Evaluation Of Leukocyte Profile In Piglet (Sus Scrofa) During The Recruitment Maneuver On Pediatric Acute Lung Injury Model
EVALUASI PROFIL LEUKOSIT ANAK BABI (Sus scrofa)
SELAMA MANUVER REKRUTMEN
PADA MODEL KERUSAKAN PARU AKUT PEDIATRIK
HANIFAH ARIEF MUQADDAM
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Evaluasi Profil
Leukosit Anak Babi (Sus scrofa) Selama Manuver Rekrutmen pada Model
Kerusakan Paru Akut Pediatrik adalah benar karya saya dengan arahan dari
komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan
tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Februari 2015
Hanifah Arief Muqaddam
NIM B04100197
ABSTRACT
HANIFAH ARIEF MUQADDAM. Evaluation of Leukocyte Profile in Piglet (Sus
scrofa) during the Recruitment Maneuver on Pediatric Acute Lung Injury Model.
Supervised by RIKI SISWANDI and GUNANTI.
This study evaluated the recruitment maneuvers effectiveness in piglet as
model for pediatric acute lung injury (PALI). Leukocyte differentiations were
observed as parameter. Six piglets in 5-8 kg weight range were divided in two
groups. Three piglets as the first group without chest bandaging (A) and three
piglets as the second group with chest bandaging (B). Chest bandaging in B
group used as model for undeveloped diaphragm in infants. Recruitment
maneuver was performed after induced acute lung injury by lavaging warm saline
into lung parenchymal. Samples were taken at screening stage and
postrecruitment maneuver within 95% confidence level. The results showed nonsignificant increase of the percentage of neutrophils and non-significant
decreases of the total leukocytes, percentage of eosinophils, lymphocytes, and
monocytes in both treatment groups. The increase and decrease level was bigger
in the chest bandaging group.
Keywords: acute lung injury, leukocyte differentiations, lung recruitment
maneuver, piglet (Sus scrofa)
ABSTRAK
HANIFAH ARIEF MUQADDAM. Evaluasi Profil Leukosit Anak Babi (Sus
scrofa) Selama Rekrutmen Manuver pada Model Kerusakan Paru Akut Pediatrik.
Dibimbing oleh RIKI SISWANDI dan GUNANTI.
Penelitian ini dilakukan untuk menguji efektivitas manuver rekrutmen
dalam tata laksana cedera paru akut (CPA) pediatrik pada model hewan anak babi
(Sus scrofa). Parameter yang diamati dalam penelitian ini adalah diferensiasi
leukosit. Enam ekor anak babi dengan berat badan 5-8 kg dibagi dalam dua
kelompok. Tiga ekor babi sebagai kelompok pertama tanpa pembebatan (A) dan
tiga ekor babi sebagai kelompok kedua diberi pembebatan rongga dada (B).
Pembebatan dinding dada dilakukan sebagai model diafragma yang belum
berkembang sempurna pada bayi. Manuver rekrutmen dilakukan setelah paru-paru
kolaps akibat pembilasan oleh larutan NaCl fisiologis hangat pada parenkim paru
dengan metode kumbah paru (lung lavage). Sampel diambil pada tahap penapisan
sebelum induksi CPA dan pascarekrutmen manuver paru. Hasil penelitian pada
taraf kepercayaan 95% menunjukkan adanya tren penurunan nilai leukosit dan
peningkatan nilai neutrofil. Kedua kelompok tidak memberikan perbedaan yang
signifikan saat penapisan dan pascarekrutmen, namun selisih peningkatan dan
penurunan yang terjadi lebih besar ditunjukkan pada perlakuan dengan
pembebatan.
Kata kunci : anak babi (Sus scrofa), cedera paru akut, diferensiasi leukosit,
manuver rekrutmen paru
EVALUASI PROFIL LEUKOSIT ANAK BABI (Sus scrofa)
SELAMA MANUVER REKRUTMEN
PADA MODEL KERUSAKAN PARU AKUT PEDIATRIK
HANIFAH ARIEF MUQADDAM
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Kedokteran Hewan
pada
Departemen Klinik, Reproduksi, dan Patologi
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian
yang berjudul “Evaluasi Profil Leukosit Anak Babi (Sus scrofa) Selama Manuver
Rekrutmen pada Model Kerusakan Paru Akut Pediatrik” dilaksanakan pada bulan
Januari hingga Februari 2013. Penelitian ini merupakan bagian dari penelitian
payung disertasi dengan judul “Tekanan Transpulmoner Sebagai Indikator Stres
Paru Akut pada Gangguan Mekanis Dinding Dada Model Hewan Pediatric Acute
Lung Injury : Kajian tentang kerusakan paru yang diinduksi ventilasi mekanik”
pada tahun 2014 dengan peneliti utama Dr dr Ririe Fachrina Malisie, SpA (K).
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ayahanda Badrun Sudang dan Ibunda
Enok Rahmatillah, kakak tersayang Almahira Az Zahra, juga adik tercinta Nabaul
Ahkam Al Faruqi dan Almira Dina Azzahra yang telah memberikan semangatnya
selama ini kepada penulis. Terima kasih kepada Drh Riki Siswandi, MSi dan Dr
Drh Gunanti, MS sebagai dosen pembimbing yang telah bersedia meluangkan
waktu dan dengan sabar hingga akhir penelitian dan penulisan skripsi ini. Terima
kasih kepada Dr dr Ririe Fachrina Malisie, SpA (K) yang telah memberikan
kesempatan yang begitu berharga untuk dapat bergabung dalam penelitian payung
disertasi ini. Terima kasih kepada teman-teman satu tim penelitian dan staf divisi
Bedah dan Radiologi FKH-IPB yang telah banyak membantu dalam penelitian ini.
Terima kasih diucapkan kepada Dhenok, Nunu, Tita, rekan-rekan Wisma All Blue
sebagai bagian terdekat dalam perjuangan menyelesaikan tugas akhir ini. Terima
kasih kepada keluarga Farmasi Unsoed 2008 atas persahabatannya selama ini,
juga kepada keluarga ACROMION 47 yang telah menjadi bagian dari perjuangan
selama di FKH IPB.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Februari 2015
Hanifah Arief Muqaddam
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
TINJAUAN PUSTAKA
Cedera Paru Akut
Ventilator Mekanik
Darah
Babi (Sus scrofa)
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Alat dan Bahan
Model Hewan
Tahap Perlakuan
Pengambilan Data
Analisis Data
HASIL DAN PEMBAHASAN
Nilai Total Leukosit
Nilai Eosinofil
Nilai Neutrofil
Nilai Limfosit
Nilai Monosit
Pembahasan
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA
RIWAYAT HIDUP
x
x
1
1
2
2
2
2
2
3
3
3
3
4
4
4
5
6
6
6
6
7
7
8
8
10
10
11
11
13
DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5
Rata-rata nilai total leukosit (x103/µL)
Rata-rata nilai Eosinofil (x103/µL)
Rata-rata nilai Neutrofil (x103/µL)
Rata-rata nilai Limfosit (x103/µL)
Rata-rata nilai Monosit (x103/µL)
6
7
7
8
8
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
Haematology Particle Counter
Model hewan anak babi (Sus scrofa) yang diberi perlakuan
Alur penelitian
4
4
5
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Cedera paru akut (CPA) merupakan gejala inflamasi paru akut dengan
manifestasi peningkatan permeabilitas barier kapiler-alveoli, edema paru, alveoli
kolaps dan terisi cairan sehingga menyebabkan kegagalan pernapasan akut.
Penyakit ini dikategorikan sebagai penyakit paru-paru yang bersifat akut noncardiac dengan rasio perbandingan antara tekanan oksigen parsial (PaO2) dan
fraksi inspirasi oksigen (FiO2) ≤300 mmHg (Grommers dan Soehnlein 2011).
Etiologi intrapulmoner berupa cedera langsung pada paru (seperti aspirasi dan
pneumonia) dan tidak langsung dari ekstrapulmoner (Wheeler dan Bernard 2007).
Kasus CPA di dunia diperkirakan terjadi pada 86.2 orang per 100 000 orang
dalam setahun di seluruh dunia dari segala usia. Meskipun inovasi yang intensif
telah dilakukan dalam dunia kedokteran, kematian akibat CPA masih mencapai
40%. Pneumonia atau sepsis dapat dipastikan sebagai penyebab terjadinya cedera,
namun dapat pula disebabkan oleh penyebab non-infeksius seperti aspirasi asam,
hiperoxia, tekanan ventilasi yang tinggi, kontusio paru, reperfusi atau bleomycin
(Matute et al. 2008).
Angka kejadian CPA pediatrik berkisar antara 2.2-12 per 100 000 orang per
tahun dengan tingkat kematian 18-60%. Rata-rata angka kematian CPA pediatrik
ini lebih tinggi dibandingkan dengan populasi dewasa, karena 45.8% penderita
meninggal disebabkan karena gagal multiorgan dan bukan karena gagal
pernapasan (Randolph 2009).
Cedera paru akut menyebabkan peningkatan permeabilitas dinding alveolus
yang menyertai masuknya neutrofil ke dalam bronkoalveolus. Kehadiran neutrofil
merupakan kunci dari derajat keparahan cedera sehingga dapat dikatakan CPA
merekrut neutrofil menuju ke paru-paru (Manicone 2009). Salah satu cara untuk
menanggulangi kejadian CPA adalah dengan menggunakan ventilasi mekanik.
Ventilasi mekanik merupakan instrumen kedokteran yang merupakan komponen
esensial dalam upaya pemenuhan pasokan oksigen ke berbagai organ dan
merupakan satu-satunya tata laksana yang sudah terbukti bermakna menurunkan
mortalitas CPA (Villar et al. 2011). Perlu diketahui bahwa penggunaan ventilator
yang tidak tepat dapat menyebabkan cedera paru dan respon inflamasi akibat
peningkatan aktivitas sitokin. Kondisi ini serupa dengan patogenensis CPA
sehingga dinamakan cedera paru yang diinduksi oleh ventilator (Villar et al.
2011).
Kasus CPA yang menghadirkan leukosit akibat reaksi inflamasi terjadi
karena aktivitas sitokin. Salah satu pemantauan yang diperlukan dalam proses
manuver rekrutmen paru oleh ventilator mekanik pada kejadian CPA adalah
gambaran diferensiasi leukosit. Melalui proses pemantauan ini diharapkan dapat
memberikan kondisi dinamika leukosit yang berkaitan dengan kejadian CPA dan
menjadi tatalaksana pengukuran efektivitas manuver rekrutmen. Penelitian ini
menggunakan model anak babi (Sus scrofa) karena spesies ini ideal digunakan
dalam berbagai penelitian biomedik, termasuk bidang respirasi mekanik. Hewan
ini memiliki karakteristik anatomi dan fisiologi yang mirip dengan manusia. Salah
satu kelompok dalam penelitian diberikan perlakuan pembebatan yang berfungsi
sebagai model kelainan diafragma pada bayi atau diafragma yang belum
2
berkembang sempurna, karena selama ini manuver rekrutmen hanya
memperhatikan komplians paru tetapi tidak mempertimbangkan elastans dinding
dada (Kornecki dan Kavanagh 2009).
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi gambaran diferensiasi leukosit
pada anak babi (Sus scrofa) yang mengalami CPA pediatrik selama manuver
rekrutmen dengan dan tanpa pembebatan dinding dada.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan manfaat bagi tatalaksana CPA
pediatrik dengan mengetahui efektivitas manuver rekrutmen pada anak babi (Sus
scrofa) yang mengalami gangguan mekanika respirasi oleh pembebatan dinding
dada.
TINJAUAN PUSTAKA
Cedera Paru Akut
Cedera paru akut (CPA) merupakan gejala hipoksemia akut yang secara
klinis terlihat dengan adanya peningkatan permeabilitas pada alveolus yang
menyebabkan edema paru. American-European Consensus Conference (AECC)
menjelaskan bahwa kriteria CPA yang sering digunakan baik pada orang dewasa
maupun anak-anak berdasarkan 4 parameter klinis, yaitu: (1) onset akut, (2)
arterial hypoxia, (3) ratio PaO2/ FiO2 ≤300 mmHg, dan (4) tidak disertai dengan
hipertensi pulmoner (Randolph 2009).
Pemicu yang paling umum adalah infeksi di traktus respiratorius bagian
bawah. Meskipun frekuensi kejadian pada anak-anak (2.2-12 dari 100 000 orang
per tahun) lebih sedikit daripada usia dewasa (306 per 100 000 orang per tahun),
tingkat kematian akibat CPA tergolong tinggi pada anak-anak (Erickson et al.
2007).
Ventilator Mekanik
Ventilator mekanik adalah alat pernapasan bertekanan negatif atau positif
yang dapat mempertahankan ventilasi dan memberikan oksigen dalam waktu yang
lama. Ventilator mekanik diklasifikasikan berdasarkan cara alat tersebut
mendukung ventilasi. Dua kategori umum adalah ventilator tekanan negatif dan
tekanan positif (Kornecki dan Kavanagh 2009).
Prinsip penggunaan ventilator tekanan negatif adalah memasukan udara ke
dalam paru dengan cara membuat tekanan sekeliling dada negatif. Pengurangan
tekanan intratoraks selama inspirasi memungkinkan udara mengalir ke dalam
paru-paru sehingga memenuhi volumenya. Ventilator jenis ini digunakan terutama
pada gagal napas kronik yang berhubungan dengan kondisi neurovaskular seperti
poliomyelitis, distrofi otot, dan miastenia gravis. Penggunaan ventilator tidak
3
sesuai untuk pasien yang tidak stabil atau pasien yang kondisinya membutuhkan
perubahan ventilasi yang sering (Smeltzer dan Bare 1996).
Ventilator tekanan positif menggembungkan paru-paru dengan
mengeluarkan tekanan positif pada jalan napas sehingga dapat mendorong alveoli
untuk mengembang selama inspirasi. Ventilator jenis ini memerlukan intubasi
endotrakeal. Ventilator ini secara luas digunakan pada klien dengan penyakit paru
primer. Terdapat tiga jenis ventilator tekanan positif, yaitu tekanan bersiklus,
waktu bersiklus dan volume bersiklus (Vitali dan Arnold 2009).
Darah
Darah ditunjang oleh keberadaan plasma yang bertindak sebagai suplemen
dalam bentuk protein sebagai makanan. Sel-sel darah terdiri atas: (1) eritrosit, (2)
leukosit, dan (3) trombosit yang dikenal sebagai benda-benda darah. Darah
berfungsi sebagai pembawa nutrien yang telah disiapkan oleh saluran pencernaan
menuju jaringan tubuh, penyalur oksigen dari paru-paru ke jaringan dan CO2 dari
jaringan ke paru-paru, pembawa sisa metabolisme tubuh untuk dieksresikan
melalui urin (ginjal), pembawa hormon ke organ lain dalam tubuh, penyeimbang
asam-basa (buffer tubuh), serta penyeimbang kandungan air tubuh dan sebagai
pembekuan darah sehingga mencegah terjadinya kehilangan darah yang berlebih
pada saat luka (Ganong 2003).
Babi (Sus scrofa)
Penggunaan babi telah banyak dilakukan sebagai model hewan dalam
penelitian bedah eksperimemtal. Penelitian dalam bidang mekanika respirasi
memperlihatkan kemiripan babi dari hemodinamik dan anatomik paru dengan
manusia. Paru-paru babi terdiri atas beberapa lobus yang juga mirip dengan
manusia. Sebagai pembeda adalah adanya lobus accessorius pada paru kanan
yang melintasi vena besar (vena cava caudalis). Pertimbangan kemiripan tersebut
menjadi dasar penentuan penggunaan babi sebagai model hewan pada kasus CPA
(Bastarache dan Blackwell 2009).
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari-Februari 2013. Pemeliharaan
babi dilakukan di kandang Unit Pengelolaan Hewan Laboratorium Fakultas
Kedokteran Hewan (UPHL-FKH), Institut Pertanian Bogor (IPB). Perlakuan
induksi CPA, manuver rekrutmen, dan pengambilan data darah dilakukan di
Laboratorium Bedah Eksperimental, Divisi Bedah dan Radiologi, Departemen
Klinik, Reproduksi, dan Patologi (KRP), FKH IPB. Pemeriksaan darah dilakukan
di Laboratorium Apotik Yasa, Jalan Dr. Semeru 84, Bogor.
4
Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan selama penelitian adalah Oxfendazole,
suplemen zat besi, pakan, air minum, Atropin Sulfat (Aludonna®, PT Armoxindo
Farma), Ketamin (Ilium Ketamil®, Troy Laboratories), Xylazine (Xylazil®, Troy
Laboratories), Vecuronium Bromida (Ecron®, PT Pharoz), kateter intravena, dan
three way stop cock. Anestesi rumatan menggunakan satu set syringe pump (B
BRAUN Medical Inc.) berisi Propofol (Lipuro®, B BRAUN Medical Inc),
Midazolam (Hipnoz®, PT Pharoz), dan Fentanyl (Fentanyl® Injection, Johnson &
Johnson). Induksi CPA menggunakan larutan Saline (NaCl 0.9%, PT Widatra
Bhakti) hangat, manset dari kain dengan lebar 50 cm untuk pembebatan dinding
dada yang terhubung dengan spigmomanometer.
Intubasi dilakukan dengan pipa endotrakeal (Endotracheal tube/ ETT),
laringoskop lurus, dan ventilator AVEA® bicore (Carefusion, Yorba LindaAmerika). Pemeriksaan diferensiasi leukosit menggunakan instrumen hematologi
particle counter (ERMA Inc., Jepang).
Gambar 1 Haematology Particle Counter
Model Hewan
Model hewan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 6 ekor babi (Sus
scrofa) yang berumur 1-3 bulan dengan berat badan 5-8 kg. Model hewan dibagi
ke dalam dua kelompok perlakuan yang masing-masing terdiri dari 3 ekor babi.
Kelompok pertama tidak dilakukan pembebatan pada dinding dada (A) dan
kelompok kedua dilakukan pembebatan pada dinding dada (B) (Gambar 2).
(A)
(B)
Gambar 2 Model hewan anak babi (Sus scrofa) yang diberi perlakuan tanpa
pembebatan (A) dan dengan pembebatan (B) dinding dada
Tahap Perlakuan
Perlakuan atas model hewan ini telah mendapatkan persetujuan etik dari
Komite Etik IPB dengan nomor 03-2013 IPB. Sebelumnya dilakukan terlebih
dahulu proses aklimatisasi selama 2 minggu. Babi ditempatkan dalam kandang
berukuran 4 x 3 m. Kandang dibersihkan setiap hari dan diberi disinfektan sebagai
5
upaya sanitasi. Selama adaptasi babi diberikan Oxfendazole sebagai antihelmintik
secara peroral dan suplemen zat besi. Babi diberikan pakan pada pagi dan sore
hari. Air minum diberikan secara ad libitum.
Kelompok babi yang akan digunakan harus melalui tahap penapisan prapenelitian berupa pemeriksaan kondisi klinis (tidak mengalami infeksi, gangguan
napas atau organ lainnya), parameter respirasi, dan parameter hemodinamik.
Kedua kelompok hewan diberikan perlakuan dasar yang sama yaitu anestesi,
induksi CPA, pemasangan ventilasi mekanik, dan manuver rekrutmen. Induksi
anestesi diberikan dengan kombinasi Ilium Ketamil® dan Xylazil® secara
intramuscular (IM) pada m. semimembranosus/ semitendinosus. Selanjutnya
diberikan premedikasi dengan Aludonna® secara intravena (IV). Rumatan anestesi
dilakukan dengan metode neuroleptanalgesia dengan kombinasi injeksi Lipuro®,
Hipnoz®, dan Fentanyl® melalui akses vena perifer setelah hewan terinduksi.
Hewan diberikan Injeksi Ecron® secara IV secaraperiodik setiap 30 menit.
Induksi CPA dilakukan dengan terlebih dahulu melakukan proses intubasi,
yaitu pemasangan pipa endotrakeal (Endotracheal tube/ ETT) ke jalan napas
(trakea) melalui mulut. Kumbah bronkus dilakukan pada parenkim paru
menggunakan Saline 0.9% hangat. Setelah anak babi terinduksi CPA, pipa
endotrakeal dihubungkan dengan ventilator AVEA® bicore, dengan modus
pengaturan pressure control. Paru yang kolaps kemudian dikembangkan kembali
secara manuver rekrutmen dengan strategi proteksi paru menggunakan metode
inkremental dan dekremental positive end expiratory pressure (PEEP).
Pembebatan dinding dada menggunakan manset yang tersambung dengan
spigmomanometer hanya dilakukan pada kelompok B.
Pengambilan Data
Pengambilan data dilakukan pada tahap penapisan sebelum induksi CPA
dan pascarekrutmen manuver paru (Gambar 3). Darah diambil dari arteri
femoralis sebanyak 3 ml menggunakan syringe dan dimasukkan ke dalam EDTA
vacuum tube dan dihomogenisasi. Setelah itu darah diperiksa menggunakan
instrumen hematologi particle counter dengan pemeriksaan darah lengkap.
Pembebatan dinding dada
(hanya pada kelompok B)
Anestesi
Intubasi
Kumbah
Bronkus
Ventilasi
Mekanik
Euthanasia
Manuver
Rekrutment
1 jam
1 jam
2 jam
Sampel darah
(Penapisan)
1 jam
Sampel Darah
(Pascarekrutmen)
Gambar 3 Alur penelitian
6
Analisis Data
Data yang diperoleh dinyatakan dalam rataan dan simpangan baku. Data
diolah menggunakan perangkat lunak Microsoft Excel 2013 dan SPSS 21. Data
variabel dianalisis secara statistik menggunakan One-way Analyze of Variant
(ANOVA) kemudian dilanjutkan dengan uji Duncan pada selang kepercayaan
95%.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Nilai Total Leukosit
Leukosit merupakan sel pembentuk komponen darah yang memiliki inti dan
memiliki kemampuan gerak mandiri. Sel ini membantu tubuh melawan berbagai
penyakit infeksi sebagai bagian dari sistem kekebalan tubuh. Nilai normal total
leukosit pada babi adalah 7-20 x103/µL (Harapin et al. 2003). Nilai yang
diperoleh memperlihatkan adanya penurunan jumlah total leukosit
pascarekrutmen yang tidak signifikan pada kedua kelompok babi, tetapi
penurunan nilai total leukosit yang lebih besar ditunjukkan pada kelompok B
(Tabel 1).
Tabel 1 Rata-rata nilai total leukosit (x103/µL) selama penapisan dan
pascarekrutmen pada anak babi (Sus scrofa) tanpa dan dengan
pembebatan
Perlakuan
Tanpa pembebatan (A)
Dengan Pembebatan (B)
Keterangan:
Penapisan
a,x
11.40±2.95
17.80±5.30a,x
Pascarekrutmen
9.87±2.16a,x
14.37±3.31a,x
Huruf superscript (x,y) yang berbeda pada kolom yang sama menyatakan adanya
perbedaan yang signifikan (p
SELAMA MANUVER REKRUTMEN
PADA MODEL KERUSAKAN PARU AKUT PEDIATRIK
HANIFAH ARIEF MUQADDAM
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Evaluasi Profil
Leukosit Anak Babi (Sus scrofa) Selama Manuver Rekrutmen pada Model
Kerusakan Paru Akut Pediatrik adalah benar karya saya dengan arahan dari
komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan
tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Februari 2015
Hanifah Arief Muqaddam
NIM B04100197
ABSTRACT
HANIFAH ARIEF MUQADDAM. Evaluation of Leukocyte Profile in Piglet (Sus
scrofa) during the Recruitment Maneuver on Pediatric Acute Lung Injury Model.
Supervised by RIKI SISWANDI and GUNANTI.
This study evaluated the recruitment maneuvers effectiveness in piglet as
model for pediatric acute lung injury (PALI). Leukocyte differentiations were
observed as parameter. Six piglets in 5-8 kg weight range were divided in two
groups. Three piglets as the first group without chest bandaging (A) and three
piglets as the second group with chest bandaging (B). Chest bandaging in B
group used as model for undeveloped diaphragm in infants. Recruitment
maneuver was performed after induced acute lung injury by lavaging warm saline
into lung parenchymal. Samples were taken at screening stage and
postrecruitment maneuver within 95% confidence level. The results showed nonsignificant increase of the percentage of neutrophils and non-significant
decreases of the total leukocytes, percentage of eosinophils, lymphocytes, and
monocytes in both treatment groups. The increase and decrease level was bigger
in the chest bandaging group.
Keywords: acute lung injury, leukocyte differentiations, lung recruitment
maneuver, piglet (Sus scrofa)
ABSTRAK
HANIFAH ARIEF MUQADDAM. Evaluasi Profil Leukosit Anak Babi (Sus
scrofa) Selama Rekrutmen Manuver pada Model Kerusakan Paru Akut Pediatrik.
Dibimbing oleh RIKI SISWANDI dan GUNANTI.
Penelitian ini dilakukan untuk menguji efektivitas manuver rekrutmen
dalam tata laksana cedera paru akut (CPA) pediatrik pada model hewan anak babi
(Sus scrofa). Parameter yang diamati dalam penelitian ini adalah diferensiasi
leukosit. Enam ekor anak babi dengan berat badan 5-8 kg dibagi dalam dua
kelompok. Tiga ekor babi sebagai kelompok pertama tanpa pembebatan (A) dan
tiga ekor babi sebagai kelompok kedua diberi pembebatan rongga dada (B).
Pembebatan dinding dada dilakukan sebagai model diafragma yang belum
berkembang sempurna pada bayi. Manuver rekrutmen dilakukan setelah paru-paru
kolaps akibat pembilasan oleh larutan NaCl fisiologis hangat pada parenkim paru
dengan metode kumbah paru (lung lavage). Sampel diambil pada tahap penapisan
sebelum induksi CPA dan pascarekrutmen manuver paru. Hasil penelitian pada
taraf kepercayaan 95% menunjukkan adanya tren penurunan nilai leukosit dan
peningkatan nilai neutrofil. Kedua kelompok tidak memberikan perbedaan yang
signifikan saat penapisan dan pascarekrutmen, namun selisih peningkatan dan
penurunan yang terjadi lebih besar ditunjukkan pada perlakuan dengan
pembebatan.
Kata kunci : anak babi (Sus scrofa), cedera paru akut, diferensiasi leukosit,
manuver rekrutmen paru
EVALUASI PROFIL LEUKOSIT ANAK BABI (Sus scrofa)
SELAMA MANUVER REKRUTMEN
PADA MODEL KERUSAKAN PARU AKUT PEDIATRIK
HANIFAH ARIEF MUQADDAM
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Kedokteran Hewan
pada
Departemen Klinik, Reproduksi, dan Patologi
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian
yang berjudul “Evaluasi Profil Leukosit Anak Babi (Sus scrofa) Selama Manuver
Rekrutmen pada Model Kerusakan Paru Akut Pediatrik” dilaksanakan pada bulan
Januari hingga Februari 2013. Penelitian ini merupakan bagian dari penelitian
payung disertasi dengan judul “Tekanan Transpulmoner Sebagai Indikator Stres
Paru Akut pada Gangguan Mekanis Dinding Dada Model Hewan Pediatric Acute
Lung Injury : Kajian tentang kerusakan paru yang diinduksi ventilasi mekanik”
pada tahun 2014 dengan peneliti utama Dr dr Ririe Fachrina Malisie, SpA (K).
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ayahanda Badrun Sudang dan Ibunda
Enok Rahmatillah, kakak tersayang Almahira Az Zahra, juga adik tercinta Nabaul
Ahkam Al Faruqi dan Almira Dina Azzahra yang telah memberikan semangatnya
selama ini kepada penulis. Terima kasih kepada Drh Riki Siswandi, MSi dan Dr
Drh Gunanti, MS sebagai dosen pembimbing yang telah bersedia meluangkan
waktu dan dengan sabar hingga akhir penelitian dan penulisan skripsi ini. Terima
kasih kepada Dr dr Ririe Fachrina Malisie, SpA (K) yang telah memberikan
kesempatan yang begitu berharga untuk dapat bergabung dalam penelitian payung
disertasi ini. Terima kasih kepada teman-teman satu tim penelitian dan staf divisi
Bedah dan Radiologi FKH-IPB yang telah banyak membantu dalam penelitian ini.
Terima kasih diucapkan kepada Dhenok, Nunu, Tita, rekan-rekan Wisma All Blue
sebagai bagian terdekat dalam perjuangan menyelesaikan tugas akhir ini. Terima
kasih kepada keluarga Farmasi Unsoed 2008 atas persahabatannya selama ini,
juga kepada keluarga ACROMION 47 yang telah menjadi bagian dari perjuangan
selama di FKH IPB.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Februari 2015
Hanifah Arief Muqaddam
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
TINJAUAN PUSTAKA
Cedera Paru Akut
Ventilator Mekanik
Darah
Babi (Sus scrofa)
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Alat dan Bahan
Model Hewan
Tahap Perlakuan
Pengambilan Data
Analisis Data
HASIL DAN PEMBAHASAN
Nilai Total Leukosit
Nilai Eosinofil
Nilai Neutrofil
Nilai Limfosit
Nilai Monosit
Pembahasan
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA
RIWAYAT HIDUP
x
x
1
1
2
2
2
2
2
3
3
3
3
4
4
4
5
6
6
6
6
7
7
8
8
10
10
11
11
13
DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5
Rata-rata nilai total leukosit (x103/µL)
Rata-rata nilai Eosinofil (x103/µL)
Rata-rata nilai Neutrofil (x103/µL)
Rata-rata nilai Limfosit (x103/µL)
Rata-rata nilai Monosit (x103/µL)
6
7
7
8
8
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
Haematology Particle Counter
Model hewan anak babi (Sus scrofa) yang diberi perlakuan
Alur penelitian
4
4
5
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Cedera paru akut (CPA) merupakan gejala inflamasi paru akut dengan
manifestasi peningkatan permeabilitas barier kapiler-alveoli, edema paru, alveoli
kolaps dan terisi cairan sehingga menyebabkan kegagalan pernapasan akut.
Penyakit ini dikategorikan sebagai penyakit paru-paru yang bersifat akut noncardiac dengan rasio perbandingan antara tekanan oksigen parsial (PaO2) dan
fraksi inspirasi oksigen (FiO2) ≤300 mmHg (Grommers dan Soehnlein 2011).
Etiologi intrapulmoner berupa cedera langsung pada paru (seperti aspirasi dan
pneumonia) dan tidak langsung dari ekstrapulmoner (Wheeler dan Bernard 2007).
Kasus CPA di dunia diperkirakan terjadi pada 86.2 orang per 100 000 orang
dalam setahun di seluruh dunia dari segala usia. Meskipun inovasi yang intensif
telah dilakukan dalam dunia kedokteran, kematian akibat CPA masih mencapai
40%. Pneumonia atau sepsis dapat dipastikan sebagai penyebab terjadinya cedera,
namun dapat pula disebabkan oleh penyebab non-infeksius seperti aspirasi asam,
hiperoxia, tekanan ventilasi yang tinggi, kontusio paru, reperfusi atau bleomycin
(Matute et al. 2008).
Angka kejadian CPA pediatrik berkisar antara 2.2-12 per 100 000 orang per
tahun dengan tingkat kematian 18-60%. Rata-rata angka kematian CPA pediatrik
ini lebih tinggi dibandingkan dengan populasi dewasa, karena 45.8% penderita
meninggal disebabkan karena gagal multiorgan dan bukan karena gagal
pernapasan (Randolph 2009).
Cedera paru akut menyebabkan peningkatan permeabilitas dinding alveolus
yang menyertai masuknya neutrofil ke dalam bronkoalveolus. Kehadiran neutrofil
merupakan kunci dari derajat keparahan cedera sehingga dapat dikatakan CPA
merekrut neutrofil menuju ke paru-paru (Manicone 2009). Salah satu cara untuk
menanggulangi kejadian CPA adalah dengan menggunakan ventilasi mekanik.
Ventilasi mekanik merupakan instrumen kedokteran yang merupakan komponen
esensial dalam upaya pemenuhan pasokan oksigen ke berbagai organ dan
merupakan satu-satunya tata laksana yang sudah terbukti bermakna menurunkan
mortalitas CPA (Villar et al. 2011). Perlu diketahui bahwa penggunaan ventilator
yang tidak tepat dapat menyebabkan cedera paru dan respon inflamasi akibat
peningkatan aktivitas sitokin. Kondisi ini serupa dengan patogenensis CPA
sehingga dinamakan cedera paru yang diinduksi oleh ventilator (Villar et al.
2011).
Kasus CPA yang menghadirkan leukosit akibat reaksi inflamasi terjadi
karena aktivitas sitokin. Salah satu pemantauan yang diperlukan dalam proses
manuver rekrutmen paru oleh ventilator mekanik pada kejadian CPA adalah
gambaran diferensiasi leukosit. Melalui proses pemantauan ini diharapkan dapat
memberikan kondisi dinamika leukosit yang berkaitan dengan kejadian CPA dan
menjadi tatalaksana pengukuran efektivitas manuver rekrutmen. Penelitian ini
menggunakan model anak babi (Sus scrofa) karena spesies ini ideal digunakan
dalam berbagai penelitian biomedik, termasuk bidang respirasi mekanik. Hewan
ini memiliki karakteristik anatomi dan fisiologi yang mirip dengan manusia. Salah
satu kelompok dalam penelitian diberikan perlakuan pembebatan yang berfungsi
sebagai model kelainan diafragma pada bayi atau diafragma yang belum
2
berkembang sempurna, karena selama ini manuver rekrutmen hanya
memperhatikan komplians paru tetapi tidak mempertimbangkan elastans dinding
dada (Kornecki dan Kavanagh 2009).
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi gambaran diferensiasi leukosit
pada anak babi (Sus scrofa) yang mengalami CPA pediatrik selama manuver
rekrutmen dengan dan tanpa pembebatan dinding dada.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan manfaat bagi tatalaksana CPA
pediatrik dengan mengetahui efektivitas manuver rekrutmen pada anak babi (Sus
scrofa) yang mengalami gangguan mekanika respirasi oleh pembebatan dinding
dada.
TINJAUAN PUSTAKA
Cedera Paru Akut
Cedera paru akut (CPA) merupakan gejala hipoksemia akut yang secara
klinis terlihat dengan adanya peningkatan permeabilitas pada alveolus yang
menyebabkan edema paru. American-European Consensus Conference (AECC)
menjelaskan bahwa kriteria CPA yang sering digunakan baik pada orang dewasa
maupun anak-anak berdasarkan 4 parameter klinis, yaitu: (1) onset akut, (2)
arterial hypoxia, (3) ratio PaO2/ FiO2 ≤300 mmHg, dan (4) tidak disertai dengan
hipertensi pulmoner (Randolph 2009).
Pemicu yang paling umum adalah infeksi di traktus respiratorius bagian
bawah. Meskipun frekuensi kejadian pada anak-anak (2.2-12 dari 100 000 orang
per tahun) lebih sedikit daripada usia dewasa (306 per 100 000 orang per tahun),
tingkat kematian akibat CPA tergolong tinggi pada anak-anak (Erickson et al.
2007).
Ventilator Mekanik
Ventilator mekanik adalah alat pernapasan bertekanan negatif atau positif
yang dapat mempertahankan ventilasi dan memberikan oksigen dalam waktu yang
lama. Ventilator mekanik diklasifikasikan berdasarkan cara alat tersebut
mendukung ventilasi. Dua kategori umum adalah ventilator tekanan negatif dan
tekanan positif (Kornecki dan Kavanagh 2009).
Prinsip penggunaan ventilator tekanan negatif adalah memasukan udara ke
dalam paru dengan cara membuat tekanan sekeliling dada negatif. Pengurangan
tekanan intratoraks selama inspirasi memungkinkan udara mengalir ke dalam
paru-paru sehingga memenuhi volumenya. Ventilator jenis ini digunakan terutama
pada gagal napas kronik yang berhubungan dengan kondisi neurovaskular seperti
poliomyelitis, distrofi otot, dan miastenia gravis. Penggunaan ventilator tidak
3
sesuai untuk pasien yang tidak stabil atau pasien yang kondisinya membutuhkan
perubahan ventilasi yang sering (Smeltzer dan Bare 1996).
Ventilator tekanan positif menggembungkan paru-paru dengan
mengeluarkan tekanan positif pada jalan napas sehingga dapat mendorong alveoli
untuk mengembang selama inspirasi. Ventilator jenis ini memerlukan intubasi
endotrakeal. Ventilator ini secara luas digunakan pada klien dengan penyakit paru
primer. Terdapat tiga jenis ventilator tekanan positif, yaitu tekanan bersiklus,
waktu bersiklus dan volume bersiklus (Vitali dan Arnold 2009).
Darah
Darah ditunjang oleh keberadaan plasma yang bertindak sebagai suplemen
dalam bentuk protein sebagai makanan. Sel-sel darah terdiri atas: (1) eritrosit, (2)
leukosit, dan (3) trombosit yang dikenal sebagai benda-benda darah. Darah
berfungsi sebagai pembawa nutrien yang telah disiapkan oleh saluran pencernaan
menuju jaringan tubuh, penyalur oksigen dari paru-paru ke jaringan dan CO2 dari
jaringan ke paru-paru, pembawa sisa metabolisme tubuh untuk dieksresikan
melalui urin (ginjal), pembawa hormon ke organ lain dalam tubuh, penyeimbang
asam-basa (buffer tubuh), serta penyeimbang kandungan air tubuh dan sebagai
pembekuan darah sehingga mencegah terjadinya kehilangan darah yang berlebih
pada saat luka (Ganong 2003).
Babi (Sus scrofa)
Penggunaan babi telah banyak dilakukan sebagai model hewan dalam
penelitian bedah eksperimemtal. Penelitian dalam bidang mekanika respirasi
memperlihatkan kemiripan babi dari hemodinamik dan anatomik paru dengan
manusia. Paru-paru babi terdiri atas beberapa lobus yang juga mirip dengan
manusia. Sebagai pembeda adalah adanya lobus accessorius pada paru kanan
yang melintasi vena besar (vena cava caudalis). Pertimbangan kemiripan tersebut
menjadi dasar penentuan penggunaan babi sebagai model hewan pada kasus CPA
(Bastarache dan Blackwell 2009).
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari-Februari 2013. Pemeliharaan
babi dilakukan di kandang Unit Pengelolaan Hewan Laboratorium Fakultas
Kedokteran Hewan (UPHL-FKH), Institut Pertanian Bogor (IPB). Perlakuan
induksi CPA, manuver rekrutmen, dan pengambilan data darah dilakukan di
Laboratorium Bedah Eksperimental, Divisi Bedah dan Radiologi, Departemen
Klinik, Reproduksi, dan Patologi (KRP), FKH IPB. Pemeriksaan darah dilakukan
di Laboratorium Apotik Yasa, Jalan Dr. Semeru 84, Bogor.
4
Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan selama penelitian adalah Oxfendazole,
suplemen zat besi, pakan, air minum, Atropin Sulfat (Aludonna®, PT Armoxindo
Farma), Ketamin (Ilium Ketamil®, Troy Laboratories), Xylazine (Xylazil®, Troy
Laboratories), Vecuronium Bromida (Ecron®, PT Pharoz), kateter intravena, dan
three way stop cock. Anestesi rumatan menggunakan satu set syringe pump (B
BRAUN Medical Inc.) berisi Propofol (Lipuro®, B BRAUN Medical Inc),
Midazolam (Hipnoz®, PT Pharoz), dan Fentanyl (Fentanyl® Injection, Johnson &
Johnson). Induksi CPA menggunakan larutan Saline (NaCl 0.9%, PT Widatra
Bhakti) hangat, manset dari kain dengan lebar 50 cm untuk pembebatan dinding
dada yang terhubung dengan spigmomanometer.
Intubasi dilakukan dengan pipa endotrakeal (Endotracheal tube/ ETT),
laringoskop lurus, dan ventilator AVEA® bicore (Carefusion, Yorba LindaAmerika). Pemeriksaan diferensiasi leukosit menggunakan instrumen hematologi
particle counter (ERMA Inc., Jepang).
Gambar 1 Haematology Particle Counter
Model Hewan
Model hewan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 6 ekor babi (Sus
scrofa) yang berumur 1-3 bulan dengan berat badan 5-8 kg. Model hewan dibagi
ke dalam dua kelompok perlakuan yang masing-masing terdiri dari 3 ekor babi.
Kelompok pertama tidak dilakukan pembebatan pada dinding dada (A) dan
kelompok kedua dilakukan pembebatan pada dinding dada (B) (Gambar 2).
(A)
(B)
Gambar 2 Model hewan anak babi (Sus scrofa) yang diberi perlakuan tanpa
pembebatan (A) dan dengan pembebatan (B) dinding dada
Tahap Perlakuan
Perlakuan atas model hewan ini telah mendapatkan persetujuan etik dari
Komite Etik IPB dengan nomor 03-2013 IPB. Sebelumnya dilakukan terlebih
dahulu proses aklimatisasi selama 2 minggu. Babi ditempatkan dalam kandang
berukuran 4 x 3 m. Kandang dibersihkan setiap hari dan diberi disinfektan sebagai
5
upaya sanitasi. Selama adaptasi babi diberikan Oxfendazole sebagai antihelmintik
secara peroral dan suplemen zat besi. Babi diberikan pakan pada pagi dan sore
hari. Air minum diberikan secara ad libitum.
Kelompok babi yang akan digunakan harus melalui tahap penapisan prapenelitian berupa pemeriksaan kondisi klinis (tidak mengalami infeksi, gangguan
napas atau organ lainnya), parameter respirasi, dan parameter hemodinamik.
Kedua kelompok hewan diberikan perlakuan dasar yang sama yaitu anestesi,
induksi CPA, pemasangan ventilasi mekanik, dan manuver rekrutmen. Induksi
anestesi diberikan dengan kombinasi Ilium Ketamil® dan Xylazil® secara
intramuscular (IM) pada m. semimembranosus/ semitendinosus. Selanjutnya
diberikan premedikasi dengan Aludonna® secara intravena (IV). Rumatan anestesi
dilakukan dengan metode neuroleptanalgesia dengan kombinasi injeksi Lipuro®,
Hipnoz®, dan Fentanyl® melalui akses vena perifer setelah hewan terinduksi.
Hewan diberikan Injeksi Ecron® secara IV secaraperiodik setiap 30 menit.
Induksi CPA dilakukan dengan terlebih dahulu melakukan proses intubasi,
yaitu pemasangan pipa endotrakeal (Endotracheal tube/ ETT) ke jalan napas
(trakea) melalui mulut. Kumbah bronkus dilakukan pada parenkim paru
menggunakan Saline 0.9% hangat. Setelah anak babi terinduksi CPA, pipa
endotrakeal dihubungkan dengan ventilator AVEA® bicore, dengan modus
pengaturan pressure control. Paru yang kolaps kemudian dikembangkan kembali
secara manuver rekrutmen dengan strategi proteksi paru menggunakan metode
inkremental dan dekremental positive end expiratory pressure (PEEP).
Pembebatan dinding dada menggunakan manset yang tersambung dengan
spigmomanometer hanya dilakukan pada kelompok B.
Pengambilan Data
Pengambilan data dilakukan pada tahap penapisan sebelum induksi CPA
dan pascarekrutmen manuver paru (Gambar 3). Darah diambil dari arteri
femoralis sebanyak 3 ml menggunakan syringe dan dimasukkan ke dalam EDTA
vacuum tube dan dihomogenisasi. Setelah itu darah diperiksa menggunakan
instrumen hematologi particle counter dengan pemeriksaan darah lengkap.
Pembebatan dinding dada
(hanya pada kelompok B)
Anestesi
Intubasi
Kumbah
Bronkus
Ventilasi
Mekanik
Euthanasia
Manuver
Rekrutment
1 jam
1 jam
2 jam
Sampel darah
(Penapisan)
1 jam
Sampel Darah
(Pascarekrutmen)
Gambar 3 Alur penelitian
6
Analisis Data
Data yang diperoleh dinyatakan dalam rataan dan simpangan baku. Data
diolah menggunakan perangkat lunak Microsoft Excel 2013 dan SPSS 21. Data
variabel dianalisis secara statistik menggunakan One-way Analyze of Variant
(ANOVA) kemudian dilanjutkan dengan uji Duncan pada selang kepercayaan
95%.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Nilai Total Leukosit
Leukosit merupakan sel pembentuk komponen darah yang memiliki inti dan
memiliki kemampuan gerak mandiri. Sel ini membantu tubuh melawan berbagai
penyakit infeksi sebagai bagian dari sistem kekebalan tubuh. Nilai normal total
leukosit pada babi adalah 7-20 x103/µL (Harapin et al. 2003). Nilai yang
diperoleh memperlihatkan adanya penurunan jumlah total leukosit
pascarekrutmen yang tidak signifikan pada kedua kelompok babi, tetapi
penurunan nilai total leukosit yang lebih besar ditunjukkan pada kelompok B
(Tabel 1).
Tabel 1 Rata-rata nilai total leukosit (x103/µL) selama penapisan dan
pascarekrutmen pada anak babi (Sus scrofa) tanpa dan dengan
pembebatan
Perlakuan
Tanpa pembebatan (A)
Dengan Pembebatan (B)
Keterangan:
Penapisan
a,x
11.40±2.95
17.80±5.30a,x
Pascarekrutmen
9.87±2.16a,x
14.37±3.31a,x
Huruf superscript (x,y) yang berbeda pada kolom yang sama menyatakan adanya
perbedaan yang signifikan (p