Penapisan Virtual Interaksi Senyawa Fenolik, Alkaloid, Dan Saponin Dengan Reseptor Estrogen Alfa

PENAPISAN VIRTUAL INTERAKSI SENYAWA FENOLIK, ALKALOID,
DAN SAPONIN DENGAN RESEPTOR ESTROGEN ALFA

ERON TIRTA WIJAYA

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Penapisan Virtual
Interaksi Senyawa Fenolik, Alkaloid, dan Saponin dengan Reseptor Estrogen Alfa
adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.

Bogor, July 2015

Eron Tirta Wijaya
NIM F251120141

RINGKASAN
ERON TIRTA WIJAYA. Penapisan virtual interaksi senyawa fenolik, Alkaloid, dan
Saponin dengan reseptor estrogen alfa. Di bawah bimbingan NURI ANDARWULAN,
NANCY DEWI YULIANA dan ARRY YANUAR.
Osteoporosis terjadi pada keadaan ketika resorpsi tulang lebih cepat
dibandingkan dengan pembentukan tulang. Hal ini dipicu oleh penurunan produksi
hormon estrogen. Penggunaan estrogen sebagai pilihan untuk mengatasi osteoporosis
dilaporkan memiliki kemugkinan dapat meningkatkan terjadinya kanker, sehingga
penelitian untuk menemukan senyawa anti-osteoporosis yang aman perlu dilakukan.
Senyawa fenolik, alkaloid, dan saponin ditemukan berlimpah dalam tumbuhan yang
dapat dikonsumsi. Beberapa dari tumbuhan tersebut telah diteliti dan menunjukan
aktivitas pencegahan osteoporosis. In silico bearti eksperimen dengan basis komputer
yang dapat digunakan untuk menjelaskan mekanisme dari interaksi protein (misalnya
antara resptor dengan ligan) dengan mekanisme penambatan yang mengidentifikasi
pose pengikatan ligan dengan tepat saat ligan terikat di dalam reseptor dan untuk

memprediksikan energi afinitas (ΔG) antara ligan dengan resptor. Teknik ini
digunakan sebagai penghubung ke tahap analisis berikutnya dengan waktu dan biaya
yang singkat untuk menemukan efektivitas dari senyawa dibandingkan dengan
menggunakan teknik in vitro atau in vivo secara langsung. Penelitian ini bertujuan
untuk menapis kapabilitas ikatan dari beberapa senyawa fenolik, alkaloid, dan saponin
pada estrogen reseptor (ER)-α in silico menggunakan beberapa software seperti
Autodock4.2, Ligplot +, dan PyMOL. AutoDock digunakan untuk memperkirakan
afinitas senyawa pada reseptor dengan mengkalkulasikan nilai ΔG. Kemudian,
Ligplot+ dan PyMol digunakan untuk membuat hipotesis bedasarkan visualisasi 2 dan
3 dimensi. Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah sebagai berikut: struktur
makromolekul ER-α (1SJ0), 2 kontrol positif (17-b estradiol dan dienestrol) dan 89
ligan. Sampel ligan terdiri dari 32 senyawa fenolik, 40 senyawa alkaloid, dan 17
senyawa saponin.
Hasil penelitian, terdapat beberapa ligan yang memiliki potensi esterogenik.
Hal ini dapat dilihat dari nilai ∆G yang berada di bawah nilai ∆G dari kontrol positif
diensterol (-9.03 Kkal/mol). Kebanyakan dari ligan terlihat menjanjikan untuk
dikembangkan lebih lanjut sebagai fitoestrogen. Semua kelompok yang diuji memiliki
ligan yang berpotensi antara lain pinoresinol dan matairesinol dari kelompok fenolik,
jurubine, taxol, emetine dan reserpine dari kelompok alkaloid, dan cucurbitacin E,
protopanaxadiol, astragaloside III, dan sarsasapogenin dari kelompok saponin.

Visualisasi penambatan menunjukan bahwa nilai ∆G dipengaruhi oleh ikatan hidrogen
dan interaksi hidrofobik. Bedasarkan visualisasi fenolik, residu dominan dari ikatan
hidrogen biasanya terikat pada sisi yang berlawanan, yaitu posisi 2: GLU 353, LEU
387, ARG 394 — posisi 3: MET 421, GLY 521, HIS 524. Senyawa fenolik yang
terikat pada posisi 2 dan 3 dengan jarak 10.78±0.65 Å dari masing-masing gugus OH
umumnya memiliki potensi esterogenik. Selain itu diperlukan tahap penelitian
berikutnya secara in vitro dan in vivo untuk memastikan hasil interaksi ini
menghasilkan efek positif (agonist).
Kata kunci: Osteoporosis, Fitoestrogen, Fenolik, Saponin, Alkaloid, In silico

SUMMARY
ERON TIRTA WIJAYA. Virtual Screening of Phenolic, Alkaloid, and Saponin
Compound with Estrogen Receptor-α Interaction. Supervised by NURI
ANDARWULAN, NANCY DEWI YULIANA and ARRY YANUAR.
Osteoporosis occurs at the situation when bone resorption is faster than bone
formation. It is triggered by a decrease in estrogen hormone production. Estrogens
intervention as an option to overcome osteoporosis was reported to possibly
enhance cancers occurrence, thus research to find safer anti-osteoporosis agent is
required. Phenolics, alkaloids and saponins are found abundantly in many edible
vegetables. Some of them were reported to show osteoporosis preventive activity.

In silico can be defined as computer based experiment, which can explain the
mechanism of protein interaction (e.g. between receptor and ligand) by docking
mechanism which will precisely identify the binding pose of ligand when it is
attached on the receptor and to predict the energy affinity (ΔG) between ligand and
receptor. This technique was used as the connection to other step of analysis in
shorter time and expenses on find out the effectivity of the compound compared to
directly use in vitro or in vivo method. The research aimed to screen the binding
caplability of several phenolics, alkaloids, and saponins to the estrogen receptor
(ER)-α in silico using Autodock4.2, Ligplot +, and PyMOL software. Autodock was
used to estimate compounds affinity to the receptor by calculating the value of ΔG.
Furthermore, Ligplot + and PyMol were used to develop hypotheses based on
visualization 2 and 3 dimension. Materials used for this research were as follow:
macromolecules ER-α (1SJ0) structure, two positive controls (17-b estradiol and
dienestrol), and 89 ligands. The sample ligands consisted of 32 phenolics, 40
alkaloids, and 17 saponins.
As results, there were some ligands that had estrogenic potency. This can be
seen from ∆G value which were under ∆G of positive control diensterol (-9.03
Kcal/mol). Most of them seems promising to be developed further as phytoestrogen.
All tested groups was found to be potent ER ligands such as pinoresinol and
matairesinol from phenolic group, jurubine and taxol, emetine and reserpine from

alkaloid group, and cucurbitacin E, protopanaxadiol, astragaloside III, and
sarsasapogenin from saponin group. Docking visualization showed that ∆G value
were affected by hydrogen bonds and hydrophobic interactions. Based on phenolic
visualization, residue of hydrogen bond usually bound to side of the ligand is at
position 2: GLU353, LEU387, ARG394 — position 3: MET421, GLY521, HIS524.
The phenolic compounds which have bound at position 2 and 3 with length of about
10.78±0.65 Å for each their hydroxyl usually have estrogenic potency. Further in
vitro and in vivo studies are needed to ensure the results of these interaction generate
positive effect (agonist)
Keywords: Osteoporosis, Phytoestrogen, Phenolic, Saponin, Alkaloid, In silico

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa
mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk
kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan,
penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak
merugikan kepentingan IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya
tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

PENAPISAN VIRTUAL INTERAKSI SENYAWA FENOLIK, ALKALOID,
DAN SAPONIN DENGAN RESEPTOR ESTROGEN ALFA

ERON TIRTA WIJAYA

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Teknologi Industri Pertanian

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

Penguji Luar Komisi Pada Ujian Tesis: Puspo Edi Giriwono, STP., M.Sc, Ph.D

Judul Tesis : Penapisan Virtual Interaksi Senyawa Fenolik, Alkaloid, dan Saponin

dengan Reseptor Estrogen Alfa
Nama
: Eron Tirta Wijaya
NIM
: F251120141
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala
anugrah dan rahmat-Nya sehingga karya tulis yang berjudul Penapisan Virtual
Interaksi Senyawa Fenolik, Alkaloid, dan Saponin dengan Reseptor Estrogen
Alfa sebagai tugas akhir untuk mendapatkan gelar Magister Sains pada Program
Studi Ilmu Pangan, Sekolah Pascasarjana, Insitut Pertanian Bogor berhasil
diselesaikan.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Prof. Dr. Ir Nuri Andarwulan M.Si
selaku ketua komisi pembimbing, Ibu Dr. Ir. Nancy Dewi Yuliana, M.Sc dan Bapak
Dr. Ir. Arry Yanuar, M.Si. Apt. selaku anggota komisi pembimbing yang telah
banyak mengarahkan dan memberikan saran selama berjalannya penelitian hingga
penulisan karya tulis ini. Penulis juga ingin mengucapkan terima kasih keapada Bapak

Puspo Edi Giriwono, STP., M.Sc, Ph.D dan Ibu. Dr. Ir. Endang Prangdimurti, MSi
yang telah meluangkan waktunya untuk menjadi penguji di sidang tesis. Ungkapan
terima kasih juga disampaikan kepada seluruh staff dan rekan di laboratorium
komputasi biomedik dan rancangan obat, Fakultas Farmasi, Universitas Indonesia,
Depok. Keluarga yang selalu mendukung, serta seluruh sahabat dan teman atas
segala doa, kasih sayang, dan dukungannya.
Penulis menyadari bahwa karya tulis ini masih jauh dari sempurna. Oleh
karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran membangun untuk memperbaiki
dan menyempurnakan penulisan karya tulis ini selanjutnya. Akhir kata, penulis
berharap karya tulis ini dapat bermanfaat bagi semua pihak yang membutuhkan
untuk menjadi pelengkap dalam dunia teknologi pangan untuk menjawab tantangan
analisis ke depan dan bagi pengembangan ilmu dan penerapan pembelajaran,
khususnya bagi Program Studi Ilmu Pangan, Sekolah Pascasarjana, Institut
Pertanian Bogor.

Bogor, July 2015
Eron Tirta Wijaya

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

x

DAFTAR GAMBAR

x

DAFTAR LAMPIRAN

x

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian

1
1

3
3
3
3

2 TINJAUAN PUSTAKA

4

3 METODE
Bahan
Alat
Prosedur Penelitian

8
8
8
9

4 HASIL DAN PEMBAHASAN

Preparasi Struktur Makromolekul
Validasi Metode Penapisann Virtual in silico
Penapisan Virtual dan Visualisasi Penambatan Senyawa Fenolik
Penapisan Virtual dan Visualisasi Penambatan Senyawa Alkaloid
Penapisan Virtual dan Visualisasi Penambatan Senyawa Saponin

12
12
12
12
18
20

5 KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Saran

26
26
26

DAFTAR PUSTAKA

27

LAMPIRAN

36

RIWAYAT HIDUP

73

DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5

Hasil validasi nilai EF1 dan AUC
Sifat kimia dan sumber pangan pada kelompok fenolik
Residu asam amino dominan dari ER-α yang berikatan hidrogen
Sifat kimia dan sumber pangan pada kelompok alkaloid
Sifat kimia dan sumber pangan pada kelompok saponin

12
14
16
21
23

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

Hubungan massa tulang dengan penuaan
Siklus penghancuran dan pembentukan tulang
Penurunan hormon estrogen
Reseptor estrogen-α (1SJ0)
Boxplot ∆G dengan sub kelas fenolik
Visualisasi posisi dari residu asam amino dominan dari ER-α yang
berikatan hidrogen
Penambatan Ligan Quersetin dengan Residu pada Posisi 2 dan 3
Boxplot ∆G dengan sub kelas alkaloid
Penambatan ligan alkaloid (Taxol dan Iriine)
Boxplot ∆G dengan sub kelas saponin
Penambatan ligan saponin (protopanaxadiol dan cucurbitacin)

4
5
5
7
13
17
18
19
19
20
24

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

Tampilan Situs Protein Data Bank (PDB)
Tampilan Situs Pub Chem
Tampilan Program PyRx
Tampilan Situs A Database of Useful Decoys: Enhanced (DUDE)
Tampilan Program Open Babel
Tampilan Program Auto Dock 4.2
Berkas min.in
Jarak gugus OH ligan kontrol dan fenolik pada posisi 2-3
Visualisasi 2 Dimensi Interaksi Ligan Kontrol Positif dengan ER-α
Visualisasi 2 Dimensi Interaksi Ligan Fenolik dengan ER-α
Visualisasi 2 Dimensi Interaksi Ligan Alkaloid dengan ER-α
Visualisasi 2 Dimensi Interaksi Ligan Saponin dengan ER-α

36
36
37
37
38
38
39
39
40
41
52
65

1

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Osteoporosis atau pengeroposan tulang adalah penyakit berkurangnya massa
tulang dan adanya perubahan mikroarsitektur (bentuk mikro) jaringan tulang yang
mengakibatkan menurunnya kekuatan tulang dan meningkatnya kerapuhan tulang,
sehingga menyebabkan tulang menjadi mudah patah. Penyebab utama seseorang
mengalami osteoporosis adalah proses resorpsi (penghacuran) tulang oleh osteoklas lebih
cepat dibandingkan proses pembentukan tulang oleh osteoblas, sehingga mengakibatkan
pengeroposan tulang (Raisz, 2005). Osteoporosis banyak ditemukan pada wanita yang
telah mengalami menopause karena pada saat tersebut terjadi penurunan hormon estrogen
yang signifikan. Menurut Sipos et al. (2009), penurunan hormon estrogen dapat
menyebabkan menurunnya Reseptor Osteoprotegerin (OPG) dan menurunnya
penyerapan kalsium di usus yang menyebabkan meningkatnya Hormon Paratiroid (PTH).
Hormon ini menstimulasi pembentukan osteoklas sehingga menyebabkan massa tulang
menurun dan menjadi keropos.
Estrogen merupakan molekul steroid, yang berperan utama dalam mengatur
metabolisme pada tulang wanita maupun pria. Estrogen pada organ tubuh dimediasi
melalui inti dan membran yang berdimerisasi dengan Estrogen Reseptor (ER) untuk
mengatur transkripsi gen estrogen responsif. ER adalah molekul protein yang berada di
dalam sel, yang menjadi target dari hormon estrogen (NCI, 2010). Estrogen pada manusia
bekerja dengan menggunakan 2 tipe reseptor yaitu ER-α dan ER-β (Raisz, 2005). Kedua
ER ini memiliki peran yang serupa pada tulang, tetapi menurut Cui et al. (2013), ER-α
adalah satu-satunya mediator yang dapat meningkatkan massa tulang, karena
penghilangan ER-β tidak berpengaruh terhadap panjang dan massa tulang (Pearce &
Jordan, 2004). Selain itu, Aktivasi ER-α mentransmisikan sinyal untuk memperpanjang
hidup osteoblast pada tikus wanita (Imai et al., 2010). Maka dari itu, penelitian kali ini
digunakan ER-α sebagai reseptor jaringan tulang. Pada tulang, estrogen berkaitan
langsung dengan osteosit dalam menurunkan aktivitas pembentukan tulang, osteoklas
dalam menurunkan perombakan tulang, dan osteoblas dalam memelihara pembentukan
tulang (Khosla et al., 2012), sehingga terapi hormon estrogen menjadi salah satu pilihan
dalam mencegah osteoporosis pada lanjut usia.
Menurut Wells et al. (2002), terapi estrogen selama 2 tahun dapat meningkatkan
massa tulang sekitar 7%, namun konsumsi estrogen secara terus-menerus dapat
mengindikasikan kanker payudara dan rahim (NCI, 2010 dan Nelson et al., 2013). Hal
tersebut terjadi karena estrogen tidak hanya mendukung terhadap jaringan tulang,
melainkan terhadap jaringan payudara dan rahim juga. Dewasa ini telah banyak penemuan
senyawa untuk memblokir aksi negatif dari estrogen yaitu Selective Estrogen Reseptor
Modulator (SERM) seperti tamoxifen dan raloxifene. Bedasarkan penelitian Love et al.
(1992), SERM tersebut memiliki efek positif dalam meningkatkan massa tulang dan
memiliki efek negatif pada payudara. Sedangkan SERM (lasofoxfene dan bazedoxifene)
tidak mengindikasikan kanker payudara dan rahim tetapi meningkatkan risiko trombosis
dan hot flushes (Cummings et al., 2010; Goldstein et al., 2011; Kulak et al., 2011). Oleh
karena itu, diperlukan suatu senyawa yang dapat berinteraksi dengan ER-α untuk
mengatasi penurunan estrogen atau penyebab osteoporosis dengan efek samping yang
tidak berbahaya.

2

Fitoestrogen merupakan hormon tanaman yang memiliki potensi estrogenik dan
diduga tidak memiliki efek samping dari terapi estrogen. Menurut Cornwell et al. (2004),
Fitoestrogen seperti isoflavonoid, stilbene, lignan, dan coumestan banyak ditemukan pada
tumbuhan yang dapat dikonsumsi, serta telah terkait dalam pencegahan kanker,
perlindungan kardiovaskular dan pengaturan sistem imun (Watanabe et al., 2002).
Penelitian in vivo pada manusia oleh Yang et al. (2012), menyatakan ekstrak kacang
kedelai yang tinggi isoflavonoid dapat memberikan efek positif pada tulang dengan
meningkatkan deoxypyridinoline atau kreatinina sebesar 10.53% (p < 0.05) dan 11.58%
(p < 0.05) dengan pemberian ekstrak kacang kedelai pada dosis 35 mg dan 70 mg selama
6 bulan. Penelitian in vivo lain pada tikus, harmaline (senyawa alkaloid heterosiklik)
meningkatkan pembentukan osteoblas dengan mendorong aktivitas fosfatase alkali dan
ekspresi osteocalcin (Yonezawa1 et al., 2011). Selain itu penelitian in vitro, Panax
Notoginseng Saponin (PNS) yang kaya akan ginsenoside (senyawa saponin steroidal)
dapat menstimulasi pembentukan sel stroma sumsum tulang dan meningkatkan
pembentukan tulang dengan meningkatkan ekspresi dari gen pembuat tulang dan
menurunkan ekspresi dari gen pembuat adiposit (Li et al., 2011). Bedasarkan penelitian
tersebut, banyak senyawa fenolik, alkaloid, dan saponin yang memiliki kemiripan struktur
dengan isoflavonoid, harmine, atau ginsenosides yang belum diteliti untuk aktivitas
pencegahan osteoporosis. Hal ini menjadi dasar pemilihan kelompok ligan yang akan
diujikan secara in silico.
In silico dapat didefinisikan sebagai percobaan berbasis komputer, di mana
matematika model dari sistem fisiologis atau farmakologi dikembangkan dan diuji pada
komputer (Colquitt et al., 2011). Metode in silico adalah satu dari banyak teknik yang
berpotensi dalam menigkatkan penemuan dan pengembangan obat baru (Ekins et al.,
2007), semenjak in vitro dan in vivo memerlukan waktu yang lebih panjang dan biaya
yang besar. Teknik ini dapat diterapkan dalam bidang kimia untuk menemukan
komponen yang baru, menguraikan mekanisme interaksi protein (misalnya antara
reseptor dan ligan), dan memprediksi interaksi antara molekul (Cozzini & Luca, 2012).
Penguraian mekanisme interaksi protein dapat menggunakan mekanisme penambatan
(docking). Penambatan bertujuan untuk mengidentifikasi secara tepat pose ligan ketika
terikat pada makromolekul (reseptor) dan memprediksi afinitas antara ligan dan protein
(Krovat et al., 2005). Bila ligan yang diujikan berjumlah banyak atau multiligan, maka
penambatan dilakukan dengan cara penapisan virtual. Penelitian secara in silico dengan
menggunakan penapisan virtual telah juga dilakukan oleh Indrawan (2013), yang
memberikan informasi berbagai senyawa fenolik yang berperan dalam meningkatkan air
susu ibu dengan mengukur energi ikatan (∆G) antara reseptor dan ligan yang diuji.
Semakin rendah ∆G, maka semakin mudah ligan tersebut berinteraksi dengan reseptor
(Yuiana et al., 2013).
Bedasarkan potensi alam yang tinggi di Indonesia, maka Indonesia banyak
memiliki jenis dan ragam dari sumber daya alam khususnya tumbuhan yang lazim
dikonsumsi dengan harapan tumbuhan tersebut berpotensi mengandung ligan yang dapat
mencegah osteoporosis seperti permasalahan di atas. Penapisan virtual secara in silico
digunakan sebagai penyambung antara satu tahap ke tahap berikutnya dengan waktu yang
singkat dan biaya yang rendah untuk menentukan efektifitas senyawa dibandingkan
dengan metode in vitro dan in vivo. Menurut Seifert et al. (2003), metode in silico dapat
menghemat 130 juta dollar Amerika serikat dan 0.8 tahun per obatnya, namun teknik ini
tidaklah dapat menerangkan hasil seperti in vivo karena sistem biologis makhluk hidup
lebih kompleks dibandingkan dengan sistem di dalam simulasi komputer.

3

Perumusan Masalah
Tumbuhan konsumsi yang terdapat di Indonesia umumnya mengandung senyawa
fenolik, alkaloid, dan saponin, yang pada senyawa tersebut sangat banyak terdapat macam
ligan yang mungkin bersifat estrogenik. Selain itu mekanisme interaksi suatu ligan
dengan ER-α belum diketahui, sehingga diperlukan metode untuk memprediksi interaksi
antara ligan dengan reseptor. AutoDock merupakan program penambatan yang dapat
memprediksi interaksi berdasarkan nilai ∆G antara ligan dan reseptor. Selain itu,
penambatan juga dapat dilakukan pada PyRx 0.8 yang dapat melakukan proses
penambatan untuk sejumlah ligan dalam waktu yang relatif lebih singkat. Sebagai
pelengkap, posisi penambatan divisualisasikan dengan Autodock Tools 1.5.6rc3, PyMOL
1.3 dan Ligplot +1.4.4.
Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah 1) untuk mengidentifikasi senyawa dalam
tumbuhan yang mengandung fenolik, alkaloid dan saponin yang dapat berinteraksi
spontan dengan makromolekul ER-α secara in silico, 2) memperoleh data nilai ΔG
interkasi ligan terhadap makromolekul, dan 3) menyusun hipotesis interaksi ligan dengan
makromolekul berdasarkan hasil visualisasi.
Manfaat Penelitian
Manfaat dari penelitian ini adalah diperolehnya simulasi interaksi antara ligan dari
tumbuhan dengan ER-α dalam mencegah osteoporosis dalam waktu yang relatif singkat
dan biaya yang jauh lebih murah. Informasi ini dapat digunakan sebagai hipotesis dan
penghubung ke tahap penelitian secara in vitro dan in vivo dalam hal penemuan senyawa
yang bersifat estrogenik, serta diperoleh juga berbagai rekomendasi pangan yang dapat
digunakan untuk mencegah osteoporosis yang umumnya diderita oleh manula wanita
ataupun pria.
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini didesain untuk mempelajari interaksi ligan tanaman yang
mengandung fenolik, alkaloid, dan saponin dengan ER-α secara in silico. Teknik in silico
difokuskan pada senyawa yang secara empiris dapat meningkatkan massa tulang. Selain
itu fokus penelitian mengarah pada mekanisme interaksi ligan dengan reseptor tanpa
memperhatikan dosis dan efikasi. Simulasi program hanya menghitung ΔG antara ligan
dengan ER-α.

4

2 TINJAUAN PUSTAKA
Mekanisme Terjadinya Osteoporosis
Osteoporosis adalah penyakit berkurangnya massa tulang, sehingga tulang
menjadi tipis, rapuh, keropos, dan mudah patah. Bedasarkan penyebabnya osteoporosis
dibagi menjadi 2, osteoporosis primer disebabkan berhentinya produksi hormon
(khususnya wanita) dengan bertambahnya usia, serta osteoporosis primer sendiri dibagi
menjadi 2 tipe, “pascamenopause” yang terjadi pada wanita dan disebabkan karena
menurunnya hormon estrogen (tipe I) dan “senil” yang terjadi pada wanita ataupun pria,
dan disebabkan karena proses penuaan termasuk disfungsi osteoblas (tipe II) (Sipos et al.,
2009), untuk ilustrasi penurunan massa tulang yang disebabkan osteoporosis primer dapat
dilihat pada Gambar 1 sedangkan osteoporosis sekunder disebabkan oleh berbagai
penyakit tulang (chronic rheumatoid atau artritis), pengobatan steroid dengan jangka
panjang, kelumpuhan otot, ataupun hipertiroid.

Gambar 1 Hubungan massa tulang dengan penuaan
Sumber: (Luisa, 2009)
Penyebab utama terjadinya osteoporosis adalah penurunan hormon estrogen.
Menurut Sipos et al. (2009), penurunan hormon estrogen berkorelasi dengan menurunnya
OPG dan menurunnya penyerapan kalsium di usus. Kekurangan kalsium pada tubuh
menyebabkan meningkatnya PTH yang berhubungan dengan meningkatnya receptor
activator of nuclear factor kappa-B Ligand (RANKL). Peningkatan RANKL dan
menurunnya OPG menstimulasi pembentukan osteoklas, meningkatnya osteoklas
menyebabkan proses resorpsi tulang. Pada keadaan normal, bila kerja osteoklas atau
resorpsi tulang dapat diimbangi oleh kerja osteoblas atau pembentukan tulang, maka tidak
akan terjadi penurunan massa tulang, tetapi bila terjadi stimulasi pembentukan osteoklas,
maka mengakibatkan massa tulang menurun dan menyebabkan keropos atau
osteoporosis. Ilustrasi kerja dari osteoklas dan osteoblas sebagai siklus dapat dilihat pada
Gambar 2.
Selain dari kekurangan kalium tubuh, peningkatan PTH dapat juga disebabkan
oleh menurunnya kadar vitamin D (calcitrol), karena vitamin D tidak hanya berperan
dalam mengatur penyerapan kalsium dan fosfor di usus, tetapi menghambat pembentukan
PTH (Raisz, 2005). Khosla et al. (2012), menyatakan bahwa terdapatnya hormon estrogen
dapat menghambat proses pembentukan ulang tulang oleh osteosit, menurunkan proses

5

perombakan tulang oleh osteoklas dan menstimulasi proses pemeliharaan tulang oleh
osteoblas, sehingga estrogen bersifat positif pada jaringan tulang atau mencegah
osteoporosis. Ilustrasi penurunan estrogen dapat dilihat pada Gambar 3.

Gambar 2. Siklus penghancuran dan pembentukan tulang
Sumber: (Luisa, 2009)

Gambar 3: Penurunan hormon estrogen
Sumber: (Spios et al., 2009)
Senyawa Fenolik dan Saponin dalam Tumbuhan
Terdapat beberapa anggota senyawa fenolik (minimal memiliki 1 gugus fenol)
yang memiliki peran dalam meningkatkan massa tulang atau mencegah osteoporosis.
Menurut Kanno et al. (2004), pencegahan osteoporosis dapat terjadi karena sebagian
anggota fenolik memiliki kemiripan struktur dengan 17β-estradiol (estrogen), kemiripan
struktur dengan 17β-estradiol dipercaya memiliki potensi sebagai estrogenik yang dapat

6

bekerja sebagai efek positif dari estrogen. Senyawa yang memiliki potensi estrogenik
disebut fitoestrogen. Anggota fenolik yang termasuk fitoestrogen antara lain isoflavonoid
seperti puerarin, genistin, daidzein dan, genistein; stilbenes seperti trans-resveratro;
lignan seperti mataresinol; coumestan seperti coumestrol. (Cornwell et al., 2004
Cherdshewasart et al,. 2008; Schilling et al., 2013). Menurut Cassidy (2003), fitoestrogen
memberikan dampak positif seperti mencegah kanker dengan risiko yang tidak
berbahaya. Fitoestrogen paling banyak dapat dijumpai kacang-kacangan seperti kacang
kedelai, kacang merah, dan kacang kapri (Mazur, 1998; Lee et al., 2005). Bedasarkan
penelitian Yang et al. (2012), ekstrak kacang kedelai yang tinggi akan isoflavon dapat
meningkatkan massa tulang, serta fitoestrogen seperti genistein, daidzein, dan coumestrol
dapat mencegah osteoporosis dengan menurunkan aktivitas osteoklas atau penghancuran
tulang dengan cara menghambat pembentukan RANKL, di mana coumestrol memiliki
efektivitas pencegahan paling tinggi diantara fitoestrogen lain (Kanno et al., 2004).
Selain fitoestrogen terdapat senyawa lain yang memiliki aktivitas estrogenik yaitu
saponin. Saponin adalah jenis glikosida yang banyak terdapat ditanaman. Bedasarkan
kerangka aglikon saponin dibagi menjadi 2 kelompok, saponin steroid dan triterpenoid
(Sparg et al.,2004). Tanaman ginseng (panax notoginseng) atau Tienchi/San-chi dalam
bahasa mandarin memiliki kandungan saponin triterpenoid yang tinggi. Menurut Li et al.
(2011), senyawa saponin dalam panax notoginseng seperti notoginsenoside R1,
ginsenoside Rg1, ginsenoside Re, ginsenoside Rb1, dan ginsenoside Rd dapat
meningkatkan massa tulang, serta peneliti lain juga menyatakan hal yang serupa bahwa
saponin dari ekstrak ginseng dapat mencegah osteoporosis dengan mengurangi proses
resorpsi (penghancuran tulang) oleh osteoklas yaitu, dengan cara meningkatkan OPG dan
mengurangi RANKL, sehingga membuat RANKL terikat pada OPG dan mengurangi
terjadinya ikatan antara RANKL dengan receptor activator of nuclear factor kappa-B
(RANK) yang mengaktifkan pembentukan osteoklas (Chen et al., 2012; Schilling et al.,
2013).
Estrogen Reseptor (ER)
Estrogen memiliki peran penting dalam pengembangan dan fungsi fisiologis
normal dari berbagai sistem jaringan tubuh termasuk tulang baik pada wanita ataupun
pria (Khosla et al. 2012). Efek biologis estrogen pada jaringan tertentu seperti tulang
dimediasi melalui interaksi dengan reseptor inti, yang merupakan anggota dari
superfamili ligand activated transciption factors. Menurut Cui et al. (2013), terdapat 2
jenis ER yang berperan pada organ manusia yaitu, ER-α (NR3A1) dan ER-β (NR3A2),
keduanya merupakan hormon steroid yang termasuk dalam anggota reseptor inti
subfamili 3 (Gibson & Philippa, 2012). Estrogen yang dimediasi oleh ER memiliki 2 sifat
yaitu agonis dan antagonis, di mana setiap ER juga memiliki jaringan target yang
berbeda-beda. Menurut Ascenzi et al. (2006); Cui et al. (2013); Hertrampf et al. (2007);
Nelson et al. (2013); Timm & Craig (2004), ER-α adalah ER yang bertanggung jawab
terhadap jaringan tulang dengan memberikan efek positif. Imai et al. (2010), menyatakan
aktivasi ER-α mentransmisikan sinyal untuk memperpanjang hidup osteoblas, sehingga
bila hormon estrogen yang disintesis dalam tubuh atau penambahan dari luar dimediasi
oleh ER-α, maka akan terjadi peningkatan massa tulang atau mencegah osteoporosis.
Visualisasi ER-α dengan kode 1SJ0 dari protein data bank dapat dilihat pada Gambar 4.

7

Gambar 4: Reseptor estrogen-α (1SJ0)
Sumber: (PDB, 2013)
Penambatan Molekuler secara In Silico
Penambatan molekuler atau molecular docking adalah prosedur komputasional
yang digunakan untuk memprediksi ikatan non-kovalen makromolekul seperti ikatan
hidrogen atau interaksi hidrofobik antara sebuah molekul besar (reseptor) dan sebuah
molekul kecil (ligan). Penambatan molekuler bertujuan untuk memahami dan
memprediksi rekognisi molekuler untuk dihasilkanya kecocokan geometris (menemukan
mode ikatan yang paling mungkin) dan kecocokan energi (memprediksi energi ikatan)
(Yanuar, 2012). Teknik komputasi yang digunakan dalam penambatan molekuler adalah
penapisan virtual. Penapisan ini bekerja dengan menapis struktur 3 dimensi semua
kemungkinan yang terjadi antara ligan dengan reseptor secara cepat dan praktis dengan
memperhatikan nilai ΔG dan jenis interaksi yang terjadi. Penapisan virtual dalam
penambatan molekuler disebut dengan teknik in silico, teknik ini dapat menvisualisasi
interaksi yang terjadi antara ligan dengan reseptor dalam penggambaran komputer,
sehingga nantinya simulasi komputer ini dapat menggambarkan sistem secara
keseluruhan. In silico umumnya diterapkan dalam bidang kimia untuk menemukan
komponen yang baru, menguraikan mekanisme dari ikatan protein dan ligan,
memprediksi interaksi antara molekul, dan mempelajari hubungan aktivitas struktur
(Cozzini & Luca, 2012).
Aturan Lipinski (The rule of five)
Rule of Five (ROF) adalah aturan untuk obat oral agar dapat larut dan terserap ke
dalam tubuh. ROF dikemukakan oleh Christoper A. Lipinski dan rekan-rekanya saat
menganalisis sifat fisiko-kimia lebih dari 2000 obat dan kandidat obat dalam uji klinis.
Analisis menyimpulkan bahwa senyawa dalam obat cenderung bersifat membran
permeabel (berdifusi pasif) dan mudah diserap oleh tubuh jika memenuhi kriteria seperti
(a) berat dari bobot molekuler kurang dari 500 gram/mol (b) koefisien partisi antara air
dan 1-oktanol atau Log P kurang dari 5 (c) donor ikatan hidrogen jumlahnya tidak lebih
dari 5 (d) akseptor ikatan hidrogen jumlahnya tidak lebih dari 10 (Lipinski et al., 1997;
Lipinski et al., 2012), sehingga bila ligan yang diuji coba dalam penelitian ini mampu
melewati aturan ini maka, diduga kuat senyawa yang mengandung ligan tersebut dapat
terserap dengan baik pada tubuh, tetapi penelitian Bickton et al. (2012), menyatakan
bahwa tidak semua obat oral yang memiliki aktivitas dan di rekomendasi oleh US Food
and Drug Administration memenuhi syarat ROF.

8

3 METODE
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penapisan virtual secara in silico ini antara
lain makromolekul ER-α yang dapat diunduh di (PDB, 2013) dengan kode 1SJ0
(Lampiran 1), 2 kontrol positif (KP) (17-b estradiol dan dienestrol) dan 89 ligan. Struktur
tiga dimensi KP dan basis data ligan yang dapat diunduh di Pub Chem Project (PubChem,
2013) (Lampiran 2). Sampel ligan terdiri dari 32 senyawa fenolik, 40 senyawa alkaloid,
dan 17 senyawa saponin. Kelompok ligan fenolik dibagi menjadi 12 sub kelas: (1) asam
hidroksi sinamat: asam kafeat, asam klorogenat, dan asam ferulat (2) Lignan: sesamin,
secoisolariciresinol, pinoresinol, syringaresinol, lariciresinol, dan matairesinol (3)
Flavonol: kaempferol, quersetin, dan mirisetin (4) Flavon: apigenin, baicalein, dan
luteolin (5) Flavanon : naringenin, naringin, dan hesperitin (6) Flavanol: katekin dan
galokatekin (7) Anthocyanidin: pelargonidin, cyanidin, dan malvidin (8)
Proanthocyanidins: prodelphinidin dan proanthocyanidin (9) Coumestan : coumestrol
(10) Stilbene : resveratrol (11) Isoflavone : daidzein, genistein, dan glycitein (12)
Monoterpen fenolik: carvacrol dan thymol. Kelompok ligan alkaloid dibagi menjadi 2
sub kelas: (1) Alkaloid non-heterosiklik: jurubine, taxol, capsaicin, colchine, dopamine,
dan ephedrine (2) Alkaloid heterosiklik: emetine dan dehatrine (Isoquinoline); reserpine,
vincristine, dan harmaline (Indole); solanidine dan solanine (Steroidal); echimidine dan
senecionine (Pyrrolizidine); irniine, broussonetine c, dan hygrine (Pyrrole dan
Pyrrolidine); sparteine, 1,3-hydroxylupanine, cytisine, dan norlupinane (Quinolizidine);
cinchonine dan quinine (Quinoline); aconine dan aconitine (Terpenoid); cocaine,
atropine, dan scopolamine (Tropane); elemicin dan boldine (Aporphine); piperine,
nicotine, dan arecoline (Pyridine dan Piperidine); isopilocarpine dan pilocarpine
(Imidazole); castanospermine dan swainsonine (Indolizidine); theobromine dan caffeine
(Purine). Kelompok ligan saponin dibagi menjadi 2 sub kelas: (1) Saponin triterpenoidal:
cucurbitacin_E, saikosaponin_A, asam glycyrrhetinic, dan asam glycyrrhizic (2) Saponin
steroidal: protopanaxadiol, astragaloside_III, sarsasapogenin, ruscogenin, diosgenin,
protopanaxatriol, cimicifugoside, ginsenoside_Rg1, ginsenoside_Rh2, ginsenoside_Rb1,
ginsenoside_Rd, ginsenoside_Re, dan notoginsenoside_R1.
Alat
Alat-alat yang digunakan berupa perangkat keras dan perangkat lunak. Perangkat
keras terdiri atas komputer dengan spesifikasi RAM (Random Access Memory) 8
gigabyte, Quad Core Processor (Intel® CoreTM, Amerika), Graphic Card NVIDIA Ge
Force GTX 660M (Amerika), dan sistem operasi Microsoft Windows 7 Professional 64bit (Microsoft, Amerika). Kelengkapan computer yakni monitor (LG, Korea selatan),
CPU (Central Processing Unit) Asus (Amerika), mouse (Logitech, China) dan keyboard
(Logitech, China). Komputer terhubung dengan koneksi internet dan UPS (Uninterupted
Power Supply), CPU dengan spesifikasi RAM 32 gigabyte, Graphic Card NVIDIA Ge
Force GTX 680 dual eight Core Xeon E5620 processor (Intel® CoreTM, Amerika).
Perangkat lunak terdiri atas Open Babel-2.3.1, Autodock 4.2 berbantu PyRx 0.8
(The Scripps Research Institute, Amerika) untuk mencari nilai ΔG sekaligus member
peringkat dan posisi terbaik, AutoDock Tools 1.5.6rc3 (The Scripps Research Institute,
America), Amber 12 (University of California, San Franciso), PuTTy, PyMOL 1.3

9

(DeLano Scientific LLC, Italia), dan Ligplot + 1.4.4 (©Roman Lawkowski 2009) untuk
mengobservasi interaksi dengan cara visualisasi baik dua atau tiga dimensi interaksi ligan
dengan ER-α.
Tempat dan Waktu Penelitian
Laboratorium Komputasi Biomedik dan Rancangan Obat, Fakultas Farmasi,
Universitas Indonesia, Depok. Penelitian dilakukan dalam 6 bulan mulai bulan Desember
2013 hingga Mei 2014.
Prosedur Penelitian
Penelitian ini dilakukan berdasarkan studi literatur, simulasi, dan penapisan virtual
dengan tahapan-tahapannya menurut Yanuar (2012):
a. Preparasi struktur makromolekul ER-α
Struktur makromolekul diunduh (kode PDB: 1SJ0) (PDB, 2013)
dalam format *.pdb lalu diubah ke dalam format *.pdbqt melalui program
AutoDock 4.2 berbantu PyRx 0.8 (Lampiran 3).
b. Validasi metode penapisan virtual in silico.
Tahap ini dilakukan untuk memastikan paremeter dan ukuran area penambatan pada ERα yang akan dilakukan untuk tahap selanjutnya. Validasi metode penapisan virtual
dilakukan dengan menambatkan ER-α dengan KP yang disebut ligand dan kontrol negatif
(decoy) yang diunduh dari (DUDE, 2013) (Lampiran 4). Pengunduhan dari DUDE akan
menghasilkan dua berkas yang berisi ligand dengan 627 struktur dan decoy dengan
20.818 struktur dengan format *.sdf, untuk memecah struktur yang berada dalam satu
berkas diperlukan akses melalui PuTTY dengan perintah:
Csplit file.sdf
find

new file ‘/ZINC/’ ‘{*}’

-f

-type f -exec mv

‘{}’ ‘{}’.(sdf) \;

Setelah terbentuk sejumlah 627 berkas struktur ligand dan 20.818 berkas struktur decoy
dengan format *.sdf. Selanjutnya, diubah formatnya menjadi format *.pdbqt
menggunakan Open Babel (Lampiran 5). Kemudian seluruh berkas dengan format
*.pdbqt dilakukan penapisan virtual menggunakan program PyRx 0.8 dengan parameter
penambatan diset 10 GA, 250.000 perhitungan, 27.000 generasi 150 populasi dan
koordinat penambatan (grid center) yang berasal dari co-kristal 1SJ0 yaitu, x = 30.8850;
y = -1,0670; dan z = 23,4640. Validasi dilakuan dengan 3 variasi ukuran penambatan
(grid box) seperti x, y, z (40, 40, 40; 50, 50, 50; dan 60, 60, 60). Hasil dari validasi akan
ditabulasikan dan dianalisis menggunakan Enrichment Factor 1% dari peringkat
pangkalan data (EF1) dan Area Under the Curve (AUC). Nilai EF1 dan AUC terbesar akan
digunakan untuk tahap selanjutnya.
Perhitungan EF1 dan AUC dilakukan dengan cara:
EF1=

L a

t r l

t tal L a

/ N1

/ t tal N

(Huang et al., 2006)

Sebagai contoh, protein tertentu dengan 150 ligand (total Ligand) di dalam pangkalan
data 95,000 senyawa (total N), 950 senyawa (N1), jumlah ligand yang terpilih di dalam
N1 (Ligands selected). Hal ini bedasarkan EF1.

10

AUC didapat dari plot kurva Receiver Operator Characteristic (ROC) oleh sensitivitas
(Se) dan spesifisitas (Sp), di mana
Sesubset =

L a

t r l

Spsubset =

t tal L a

yt r l

t tal

y

Kurva ROC diplot dengan sumbu x adalah Sp (% decoy terpilih) terhadap sumbu y
yaitu, Se (% ligand terpilih). AUC adalah nilai dari Se ketika nilai Sp setengah dari
totalnya.
(Triballeau et al., 2005)
c. Preparasi basis data ligan (KP dan sampel).
Sampel yang diuji dan KP didapat dari PubChem (PubChem, 2013) dalam format *.sdf
lalu diubah ke dalam format *.pdb menggunakan Open Babel. Selanjutnya dilakukan
tahap minimisasi untuk fleksibilitas ligan pada tahap penambatan yang melalui 3 langkah
antara lain persiapan ligan, topologi dan koordinat, dan minimisasi ligan.
- Persiapan Ligan
Persiapan ligan dilakukan dengan mengubah berkas 2 dimensi menjadi 3 dimensi,
mengubah format *.pdb ke dalam format *.mol2, dan penambahan atom hidrogen.
Persiapan ligan dilakukan dengan menggunakan program Open Babel, melalui perintah:
babel -i pdb -fi file.pdb -o mol2 –fo file.mol2 -h

- Topologi dan Koordinat
Pembuatan topologi dan koordinat dilakukan dengan cara, berkas ligan dengan format
*.pdb dan *.mol2 diletakan dalam satu folder, selanjutnya struktur dari ligan harus
diberikan muatan AM1-BCC menggunakan piranti lunak Antechamber yang diakses
melalui PuTTY dengan perintah:
Antechamber -i file.mol2 -fi mol2 -o file mol2. -fo mol2 -c bcc -s 2 &.

Berkas keluaran mol2 hasil antechamber harus dibuat berkas dengan format *. Frcmod
(merupakan berkas parameter yang akan dibaca pada tleap) dengan perintah:
Parmchk -i file.mol2 -f mol2 -o file.frcmod.

Berkas yang telah siap dilakukan akan dilakukan permbuatan topologi dan koordinat
dengan piranti lunak tLeap dengan perintah:
Tleap -f leaprc.ff99SB

(ff99SB merupakan force field untuk asam amino)
Program LEAP diawali dengan tampilan ”>”
>
>
>
>
>
>
>
>

source leaprc.gaff
EST = loadmol2 estradiol_ok.mol2
check EST
loadamberparams estradiol.frcmod
check EST
saveoff EST est.lib
saveamberparm EST estradiol.prmtop estradiol.inpcrd
quit

11

- Minimisasi Ligan
Selain Berkas topologi (prmtop) dan koordinat (inpcrd), tahap minimsasi juga diperlukan
berkas min.in (Lampiran 7). Proses minimisasi ini dilakukan dengan piranti lunak sander
yang dapat diakses dengan PuTTY dengan perintah:
Sander -O -i min.in -o file_min.out -p file.prmtop –c file.inpcrd -r
file_min.crd &

Perintah -p ditunjukan untuk input file topologi kompleks ligan-makromolekul dalam
pelarut air, -c ditunjukan untuk input file koordinat ligan, -o ditunjukan untuk output file
yang berisi hasil perhitungan minimisasi ligan, -r ditunjukan untuk output restart file hasil
minimisasi. Berkas hasil dari minimisasi dapat dibentuk menjadi format *.pdb kembali
dengan perintah:
ambpdb –p file.prmtop < file_min.crd > new file_min.pdb

Selanjutnya pada tahap akhir ligan dengan format *.pdb diubah ke dalam format *.pdbqt
dengan menggunakan program AutoDock 4.2 (Lampiran 6). Tahap minimisasi ini penting
dilakukan karena untuk menghitung secara rinci energi yang berada pada ligan tersebut,
sehingga diharapkan tahap minimisasi akan menghasilkan nilai energi ikatan atau energi
Gibs (ΔG) yang akurat dan presisi.
d. Penapisan virtual senyawa fenolik, alkaloid, dan saponin
Penapisan virtual dilakukan dengan program Autodock berbantu PyRx. Ligan akan
ditambatkan pada posisi grid center x = 30.8850; y = -1,0670; dan z = 23,4640 dengan
ukuran grid box terbaik 60 x 60 x 60 dan spacing 0,375Å per unit, serta parameter
penambatan ligan dengan ER-α diset 100 GA, 25.000.000 perhitungan, 27.000 generasi,
dan 150 populasi. Hasil dari penapisan virtual ini akan menghasilkan nilai ΔG dari masingmasing ligan yang diujikan. Perhitungan ligan dari 100 GA yang memiliki ΔG terendah
akan dilanjutkan ke tahap selanjutnya yaitu, visualisasi penambatan.
e. Visualisasi penambatan
Pada tahap ini ligan dengan ΔG paling negatif (posisi penambatan terbaik) diamati jenis
interaksi yang terjadi dan residu asam amino yang paling berperan pada ligan tersebut.
Visualisasi dilakukan dengan menggunakan program AutoDock Tools 1.5.6rc3, PyMOL
(visualisasi tiga dimensi) dan Ligplot + (visualisasi dua dimensi).

12

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Preparasi Struktur Makromolekul
Kriteria makromolekul ER-α 1SJ0 dipilih bedasarkan tervalidasi oleh situs PDB,
DUDE, sebagai reseptor non-mutan, dan memiliki resolusi di bawah 2Å. PDB merupakan
kumpulan arsip tunggal mengenai data struktural makromolekul biologi dari seluruh
dunia yang telah dideterminasi menggunakan teknik kristalografi X-ray, NMR, dan
mikroskop elektron. Sedangkan DUDE adalah situs yang menyediakan kumpulan KP
(ligand) dan kontrol negatif (decoy) yang bermanfaat dalam ponolokukuran pada proses
penapisan virtual (Yanuar, 2012). Reseptor yang bersifat non-mutan atau wild type
diperlukan untuk penambatan molekuler karena, ER mutan tidak akan berikatan dengan
estradiol yang merupakan kontrol positifnya, serta menurut Cross et al. (2009), resolusi
makromolekul di bawah 2 Å akan memberikan hasil penambatan yang lebih presisi dan
akurat. Hal ini menandakan bahwa ER 1SJ0 telah banyak digunakan sebagai ER-α pada
penelitian sebelumnya (berada dalam pangkalan data PDB dan DUDE) dan dapat
menggambarkan hasil sebuah interaksi reseptor dan ligan dengan baik (bersifat nonmutan dan resolusi di bawah 2 Å).
Validasi Metode Penapisan Virtual in silico
Validasi bertujuan memastikan parameter dan ukuran area penambatan ligan pada
ER-α untuk tahap selanjutnya. Validasi dilakukan dengan menggunakan ligand dan decoy
dari DUDE, untuk hasil dari validasi penambatan ligand dan decoy yang telah
ditabulasikan dalam EF1 dan AUC dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Hasil validasi nilai EF1 dan AUC
Grid box
40x40x40
50x50x50
60x60x60
Standar (DUDE)

EF1

AUC

17.54
19.30
19.30
15.4

0.776
0.768
0.770
0.675

Nilai EF1 & AUC mencerminkan kemampuan Penambatan dalam membedakan
ligand asli di dalam banyak senyawa pengecoh atau decoy. Semakin tinggi nilai EF1 dan
AUC maka, semakin baik performa yang dihasilkan penapisan virtual (Huang et al.,
2006). Nilai AUC yang baik adalah yang mendekati 1 (Triballeau et al., 2005). Parameter
yang digunakan dengan 3 ukuran grid box berbeda menghasilkan nilai EF1 dan AUC yang
lebih tinggi dari standar dengan ukuran grid box terbaik adalah 60 x 60 x 60. Hal tersebut
menandakan bahwa parameter yang digunakan dengan grid box 60 x 60 x 60 dapat
membedakan ligand dan decoy dengan baik, lebih akurat dan presisi dibandingkan
menggunakan grid box 50 x 50 x 50 dan 40 x 40 x 40.
Penapisan Virtual dan Visualisasi Penambatan Senyawa Fenolik
Penapisan virtual akan menghasilkan nilai ∆G antara reseptor dengan ligannya.
Hasil dari penapisan virtual menunjukan nilai ∆G dari estradiol dan dienestrol (KP)

13

adalah -9.54 dan -9.03 kkal/mol, sementara nilai ∆G dari kelompok fenolik berkisar
antara -9.3 — -4.8 kkal/mol (Gambar 5). Ligan fenolik yang memiliki nilai ∆G lebih
rendah atau mendekati KP menandakan ligan tersebut dapat berinteraksi spontan dengan
ER-α tanpa memerlukan energi ikatan yang besar, sehingga ligan tersebut diduga
memiliki potensi estrogenik. Pinoresinol dan matairesinol dari sub kelas lignan ialah ligan
yang paling berpotensi dari kelompok fenolik dengan nilai ∆G lebih rendah dari nilai ∆G
dienestrol yaitu, -9.32 dan -9.13 kkal/mol diikuti sub kelas isoflavon (glycitein, daidzein,
dan genistein), flavanon (naringin dan naringenin), dan flavon (baicalein). Informasi sifat
kimia dan sumber pangan dari ligan fenolik yang telah diurutkan bedasarkan rendahnya
nilai ∆G dapat dilihat pada Tabel 2. Menurut Yuiana et al. (2013), semakin rendah nilai
∆G, menandakan semakin mudah suatu ligan dapat berikatan dengan reseptornya dan
semakin tidak memerlukan energi untuk berikatan.

Gambar 5. Boxplot ∆G dengan sub kelas fenolik
Sub kelas isoflavon, coumestrol, stilbene, dan flavonol memiliki nilai ∆G lebih
tinggi dibandingkan KP (-8.74 — -7.79 kkal/mol), namun sebaliknya penelitian Kanno et
al. (2004), melaporkan bahwa isoflavonoid dan coumestrol memiliki efek dalam
menghambat pembentukan osteoklas. Penghambatan terjadi dengan menurunkan
RANKL yang berinteraksi dengan RANK dalam mengaktifkan pembentukan osteoklas.
Selain itu, 30–300 µM kaempferol dari sub kelas flavonol pada calvarial pre-osteoblasts
tikus mendorong pembentukan tulang tergantung dari dosis, bahkan dosis terrendah dari
kaempferol memiliki performa lebih baik dari 10 µM estradiol (Guo et al., 2012).
Kemudian, penelitian in vivo pada manusia menyatakan bahwa konsumsi isoflavonoid
sebesar 35mg/hari selama 6 bulan dapat meningkatkan low-density lipoprotein dan total
kolesterol (penigkatan sebesar 4.50% [p < 0.01] dan 4.67% [p < 0.05]) (Yang et al., 2012).
Selanjutnya konsumsi isoflavonoid di atas 17.3 mg/hari selama 2 tahun dapat
menurunkan angka kematian dari kanker payudara sebesar 38-36% (Zhang et al., 2012).
Serta, konsumsi isoflavonoid sebesar 107 mg/hari selama 6 bulan dapat menurunkan antiapoptosis penyebab kanker dan menurunkan insiden kanker prostat (Hamilton-Reeves et
al., 2008). Hal ini menandakan bahwa fitoestrogen dianggap aman sebagai pengganti
estrogen dalam tubuh manusia.

14

Tabel 2. Sifat kimia dan sumber pangan pada kelompok fenolik
Berat
Molekul
(gr/mol)

X
Log
P3

Ikatan
hidrogen
donor
proton

Ikatan
hidrogen
akesptor
proton

∆G
(kkal/mol)

234817

358.4

2.3

2

6

-9.32

C20H22O6

119205

358.4

3.3

2

6

-9.13

Sesamin

C20H18O6

72307

354.4

2.7

0

6

-8.1

Lariciresinol

C20H24O6

332427

360.4

2.4

3

6

-7.53

Syringaresinol
Secoisolariciresinol
Glycitein
Daidzein
Genistein
Naringin
Naringenin
Hesperitin
Baicalein

C22H26O8
C20H26O6
C16H12O5
C15H10O4
C15H10O5
C27H32O14
C15H12O5
C16H14O6
C15H10O5

332426
65373
5317750
5281708
5280961
442428
932
72281
5281605

418.4
362.4
284.3
254.2
270.2
580.5
272.3
302.3
270.2

2.2
2.5
2.4
2.5
2.7
-0.5
2.4
2.4
1.7

2
4
2
2
3
8
3
3
3

8
6
5
4
5
14
5
6
5

-7.35
-7.33
-8.74
-8.62
-8.41
-8.6
-8.43
-8.13
-8.56

Apigenin

C15H10O5

5280443

270.2

1.7

3

5

-7.97

Luteolin

C15H10O6

5280445

286.2

1.4

4

6

-7.76

Coumestan

Coumestrol

C15H8O5

5281707

268.2

2.8

2

5

-8.38

Proanthocyanidin

Prodelphinidin
Proanthocyanidin

C21H18O9
C31H28O12

14009028
108065

414.4
592.5

1.8
2.7

8
9

9
12

-8.38
-8.13

Sub Kelas

Lignan

Isoflavon
Flavanon

Flavon

Ligan

Rumus
molekul

PubChem
CID

Pinoresinol

C20H22O6

Matairesinol

Sumber
Sesame seed (Sesanum indicum L.), Sunflower seed (Helianthus
annuus L.) & Brassica vegetables (Brassica oleracea L.)
(Milder et al., 2005).
Flaxseed (Linum usitatı´ssimum L.) & Sesame seed (Sesanum
indicum L.) (Milder et al., 2005).
Sesame seed (Sesanum indicum L.) (Liu et al., 2006).
Sesame seed (Sesanum indicum L.), Curly kale (cv. acephala D.
C. Alef.), & Sunflower seed (Helianthus annuus L.) (Milder et
al., 2005).
Rye (Secale cereale) (Smeds et al., 2007).
Flaxseed (Linum usitatı´ssimum L.) (Milder et al., 2005).
Soybeans (Watanabe et al., 2002).
Soybeans (Watanabe et al., 2002).
Soybeans (Watanabe et al., 2002).
Grapefruit & citrus (Ang et al., 2011).
Grapefruit (Ho et al., 2000).
Citrus sinensis L. & Citrus aurantium L (Kelly et al., 2005).
Baikal skullcap (Scutellaria baicalensis G.) (Li & Chen, 2005).
Lembayung/ blackeyed pea (Vigna unguiculata (L.)) & pepaya/
papaya (Carica papaya L.) (Andarwulan et al., 2012).
Kemangi/ basil (Ocimum americanum L.) (Andarwulan et al.,
2012).
Alfalfa sprouts, clover, & Soybeans sprouts (Mulligan et al.,
2012).
Pelargonium sidoides (Theisen & Muller, 2012).
Pine bark, elm tree & grape seeds (Fine, 2000).

15

Tabel 2. Sifat kimia dan sumber pangan pada kelompok fenolik lanjutan
Sub Kelas
Flavanol
Stilbene

Flavonol

Anthocyanidin

Hydroxycinnamic
acids

0
0.4
3.1

Ikatan
hidrogen
donor
proton
6
5
3

Ikatan
hidrogen
akesptor
proton
7
6
3

302.2

1.5

5

7

-8.16

5280863

286.2

1.9

4

6

-8.06

C15H10O8

5281672

318.2

1.2

6

8

-7.79

Cyanidin

C15H11O6+

128861

287.2

̶

5

5

-8.13

Pelargonidin

C15H11O5+

440832

271.2

̶

4

4

-7.86

Malvidin

C17H15O7+

159287

331.3

̶

4

6

-7.78

Chlorogenic
acid

C16H18O9

1794427

354.3

-0.4

6

9

-7.44

Caffeic acid

C9H8O4

689043

180.2

1.2

3

4

-5.32

Ferulic acid

C10H10O4

445858

194.2

1.5

2

4

-4.8

Thymol

C10H14O

6989

150.2

3.3

1

1

-5.93

Carvacrol

C10H14O

10364

150.2

3.1

1

1

-5.86

Berat
Molekul
(gr/mol)

X
Log
P3

65084
9064
445154

306.3
290.3
228.2

C15H10O7

5280343

Kaempferol

C15H10O6

Miricetin

Ligan

Rumus
molekul

PubChem
CID

Gallocatechin
Catechin
Resveratrol

C15H14O7
C15H14O6
C14H12O3

Quersetin

∆G
(kkal/mol)
-8.32
-8.12
-8.17

Monoterpenephenol

Sumber
Black & green tea (El-Shahawi et al., 2012; Kerio et al., 2013).
Black & green tea (El-Shahawi et al., 2012; Kerio et al., 2013).
Melinjo (Gnetum gnemon Linn) (Iliya et al., 2003).
Jambu mete/ cashew (Anacardium occidentale L.) & kelor/
horseradish tree (Moringa pterygosperma G.) (Andarwulan et
al., 2010 & 2012).
Kaempferia galanga L., Katuk/ chekkurmanis (Sauropus
androgynus (L.) Merr.) & kedongdong cina/ balfour aralia
(Polyscias pinnata) (Andarwulan et al., 201