DAYA HAMBAT EKSTRAK DAUN DEWANDARU (Eugenia uniflora L.) TERHADAP AKTIVITAS GLUTATION S-TRANSFERASE PARU TIKUS SECARA IN VITRO
BAB I
PENDAHULUAN
Glutation S-transferase (GST) merupakan sekelompok enzim yang
memiliki peran utama sebagai katalis enzimatik pada detoksifikasi senyawa
elektrofilik, yang sering bersifat sitotoksik, mutagenik, dan karsinogenik, melalui
konjugasi dengan glutation (Josephy dkk, 1997; Mannervik dan Danielson, 1988).
GST terdiri dari 6 kelas enzim sitosolik yaitu kelas alpha, mu, pi, theta, sigma dan
zeta, dan 2 kelas GST yang terikat membran yaitu GST kelas kappa dari
mitokondria dan GST mikrosomal (Morgenstern dan DePierre, 1983; Mannervik
dkk, 1985; Meyer dan Thomas, 1995; Meyer dkk, 1991; Board dkk, 1997;Pemble
dkk, 1996).
Pada penyakit kanker sering menunjukkan aktivitas GST
berlebihan,
sebagai contoh GST kelas pi sering dapat digunakan sebagai petunjuk adanya
tumor. Pada tikus, enzim ini diekspresikan cukup tinggi pada preneoplastik nodul
dan hepatoseluler karsinoma dibandingkan pada hati normal. Hal yang sama juga
ditunjukkan pada tumor hepatik manusia (Van Bladeren dan Van Ommen, 1991).
Dalam banyak kasus juga ditemukan peningkatan isoenzim kelas pi pada jaringan
kanker payudara jauh lebih tinggi dibanding jaringan payudara normal pada
pasien yang sama (Kelley dkk, 1994). Dilaporkan juga terjadinya ekspresi
berlebih GST kelas pi pada kanker nasofaring (Jayasurya dkk, 2002). Pada tumor
paru, dilaporkan juga terjadinya peningkatan berlebihan GST kelas mu (Black dan
Wolf, 1991).
Dengan peningkatan berlebihan aktivitas enzim GST kelas tertentu
tersebut, maka terapi sel kanker dengan obat-obat sitostatik umumnya akan
mengalami resistensi karena sebagian besar obat sitostatik justru dimetabolisme
melalui konjugasi glutation (GSH) yang dikatalisis oleh GST. Detoksifikasi
beberapa obat antikanker seperti 1,3-bis-(2-kloroetil)-1-nitrosourea (BCNU),
klorambusil, siklofosfamid, melpalan, dan tiotepa yang mengalami konjugasi
dengan glutation juga dikatalisis oleh GST (Hayes dan Pulford, 1995). Sebagai
akibatnya terjadilah penurunan efektivitas obat sitostatik tersebut. Namun apabila
1
obat sitostatik tersebut diberikan bersama-sama obat lain yang bersifat sebagai
inhibitor GST, maka efektivitas obat sitostatik tersebut akan meningkat. Sebagai
contoh adalah indometasin, obat antiinflamasi yang juga bersifat sebagai inhibitor
GST, yang dikombinasi dengan klorambusil, maka akan terjadi peningkatan
efektivitas klorambusil pada terapi jenis kanker tertentu (Hayes dan Pulford,
1995).
Senyawa-senyawa fenol dalam tanaman (asam elegat, asam kafeat, asam
ferulat, asam klorogenat) dilaporkan sebagai inhibitor in vitro terhadap enzim
GST dengan substrat
1-kloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB) (Das dkk, 1984).
Senyawa flavonoid, yang juga merupakan senyawa fenol (fisetin, myricetin,
kaempferol, quercetin, baicalein, quercitrin, chrysin, baicalin, morin, rutin,
apigenin) dilaporkan juga dapat menghambat secara in vitro aktivitas enzim GST
dengan substrat CDNB (Iio dkk, 1993).
Dewandaru (Eugenia uniflora L.) adalah tanaman yang hidup tersebar di
pulau Jawa dan Sumatera (Hutapea, 1991). Dewandaru mengandung senyawa
seperti sitronela, sineol, terpenin, sesquiterpen, vitamin C, saponin, flavonoid,
tanin
dan antosianin (Einbond, et al., 2004). Penelitian terkait yang pernah
dilakukan melaporkan bahwa ekstrak kloroform, etil asetat dan etanol daun
Dewandaru mampu menghambat aktivitas GST ginjal tikus dengan substrat
CDNB dimana nilai IC50-nya berturut-turut untuk ekstrak kloroform, etil asetat
dan etanol adalah 376,26; 228,96; dan 180,05 µg/ml (Utami, 2007).
Oleh karena itu, penelitian ini dilakukan untuk mengetahui apakah ekstrak
daun dewandaru (Eugenia uniflora L.) mampu menghambat secara in vitro
aktivitas GST paru tikus dengan substrat 1-kloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB) yang
merupakan substrat umum untuk mendemonstrasikan aktivitas GST pada berbagai
jaringan biologis.
2
DAFTAR PUSTAKA
Backer, C.A. and Brink, B.R.C., 1965, Flora of Java (Spermatophytes Only),
Vol. III, NVP
Board, P.G., Baker, R.T., Chelvanayagam, G., and Jermin, L.S., 1997, Zeta, a
novel class of glutathione transferases in a range of species from
plants to human, Biochem. J., 328, 929-935.
Black, S.M. and Wolf, C.R., 1991, The role of glutathione-dependent enzymes
in drug resistance, Pharmacol. Ther., 51, 139-154.
Commandeur, J.N.M., Stijntjes, G.J., and Vermeulen, N.P.E., 1995, Enzymes
and transport systems involved in the formation and disposition of
glutathione S-conjugates, Pharmacol. Rev., 47, (2), 271-330.
Clark, A.G., Smith, J.N., and Speir, T.W., 1973, Cross specificity in some
vertebrate and insect glutathione-transferases with methyl parathion
(dimethyl
p-nitrophenyl
phosphorothionate),
1-chloro-2,4dinitrobenzene and S-crotonyl-N-acetylcystea-mine as substrates,
Biochem. J., 135, 385-392.
Das, M., Bickers, D.R., Mukhtar, H., 1984, Plant Phenols as in vitro inhibitors
of glutathione S-transferase, Biochem. Biophys. Res. Comm., 120, (2),
427-433.
Einbond, L., Reynertson, K.A., Luo, X. D., Basile, M.J., Kennely, E.J., 2004,
Anthocyanin Antioxidants From Edible Fruits, Food Chem., 84, 23-28.
Habig, W.H., Pabst, M.J., and Jakoby, W.B., 1974, Glutathione S-transferase,
the first enzymatic step in mercapturic acid formation, J. Biol. Chem.,
249, (22), 7130-7139.
Hayes, J.D. and Pulford, D.J., 1995, The glutathione S-transferases supergene
family : regulation of GST and the contribution of the isoenzymes to
cancer chemoprotection and drug resistance, Crit. Rev. in Biochem.
and Mol. Biol., 30 (6), 445-600.
Hsieh, CC.H., Liu, L.F., Tsai, S.P., and Tam, M.F., 1999, Characterization and
cloning of avian-hepatic glutathione S-transferases, Biochem. J., 343,
87-93.
Hutapea, J.R., dkk., 1991, Inventaris Tanaman Obat Indonesia III,
Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta
23
Igarashi, T., Satoh, T., Iwashita, K., Ono, S., Ueno, K., and Kitagawa, H.,
1985, Sex difference in subunit composition of hepatic glutathione Stransferases in rats, J. Biochem., (Tokyo), 98, 117-123.
Iio, M., Kawaguchi, H., Sakoto, Y., Otonari, J., and Nitaha, H., 1993, Effects
of polyphenols, including flavonoids, on glutathione S-transferases and
glutathione reductase, Biosci. Biotech, Biochem., 57, (10), 168-160.
Jayasurya, A., Yap, W.M., Tan, N.G., Tan, B.K.H., and Bay, B.H., 2002,
Glutathione S-transferases π expression on nasopharyngeal cancer,
Arch Otolaryngol Head Neck Surg., 128, 13961399.
Josephy, P.D., Mannervik, B., Montellano, P.O., 1997, Molecular Toxicology,
p.158-170, Oxford University Press, New York.
Kelley, M.K., Engqvist-Goldstein, A., Montali, J.A., Wheatly, J.B., Schmidt
Jr., D.E., and Kauvar, L.M., 1994, Variability of glutathione Stransferases isoenzyme patterns in matched normal and cancer human
breast tissue, Biochem. J., 304, 843-848.
Khotimah, Khusnul D.S. ,2004. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kloroform
dan Metanol Daun Dewandaru (Eugenia uniflora. L.) Terhadap
Staphyloccus Aureus,Shigella Dysentriae dan Escherichia Coli,
Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Muhamadiyah Surakarta:
Surakarta
Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., and Randall, R.J., 1951, Protein
measurement with the Folin phenol reagen, J. Biol. Chem., 193, 265275.
Lundgren, B., Meijer, J. and DePiere, J.W., 1987, Characterization of the
induction of cytosolic and microsomal epoxide hydrolases by 2ethylhexanoic acid in mouse liver, Drug Metab.Dispos., 15, 114-121.
Mannervik, B., Alin, P., Guthenberg, C., Jensson, H., Tahir, M.K., Warholm,
M., and Jornvall, H., 1985, Identifiction of three classes of cytosolic
glutathione transferases common to several mammalian species:
Correlation between structural data and enzymatic properties, Proc.
Natl. Acid. Sci. U.S.A, 82, 7202-7206.
Mannervik, B. and Danielson, U.H., 1988, Glutathione transferases-stucture
and catalytic activity, CRC Crit. Rev. Biochem., 23, 283-337.
Meyer, D.J., Coles, B., Pemble, S.E., Gilmore, K.S.,Frazer, G.M., and
Ketterer, B., 1991, Theta, a new class of glutathione transferases
purified from rat and human, Biochem. J., 274. 409-414.
24
Meyer, D.J. and Thomas, M., 1995, Characterization of rat spleen
prostaglandin H D-isomerase as a sigma class GSH transferase,
Biochem. J., 311, 739-742.
Morgenstern, R. and DePierre, J.W., 1983, Microsomal glutathione
transferase, purification in unactivated form and further
characterization of the activation process, substrate specificity and
amino acid composition, 1983, Eur. J. Biochem., 134, 581-593.
Pemble, S.E., Wardle, A.F., and Taylor, J.B., 1996, Glutathione S-transferase
class Kappa: characterization by the cloning of rat mitochondrial GST
and identification of a human homologue, Biochem. J., 319, 749-754.
Ploemen, J.H.T.M., Van Ommen, B., and Van Bladeren, P.J., 1990, Inhibition
of rat and human glutathione S-transferase isoenzymes by ethacrynic
acid and its glutathione conjugate, Biochem. Pharmacol., 40, (7),
1631-1635.
Van Bladeren, P.J. and Van Ommen, B., 1991, The inhibition of glutathione
S-transferases: mechanisms, toxic consequences and therapeutic
benefits, Pharmacol. Ther., 51, 35-46.
Van der Aar, E.M., 1997, Structure-activity relationship and active site
characterization of glutathione S-transferase, Ph.D Thesis, Division of
Molecular Toxicology, Department of Pharmacochemistry, LACDRVrije Universiteit, Amsterdam.
Utami, W., Da’i, M., Sofiana, Y.S., 2005. Uji Aktivitas Penangkap Radikal
dengan Metode DPPH serta Penetapan Kandungan Fenol dan
Flavonoid dalam Ekstrak Kloroform, Ekstrak Etil Asetat, Ekstrak
Etanol Daun Dewandaru (Eugenia uniflora L.), Pharmacon, 6, (1), 59..
Utami, W., 2007, Pengaruh Ekstrak Daun Dewandaru (Eugenia uniflora L.)
terhadap Aktivitas Glutation S-Transferase Ginjal Tikus secara In
Vitro dengan Substrat 1–Kloro-2,4-Dinitrobenzen, Laporan Penelitian
Reguler LP2M UMS, Universitas Muhamadiyah Surakarta, Surakarta.
25
LAPORAN PENELITIAN DOSEN MUDA
DAYA HAMBAT EKSTRAK DAUN DEWANDARU (Eugenia uniflora L.)
TERHADAP AKTIVITAS GLUTATION S-TRANSFERASE PARU TIKUS
SECARA IN VITRO
Oleh:
Wahyu Utami, M.Si.,Apt
Andi Suhendi, S.Farm.,Apt
Dibiayai oleh Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi,
Departemen Pendidikan Nasional
Sesuai dengan Surat Perjanjian Pelaksanaan Hibah Penelitian
Nomor: 156/SP2H/PP/DP2M/III/2008, tanggal 29 Maret 2007
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA
BULAN SEPTEMBER, TAHUN 2008
i
RINGKASAN
Glutation
S-Transferase
(GST)
merupakan
suatu
famili
enzim
multifungsional yang mengkatalisis konjugasi antara glutation (GSH) dengan
senyawa xenobiotik elektrofilik (Hsieh dkk., 1999). Pada mamalia, GST dapat
digolongkan menjadi 7 kelas isoenzim yang berbeda, yakni kelas alpha, mu, pi
(Mannervik & Danielson, 1988), sigma (Meyer & Thomas, 1995), theta (Meyer
dkk., 1991), zeta (Board dkk., 1997), Omega (Board dkk., 2000).
Pada penyakit kanker sering menunjukkan aktivitas GST
berlebihan.
sehingga terapi kanker dengan obat sitostatik, yang bersifat elektrofilik, umumnya
akan mengalami resistensi karena sebagian besar obat sitostatik justru
dimetabolisme melalui konjugasi dengan GSH yang dikatalisis oleh GST. Sebagai
akibatnya terjadilah penurunan efektivitas obat sitostatik tersebut. Namun apabila
obat sitostatik tersebut diberikan bersama obat lain yang bersifat sebagai inhibitor
GST yang selektif, maka efektivitas obat sitostatik tersebut akan meningkat.
Pada penelitian terdahulu, senyawa fenol dalam tanaman, termasuk
flavonoid, dilaporkan sebagai inhibitor in vitro terhadap GST dengan substrat 1kloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB) (Das dkk, 1984 ; Iio dkk, 1993).
Dewandaru (Eugenia uniflora L.) adalah tanaman yang hidup tersebar di
pulau Jawa dan Sumatera (Hutapea, 1991). Dewandaru mengandung senyawa
seperti sitronela, sineol, terpenin, sesquiterpen, vitamin C, saponin, flavonoid,
tanin
dan antosianin (Einbond, et al., 2004). Penelitian terkait yang pernah
dilakukan melaporkan bahwa ekstrak kloroform, etil asetat dan etanol daun
Dewandaru mampu menghambat aktivitas GST ginjal tikus dengan substrat
CDNB dimana nilai IC50-nya berturut-turut untuk ekstrak kloroform, etil asetat
dan etanol adalah 376,26; 228,96; dan 180,05 µg/ml (Utami, 2007).
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh ekstrak daun
dewandaru terhadap aktivitas GST paru tikus secara in vitro dengan substrat
CDNB sebagai substrat kelas GST umum.
Penelitian dilakukan dengan fraksi sitosol paru tikus sebagai sumber GST
yang disiapkan dengan metode Lundgren dkk (1987). Ekstrak kloroform, etil
iii
asetat dan etanol daun dewandaru diperoleh dengan cara maserasi bertingkat..
Kadar protein fraksi sitosol ditentukan dengan metode Lowry (1951) dengan
Bovine Serum Albumin (BSA) sebagai standar. Aktivitas GST diukur dari
kecepatan
pembentukan
produk
konjugat
GSH
dan
substrat,
secara
spektrofotometri (Habig dkk,1974). Diperoleh hasil berupa aktivitas GST dengan
dan tanpa ekstrak sehingga dapat dihitung % inhibisi ekstrak terhadap aktivitas
GST. Kemudian dari persamaan garis regresi antara log konsentrasi ekstrak
dengan % inhibisi yang dihasilkan. ditentukan IC50 masing-masing ekstrak, yaitu
konsentrasi ekstrak yang mampu menghambat aktivitas GST sebesar 50%.
Hasil penelitian menunjukkan terjadinya penurunan aktivitas GST paru
V (nm ol/m in/m g protein)
tikus dengan penambahan ekstrak daun dewandaru (Gambar 1).
120
100
80
Ekstrak kloroform
60
Ekstrak etil asetat
40
Ekstrak etanol
20
0
0
100
200
300
400
500
Konsentrasi ekstrak (µg/ml)
Gambar 1. Daya Hambat Ekstrak Daun Dewandaru terhadap
Aktivitas GST Paru Tikus dengan Substrat CDNB.
Pada penelitian didapatkan bahwa ekstrak kloroform, etil asetat dan
etanol daun dewandaru mampu menghambat GST. Ekstrak kloroform mempunyai
nilai IC50 yang paling kecil, ini menunjukkan bahwa potensi penghambatannya
besar. Ekstrak kloroform mempunyai potensi penghambatan yang paling besar
jika dibandingkan dengan ekstrak etil asetat maupun ekstrak etanol yaitu dengan
nilai IC50 77,964 µg/ml diikuti dengan ekstrak etanol (160,0135 µg/ml) dan
ekstrak etil asetat (299,305 µg/ml) (Tabel 1). Menurut Iio dkk., (1993) senyawa
flavonoid terbukti mampu menghambat aktivitas GST pada liver tikus secara in
vitro dengan substrat CDNB, senyawa flavonoid ini menghambat aktivitas GST
iv
secara kompetitif melalui ikatan pada sisi nukleofilik GST yang menyebabkan
tidak terbentuknya konjugat GS-DNB.
Tabel 1. Penetapan Nilai IC50 Ekstrak Daun Dewandaru
Ekstrak
Kadar
protein
(mg/ml)
Etanol
12,87
Etil
asetat
12,87
Klorofor
m
12,87
Kadar
ekstrak
(µg/ml)
Rate
(abs/min)
V
(nmol/min/m
g protein)
% inhibisi
0
100
150
200
250
0
100
200
300
400
0
50
100
150
200
0,178
0,125
0,083
0,077
0,064
0,154
0,109
0,087
0,080
0,067
0,187
0,106
0,087
0,078
0,057
108,05
75,88
50,38
46,74
38,85
93,48
66,17
52,81
48,56
40,67
113,52
64,35
52,81
47,35
34,60
30,14
53,57
56,92
64,19
29,22
43,51
48,05
56,49
43,31
53,48
58,29
69,52
IC50
(µg/ml)
160,014
299,305
77,964
Pada tabel 1 terlihat bahwa terdapat perbedaan nilai penghambatan.
Perbedaan nilai penghambatan oleh masing-masing ekstrak
ini kemungkinan
karena perbedaan struktur dan kandungan senyawa fenolik maupun flavonoid
yang ada pada masing-masing ekstrak tersebut
Adanya perbedaan daya hambat yang dimiliki, disebabkan karena
kandungan senyawa aktif yang berbeda pada masing-masing ekstrak. Meskipun
telah dilaporkan bahwa senyawa aktif yang berperan adalah flavonoid (Das dkk.,
1984), maka perbedaan aktivitas ini juga kemungkinan disebabkan kandungan
jenis flavonoid yang berbeda pada masing-masing ekstrak. Sehingga dapat
memberikan aktivitas yang berbeda pula.
Lebih lanjut dari hasil penelitian ini, dapat dimungkinkan bahwa ekstrak
daun dewandaru dapat bermanfaat untuk meningkatkan efektivitas obat sitostatik
pada terapi kanker.
v
ABSTRACT
Objective: In some tumor cases, the Glutathione S-Transferase (GST)
have been known increased. It causes anticancer drugs would be metabolized
faster. Dewandaru leaves extracts were shown inhibitory effect on GST rat liver
activity.This research aims are to determine the inhibitory potency of chloroform,
ethyl acetate, and ethanol extract of Dewandaru leaves on GST activity of rat
pulmo by in vitro using 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) as substrate.
Methods: The research was performed by using cytosolic fraction of rat pulmo
which is prepared by centrifugation. Chloroform, ethyl acetate, and ethanol
extracts of Dewandaru leaves were obtained by maceration. The protein content of
cytosolic fraction was measured by Lowry method using bovine serum albumin
(BSA) as standard. The GST activity was known from the conjugated product
between Glutathione (GSH) and the substrate. It was measured by
spectrophotometer. IC50 of each extract was determined from the plots of
remaining activities versus the (varied) concentration of extract at a fixed
concentration of substrate.
Results: The research results showed all extracts have inhibitory effect on GST
activity. IC50 values of chloroform, ethyl acetate, and ethanol extract using CDNB
as a substrate are 77.964; 299.305; 160.014 µg/ml respectively.
Conclusions: Dewandaru leaves extracts were shown inhibitory effect on GST rat
pulmo activity by in vitro using CDNB as substrate.
Key words: Glutathione (GSH), Glutathione S-Transferase (GST), Dewandaru
(Eugenia uniflora L.), 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB)
vi
PRAKATA
Assalamu’alaikum Wr. Wb.
Alhamdulillah, segala puji syukur kami panjatkan kepada Allah SWT atas
segala rahmat dan rizqi yang diberikan sehingga penelitian dengan judul “DAYA
HAMBAT
EKSTRAK
DAUN
DEWANDARU
(Eugenia
uniflora
L.)
TERHADAP AKTIVITAS GLUTATION S-TRANSFERASE PARU TIKUS
SECARA IN VITRO” ini dapat diselesaikan.
Penelitian yang dikerjakan ini merupakan sedikit upaya untuk menemukan
senyawa inhibitor glutation S- transferase yang diharapkan dapat sebagai sebagai
kombinasi dengan obat sitostatik yang bersifat elektrofil dalam terapi kanker
untuk meningkatkan efektivitas terapi
Selesainya penelitian ini tidak terlepas dari dukungan dan bimbingan
berbagai pihak, untuk itu penulis menyampaikan terima kasih kepada :
1. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional atas
bantuan dana penelitian.
2. Rektor dan Dekan Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta.
3. Ketua Lembaga Penelitian Universitas Muhammadiyah Surakarta.
4. Agus yang telah membantu dalam penelitian ini..
5. Staf dan karyawan Instrumen Fakultas Farmasi UGM, Laboratorium Ilmu
Hayati UGM dan Unit Pengadaan Hewan Percobaan (UPHP) UGM.
6. Berbagai pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.
Semoga Allah SWT membalas segala amal dan kebaikannya.
Akhir kata penulis berharap penelitian ini dapat memberi manfaat bagi
pengembangan ilmu pengetahuan. Penulis menyadari penelitian ini masih jauh
dari kesempurnaan sehingga kritik dan saran yang membangun sangat penulis
harapkan untuk perbaikan penelitian selanjutnya.
Wassalamu’alaikum Wr. Wb.
Surakarta, September 2008
Penulis
vii
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL……………………………………………………….
i
HALAMAN PENGESAHAN……………………………………………...
ii
RINGKASAN………………………………………………………………
iii
ABSTRACT…………………………………………………………………
vi
PRAKATA……………………………………………………....................
vii
DAFTAR ISI………………………………………………………………..
viii
DAFTAR TABEL ………………………………………………………….
x
DAFTAR GAMBAR ………………………………………………………
xi
DAFTAR LAMPIRAN……………………………………………………..
xii
BAB I. PENDAHULUAN…………………………………………………
1
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA…………………………………………
3
1. Glutation (GSH)…………………………………………………………
3
2. Glutation S-Transferase ………………………………………………..
4
3. GST dan resistensi obat antikanker……………………………………
5
4. Manipulasi GST pada sel tumor……………………………………….
6
5. Senyawa 1-kloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB)………………………….
6
6. Tanaman Dewandaru (Eugenia uniflora Linn.)………………………
6
BAB III. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN………………………
9
1. Tujuan Penelitian………………………………………………….…
9
2. Manfaat Penelitian…………………………………………………
9
BAB IV. METODE PENELITIAN……………………………….………
10
1. Rancangan Penelitian……………………………………………..
10
2. Variabel Penelitian…………………………………………......
10
3. Bahan dan Alat ………………………………………………...
10
4. Jalannya Penelitian……………………………………………..
11
a.
Penyiapan simplisia daun dewandaru. ……………………….
11
b.
Pembuatan ekstrak daun dewandaru ………..........................
11
c.
Penyiapan fraksi sitosol paru tikus…....................................
11
viii
d.
Penetapan Kadar Protein Fraksi Sitosol Liver Tikus ............
12
e.
Penentuan Aktivitas GST Liver Tikus……….......................
13
f.
Penentuan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru ……………........
14
5. Cara Analisis…………………………………………………….
14
BAB III. HASIL DAN PEMBAHASAN………………….......................
15
1. Perolehan Ekstrak Daun Dewandaru…………………………….
15
2. Penyiapan Fraksi Sitosol Liver Tikus…………………………....
16
3. Penetapan Kadar Fraksi Sitosol………………………………….
18
4. Penentuan Aktivitas GST Liver Tikus..........................................
19
5. Penentuan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru.....................................
20
BAB IV. KESIMPULAN DAN SARAN……………………………………
27
A. Kesimpulan………………………………………………….....
27
B. Saran…………………………………………………………...
27
DAFTAR PUSTAKA……………………………………………………….
28
LAMPIRAN…………………………………………………………………
31
DAFTAR TABEL
ix
Halaman
Tabel 1.
Berat dan Rendemen Hasil Ekstraksi ................................
Tabel 2.
Hasil Penentuan Kadar Protein dalam Fraksi Sitosol GST
Tikus...................................................................................
Tabel 3.
17
18
Nilai % Inhibisi dan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru pada
Konjugasi GSH – CDNB dengan Katalis GST Liver
Tikus................................................................................
Tabel 4.
22
Nilai % Inhibisi dan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru pada
Konjugasi
GSH – DCNB dengan Katalis GST Liver
Tikus................................................................................
23
DAFTAR GAMBAR
x
Halaman
Gambar 1.
Struktur Glutation (GSH) ………………………………...
3
Gambar 2.
Struktur Senyawa 1-kloro-2,4- dinitrobenzen(CDNB)........
7
Gambar 3.
Reaksi Konjugasi GSH dengan Substrat CDNB.................
7
Gambar 4.
Struktur Senyawa 1,2-dikloro-4-nitrobenzen (DCNB).......
8
Gambar 5.
Reaksi Konjugasi GSH dengan Substrat DCNB.................
8
Gambar 6.
Skema Ekstraksi Daun Dewandaru....................................
13
Gambar 7. Pengaruh Ekstrak Daun Dewandaru terhadap Aktivitas GST
dengan Substrat CDNB ......................................................
21
Gambar 8. Pengaruh Ekstrak Daun Dewandaru terhadap Aktivitas GST
dengan Substrat DCNB ......................................................
21
DAFTAR LAMPIRAN
xi
Halaman
Lampiran 1. Gambar Tanaman Dewandaru (Eugenia uniflora L.)……
31
Lampiran 2.
32
Data Perhitungan Rendemen…………………………….
Lampiran 3. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (λ maks) &
Operating Time BSA…………………………………...
Lampiran 4.
33
Perhitungan Aktivitas GST Fraksi Sitosol Liver
Tikus…………...……………………………………….
34
Lampiran 5. Perhitungan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru dengan
Substrat CDNB…………………………………………
35
Lampiran 6. Perhitungan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru dengan
Substrat DCNB…………………………………………
37
xii
LAPORAN PENELITIAN DOSEN MUDA
DAYA HAMBAT EKSTRAK DAUN DEWANDARU (Eugenia uniflora L.)
TERHADAP AKTIVITAS GLUTATION S-TRANSFERASE PARU TIKUS
SECARA IN VITRO
Oleh:
Wahyu Utami, M.Si.,Apt
Andi Suhendi, S.Farm.,Apt
Dibiayai oleh Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi,
Departemen Pendidikan Nasional
Sesuai dengan Surat Perjanjian Pelaksanaan Hibah Penelitian
Nomor: 156/SP2H/PP/DP2M/III/2008, tanggal 29 Maret 2007
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA
BULAN SEPTEMBER, TAHUN 2008
i
HALAMAN PENGESAHAN
LAPORAN HASIL PENELITIAN DOSEN MUDA
1. Judul Penelitian
: Daya Hambat Ekstrak Daun Dewandaru
(Eugenia uniflora L.) terhadap Aktivitas
Glutation S-Transferase Paru Tikus secara in
Vitro
2. Bidang Ilmu Penelitian
: MIPA/Farmasi
3. Ketua Peneliti
a. Nama lengkap
b. Jenis Kelamin
c. NIK
d. Pangkat/Golongan
e. Jabatan
f. Jabatan Struktural
g. Fakultas/Jurusan
: Wahyu Utami, S.Si., M.Si., Apt
:P
: 875
: Penata Muda / IIIa
: Asisten Ahli
: Dosen
: Farmasi
4. Jumlah Tim Peneliti
: 1 Orang
5. Lokasi Penelitian
: Lab. Ilmu Hayati UGM
Lab. Kimia Instrumen Farmasi UMS
6. Waktu Penelitian
: 8 bulan
7. Biaya
: Rp. 10.000.000,00
Mengetahui,
Dekan Fakultas Farmasi
Dra. Nurul Mutmainah, M.Si.,Apt
NIK. 831
Surakarta, September 2008
Ketua Peneliti,
Wahyu Utami, S.Si.,M.Si.,Apt
NIK. 875
Menyetujui,
Ketua Lembaga Penelitian dan Pengabdian Masyarakat
Universitas Muhammadiyah Surakarta
Prof. Dr. Markhamah, M.Hum
NIP. 131683025
ii
RINGKASAN
Glutation
S-Transferase
(GST)
merupakan
suatu
famili
enzim
multifungsional yang mengkatalisis konjugasi antara glutation (GSH) dengan
senyawa xenobiotik elektrofilik (Hsieh dkk., 1999). Pada mamalia, GST dapat
digolongkan menjadi 7 kelas isoenzim yang berbeda, yakni kelas alpha, mu, pi
(Mannervik & Danielson, 1988), sigma (Meyer & Thomas, 1995), theta (Meyer
dkk., 1991), zeta (Board dkk., 1997), Omega (Board dkk., 2000).
Pada penyakit kanker sering menunjukkan aktivitas GST
berlebihan.
sehingga terapi kanker dengan obat sitostatik, yang bersifat elektrofilik, umumnya
akan mengalami resistensi karena sebagian besar obat sitostatik justru
dimetabolisme melalui konjugasi dengan GSH yang dikatalisis oleh GST. Sebagai
akibatnya terjadilah penurunan efektivitas obat sitostatik tersebut. Namun apabila
obat sitostatik tersebut diberikan bersama obat lain yang bersifat sebagai inhibitor
GST yang selektif, maka efektivitas obat sitostatik tersebut akan meningkat.
Pada penelitian terdahulu, senyawa fenol dalam tanaman, termasuk
flavonoid, dilaporkan sebagai inhibitor in vitro terhadap GST dengan substrat 1kloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB) (Das dkk, 1984 ; Iio dkk, 1993).
Dewandaru (Eugenia uniflora L.) adalah tanaman yang hidup tersebar di
pulau Jawa dan Sumatera (Hutapea, 1991). Dewandaru mengandung senyawa
seperti sitronela, sineol, terpenin, sesquiterpen, vitamin C, saponin, flavonoid,
tanin
dan antosianin (Einbond, et al., 2004). Penelitian terkait yang pernah
dilakukan melaporkan bahwa ekstrak kloroform, etil asetat dan etanol daun
Dewandaru mampu menghambat aktivitas GST ginjal tikus dengan substrat
CDNB dimana nilai IC50-nya berturut-turut untuk ekstrak kloroform, etil asetat
dan etanol adalah 376,26; 228,96; dan 180,05 µg/ml (Utami, 2007).
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh ekstrak daun
dewandaru terhadap aktivitas GST paru tikus secara in vitro dengan substrat
CDNB sebagai substrat kelas GST umum.
Penelitian dilakukan dengan fraksi sitosol paru tikus sebagai sumber GST
yang disiapkan dengan metode Lundgren dkk (1987). Ekstrak kloroform, etil
iii
asetat dan etanol daun dewandaru diperoleh dengan cara maserasi bertingkat..
Kadar protein fraksi sitosol ditentukan dengan metode Lowry (1951) dengan
Bovine Serum Albumin (BSA) sebagai standar. Aktivitas GST diukur dari
kecepatan
pembentukan
produk
konjugat
GSH
dan
substrat,
secara
spektrofotometri (Habig dkk,1974). Diperoleh hasil berupa aktivitas GST dengan
dan tanpa ekstrak sehingga dapat dihitung % inhibisi ekstrak terhadap aktivitas
GST. Kemudian dari persamaan garis regresi antara log konsentrasi ekstrak
dengan % inhibisi yang dihasilkan. ditentukan IC50 masing-masing ekstrak, yaitu
konsentrasi ekstrak yang mampu menghambat aktivitas GST sebesar 50%.
Hasil penelitian menunjukkan terjadinya penurunan aktivitas GST paru
V (nm ol/m in/m g protein)
tikus dengan penambahan ekstrak daun dewandaru (Gambar 1).
120
100
80
Ekstrak kloroform
60
Ekstrak etil asetat
40
Ekstrak etanol
20
0
0
100
200
300
400
500
Konsentrasi ekstrak (µg/ml)
Gambar 1. Daya Hambat Ekstrak Daun Dewandaru terhadap
Aktivitas GST Paru Tikus dengan Substrat CDNB.
Pada penelitian didapatkan bahwa ekstrak kloroform, etil asetat dan
etanol daun dewandaru mampu menghambat GST. Ekstrak kloroform mempunyai
nilai IC50 yang paling kecil, ini menunjukkan bahwa potensi penghambatannya
besar. Ekstrak kloroform mempunyai potensi penghambatan yang paling besar
jika dibandingkan dengan ekstrak etil asetat maupun ekstrak etanol yaitu dengan
nilai IC50 77,964 µg/ml diikuti dengan ekstrak etanol (160,0135 µg/ml) dan
ekstrak etil asetat (299,305 µg/ml) (Tabel 1). Menurut Iio dkk., (1993) senyawa
flavonoid terbukti mampu menghambat aktivitas GST pada liver tikus secara in
vitro dengan substrat CDNB, senyawa flavonoid ini menghambat aktivitas GST
iv
secara kompetitif melalui ikatan pada sisi nukleofilik GST yang menyebabkan
tidak terbentuknya konjugat GS-DNB.
Tabel 1. Penetapan Nilai IC50 Ekstrak Daun Dewandaru
Ekstrak
Kadar
protein
(mg/ml)
Etanol
12,87
Etil
asetat
12,87
Klorofor
m
12,87
Kadar
ekstrak
(µg/ml)
Rate
(abs/min)
V
(nmol/min/m
g protein)
% inhibisi
0
100
150
200
250
0
100
200
300
400
0
50
100
150
200
0,178
0,125
0,083
0,077
0,064
0,154
0,109
0,087
0,080
0,067
0,187
0,106
0,087
0,078
0,057
108,05
75,88
50,38
46,74
38,85
93,48
66,17
52,81
48,56
40,67
113,52
64,35
52,81
47,35
34,60
30,14
53,57
56,92
64,19
29,22
43,51
48,05
56,49
43,31
53,48
58,29
69,52
IC50
(µg/ml)
160,014
299,305
77,964
Pada tabel 1 terlihat bahwa terdapat perbedaan nilai penghambatan.
Perbedaan nilai penghambatan oleh masing-masing ekstrak
ini kemungkinan
karena perbedaan struktur dan kandungan senyawa fenolik maupun flavonoid
yang ada pada masing-masing ekstrak tersebut
Adanya perbedaan daya hambat yang dimiliki, disebabkan karena
kandungan senyawa aktif yang berbeda pada masing-masing ekstrak. Meskipun
telah dilaporkan bahwa senyawa aktif yang berperan adalah flavonoid (Das dkk.,
1984), maka perbedaan aktivitas ini juga kemungkinan disebabkan kandungan
jenis flavonoid yang berbeda pada masing-masing ekstrak. Sehingga dapat
memberikan aktivitas yang berbeda pula.
Lebih lanjut dari hasil penelitian ini, dapat dimungkinkan bahwa ekstrak
daun dewandaru dapat bermanfaat untuk meningkatkan efektivitas obat sitostatik
pada terapi kanker.
v
ABSTRACT
Objective: In some tumor cases, the Glutathione S-Transferase (GST)
have been known increased. It causes anticancer drugs would be metabolized
faster. Dewandaru leaves extracts were shown inhibitory effect on GST rat liver
activity.This research aims are to determine the inhibitory potency of chloroform,
ethyl acetate, and ethanol extract of Dewandaru leaves on GST activity of rat
pulmo by in vitro using 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) as substrate.
Methods: The research was performed by using cytosolic fraction of rat pulmo
which is prepared by centrifugation. Chloroform, ethyl acetate, and ethanol
extracts of Dewandaru leaves were obtained by maceration. The protein content of
cytosolic fraction was measured by Lowry method using bovine serum albumin
(BSA) as standard. The GST activity was known from the conjugated product
between Glutathione (GSH) and the substrate. It was measured by
spectrophotometer. IC50 of each extract was determined from the plots of
remaining activities versus the (varied) concentration of extract at a fixed
concentration of substrate.
Results: The research results showed all extracts have inhibitory effect on GST
activity. IC50 values of chloroform, ethyl acetate, and ethanol extract using CDNB
as a substrate are 77.964; 299.305; 160.014 µg/ml respectively.
Conclusions: Dewandaru leaves extracts were shown inhibitory effect on GST rat
pulmo activity by in vitro using CDNB as substrate.
Key words: Glutathione (GSH), Glutathione S-Transferase (GST), Dewandaru
(Eugenia uniflora L.), 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB)
vi
PRAKATA
Assalamu’alaikum Wr. Wb.
Alhamdulillah, segala puji syukur kami panjatkan kepada Allah SWT atas
segala rahmat dan rizqi yang diberikan sehingga penelitian dengan judul “DAYA
HAMBAT
EKSTRAK
DAUN
DEWANDARU
(Eugenia
uniflora
L.)
TERHADAP AKTIVITAS GLUTATION S-TRANSFERASE PARU TIKUS
SECARA IN VITRO” ini dapat diselesaikan.
Penelitian yang dikerjakan ini merupakan sedikit upaya untuk menemukan
senyawa inhibitor glutation S- transferase yang diharapkan dapat sebagai sebagai
kombinasi dengan obat sitostatik yang bersifat elektrofil dalam terapi kanker
untuk meningkatkan efektivitas terapi
Selesainya penelitian ini tidak terlepas dari dukungan dan bimbingan
berbagai pihak, untuk itu penulis menyampaikan terima kasih kepada :
1. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional atas
bantuan dana penelitian.
2. Rektor dan Dekan Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta.
3. Ketua Lembaga Penelitian Universitas Muhammadiyah Surakarta.
4. Agus yang telah membantu dalam penelitian ini..
5. Staf dan karyawan Instrumen Fakultas Farmasi UGM, Laboratorium Ilmu
Hayati UGM dan Unit Pengadaan Hewan Percobaan (UPHP) UGM.
6. Berbagai pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.
Semoga Allah SWT membalas segala amal dan kebaikannya.
Akhir kata penulis berharap penelitian ini dapat memberi manfaat bagi
pengembangan ilmu pengetahuan. Penulis menyadari penelitian ini masih jauh
dari kesempurnaan sehingga kritik dan saran yang membangun sangat penulis
harapkan untuk perbaikan penelitian selanjutnya.
Wassalamu’alaikum Wr. Wb.
Surakarta, September 2008
Penulis
vii
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL……………………………………………………….
i
HALAMAN PENGESAHAN……………………………………………...
ii
RINGKASAN………………………………………………………………
iii
ABSTRACT…………………………………………………………………
vi
PRAKATA……………………………………………………....................
vii
DAFTAR ISI………………………………………………………………..
viii
DAFTAR TABEL ………………………………………………………….
x
DAFTAR GAMBAR ………………………………………………………
xi
DAFTAR LAMPIRAN……………………………………………………..
xii
BAB I. PENDAHULUAN…………………………………………………
1
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA…………………………………………
3
1. Glutation
3
(GSH)…………………………………………………………
2. Glutation S-Transferase ………………………………………………..
4
3. GST dan resistensi obat antikanker……………………………………
5
4. Manipulasi GST pada sel tumor……………………………………….
6
5. Senyawa 1-kloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB)………………………….
6
6. Tanaman Dewandaru (Eugenia uniflora Linn.)………………………
6
BAB III. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN………………………
9
1. Tujuan Penelitian………………………………………………….…
9
2. Manfaat Penelitian…………………………………………………
9
BAB IV. METODE PENELITIAN……………………………….………
10
1. Rancangan Penelitian……………………………………………..
10
2. Variabel Penelitian…………………………………………......
10
3. Bahan dan Alat ………………………………………………...
10
4. Jalannya Penelitian……………………………………………..
11
a.
Penyiapan simplisia daun dewandaru. ……………………….
11
b.
Pembuatan ekstrak daun dewandaru ………..........................
11
viii
c.
Penyiapan fraksi sitosol paru tikus…....................................
11
d.
Penetapan Kadar Protein Fraksi Sitosol Liver Tikus ............
12
e.
Penentuan Aktivitas GST Liver Tikus……….......................
13
f.
Penentuan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru ……………........
14
5. Cara Analisis…………………………………………………….
14
BAB III. HASIL DAN PEMBAHASAN………………….......................
15
1. Perolehan Ekstrak Daun Dewandaru…………………………….
15
2. Penyiapan Fraksi Sitosol Liver Tikus…………………………....
16
3. Penetapan Kadar Fraksi Sitosol………………………………….
18
4. Penentuan Aktivitas GST Liver Tikus..........................................
19
5. Penentuan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru.....................................
20
BAB IV. KESIMPULAN DAN SARAN……………………………………
27
A. Kesimpulan………………………………………………….....
27
B. Saran…………………………………………………………...
27
DAFTAR PUSTAKA……………………………………………………….
28
LAMPIRAN…………………………………………………………………
31
ix
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1.
Berat dan Rendemen Hasil Ekstraksi ................................
Tabel 2.
Hasil Penentuan Kadar Protein dalam Fraksi Sitosol GST
Tikus...................................................................................
Tabel 3.
17
18
Nilai % Inhibisi dan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru pada
Konjugasi GSH – CDNB dengan Katalis GST Liver
Tikus................................................................................
Tabel 4.
22
Nilai % Inhibisi dan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru pada
Konjugasi
GSH – DCNB dengan Katalis GST Liver
Tikus................................................................................
23
x
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1.
Struktur Glutation (GSH) ………………………………...
3
Gambar 2.
Struktur Senyawa 1-kloro-2,4- dinitrobenzen(CDNB)........
7
Gambar 3.
Reaksi Konjugasi GSH dengan Substrat CDNB.................
7
Gambar 4.
Struktur Senyawa 1,2-dikloro-4-nitrobenzen (DCNB).......
8
Gambar 5.
Reaksi Konjugasi GSH dengan Substrat DCNB.................
8
Gambar 6.
Skema Ekstraksi Daun Dewandaru....................................
13
Gambar 7. Pengaruh Ekstrak Daun Dewandaru terhadap Aktivitas GST
dengan Substrat CDNB ......................................................
21
Gambar 8. Pengaruh Ekstrak Daun Dewandaru terhadap Aktivitas GST
dengan Substrat DCNB ......................................................
21
xi
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Gambar Tanaman Dewandaru (Eugenia uniflora L.)……
31
Lampiran 2.
32
Data Perhitungan Rendemen…………………………….
Lampiran 3. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (λ maks) &
Operating Time BSA…………………………………...
Lampiran 4.
33
Perhitungan Aktivitas GST Fraksi Sitosol Liver
Tikus…………...……………………………………….
34
Lampiran 5. Perhitungan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru dengan
Substrat CDNB…………………………………………
35
Lampiran 6. Perhitungan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru dengan
Substrat DCNB…………………………………………
37
xii
PENDAHULUAN
Glutation S-transferase (GST) merupakan sekelompok enzim yang
memiliki peran utama sebagai katalis enzimatik pada detoksifikasi senyawa
elektrofilik, yang sering bersifat sitotoksik, mutagenik, dan karsinogenik, melalui
konjugasi dengan glutation (Josephy dkk, 1997; Mannervik dan Danielson, 1988).
GST terdiri dari 6 kelas enzim sitosolik yaitu kelas alpha, mu, pi, theta, sigma dan
zeta, dan 2 kelas GST yang terikat membran yaitu GST kelas kappa dari
mitokondria dan GST mikrosomal (Morgenstern dan DePierre, 1983; Mannervik
dkk, 1985; Meyer dan Thomas, 1995; Meyer dkk, 1991; Board dkk, 1997;Pemble
dkk, 1996).
Pada penyakit kanker sering menunjukkan aktivitas GST
berlebihan,
sebagai contoh GST kelas pi sering dapat digunakan sebagai petunjuk adanya
tumor. Pada tikus, enzim ini diekspresikan cukup tinggi pada preneoplastik nodul
dan hepatoseluler karsinoma dibandingkan pada hati normal. Hal yang sama juga
ditunjukkan pada tumor hepatik manusia (Van Bladeren dan Van Ommen, 1991).
Dalam banyak kasus juga ditemukan peningkatan isoenzim kelas pi pada jaringan
kanker payudara jauh lebih tinggi dibanding jaringan payudara normal pada
pasien yang sama (Kelley dkk, 1994). Dilaporkan juga terjadinya ekspresi
berlebih GST kelas pi pada kanker nasofaring (Jayasurya dkk, 2002). Pada tumor
paru, dilaporkan juga terjadinya peningkatan berlebihan GST kelas mu (Black dan
Wolf, 1991).
Dengan peningkatan berlebihan aktivitas enzim GST kelas tertentu
tersebut, maka terapi sel kanker dengan obat-obat sitostatik umumnya akan
mengalami resistensi karena sebagian besar obat sitostatik justru dimetabolisme
melalui konjugasi glutation (GSH) yang dikatalisis oleh GST. Detoksifikasi
beberapa obat antikanker seperti 1,3-bis-(2-kloroetil)-1-nitrosourea (BCNU),
klorambusil, siklofosfamid, melpalan, dan tiotepa yang mengalami konjugasi
dengan glutation juga dikatalisis oleh GST (Hayes dan Pulford, 1995). Sebagai
akibatnya terjadilah penurunan efektivitas obat sitostatik tersebut. Namun apabila
1
obat sitostatik tersebut diberikan bersama-sama obat lain yang bersifat sebagai
inhibitor GST, maka efektivitas obat sitostatik tersebut akan meningkat. Sebagai
contoh adalah indometasin, obat antiinflamasi yang juga bersifat sebagai inhibitor
GST, yang dikombinasi dengan klorambusil, maka akan terjadi peningkatan
efektivitas klorambusil pada terapi jenis kanker tertentu (Hayes dan Pulford,
1995).
Senyawa-senyawa fenol dalam tanaman (asam elegat, asam kafeat, asam
ferulat, asam klorogenat) dilaporkan sebagai inhibitor in vitro terhadap enzim
GST dengan substrat
1-kloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB) (Das dkk, 1984).
Senyawa flavonoid, yang juga merupakan senyawa fenol (fisetin, myricetin,
kaempferol, quercetin, baicalein, quercitrin, chrysin, baicalin, morin, rutin,
apigenin) dilaporkan juga dapat menghambat secara in vitro aktivitas enzim GST
dengan substrat CDNB (Iio dkk, 1993).
Dewandaru (Eugenia uniflora L.) adalah tanaman yang hidup tersebar di
pulau Jawa dan Sumatera (Hutapea, 1991). Dewandaru mengandung senyawa
seperti sitronela, sineol, terpenin, sesquiterpen, vitamin C, saponin, flavonoid,
tanin
dan antosianin (Einbond, et al., 2004). Penelitian terkait yang pernah
dilakukan melaporkan bahwa ekstrak kloroform, etil asetat dan etanol daun
Dewandaru mampu menghambat aktivitas GST ginjal tikus dengan substrat
CDNB dimana nilai IC50-nya berturut-turut untuk ekstrak kloroform, etil asetat
dan etanol adalah 376,26; 228,96; dan 180,05 µg/ml (Utami, 2007).
Oleh karena itu, penelitian ini dilakukan untuk mengetahui apakah ekstrak
daun dewandaru (Eugenia uniflora L.) mampu menghambat secara in vitro
aktivitas GST paru tikus dengan substrat 1-kloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB) yang
merupakan substrat umum untuk mendemonstrasikan aktivitas GST pada berbagai
jaringan biologis.
2
DAFTAR PUSTAKA
Backer, C.A. and Brink, B.R.C., 1965, Flora of Java (Spermatophytes Only),
Vol. III, NVP
Board, P.G., Baker, R.T., Chelvanayagam, G., and Jermin, L.S., 1997, Zeta, a
novel class of glutathione transferases in a range of species from
plants to human, Biochem. J., 328, 929-935.
Black, S.M. and Wolf, C.R., 1991, The role of glutathione-dependent enzymes
in drug resistance, Pharmacol. Ther., 51, 139-154.
Commandeur, J.N.M., Stijntjes, G.J., and Vermeulen, N.P.E., 1995, Enzymes
and transport systems involved in the formation and disposition of
glutathione S-conjugates, Pharmacol. Rev., 47, (2), 271-330.
Clark, A.G., Smith, J.N., and Speir, T.W., 1973, Cross specificity in some
vertebrate and insect glutathione-transferases with methyl parathion
(dimethyl
p-nitrophenyl
phosphorothionate),
1-chloro-2,4dinitrobenzene and S-crotonyl-N-acetylcystea-mine as substrates,
Biochem. J., 135, 385-392.
Das, M., Bickers, D.R., Mukhtar, H., 1984, Plant Phenols as in vitro inhibitors
of glutathione S-transferase, Biochem. Biophys. Res. Comm., 120, (2),
427-433.
Einbond, L., Reynertson, K.A., Luo, X. D., Basile, M.J., Kennely, E.J., 2004,
Anthocyanin Antioxidants From Edible Fruits, Food Chem., 84, 23-28.
Habig, W.H., Pabst, M.J., and Jakoby, W.B., 1974, Glutathione S-transferase,
the first enzymatic step in mercapturic acid formation, J. Biol. Chem.,
249, (22), 7130-7139.
Hayes, J.D. and Pulford, D.J., 1995, The glutathione S-transferases supergene
family : regulation of GST and the contribution of the isoenzymes to
cancer chemoprotection and drug resistance, Crit. Rev. in Biochem.
and Mol. Biol., 30 (6), 445-600.
Hsieh, CC.H., Liu, L.F., Tsai, S.P., and Tam, M.F., 1999, Characterization and
cloning of avian-hepatic glutathione S-transferases, Biochem. J., 343,
87-93.
Hutapea, J.R., dkk., 1991, Inventaris Tanaman Obat Indonesia III,
Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta
23
Igarashi, T., Satoh, T., Iwashita, K., Ono, S., Ueno, K., and Kitagawa, H.,
1985, Sex difference in subunit composition of hepatic glutathione Stransferases in rats, J. Biochem., (Tokyo), 98, 117-123.
Iio, M., Kawaguchi, H., Sakoto, Y., Otonari, J., and Nitaha, H., 1993, Effects
of polyphenols, including flavonoids, on glutathione S-transferases and
glutathione reductase, Biosci. Biotech, Biochem., 57, (10), 168-160.
Jayasurya, A., Yap, W.M., Tan, N.G., Tan, B.K.H., and Bay, B.H., 2002,
Glutathione S-transferases π expression on nasopharyngeal cancer,
Arch Otolaryngol Head Neck Surg., 128, 13961399.
Josephy, P.D., Mannervik, B., Montellano, P.O., 1997, Molecular Toxicology,
p.158-170, Oxford University Press, New York.
Kelley, M.K., Engqvist-Goldstein, A., Montali, J.A., Wheatly, J.B., Schmidt
Jr., D.E., and Kauvar, L.M., 1994, Variability of glutathione Stransferases isoenzyme patterns in matched normal and cancer human
breast tissue, Biochem. J., 304, 843-848.
Khotimah, Khusnul D.S. ,2004. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kloroform
dan Metanol Daun Dewandaru (Eugenia uniflora. L.) Terhadap
Staphyloccus Aureus,Shigella Dysentriae dan Escherichia Coli,
Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Muhamadiyah Surakarta:
Surakarta
Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., and Randall, R.J., 1951, Protein
measurement with the Folin phenol reagen, J. Biol. Chem., 193, 265275.
Lundgren, B., Meijer, J. and DePiere, J.W., 1987, Characterization of the
induction of cytosolic and microsomal epoxide hydrolases by 2ethylhexanoic acid in mouse liver, Drug Metab.Dispos., 15, 114-121.
Mannervik, B., Alin, P., Guthenberg, C., Jensson, H., Tahir, M.K., Warholm,
M., and Jornvall, H., 1985, Identifiction of three classes of cytosolic
glutathione transferases common to several mammalian species:
Correlation between structural data and enzymatic properties, Proc.
Natl. Acid. Sci. U.S.A, 82, 7202-7206.
Mannervik, B. and Danielson, U.H., 1988, Glutathione transferases-stucture
and catalytic activity, CRC Crit. Rev. Biochem., 23, 283-337.
Meyer, D.J., Coles, B., Pemble, S.E., Gilmore, K.S.,Frazer, G.M., and
Ketterer, B., 1991, Theta, a new class of glutathione transferases
purified from rat and human, Biochem. J., 274. 409-414.
24
Meyer, D.J. and Thomas, M., 1995, Characterization of rat spleen
prostaglandin H D-isomerase as a sigma class GSH transferase,
Biochem. J., 311, 739-742.
Morgenstern, R. and DePierre, J.W., 1983, Microsomal glutathione
transferase, purification in unactivated form and further
characterization of the activation process, substrate specificity and
amino acid composition, 1983, Eur. J. Biochem., 134, 581-593.
Pemble, S.E., Wardle, A.F., and Taylor, J.B., 1996, Glutathione S-transferase
class Kappa: characterization by the cloning of rat mitochondrial GST
and identification of a human homologue, Biochem. J., 319, 749-754.
Ploemen, J.H.T.M., Van Ommen, B., and Van Bladeren, P.J., 1990, Inhibition
of rat and human glutathione S-transferase isoenzymes by ethacrynic
acid and its glutathione conjugate, Biochem. Pharmacol., 40, (7),
1631-1635.
Van Bladeren, P.J. and Van Ommen, B., 1991, The inhibition of glutathione
S-transferases: mechanisms, toxic consequences and therapeutic
benefits, Pharmacol. Ther., 51, 35-46.
Van der Aar, E.M., 1997, Structure-activity relationship and active site
characterization of glutathione S-transferase, Ph.D Thesis, Division of
Molecular Toxicology, Department of Pharmacochemistry, LACDRVrije Universiteit, Amsterdam.
Utami, W., Da’i, M., Sofiana, Y.S., 2005. Uji Aktivitas Penangkap Radikal
dengan Metode DPPH serta Penetapan Kandungan Fenol dan
Flavonoid dalam Ekstrak Kloroform, Ekstrak Etil Asetat, Ekstrak
Etanol Daun Dewandaru (Eugenia uniflora L.), Pharmacon, 6, (1), 59..
Utami, W., 2007, Pengaruh Ekstrak Daun Dewandaru (Eugenia uniflora L.)
terhadap Aktivitas Glutation S-Transferase Ginjal Tikus secara In
Vitro dengan Substrat 1–Kloro-2,4-Dinitrobenzen, Laporan Penelitian
Reguler LP2M UMS, Universitas Muhamadiyah Surakarta, Surakarta.
25
LAPORAN PENELITIAN DOSEN MUDA
DAYA HAMBAT EKSTRAK DAUN DEWANDARU (Eugenia uniflora L.)
TERHADAP AKTIVITAS GLUTATION S-TRANSFERASE PARU TIKUS
SECARA IN VITRO
Oleh:
Wahyu Utami, M.Si.,Apt
Andi Suhendi, S.Farm.,Apt
Dibiayai oleh Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi,
Departemen Pendidikan Nasional
Sesuai dengan Surat Perjanjian Pelaksanaan Hibah Penelitian
Nomor: 156/SP2H/PP/DP2M/III/2008, tanggal 29 Maret 2007
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA
BULAN SEPTEMBER, TAHUN 2008
i
RINGKASAN
Glutation
S-Transferase
(GST)
merupakan
suatu
famili
enzim
multifungsional yang mengkatalisis konjugasi antara glutation (GSH) dengan
senyawa xenobiotik elektrofilik (Hsieh dkk., 1999). Pada mamalia, GST dapat
digolongkan menjadi 7 kelas isoenzim yang berbeda, yakni kelas alpha, mu, pi
(Mannervik & Danielson, 1988), sigma (Meyer & Thomas, 1995), theta (Meyer
dkk., 1991), zeta (Board dkk., 1997), Omega (Board dkk., 2000).
Pada penyakit kanker sering menunjukkan aktivitas GST
berlebihan.
sehingga terapi kanker dengan obat sitostatik, yang bersifat elektrofilik, umumnya
akan mengalami resistensi karena sebagian besar obat sitostatik justru
dimetabolisme melalui konjugasi dengan GSH yang dikatalisis oleh GST. Sebagai
akibatnya terjadilah penurunan efektivitas obat sitostatik tersebut. Namun apabila
obat sitostatik tersebut diberikan bersama obat lain yang bersifat sebagai inhibitor
GST yang selektif, maka efektivitas obat sitostatik tersebut akan meningkat.
Pada penelitian terdahulu, senyawa fenol dalam tanaman, termasuk
flavonoid, dilaporkan sebagai inhibitor in vitro terhadap GST dengan substrat 1kloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB) (Das dkk, 1984 ; Iio dkk, 1993).
Dewandaru (Eugenia uniflora L.) adalah tanaman yang hidup tersebar di
pulau Jawa dan Sumatera (Hutapea, 1991). Dewandaru mengandung senyawa
seperti sitronela, sineol, terpenin, sesquiterpen, vitamin C, saponin, flavonoid,
tanin
dan antosianin (Einbond, et al., 2004). Penelitian terkait yang pernah
dilakukan melaporkan bahwa ekstrak kloroform, etil asetat dan etanol daun
Dewandaru mampu menghambat aktivitas GST ginjal tikus dengan substrat
CDNB dimana nilai IC50-nya berturut-turut untuk ekstrak kloroform, etil asetat
dan etanol adalah 376,26; 228,96; dan 180,05 µg/ml (Utami, 2007).
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh ekstrak daun
dewandaru terhadap aktivitas GST paru tikus secara in vitro dengan substrat
CDNB sebagai substrat kelas GST umum.
Penelitian dilakukan dengan fraksi sitosol paru tikus sebagai sumber GST
yang disiapkan dengan metode Lundgren dkk (1987). Ekstrak kloroform, etil
iii
asetat dan etanol daun dewandaru diperoleh dengan cara maserasi bertingkat..
Kadar protein fraksi sitosol ditentukan dengan metode Lowry (1951) dengan
Bovine Serum Albumin (BSA) sebagai standar. Aktivitas GST diukur dari
kecepatan
pembentukan
produk
konjugat
GSH
dan
substrat,
secara
spektrofotometri (Habig dkk,1974). Diperoleh hasil berupa aktivitas GST dengan
dan tanpa ekstrak sehingga dapat dihitung % inhibisi ekstrak terhadap aktivitas
GST. Kemudian dari persamaan garis regresi antara log konsentrasi ekstrak
dengan % inhibisi yang dihasilkan. ditentukan IC50 masing-masing ekstrak, yaitu
konsentrasi ekstrak yang mampu menghambat aktivitas GST sebesar 50%.
Hasil penelitian menunjukkan terjadinya penurunan aktivitas GST paru
V (nm ol/m in/m g protein)
tikus dengan penambahan ekstrak daun dewandaru (Gambar 1).
120
100
80
Ekstrak kloroform
60
Ekstrak etil asetat
40
Ekstrak etanol
20
0
0
100
200
300
400
500
Konsentrasi ekstrak (µg/ml)
Gambar 1. Daya Hambat Ekstrak Daun Dewandaru terhadap
Aktivitas GST Paru Tikus dengan Substrat CDNB.
Pada penelitian didapatkan bahwa ekstrak kloroform, etil asetat dan
etanol daun dewandaru mampu menghambat GST. Ekstrak kloroform mempunyai
nilai IC50 yang paling kecil, ini menunjukkan bahwa potensi penghambatannya
besar. Ekstrak kloroform mempunyai potensi penghambatan yang paling besar
jika dibandingkan dengan ekstrak etil asetat maupun ekstrak etanol yaitu dengan
nilai IC50 77,964 µg/ml diikuti dengan ekstrak etanol (160,0135 µg/ml) dan
ekstrak etil asetat (299,305 µg/ml) (Tabel 1). Menurut Iio dkk., (1993) senyawa
flavonoid terbukti mampu menghambat aktivitas GST pada liver tikus secara in
vitro dengan substrat CDNB, senyawa flavonoid ini menghambat aktivitas GST
iv
secara kompetitif melalui ikatan pada sisi nukleofilik GST yang menyebabkan
tidak terbentuknya konjugat GS-DNB.
Tabel 1. Penetapan Nilai IC50 Ekstrak Daun Dewandaru
Ekstrak
Kadar
protein
(mg/ml)
Etanol
12,87
Etil
asetat
12,87
Klorofor
m
12,87
Kadar
ekstrak
(µg/ml)
Rate
(abs/min)
V
(nmol/min/m
g protein)
% inhibisi
0
100
150
200
250
0
100
200
300
400
0
50
100
150
200
0,178
0,125
0,083
0,077
0,064
0,154
0,109
0,087
0,080
0,067
0,187
0,106
0,087
0,078
0,057
108,05
75,88
50,38
46,74
38,85
93,48
66,17
52,81
48,56
40,67
113,52
64,35
52,81
47,35
34,60
30,14
53,57
56,92
64,19
29,22
43,51
48,05
56,49
43,31
53,48
58,29
69,52
IC50
(µg/ml)
160,014
299,305
77,964
Pada tabel 1 terlihat bahwa terdapat perbedaan nilai penghambatan.
Perbedaan nilai penghambatan oleh masing-masing ekstrak
ini kemungkinan
karena perbedaan struktur dan kandungan senyawa fenolik maupun flavonoid
yang ada pada masing-masing ekstrak tersebut
Adanya perbedaan daya hambat yang dimiliki, disebabkan karena
kandungan senyawa aktif yang berbeda pada masing-masing ekstrak. Meskipun
telah dilaporkan bahwa senyawa aktif yang berperan adalah flavonoid (Das dkk.,
1984), maka perbedaan aktivitas ini juga kemungkinan disebabkan kandungan
jenis flavonoid yang berbeda pada masing-masing ekstrak. Sehingga dapat
memberikan aktivitas yang berbeda pula.
Lebih lanjut dari hasil penelitian ini, dapat dimungkinkan bahwa ekstrak
daun dewandaru dapat bermanfaat untuk meningkatkan efektivitas obat sitostatik
pada terapi kanker.
v
ABSTRACT
Objective: In some tumor cases, the Glutathione S-Transferase (GST)
have been known increased. It causes anticancer drugs would be metabolized
faster. Dewandaru leaves extracts were shown inhibitory effect on GST rat liver
activity.This research aims are to determine the inhibitory potency of chloroform,
ethyl acetate, and ethanol extract of Dewandaru leaves on GST activity of rat
pulmo by in vitro using 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) as substrate.
Methods: The research was performed by using cytosolic fraction of rat pulmo
which is prepared by centrifugation. Chloroform, ethyl acetate, and ethanol
extracts of Dewandaru leaves were obtained by maceration. The protein content of
cytosolic fraction was measured by Lowry method using bovine serum albumin
(BSA) as standard. The GST activity was known from the conjugated product
between Glutathione (GSH) and the substrate. It was measured by
spectrophotometer. IC50 of each extract was determined from the plots of
remaining activities versus the (varied) concentration of extract at a fixed
concentration of substrate.
Results: The research results showed all extracts have inhibitory effect on GST
activity. IC50 values of chloroform, ethyl acetate, and ethanol extract using CDNB
as a substrate are 77.964; 299.305; 160.014 µg/ml respectively.
Conclusions: Dewandaru leaves extracts were shown inhibitory effect on GST rat
pulmo activity by in vitro using CDNB as substrate.
Key words: Glutathione (GSH), Glutathione S-Transferase (GST), Dewandaru
(Eugenia uniflora L.), 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB)
vi
PRAKATA
Assalamu’alaikum Wr. Wb.
Alhamdulillah, segala puji syukur kami panjatkan kepada Allah SWT atas
segala rahmat dan rizqi yang diberikan sehingga penelitian dengan judul “DAYA
HAMBAT
EKSTRAK
DAUN
DEWANDARU
(Eugenia
uniflora
L.)
TERHADAP AKTIVITAS GLUTATION S-TRANSFERASE PARU TIKUS
SECARA IN VITRO” ini dapat diselesaikan.
Penelitian yang dikerjakan ini merupakan sedikit upaya untuk menemukan
senyawa inhibitor glutation S- transferase yang diharapkan dapat sebagai sebagai
kombinasi dengan obat sitostatik yang bersifat elektrofil dalam terapi kanker
untuk meningkatkan efektivitas terapi
Selesainya penelitian ini tidak terlepas dari dukungan dan bimbingan
berbagai pihak, untuk itu penulis menyampaikan terima kasih kepada :
1. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional atas
bantuan dana penelitian.
2. Rektor dan Dekan Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta.
3. Ketua Lembaga Penelitian Universitas Muhammadiyah Surakarta.
4. Agus yang telah membantu dalam penelitian ini..
5. Staf dan karyawan Instrumen Fakultas Farmasi UGM, Laboratorium Ilmu
Hayati UGM dan Unit Pengadaan Hewan Percobaan (UPHP) UGM.
6. Berbagai pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.
Semoga Allah SWT membalas segala amal dan kebaikannya.
Akhir kata penulis berharap penelitian ini dapat memberi manfaat bagi
pengembangan ilmu pengetahuan. Penulis menyadari penelitian ini masih jauh
dari kesempurnaan sehingga kritik dan saran yang membangun sangat penulis
harapkan untuk perbaikan penelitian selanjutnya.
Wassalamu’alaikum Wr. Wb.
Surakarta, September 2008
Penulis
vii
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL……………………………………………………….
i
HALAMAN PENGESAHAN……………………………………………...
ii
RINGKASAN………………………………………………………………
iii
ABSTRACT…………………………………………………………………
vi
PRAKATA……………………………………………………....................
vii
DAFTAR ISI………………………………………………………………..
viii
DAFTAR TABEL ………………………………………………………….
x
DAFTAR GAMBAR ………………………………………………………
xi
DAFTAR LAMPIRAN……………………………………………………..
xii
BAB I. PENDAHULUAN…………………………………………………
1
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA…………………………………………
3
1. Glutation (GSH)…………………………………………………………
3
2. Glutation S-Transferase ………………………………………………..
4
3. GST dan resistensi obat antikanker……………………………………
5
4. Manipulasi GST pada sel tumor……………………………………….
6
5. Senyawa 1-kloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB)………………………….
6
6. Tanaman Dewandaru (Eugenia uniflora Linn.)………………………
6
BAB III. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN………………………
9
1. Tujuan Penelitian………………………………………………….…
9
2. Manfaat Penelitian…………………………………………………
9
BAB IV. METODE PENELITIAN……………………………….………
10
1. Rancangan Penelitian……………………………………………..
10
2. Variabel Penelitian…………………………………………......
10
3. Bahan dan Alat ………………………………………………...
10
4. Jalannya Penelitian……………………………………………..
11
a.
Penyiapan simplisia daun dewandaru. ……………………….
11
b.
Pembuatan ekstrak daun dewandaru ………..........................
11
c.
Penyiapan fraksi sitosol paru tikus…....................................
11
viii
d.
Penetapan Kadar Protein Fraksi Sitosol Liver Tikus ............
12
e.
Penentuan Aktivitas GST Liver Tikus……….......................
13
f.
Penentuan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru ……………........
14
5. Cara Analisis…………………………………………………….
14
BAB III. HASIL DAN PEMBAHASAN………………….......................
15
1. Perolehan Ekstrak Daun Dewandaru…………………………….
15
2. Penyiapan Fraksi Sitosol Liver Tikus…………………………....
16
3. Penetapan Kadar Fraksi Sitosol………………………………….
18
4. Penentuan Aktivitas GST Liver Tikus..........................................
19
5. Penentuan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru.....................................
20
BAB IV. KESIMPULAN DAN SARAN……………………………………
27
A. Kesimpulan………………………………………………….....
27
B. Saran…………………………………………………………...
27
DAFTAR PUSTAKA……………………………………………………….
28
LAMPIRAN…………………………………………………………………
31
DAFTAR TABEL
ix
Halaman
Tabel 1.
Berat dan Rendemen Hasil Ekstraksi ................................
Tabel 2.
Hasil Penentuan Kadar Protein dalam Fraksi Sitosol GST
Tikus...................................................................................
Tabel 3.
17
18
Nilai % Inhibisi dan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru pada
Konjugasi GSH – CDNB dengan Katalis GST Liver
Tikus................................................................................
Tabel 4.
22
Nilai % Inhibisi dan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru pada
Konjugasi
GSH – DCNB dengan Katalis GST Liver
Tikus................................................................................
23
DAFTAR GAMBAR
x
Halaman
Gambar 1.
Struktur Glutation (GSH) ………………………………...
3
Gambar 2.
Struktur Senyawa 1-kloro-2,4- dinitrobenzen(CDNB)........
7
Gambar 3.
Reaksi Konjugasi GSH dengan Substrat CDNB.................
7
Gambar 4.
Struktur Senyawa 1,2-dikloro-4-nitrobenzen (DCNB).......
8
Gambar 5.
Reaksi Konjugasi GSH dengan Substrat DCNB.................
8
Gambar 6.
Skema Ekstraksi Daun Dewandaru....................................
13
Gambar 7. Pengaruh Ekstrak Daun Dewandaru terhadap Aktivitas GST
dengan Substrat CDNB ......................................................
21
Gambar 8. Pengaruh Ekstrak Daun Dewandaru terhadap Aktivitas GST
dengan Substrat DCNB ......................................................
21
DAFTAR LAMPIRAN
xi
Halaman
Lampiran 1. Gambar Tanaman Dewandaru (Eugenia uniflora L.)……
31
Lampiran 2.
32
Data Perhitungan Rendemen…………………………….
Lampiran 3. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (λ maks) &
Operating Time BSA…………………………………...
Lampiran 4.
33
Perhitungan Aktivitas GST Fraksi Sitosol Liver
Tikus…………...……………………………………….
34
Lampiran 5. Perhitungan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru dengan
Substrat CDNB…………………………………………
35
Lampiran 6. Perhitungan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru dengan
Substrat DCNB…………………………………………
37
xii
LAPORAN PENELITIAN DOSEN MUDA
DAYA HAMBAT EKSTRAK DAUN DEWANDARU (Eugenia uniflora L.)
TERHADAP AKTIVITAS GLUTATION S-TRANSFERASE PARU TIKUS
SECARA IN VITRO
Oleh:
Wahyu Utami, M.Si.,Apt
Andi Suhendi, S.Farm.,Apt
Dibiayai oleh Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi,
Departemen Pendidikan Nasional
Sesuai dengan Surat Perjanjian Pelaksanaan Hibah Penelitian
Nomor: 156/SP2H/PP/DP2M/III/2008, tanggal 29 Maret 2007
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA
BULAN SEPTEMBER, TAHUN 2008
i
HALAMAN PENGESAHAN
LAPORAN HASIL PENELITIAN DOSEN MUDA
1. Judul Penelitian
: Daya Hambat Ekstrak Daun Dewandaru
(Eugenia uniflora L.) terhadap Aktivitas
Glutation S-Transferase Paru Tikus secara in
Vitro
2. Bidang Ilmu Penelitian
: MIPA/Farmasi
3. Ketua Peneliti
a. Nama lengkap
b. Jenis Kelamin
c. NIK
d. Pangkat/Golongan
e. Jabatan
f. Jabatan Struktural
g. Fakultas/Jurusan
: Wahyu Utami, S.Si., M.Si., Apt
:P
: 875
: Penata Muda / IIIa
: Asisten Ahli
: Dosen
: Farmasi
4. Jumlah Tim Peneliti
: 1 Orang
5. Lokasi Penelitian
: Lab. Ilmu Hayati UGM
Lab. Kimia Instrumen Farmasi UMS
6. Waktu Penelitian
: 8 bulan
7. Biaya
: Rp. 10.000.000,00
Mengetahui,
Dekan Fakultas Farmasi
Dra. Nurul Mutmainah, M.Si.,Apt
NIK. 831
Surakarta, September 2008
Ketua Peneliti,
Wahyu Utami, S.Si.,M.Si.,Apt
NIK. 875
Menyetujui,
Ketua Lembaga Penelitian dan Pengabdian Masyarakat
Universitas Muhammadiyah Surakarta
Prof. Dr. Markhamah, M.Hum
NIP. 131683025
ii
RINGKASAN
Glutation
S-Transferase
(GST)
merupakan
suatu
famili
enzim
multifungsional yang mengkatalisis konjugasi antara glutation (GSH) dengan
senyawa xenobiotik elektrofilik (Hsieh dkk., 1999). Pada mamalia, GST dapat
digolongkan menjadi 7 kelas isoenzim yang berbeda, yakni kelas alpha, mu, pi
(Mannervik & Danielson, 1988), sigma (Meyer & Thomas, 1995), theta (Meyer
dkk., 1991), zeta (Board dkk., 1997), Omega (Board dkk., 2000).
Pada penyakit kanker sering menunjukkan aktivitas GST
berlebihan.
sehingga terapi kanker dengan obat sitostatik, yang bersifat elektrofilik, umumnya
akan mengalami resistensi karena sebagian besar obat sitostatik justru
dimetabolisme melalui konjugasi dengan GSH yang dikatalisis oleh GST. Sebagai
akibatnya terjadilah penurunan efektivitas obat sitostatik tersebut. Namun apabila
obat sitostatik tersebut diberikan bersama obat lain yang bersifat sebagai inhibitor
GST yang selektif, maka efektivitas obat sitostatik tersebut akan meningkat.
Pada penelitian terdahulu, senyawa fenol dalam tanaman, termasuk
flavonoid, dilaporkan sebagai inhibitor in vitro terhadap GST dengan substrat 1kloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB) (Das dkk, 1984 ; Iio dkk, 1993).
Dewandaru (Eugenia uniflora L.) adalah tanaman yang hidup tersebar di
pulau Jawa dan Sumatera (Hutapea, 1991). Dewandaru mengandung senyawa
seperti sitronela, sineol, terpenin, sesquiterpen, vitamin C, saponin, flavonoid,
tanin
dan antosianin (Einbond, et al., 2004). Penelitian terkait yang pernah
dilakukan melaporkan bahwa ekstrak kloroform, etil asetat dan etanol daun
Dewandaru mampu menghambat aktivitas GST ginjal tikus dengan substrat
CDNB dimana nilai IC50-nya berturut-turut untuk ekstrak kloroform, etil asetat
dan etanol adalah 376,26; 228,96; dan 180,05 µg/ml (Utami, 2007).
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh ekstrak daun
dewandaru terhadap aktivitas GST paru tikus secara in vitro dengan substrat
CDNB sebagai substrat kelas GST umum.
Penelitian dilakukan dengan fraksi sitosol paru tikus sebagai sumber GST
yang disiapkan dengan metode Lundgren dkk (1987). Ekstrak kloroform, etil
iii
asetat dan etanol daun dewandaru diperoleh dengan cara maserasi bertingkat..
Kadar protein fraksi sitosol ditentukan dengan metode Lowry (1951) dengan
Bovine Serum Albumin (BSA) sebagai standar. Aktivitas GST diukur dari
kecepatan
pembentukan
produk
konjugat
GSH
dan
substrat,
secara
spektrofotometri (Habig dkk,1974). Diperoleh hasil berupa aktivitas GST dengan
dan tanpa ekstrak sehingga dapat dihitung % inhibisi ekstrak terhadap aktivitas
GST. Kemudian dari persamaan garis regresi antara log konsentrasi ekstrak
dengan % inhibisi yang dihasilkan. ditentukan IC50 masing-masing ekstrak, yaitu
konsentrasi ekstrak yang mampu menghambat aktivitas GST sebesar 50%.
Hasil penelitian menunjukkan terjadinya penurunan aktivitas GST paru
V (nm ol/m in/m g protein)
tikus dengan penambahan ekstrak daun dewandaru (Gambar 1).
120
100
80
Ekstrak kloroform
60
Ekstrak etil asetat
40
Ekstrak etanol
20
0
0
100
200
300
400
500
Konsentrasi ekstrak (µg/ml)
Gambar 1. Daya Hambat Ekstrak Daun Dewandaru terhadap
Aktivitas GST Paru Tikus dengan Substrat CDNB.
Pada penelitian didapatkan bahwa ekstrak kloroform, etil asetat dan
etanol daun dewandaru mampu menghambat GST. Ekstrak kloroform mempunyai
nilai IC50 yang paling kecil, ini menunjukkan bahwa potensi penghambatannya
besar. Ekstrak kloroform mempunyai potensi penghambatan yang paling besar
jika dibandingkan dengan ekstrak etil asetat maupun ekstrak etanol yaitu dengan
nilai IC50 77,964 µg/ml diikuti dengan ekstrak etanol (160,0135 µg/ml) dan
ekstrak etil asetat (299,305 µg/ml) (Tabel 1). Menurut Iio dkk., (1993) senyawa
flavonoid terbukti mampu menghambat aktivitas GST pada liver tikus secara in
vitro dengan substrat CDNB, senyawa flavonoid ini menghambat aktivitas GST
iv
secara kompetitif melalui ikatan pada sisi nukleofilik GST yang menyebabkan
tidak terbentuknya konjugat GS-DNB.
Tabel 1. Penetapan Nilai IC50 Ekstrak Daun Dewandaru
Ekstrak
Kadar
protein
(mg/ml)
Etanol
12,87
Etil
asetat
12,87
Klorofor
m
12,87
Kadar
ekstrak
(µg/ml)
Rate
(abs/min)
V
(nmol/min/m
g protein)
% inhibisi
0
100
150
200
250
0
100
200
300
400
0
50
100
150
200
0,178
0,125
0,083
0,077
0,064
0,154
0,109
0,087
0,080
0,067
0,187
0,106
0,087
0,078
0,057
108,05
75,88
50,38
46,74
38,85
93,48
66,17
52,81
48,56
40,67
113,52
64,35
52,81
47,35
34,60
30,14
53,57
56,92
64,19
29,22
43,51
48,05
56,49
43,31
53,48
58,29
69,52
IC50
(µg/ml)
160,014
299,305
77,964
Pada tabel 1 terlihat bahwa terdapat perbedaan nilai penghambatan.
Perbedaan nilai penghambatan oleh masing-masing ekstrak
ini kemungkinan
karena perbedaan struktur dan kandungan senyawa fenolik maupun flavonoid
yang ada pada masing-masing ekstrak tersebut
Adanya perbedaan daya hambat yang dimiliki, disebabkan karena
kandungan senyawa aktif yang berbeda pada masing-masing ekstrak. Meskipun
telah dilaporkan bahwa senyawa aktif yang berperan adalah flavonoid (Das dkk.,
1984), maka perbedaan aktivitas ini juga kemungkinan disebabkan kandungan
jenis flavonoid yang berbeda pada masing-masing ekstrak. Sehingga dapat
memberikan aktivitas yang berbeda pula.
Lebih lanjut dari hasil penelitian ini, dapat dimungkinkan bahwa ekstrak
daun dewandaru dapat bermanfaat untuk meningkatkan efektivitas obat sitostatik
pada terapi kanker.
v
ABSTRACT
Objective: In some tumor cases, the Glutathione S-Transferase (GST)
have been known increased. It causes anticancer drugs would be metabolized
faster. Dewandaru leaves extracts were shown inhibitory effect on GST rat liver
activity.This research aims are to determine the inhibitory potency of chloroform,
ethyl acetate, and ethanol extract of Dewandaru leaves on GST activity of rat
pulmo by in vitro using 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) as substrate.
Methods: The research was performed by using cytosolic fraction of rat pulmo
which is prepared by centrifugation. Chloroform, ethyl acetate, and ethanol
extracts of Dewandaru leaves were obtained by maceration. The protein content of
cytosolic fraction was measured by Lowry method using bovine serum albumin
(BSA) as standard. The GST activity was known from the conjugated product
between Glutathione (GSH) and the substrate. It was measured by
spectrophotometer. IC50 of each extract was determined from the plots of
remaining activities versus the (varied) concentration of extract at a fixed
concentration of substrate.
Results: The research results showed all extracts have inhibitory effect on GST
activity. IC50 values of chloroform, ethyl acetate, and ethanol extract using CDNB
as a substrate are 77.964; 299.305; 160.014 µg/ml respectively.
Conclusions: Dewandaru leaves extracts were shown inhibitory effect on GST rat
pulmo activity by in vitro using CDNB as substrate.
Key words: Glutathione (GSH), Glutathione S-Transferase (GST), Dewandaru
(Eugenia uniflora L.), 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB)
vi
PRAKATA
Assalamu’alaikum Wr. Wb.
Alhamdulillah, segala puji syukur kami panjatkan kepada Allah SWT atas
segala rahmat dan rizqi yang diberikan sehingga penelitian dengan judul “DAYA
HAMBAT
EKSTRAK
DAUN
DEWANDARU
(Eugenia
uniflora
L.)
TERHADAP AKTIVITAS GLUTATION S-TRANSFERASE PARU TIKUS
SECARA IN VITRO” ini dapat diselesaikan.
Penelitian yang dikerjakan ini merupakan sedikit upaya untuk menemukan
senyawa inhibitor glutation S- transferase yang diharapkan dapat sebagai sebagai
kombinasi dengan obat sitostatik yang bersifat elektrofil dalam terapi kanker
untuk meningkatkan efektivitas terapi
Selesainya penelitian ini tidak terlepas dari dukungan dan bimbingan
berbagai pihak, untuk itu penulis menyampaikan terima kasih kepada :
1. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional atas
bantuan dana penelitian.
2. Rektor dan Dekan Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta.
3. Ketua Lembaga Penelitian Universitas Muhammadiyah Surakarta.
4. Agus yang telah membantu dalam penelitian ini..
5. Staf dan karyawan Instrumen Fakultas Farmasi UGM, Laboratorium Ilmu
Hayati UGM dan Unit Pengadaan Hewan Percobaan (UPHP) UGM.
6. Berbagai pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.
Semoga Allah SWT membalas segala amal dan kebaikannya.
Akhir kata penulis berharap penelitian ini dapat memberi manfaat bagi
pengembangan ilmu pengetahuan. Penulis menyadari penelitian ini masih jauh
dari kesempurnaan sehingga kritik dan saran yang membangun sangat penulis
harapkan untuk perbaikan penelitian selanjutnya.
Wassalamu’alaikum Wr. Wb.
Surakarta, September 2008
Penulis
vii
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL……………………………………………………….
i
HALAMAN PENGESAHAN……………………………………………...
ii
RINGKASAN………………………………………………………………
iii
ABSTRACT…………………………………………………………………
vi
PRAKATA……………………………………………………....................
vii
DAFTAR ISI………………………………………………………………..
viii
DAFTAR TABEL ………………………………………………………….
x
DAFTAR GAMBAR ………………………………………………………
xi
DAFTAR LAMPIRAN……………………………………………………..
xii
BAB I. PENDAHULUAN…………………………………………………
1
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA…………………………………………
3
1. Glutation
3
(GSH)…………………………………………………………
2. Glutation S-Transferase ………………………………………………..
4
3. GST dan resistensi obat antikanker……………………………………
5
4. Manipulasi GST pada sel tumor……………………………………….
6
5. Senyawa 1-kloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB)………………………….
6
6. Tanaman Dewandaru (Eugenia uniflora Linn.)………………………
6
BAB III. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN………………………
9
1. Tujuan Penelitian………………………………………………….…
9
2. Manfaat Penelitian…………………………………………………
9
BAB IV. METODE PENELITIAN……………………………….………
10
1. Rancangan Penelitian……………………………………………..
10
2. Variabel Penelitian…………………………………………......
10
3. Bahan dan Alat ………………………………………………...
10
4. Jalannya Penelitian……………………………………………..
11
a.
Penyiapan simplisia daun dewandaru. ……………………….
11
b.
Pembuatan ekstrak daun dewandaru ………..........................
11
viii
c.
Penyiapan fraksi sitosol paru tikus…....................................
11
d.
Penetapan Kadar Protein Fraksi Sitosol Liver Tikus ............
12
e.
Penentuan Aktivitas GST Liver Tikus……….......................
13
f.
Penentuan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru ……………........
14
5. Cara Analisis…………………………………………………….
14
BAB III. HASIL DAN PEMBAHASAN………………….......................
15
1. Perolehan Ekstrak Daun Dewandaru…………………………….
15
2. Penyiapan Fraksi Sitosol Liver Tikus…………………………....
16
3. Penetapan Kadar Fraksi Sitosol………………………………….
18
4. Penentuan Aktivitas GST Liver Tikus..........................................
19
5. Penentuan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru.....................................
20
BAB IV. KESIMPULAN DAN SARAN……………………………………
27
A. Kesimpulan………………………………………………….....
27
B. Saran…………………………………………………………...
27
DAFTAR PUSTAKA……………………………………………………….
28
LAMPIRAN…………………………………………………………………
31
ix
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1.
Berat dan Rendemen Hasil Ekstraksi ................................
Tabel 2.
Hasil Penentuan Kadar Protein dalam Fraksi Sitosol GST
Tikus...................................................................................
Tabel 3.
17
18
Nilai % Inhibisi dan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru pada
Konjugasi GSH – CDNB dengan Katalis GST Liver
Tikus................................................................................
Tabel 4.
22
Nilai % Inhibisi dan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru pada
Konjugasi
GSH – DCNB dengan Katalis GST Liver
Tikus................................................................................
23
x
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1.
Struktur Glutation (GSH) ………………………………...
3
Gambar 2.
Struktur Senyawa 1-kloro-2,4- dinitrobenzen(CDNB)........
7
Gambar 3.
Reaksi Konjugasi GSH dengan Substrat CDNB.................
7
Gambar 4.
Struktur Senyawa 1,2-dikloro-4-nitrobenzen (DCNB).......
8
Gambar 5.
Reaksi Konjugasi GSH dengan Substrat DCNB.................
8
Gambar 6.
Skema Ekstraksi Daun Dewandaru....................................
13
Gambar 7. Pengaruh Ekstrak Daun Dewandaru terhadap Aktivitas GST
dengan Substrat CDNB ......................................................
21
Gambar 8. Pengaruh Ekstrak Daun Dewandaru terhadap Aktivitas GST
dengan Substrat DCNB ......................................................
21
xi
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Gambar Tanaman Dewandaru (Eugenia uniflora L.)……
31
Lampiran 2.
32
Data Perhitungan Rendemen…………………………….
Lampiran 3. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (λ maks) &
Operating Time BSA…………………………………...
Lampiran 4.
33
Perhitungan Aktivitas GST Fraksi Sitosol Liver
Tikus…………...……………………………………….
34
Lampiran 5. Perhitungan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru dengan
Substrat CDNB…………………………………………
35
Lampiran 6. Perhitungan IC50 Ekstrak Daun Dewandaru dengan
Substrat DCNB…………………………………………
37
xii