm1-6 (kanan) dan Slamet non mutan (kiri)

10 cm

ABSTRAK
HAYATUL FAJRI. Identifikasi Secara Molekular Kandidat Mutan Gen Gα dari Kedelai Kultivar
Slamet berdasarkan mRNA. Dibimbing oleh UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO dan ARIS
TJAHJOLEKSONO.
Protein heterotrimerik G terdiri atas tiga subunit yaitu α, , dan (Gα, G dan G ) yang
terletak di membran internal sel. Protein Gα teraktivasi ketika adanya cekaman biotik atau abiotik
dari luar sel. Protein Gα diduga berperan terhadap ketahanan cekaman Aluminium (Al). Kedelai
kultivar Slamet merupakan kedelai toleran Al yang memiliki satu kopi gen Gα. Irradiasi sinar
gamma pada biji kedelai kultivar Slamet menyebabkan mutasi random pada kedelai kultivar
Slamet generasi M2. Kandidat mutan Gα M2 diseleksi berdasarkan keadaan stomata menutup pada
siang hari dan tinggi tanaman. Mutan Gα M4 nomor 338 dan 103 mengalami kerusakan jaringan
sel akar lebih besar dibandingkan tanaman non mutan. Tanaman nomor 338/3S1.174/12/14 (M4)
dan 103/3S3.103/8/5/1/4 (M5) mengalami mutasi gen Gα pada ruas U3-L4 (ekson 5 – ekson 11).
Sedangkan tanaman nomor 344/3S1.196/14/1/8 (M4) diduga mutan gen Gα. Ketiga nomor
tersebut ditanam kembali sampai generasi ke 6 dan diseleksi kandidat mutan Gα berdasarkan
fenotipe lebih pendek dari pada Slamet non mutan dan stomata menutup >50%. Dipilih empat
nomor dari M5 dan tiga nomor dari M6 untuk diidentifikasi mutan Gα bedasarkan mRNA.
Tanaman M5 nomor 344/3S1.196/14/1/8/7 mengalami penurunan ekspresi gen Gα pada
ruas L5-L4 (ekson 7- ekson 11). Generasi selanjutnya (M6) yaitu nomor 344/3S1.196/14/1/8/7/5
mengalami mutasi gen Gα pada ruas L1 sampai L3 (ekson 2 – ekson 6). Penurunan ekspresi gen
Gα dapat terjadi karena adanya mutasi pada promotor gen Gα. Tiga tanaman M5 lain diduga
mengalami mutasi gen Gα. Dua tanaman M6 yaitu nomor 103/3S3.103/8/5/1/4/8 mengalami
mutasi pada ruas L3-L2 (ekson 6 – ekson 15) dan nomor 103/3S3.103/8/5/1/4/9 pada ruas U3-L4
(ekson 5 – ekson 11). Mutasi yang terjadi pada dua nomor ini adalah penurunan ekspresi gen yang
ditandai dengan lebih tipisnya pita gen Gα dibandingan tanaman Slamet non mutan.

ABSTRACT
HAYATUL FAJRI. Molecular Identification of Mutant Candidate of Gα Gene from Soybean cv.
Slamet Based on mRNA. Supervised by UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO and ARIS
TJAHJOLEKSONO.
Heterotrimeric G proteins composed of α, , and subunits, are bound to the inside surface
of the cell membrane. Gα proteins will be activated by extracellular stimuli (biotic or abiotic
stress). It is presumably Gα proteins playing an important role in aluminum (Al)-stress tolerance.
Soybean cv. Slamet was considered as a tolerant plant to Al and has a single copy of Gα gene.
Gamma irradiation to soybean cv. Slamet seeds caused a random chromosomal mutation of second
generation plants (designated as M2). The Gα mutant candidates were selected based on stomatal
closure in the daylight and dwarf. Gα mutant candidates M4, number 338 and 103 have severe
root cell tissues damage compared to non mutant ones. Plant number 338/3S1.174/12/14 (M4) and
103/3S3.103/8/5/1/4 (M5) have a Gα gene mutation at the U3-L4 sequences (exon 5 – exon 11).
Whereas, plant number 344/3S1.196/14/1/8 (M4) is assumed as Gα gene mutant. All of those
plants were replanted until sixth generation. The candidates of Gα mutant selected have more than
fifty percent of closed stomata and dwarf. Four number of M5 plants and three number of M6
plants were selected for Gα mutant identification based on mRNA analysis.
The fifth generation plant number 344/3S1.196/14/1/8/7 were decreased its Gα gene
expression at L5-L4 sequences (exon 7 – exon 11). The M6 generation plant number
344/3S1.196/14/1/8/7/5 have mutation in Gα gene at L1-L3 sequences (exon 2 – exon 6). A major
contributing factor to decreased expression levels of Gα gene may be due to mutation of Gα gene
promotor. Three other of M5 plants were assumed as Gα mutant. M6 plant number
103/3S3.103/8/5/1/4/8 has mutation at L3-L2 sequences (exon 6 – exon 15) and number
103/3S3.103/8/5/1/4/9 has mutation at U3-L4 sequences (exon 5 – exon 11). The decreasing of
gene expression caused by mutation in those plants was indicated by the less pronounced DNA
bands on agarose gel than that of non mutant plants.

PENDAHULUAN
Latar belakang penelitian
Protein G berdasarkan komposisi dan
fungsinya diklasifikasikan menjadi protein G
kecil dan protein heterotrimerik G (Ma 1994).
Protein heterotrimerik G terdiri atas tiga
subunit yaitu α, dan (Gα, G dan G )
(Ma 1994) dan dapat diaktifasi dengan adanya
sinyal ekstraseluler (Albert et al. 2002).
Protein heterotrimerik G adalah mediator yang
mengirimkan sinyal ekstraseluler melalui
molekul reseptor ke molekul efektor
(Fujisawa et al. 2001). Sinyal ekstraseluler
menyebabkan protein heterotrimerik G aktif
dan akan mengubah Guanin Diphospat (GDP)
yang berlekatan dengan Gα menjadi Guanin
Triphospat (GTP). Terikatnya GTP pada Gα
menyebabkan Gα berpisah dari dimer G
dan kembali membentuk trimer saat inaktif
(Perfush-Barbeoch et al. 2004).
Kedelai kultivar Slamet merupakan
tanaman toleran aluminium (Al) (Jusuf &
Suharsono 2006). Salah satu sinyal
ekstraseluler yang dapat mempengaruhi
regulasi seluler pada tanaman adalah cekaman
Al. Kedelai kultivar Slamet memiliki satu
kopi gen Gα (Suharsono & Suharsono 2004).
Mastoparan berperan sebagai aktivator protein
Gα dan dapat meningkatkan sistem
pertahanan tanaman kedelai kultivar Lumut
yang peka terhadap cekaman Al (Jusuf &
Suharsono 2006), melalui pertambahan
panjang akar, penurunan kandungan Al dan
kalosa, dan peningkatan integritas membran
(Srimulyati 2007).
Hartini (2008) telah melakukan induksi
dengan menggunakan irradiasi sinar gamma
dosis 0.1 dan 0.3 kGy pada kedelai kultivar
Slamet dan Lumut untuk mendapatkan mutan
Gα. Irradiasi tersebut menghasilkan sepuluh
kandidat mutan Gα generasi ke-2 (M2)
dengan ciri kondisi stomata menutup.
Kandidat mutan dari kultivar lumut dihasilkan
dari dosis irradiasi 0.3kGy, sedangkan
kandidat mutan dari kultivar Slamet
dihasilkan dari dosis irradiasi 0.1 dan 0.3 kGy.
Dari sepuluh tanaman tersebut, baru satu
kandidat mutan yang telah dianalisis secara
molekular dan menunjukkan adanya mutasi
gen Gα.
Selanjutnya kesepuluh kandidat mutan
generasi M2 tersebut ditanam masing-masing
sebanyak 10-15 tanaman dan dilakukan
seleksi berdasarkan kondisi stomata yang
menutup (Perfush-Barbeoch et al. 2004) dan
kerdil (Fujisawa et al. 1999; Ma 2001) pada
generasi M3. Biji dari kandidat mutan

generasi M3 selanjutnya ditanam untuk
mendapatkan tanaman generasi M4. Kandidat
mutan M4 untuk setiap nomor dipilih
berdasarkan kondisi stomata yang menutup
>50% dan pendek. Limbong (2010) telah
berhasil menseleksi tiga generasi (M2 sampai
M4) dan mendapatkan 26 tanaman yang
diduga merupakan kandidat mutan Gα dengan
ciri stomata menutup >50%. Identifikasi
mutan berdasarkan keberadaan gen Gα telah
dilakukan berdasarkan DNA genom dari
tanaman kandidat mutan.
Dua tanaman M4 yaitu nomor
338/3S1.174/12/1/4 dan 103/3S3.103/8/5/1/4
merupakan mutan Gα pada ruas U3-L4.
Tanaman nomor 344/3S1.196/14/1/8 diduga
mengalami mutan gen Gα. Identifikasi mutan
Gα berdasarkan DNA genom tersebut
menghasilkan fragmen (bukan gen utuh) gen
Gα. Oleh karena itu, perlu dilakukan
identifikasi Gα berdasarkan mRNA sehingga
dapat diketahui adanya mutasi pada ruas utuh
(full lenght) gen Gα dari ketiga tanaman
kandidat mutan tersebut.

Tujuan penelitian
Tujuan penelitian ini adalah untuk
mengidentifikasi kandidat mutan protein
heterotrimerik Gα dari kedelai toleran Al
kultivar Slamet berdasarkan hasil analisis
mRNA.

BAHAN DAN METODE
Waktu dan tempat
Penelitian dilaksanakan mulai bulan
Februari 2010 sampai dengan bulan Mei 2011
di Laboratorium Biotechnological Research
Indonesia-Netherland
(BIORIN),
Pusat
Penelitian Sumber Daya Hayati dan
Bioteknologi (PPSHB), Institut Pertanian
Bogor.

Bahan dan alat
Bahan tanaman yang digunakan dalam
penelitian ini antara lain yaitu biji kedelai
kultivar Slamet yang merupakan kandidat
mutan heterotrimerik Gα (Limbong 2010).
Biji tersebut adalah kandidat mutan generasi
ke-5 (M5) dari tanaman generasi ke-4 (M4)
nomor
338/3S1.174/12/1/4,
344/3S1.196/14/1/8, dan generasi ke-6 (M6)
dari tanaman M5 nomor 103/3S3.103/8/5/1/4,
serta kedelai kultivar Slamet non mutan.
Alat yang digunakan antara lain yaitu 4 in
1 environment tester, penggaris, kamera
digital, mikroskop cahaya, mortar, sudip, tip
berbagai ukuran, tube 1.5 ml, autoklaf, pipet

PENDAHULUAN
Latar belakang penelitian
Protein G berdasarkan komposisi dan
fungsinya diklasifikasikan menjadi protein G
kecil dan protein heterotrimerik G (Ma 1994).
Protein heterotrimerik G terdiri atas tiga
subunit yaitu α, dan (Gα, G dan G )
(Ma 1994) dan dapat diaktifasi dengan adanya
sinyal ekstraseluler (Albert et al. 2002).
Protein heterotrimerik G adalah mediator yang
mengirimkan sinyal ekstraseluler melalui
molekul reseptor ke molekul efektor
(Fujisawa et al. 2001). Sinyal ekstraseluler
menyebabkan protein heterotrimerik G aktif
dan akan mengubah Guanin Diphospat (GDP)
yang berlekatan dengan Gα menjadi Guanin
Triphospat (GTP). Terikatnya GTP pada Gα
menyebabkan Gα berpisah dari dimer G
dan kembali membentuk trimer saat inaktif
(Perfush-Barbeoch et al. 2004).
Kedelai kultivar Slamet merupakan
tanaman toleran aluminium (Al) (Jusuf &
Suharsono 2006). Salah satu sinyal
ekstraseluler yang dapat mempengaruhi
regulasi seluler pada tanaman adalah cekaman
Al. Kedelai kultivar Slamet memiliki satu
kopi gen Gα (Suharsono & Suharsono 2004).
Mastoparan berperan sebagai aktivator protein
Gα dan dapat meningkatkan sistem
pertahanan tanaman kedelai kultivar Lumut
yang peka terhadap cekaman Al (Jusuf &
Suharsono 2006), melalui pertambahan
panjang akar, penurunan kandungan Al dan
kalosa, dan peningkatan integritas membran
(Srimulyati 2007).
Hartini (2008) telah melakukan induksi
dengan menggunakan irradiasi sinar gamma
dosis 0.1 dan 0.3 kGy pada kedelai kultivar
Slamet dan Lumut untuk mendapatkan mutan
Gα. Irradiasi tersebut menghasilkan sepuluh
kandidat mutan Gα generasi ke-2 (M2)
dengan ciri kondisi stomata menutup.
Kandidat mutan dari kultivar lumut dihasilkan
dari dosis irradiasi 0.3kGy, sedangkan
kandidat mutan dari kultivar Slamet
dihasilkan dari dosis irradiasi 0.1 dan 0.3 kGy.
Dari sepuluh tanaman tersebut, baru satu
kandidat mutan yang telah dianalisis secara
molekular dan menunjukkan adanya mutasi
gen Gα.
Selanjutnya kesepuluh kandidat mutan
generasi M2 tersebut ditanam masing-masing
sebanyak 10-15 tanaman dan dilakukan
seleksi berdasarkan kondisi stomata yang
menutup (Perfush-Barbeoch et al. 2004) dan
kerdil (Fujisawa et al. 1999; Ma 2001) pada
generasi M3. Biji dari kandidat mutan

generasi M3 selanjutnya ditanam untuk
mendapatkan tanaman generasi M4. Kandidat
mutan M4 untuk setiap nomor dipilih
berdasarkan kondisi stomata yang menutup
>50% dan pendek. Limbong (2010) telah
berhasil menseleksi tiga generasi (M2 sampai
M4) dan mendapatkan 26 tanaman yang
diduga merupakan kandidat mutan Gα dengan
ciri stomata menutup >50%. Identifikasi
mutan berdasarkan keberadaan gen Gα telah
dilakukan berdasarkan DNA genom dari
tanaman kandidat mutan.
Dua tanaman M4 yaitu nomor
338/3S1.174/12/1/4 dan 103/3S3.103/8/5/1/4
merupakan mutan Gα pada ruas U3-L4.
Tanaman nomor 344/3S1.196/14/1/8 diduga
mengalami mutan gen Gα. Identifikasi mutan
Gα berdasarkan DNA genom tersebut
menghasilkan fragmen (bukan gen utuh) gen
Gα. Oleh karena itu, perlu dilakukan
identifikasi Gα berdasarkan mRNA sehingga
dapat diketahui adanya mutasi pada ruas utuh
(full lenght) gen Gα dari ketiga tanaman
kandidat mutan tersebut.

Tujuan penelitian
Tujuan penelitian ini adalah untuk
mengidentifikasi kandidat mutan protein
heterotrimerik Gα dari kedelai toleran Al
kultivar Slamet berdasarkan hasil analisis
mRNA.

BAHAN DAN METODE
Waktu dan tempat
Penelitian dilaksanakan mulai bulan
Februari 2010 sampai dengan bulan Mei 2011
di Laboratorium Biotechnological Research
Indonesia-Netherland
(BIORIN),
Pusat
Penelitian Sumber Daya Hayati dan
Bioteknologi (PPSHB), Institut Pertanian
Bogor.

Bahan dan alat
Bahan tanaman yang digunakan dalam
penelitian ini antara lain yaitu biji kedelai
kultivar Slamet yang merupakan kandidat
mutan heterotrimerik Gα (Limbong 2010).
Biji tersebut adalah kandidat mutan generasi
ke-5 (M5) dari tanaman generasi ke-4 (M4)
nomor
338/3S1.174/12/1/4,
344/3S1.196/14/1/8, dan generasi ke-6 (M6)
dari tanaman M5 nomor 103/3S3.103/8/5/1/4,
serta kedelai kultivar Slamet non mutan.
Alat yang digunakan antara lain yaitu 4 in
1 environment tester, penggaris, kamera
digital, mikroskop cahaya, mortar, sudip, tip
berbagai ukuran, tube 1.5 ml, autoklaf, pipet

mikro, sentrifus Jouan BRi, vacuum dryer,
perangkat elektroforesis, UV transluminator,
spektrofotometer, dan perangkat PCR
(Polymerase Chain Reaction).

Metode penelitian
Penanaman biji dan seleksi kandidat mutan
gen Gα
Biji kedelai ditanam pada lahan seluas 4 x
7 meter, dengan media tanam tanah yang
dicampur kompos. Masing-masing nomor
ditanam pada sepuluh lubang (satu biji/
lubang) dengan jarak tanam 20 x 40 cm.
Pemupukan dilakukan dua minggu setelah
tanam
dengan
dosis
Urea/TSP/KCL:
50/100/50 kg/ha. Hama diatasi dengan
Acodan dosis 0.5ml/l. Penyemprotan Acodan
dilakukan tiga kali selama masa tanam, yaitu
1 kali perbulan. Setelah tanaman memiliki
cukup daun (± 3 minggu setelah tanam),
dilakukan pengamatan kondisi stomata pada
saat pukul 12.00 dengan metode nail polish
swath. Selain itu, juga diamati suhu dan
kelembaban pada saat pengamatan stomata
(Lampiran 1). Pengamatan tinggi tanaman
dilakukan pada saat muncul bunga. Tanaman
yang tingginya lebih rendah dari pada Slamet
non mutan dan jumlah stomata menutup
>50% dipilih untuk diisolasi RNAnya.
Isolasi RNA total
Isolasi RNA menggunakan Kit Trizol
Invitrogen. Langkah-langkah isolasi yaitu:
500-1000
mg
daun
segar
digerus
menggunakan nitrogen cair dan dicampur
dengan 800µl Kit Trizol invitrogen. Campuran
diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit
dan ditambah dengan 200µl kloroform.
Campuran dikocok selama 30 detik dan
disentrifus dengan kecepatan 9000rpm,
selama 15 menit pada suhu 6ºC. Supernatan
diambil dan ditambah 500µl isopropanol dan
diinkubasi kembali selama 10 menit pada
suhu ruang, kemudian disentrifus dengan
kecepatan 9000rpm selama 10 menit pada
suhu 6ºC. Pelet diambil dan dicuci
menggunakan alkohol-DEPC 70% dengan
sentrifugasi 5700 rpm selama 5 menit pada
suhu 6ºC. Pelet dikeringkan menggunakan
vacuum dryer dan dilarutkan dalam 30 µl
ddH2O-DEPC
1%,
kemudian
RNA
dikuantifikasi menggunakan spektrofotometer
pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.
Keutuhan RNA di cek dengan elektroforesis
agarosa 1% (b/v) menggunakan buffer MOPS
1x (Lampiran 2). Langkah-langkah elektroforesis yaitu 10µg RNA dicampur dengan 12
µl premix (formamid, formaldehid, MOPS
20x dan ddH2O-DEPC 1%) dan dipanaskan

pada suhu 65ºC selama 10 menit, kemudian
didinginkan di dalam es selama 5 menit. RNA
dicampur dengan loading dye, dimasukan ke
dalam gel dan dimigrasikan menggunakan
buffer MOPS selama 30 menit dengan
tegangan 100 volt. Selanjutnya gel direndam
dalam larutan ethidium bromida 0.5 µg/ml
selama 10 menit, dibilas dengan akuades,
kemudian pita RNA dilihat menggunakan UV
transluminator.
Sintesis cDNA
Sebelum sintesis cDNA, dilakukan
pemurnian RNA dari DNA yaitu dengan
mencampur 5µg RNA dengan 1.1 µl buffer
DNase dan 1 unit enzim DNase. Campuran di
inkubasi pada suhu 25ºC selama 8 menit.
Selanjutnya dicampur dengan 1µl EDTA
25mM dan diinkubasi pada suhu 65ºC selama
10 menit. RNA murni didinginkan dalam es
selama 5 menit. Sintesis cDNA dilakukan
dengan metode Suharsono et al. (2002). Lima
µl RNA murni dicampur dengan 4µl 5x buffer
reaksi, 2 µl primer oligo dT, 1.6 µl dNTP 2.5
mM, 1 unit enzim reverse transcriptase III
(Invitrogen), 1 µl dTT (0.1 M) dan ddH20DEPC 1% steril sampai volume akhir 20 µl.
Reaksi transkripsi balik (RT) dilakukan pada
suhu 30ºC selama 10 menit, 42ºC selama 50
menit, 95ºC selama 5 menit sebanyak satu
siklus. Untuk mengetahui keberhasilan
sintesis cDNA dilakukan amplifikasi cDNA
melalui PCR menggunakan primer aktin yang
didesain dari kedelai (Accession V00450)
dengan primer forward tepat dikodon awal
dari ekson 1 (5’ATGGCAGATGCCGAGGγ’)
dan primer reverse tepat pada daerah ekson 2
(5’CAGTTGTGCGACCACTTGCAγ’). PCR
dilakukan dengan mencampur 1 µl hasil RT
dengan 1 µl buffer taq 10x, 1 µl dNTP 2.5
mM, 10 pmol primer forward, 10 pmol
primer reverse, 0.4 µl DMSO, 1 unit enzim
taq polymerase dan ddH20 sampai volume
akhir 10 µl. Kondisi PCR untuk aktin ada