Ekspresi Gen inaZ pada Beberapa Galur Bradyrhizobium japonicum Toleran Asam-Al
EKSPRESI GEN inaZPADA BEBERAPA GALUR
Bradyr Itizobilllll japolliclll1l
TOLERAN ASAM-AL
FARlDA ARlYANI
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
1998
RINGKASAN
F ARlDA ARIY ANI. Ekspresi Gen inaZ Bcberapa Galur BradyrhizobiulII japoniclIlII Toleran AsamAl (Expression of illaZ Gene in Sereral BradrrhizobiulII japonicu/Il Acid-AI Toleranl Sirains). Dibimbing
oldl TEDJA IMAS dan ARIS TRI WAHY UD I.
Penclitian lerdahulu yang berlallgsung di Laboraloriwn Mikrubiologi JurUSatl Biologi, F.tv1lPA, IPB,
lelah berhasil menyeleksi beberapa galur Bradyrhizobium japoniclIlII loleratl aSliln-AJ yang diltarapkatl
dapal ditllattfaalkatl sebagai simbion kedelai pada lattah asam. Unluk lelaall kematnpUatl hidup bakleri
lerscbul di lingkwigati alatlU dibulultkatl sualu penatlda yang bersifal slabi!. Gen inaZ merupakatl salall
salu pelUlllda lIIulekuler yang scring digWtakatl dati dapal dipimIaltkatl ke bakleri lain melalui lelunk
kOlUugasi. Gen inaZ lerdapal pada plasnud pJLI703 Escherichia coli DH5u (dunor = D). Pemindallatl
gcn ini ke B. japonicZIIn (rcsipien = R) membutultkan plasmid lain (pRK2013 E. coli HBIOI) yang
bcrtindak sebagai penolong (helper = H). Konjugasi yang demikian dikenal sebagai konjugasi tiga tetua.
Tujuau penelitian ini untnk mempelajari ekspresi gen inaZ pada bcbcrapa galur B. japonicum tolerdll
asam-AJ pada fase sel dan bakteroid.
Penentuau media seleksi dilaknkau dengan menwnbultkan enatn galur uji (OS, 09, 15, 32, 38, dan 45)
B. japonim/ll loleml aSliln-AJ pada media agar Matulol Ekstrak Khalllir (MEK) dati dua galur E. coli pada
media agar Luria (LA) yatlg masing-ntasing dilambalu atltibiolik rifampisill dati kattalluSlll dellgatl
lingkalan konselllrasi berkisar atllard 100-250 J.ig/m!. Hasil penenluan resislensi antibiolik lllellllluukkati
media seleksi hasil konjugasi adalah media MEK yang mellgandung rifatnpisin 100 J.ig/ml dan kauamisin
250 J.ig/1Il!'
Konjugasi liga tetua telall bcrhasil dilaknkau pada B. japonicum dan E. coli dengan freknensi
konjugasi bcrkisar antara 0.18 x 10.7 sarnpai dengan 1.27 x 10-6 per resipien. Freknensi konjugasi
tertinggi ditunjukkan oleh B. japoniculII galur 45 serumgkan terendah oleh 09. Esei nukleasi es semua
koloni ekskonjugan dari elllpat galur uji (05, 09, 15, 38) meuunjukkan hasil positif, sedangkan 2 galur uji
lainnya (32 dan 45) menunjukkan jumiah ekskonjugan masing-masing 40% dan 60%. Sementara itu
koloni taIlllP I juga digurtakau sebagai inokulau pada tauatnan siratro. Jwnlah bintil akar yang terbcntnk
diketaIllli tidak bcrkaitan dengau kentampuau membentuk nukleasi es. Suspensi bintil akar (bakteroid)
seluruh ekskonjugan marnpu twnbuh pada media MEK + MK+ Rif, sementara pada media seleksi MEK +
MK + Rif + Kau hanya 6 ekskonjugan. Esei kualilalif nukleasi es bakteroid menyatakau bahwa galur
ekskonjugan 09.1 dan 15.5 menunjukkan hasil positif.
Koloni taltap II merupakau koloni B. japonicum asal bakteroid yang ditumbultkan pada media seleksi.
Esei kualilalif Ilukleasi es koloni ta1tap II lllenwuukkan hanya galur ekskOluugan 09.1 dengan hasil posilif.
Dengan denrikia.tl galur 09.1 lIlaHlpU mengekspresikau gen inaZ pada fase sel dati bakleroid, kolmu laltap I
dan II.
SUMMARY
F ARlDA AlUYANI. Expression of illaZ Gene in Several Bradyrhizobilll1l japolliclll1l Acid-AI
Tolerant Stmins. Supen·ised by TEDJA llvlAS and AlUS TRI WAHYUDI.
Acid-AI toienM slrains of Bradyrhizvbilllll japvlliclim have been obtained and tile next slep is to
provide a genetical marker to follow lhe fate of B. japulliwlII Acid-AItolenmt stmillS as inoculum in tileir
new environment. inaZ gene is k.tlO\\1l as lhe molecular marker frequently used. The gene transfer Lo
another gralllnegativc bacteria such as B. japuniclillI needs plasmid pRK2013 (Escherichia cvli HBIOI)
as helper and pJLl703 (E. cvli DH5u) as donor. Such cOluugation is called tilTee parental mating.
TIle objective of this research is to study the expression of inaZ gene in several B. japol1iclim acid-AI
strdins in free living and bacteroid slage. TIle test Strdins (OS, 09, 15,32,38, and 45) grew well in Yeast
Manitol Agar (YlvlA) supplemented with 100 J-lgiml Rifampicin wltile E. coli in Luria Agar (LA) Witil 250
ｾｧＯｬ＠
KllllaJIl)cill. TIle medium for screening lhl! exconjuganl consist ofbuUllhe antibiotics.
TIle conjugation was done well with lrequency about 0.18 x 10-' to 1.27 X 10-6 per recipien_ The
highest frequency shown by stmin 45 and 09 was the lowest. All exconjugant of strdins OS, 09, 15, 38
were able to fonn an ice nucleation while tile otilers 32, 45 showed a part of it such as 40% and 60% each.
TIle roct noduJes fanned were not related witil tile ice nucleation ability. The bacteroid stage of all
exconjugant suspensions were able to grow an )MA + CR+ Rif 100J-lgimJ but on YlvlA + CR + Rif 100
J-lgiml + Kan 250 ftgiml ｏＡｾｹ＠
six of Utem. TIle figure shows out Utat tile inlroduction of inaZ gene was not
completely stable. TIle conclusion of titis study shows timt Strdin 09_1 has the capability to form an ice
nucleation in free living cells as well as at bacteroid stage.
EKSPRESI GEN ;llaZPADA BEBERAPA GALUR
Bradyr";zob;1l11l japOlliCll11l
TOLERAN ASAM-AL
FARIDA ARIYANI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Jurusan Biologi
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKADAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
1998
Judul
EKSPRESI GEN
Inaz
PADA BEBERAPA GALUR
Bradyrhizobium japonicum TOLERAN
ASAM-AL
Nama Mahasiswa
Farida Ariyani
Nomor Pokok
G28.0443
Menyetujui:
Ir. Tedja Imas, MS
Drs. Aris Tri Wahyudi, MSi
Pembimbing I
Pembimbing II
Mengetahui:
Yusuf
ua Jurusan
Tanggal Lulus :
01 SEP 1998
RIWAYAT
mnup
Pcnulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 18 September 1972 sebagai anal< bungsu dari empat
bersaudard. kcluarga Moclullrutllld Badri dan Tali Srutarti.
Penulis menyclesaikan Sekolah Dasar Negeri 03 Pagi pada tahun 1985, kemudian tallun 1988 lulus
dari Sekolah Menengall Pertama Negcri -19. dan tallml 1991 lulus dari Sekola11 Menengall Tillgkat Alas
Ncgeri 39. keliganya berlokasi di Jakarta. Pellulis lulus seleksi masuk!PB melaluijalur Undallgan Seleksi
Masuk !PB pada tahun 1991. Sctahun kCllludian diterima di Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan
lImu Pengetahuan Alam.
Pada lahun ajardll 199-1-1995 dan 1995-1996 penulis menjadi asisten luar biasa Praktikum
Mikrobiologi Dasar. uismnping lllcluaui asistcn luar biasa Praktikulll Mikrobiulogi T,mall paua tahun
ajarau 1995-1996.
KATA PENGANTAR
Sujud puji dan syukur penulis panjalkim ke hadiml Allah SWT alas segala nikmal yang diberikan
sehingga lugas k>lf)a illlliah ini dapal discicsawm. Teriring salmn timl slmlawat kepada Rasulullall SAW
yang lllelllberikml leladan dalalll bersabar di jalml-Nya.
Terima kasih Y'mg sebesar-besamya penulis ucapk>m kepada Ibu Ir. Tedja Imas, MS dan Bapak Drs.
Aris Tri Wall)udi, MSi
｡ｾｬｓ＠
billlbingan dan dorongml yang diberikan selmlm penelitian sampai
penyusunan skripsi.
Ucapan lerima kasih juga dis
Bradyr Itizobilllll japolliclll1l
TOLERAN ASAM-AL
FARlDA ARlYANI
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
1998
RINGKASAN
F ARlDA ARIY ANI. Ekspresi Gen inaZ Bcberapa Galur BradyrhizobiulII japoniclIlII Toleran AsamAl (Expression of illaZ Gene in Sereral BradrrhizobiulII japonicu/Il Acid-AI Toleranl Sirains). Dibimbing
oldl TEDJA IMAS dan ARIS TRI WAHY UD I.
Penclitian lerdahulu yang berlallgsung di Laboraloriwn Mikrubiologi JurUSatl Biologi, F.tv1lPA, IPB,
lelah berhasil menyeleksi beberapa galur Bradyrhizobium japoniclIlII loleratl aSliln-AJ yang diltarapkatl
dapal ditllattfaalkatl sebagai simbion kedelai pada lattah asam. Unluk lelaall kematnpUatl hidup bakleri
lerscbul di lingkwigati alatlU dibulultkatl sualu penatlda yang bersifal slabi!. Gen inaZ merupakatl salall
salu pelUlllda lIIulekuler yang scring digWtakatl dati dapal dipimIaltkatl ke bakleri lain melalui lelunk
kOlUugasi. Gen inaZ lerdapal pada plasnud pJLI703 Escherichia coli DH5u (dunor = D). Pemindallatl
gcn ini ke B. japonicZIIn (rcsipien = R) membutultkan plasmid lain (pRK2013 E. coli HBIOI) yang
bcrtindak sebagai penolong (helper = H). Konjugasi yang demikian dikenal sebagai konjugasi tiga tetua.
Tujuau penelitian ini untnk mempelajari ekspresi gen inaZ pada bcbcrapa galur B. japonicum tolerdll
asam-AJ pada fase sel dan bakteroid.
Penentuau media seleksi dilaknkau dengan menwnbultkan enatn galur uji (OS, 09, 15, 32, 38, dan 45)
B. japonim/ll loleml aSliln-AJ pada media agar Matulol Ekstrak Khalllir (MEK) dati dua galur E. coli pada
media agar Luria (LA) yatlg masing-ntasing dilambalu atltibiolik rifampisill dati kattalluSlll dellgatl
lingkalan konselllrasi berkisar atllard 100-250 J.ig/m!. Hasil penenluan resislensi antibiolik lllellllluukkati
media seleksi hasil konjugasi adalah media MEK yang mellgandung rifatnpisin 100 J.ig/ml dan kauamisin
250 J.ig/1Il!'
Konjugasi liga tetua telall bcrhasil dilaknkau pada B. japonicum dan E. coli dengan freknensi
konjugasi bcrkisar antara 0.18 x 10.7 sarnpai dengan 1.27 x 10-6 per resipien. Freknensi konjugasi
tertinggi ditunjukkan oleh B. japoniculII galur 45 serumgkan terendah oleh 09. Esei nukleasi es semua
koloni ekskonjugan dari elllpat galur uji (05, 09, 15, 38) meuunjukkan hasil positif, sedangkan 2 galur uji
lainnya (32 dan 45) menunjukkan jumiah ekskonjugan masing-masing 40% dan 60%. Sementara itu
koloni taIlllP I juga digurtakau sebagai inokulau pada tauatnan siratro. Jwnlah bintil akar yang terbcntnk
diketaIllli tidak bcrkaitan dengau kentampuau membentuk nukleasi es. Suspensi bintil akar (bakteroid)
seluruh ekskonjugan marnpu twnbuh pada media MEK + MK+ Rif, sementara pada media seleksi MEK +
MK + Rif + Kau hanya 6 ekskonjugan. Esei kualilalif nukleasi es bakteroid menyatakau bahwa galur
ekskonjugan 09.1 dan 15.5 menunjukkan hasil positif.
Koloni taltap II merupakau koloni B. japonicum asal bakteroid yang ditumbultkan pada media seleksi.
Esei kualilalif Ilukleasi es koloni ta1tap II lllenwuukkan hanya galur ekskOluugan 09.1 dengan hasil posilif.
Dengan denrikia.tl galur 09.1 lIlaHlpU mengekspresikau gen inaZ pada fase sel dati bakleroid, kolmu laltap I
dan II.
SUMMARY
F ARlDA AlUYANI. Expression of illaZ Gene in Several Bradyrhizobilll1l japolliclll1l Acid-AI
Tolerant Stmins. Supen·ised by TEDJA llvlAS and AlUS TRI WAHYUDI.
Acid-AI toienM slrains of Bradyrhizvbilllll japvlliclim have been obtained and tile next slep is to
provide a genetical marker to follow lhe fate of B. japulliwlII Acid-AItolenmt stmillS as inoculum in tileir
new environment. inaZ gene is k.tlO\\1l as lhe molecular marker frequently used. The gene transfer Lo
another gralllnegativc bacteria such as B. japuniclillI needs plasmid pRK2013 (Escherichia cvli HBIOI)
as helper and pJLl703 (E. cvli DH5u) as donor. Such cOluugation is called tilTee parental mating.
TIle objective of this research is to study the expression of inaZ gene in several B. japol1iclim acid-AI
strdins in free living and bacteroid slage. TIle test Strdins (OS, 09, 15,32,38, and 45) grew well in Yeast
Manitol Agar (YlvlA) supplemented with 100 J-lgiml Rifampicin wltile E. coli in Luria Agar (LA) Witil 250
ｾｧＯｬ＠
KllllaJIl)cill. TIle medium for screening lhl! exconjuganl consist ofbuUllhe antibiotics.
TIle conjugation was done well with lrequency about 0.18 x 10-' to 1.27 X 10-6 per recipien_ The
highest frequency shown by stmin 45 and 09 was the lowest. All exconjugant of strdins OS, 09, 15, 38
were able to fonn an ice nucleation while tile otilers 32, 45 showed a part of it such as 40% and 60% each.
TIle roct noduJes fanned were not related witil tile ice nucleation ability. The bacteroid stage of all
exconjugant suspensions were able to grow an )MA + CR+ Rif 100J-lgimJ but on YlvlA + CR + Rif 100
J-lgiml + Kan 250 ftgiml ｏＡｾｹ＠
six of Utem. TIle figure shows out Utat tile inlroduction of inaZ gene was not
completely stable. TIle conclusion of titis study shows timt Strdin 09_1 has the capability to form an ice
nucleation in free living cells as well as at bacteroid stage.
EKSPRESI GEN ;llaZPADA BEBERAPA GALUR
Bradyr";zob;1l11l japOlliCll11l
TOLERAN ASAM-AL
FARIDA ARIYANI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Jurusan Biologi
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKADAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
1998
Judul
EKSPRESI GEN
Inaz
PADA BEBERAPA GALUR
Bradyrhizobium japonicum TOLERAN
ASAM-AL
Nama Mahasiswa
Farida Ariyani
Nomor Pokok
G28.0443
Menyetujui:
Ir. Tedja Imas, MS
Drs. Aris Tri Wahyudi, MSi
Pembimbing I
Pembimbing II
Mengetahui:
Yusuf
ua Jurusan
Tanggal Lulus :
01 SEP 1998
RIWAYAT
mnup
Pcnulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 18 September 1972 sebagai anal< bungsu dari empat
bersaudard. kcluarga Moclullrutllld Badri dan Tali Srutarti.
Penulis menyclesaikan Sekolah Dasar Negeri 03 Pagi pada tahun 1985, kemudian tallun 1988 lulus
dari Sekolah Menengall Pertama Negcri -19. dan tallml 1991 lulus dari Sekola11 Menengall Tillgkat Alas
Ncgeri 39. keliganya berlokasi di Jakarta. Pellulis lulus seleksi masuk!PB melaluijalur Undallgan Seleksi
Masuk !PB pada tahun 1991. Sctahun kCllludian diterima di Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan
lImu Pengetahuan Alam.
Pada lahun ajardll 199-1-1995 dan 1995-1996 penulis menjadi asisten luar biasa Praktikum
Mikrobiologi Dasar. uismnping lllcluaui asistcn luar biasa Praktikulll Mikrobiulogi T,mall paua tahun
ajarau 1995-1996.
KATA PENGANTAR
Sujud puji dan syukur penulis panjalkim ke hadiml Allah SWT alas segala nikmal yang diberikan
sehingga lugas k>lf)a illlliah ini dapal discicsawm. Teriring salmn timl slmlawat kepada Rasulullall SAW
yang lllelllberikml leladan dalalll bersabar di jalml-Nya.
Terima kasih Y'mg sebesar-besamya penulis ucapk>m kepada Ibu Ir. Tedja Imas, MS dan Bapak Drs.
Aris Tri Wall)udi, MSi
｡ｾｬｓ＠
billlbingan dan dorongml yang diberikan selmlm penelitian sampai
penyusunan skripsi.
Ucapan lerima kasih juga dis