Inokulan Bradyrhizobium japonicum Toleran Asam-Al : Uji Viabilitas dan Efektivitas Simbiotik Terhadap Tanaman Kedelai.
INOKUL
LAN Bradyyrhizobium
m japonicu
um TOLERAN ASA
AM-Al :
UJII VIABILIITAS DAN
N EFEKT
TIVITAS S
SIMBIOTIIK
TERH
HADAP T
TANAMA
AN KEDELAI
LENNY
Y HANDA
AYANI
SE
EKOLAH
H PASCAS
SARJANA
A
INS
STITUT PERTANIA
AN BOGO
OR
BOGOR
2009
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Inokulan Bradyrhizobium
japonicum Toleran Asam-Aluminium : Uji Viabilitas dan Efektivitas
Simbiotik terhadap Tanaman Kedelai adalah karya saya sendiri dengan arahan
komisi pembimbing dan belum pernah diajukan kepada perguruan tinggi manapun.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam daftar pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Juli 2009
Lenny Handayani
NRP G3510701
ABSTRACT
LENNY HANDAYANI. Inoculant of Acid-Aluminium Tolerant Bradyrhizobium
japonicum : Viability Test and Symbiotic Effectivity Evaluation on Soybean.
Under direction of NISA RACHMANIA MUBARIK and ARIS TRI
WAHYUDI.
Acid soil is limiting factor of growth and production of soybean. Soil acidity
directly can inhibit the growth of soybean and root-nodule bacterium
Bradyrhizobium. This research was aimed to test viability strains of acidaluminium tolerant Bradyrhizobium japonicum after a period of storages (1, 2,
and 3 months) both at room (± 25 ºC) and 10 ºC temperature, and test its
symbiotic effectivity on soybean. Inoculant of B. japonicum wild type Bj 11 (wt),
and its mutants Bj 11 (5) and Bj 11 (19), were tested by using steril peat as carrier.
The experiments was designed as factorial randomized completely design with
three factors. Result of viability test showed that there were an interaction
between strain types, temperature, and a period of storage. Inoculant of Bj 11 (19)
stored at temperature 10 ºC for 2 months showed the highest viability at 2,5 x 108
cell/g inoculant. Inoculant of Bj 11 (5) had the highest result for plant height,
shoot dry weight, symbiotic effectivity, and N-content before storage. Inoculant of
Bj 11 (19) showed the highest result after storage 2 months at room temperature
and temperature 10 ºC. The research showed that mutant strain of acid-Al tolerant
B. japonicum Bj 11 (19) had better viability and higher symbiotic effectivity than
wild-type strain.
Key words : acid-Al tolerant Bradyrhizobium japonicum, cell viability, symbiotic
effectivity, soybean.
RINGKASAN
LENNY HANDAYANI. Inokulan Bradyrhizobium japonicum Toleran Asam-Al :
Uji Viabilitas dan Efektivitas Simbiotik Terhadap Tanaman Kedelai. Dibimbing
oleh NISA RACHMANIA MUBARIK and ARIS TRI WAHYUDI.
Salah satu cara untuk meningkatkan produksi tanaman kedelai di tanah pH
asam (pH 4,0 – 5,0) yaitu menggunakan galur inokulan toleran asam beserta
inangnya. Bradyrhizobium merupakan bakteri tumbuh lambat yang toleran pada
kondisi asam. Beberapa penelitian sebelumnya telah menyeleksi galur B.
japonicum toleran media asam-aluminium dan telah mengkonstruksi mutan B.
japonicum toleran asam-aluminium melalui mutagenesis dengan transposon.
Penelitian ini bertujuan untuk menguji viabilitas inokulan beberapa galur B.
japonicum toleran asam-aluminium dengan menggunakan bahan pembawa
gambut steril yang disimpan selama 1, 2, dan 3 bulan pada suhu ruang (± 25 ºC)
dan suhu 10 ºC serta menguji efektivitas simbiotik inokulan terhadap tanaman
kedelai varietas Slamet sebelum dan setelah beberapa masa penyimpanan.
Peremajaan B. japonicum dilakukan dengan cara menginokulasikan satu lup
dari biakan stok ke dalam media Yeast Mannitol Agar (YMA) yang ditambah
merah kongo 0,0025% dan antibiotik rifampisin 50 µg/ml dengan metode kuadran,
diinkubasi di tempat gelap pada suhu ruang selama 5-7 hari. Satu koloni tunggal
digoreskan pada media agar-agar miring YMA tanpa penambahan merah kongo.
Kultur B. japonicum cair diproduksi pada medium YMB yang diinkubasi
selama 7 hari di atas mesin penggoyang 120 rpm pada suhu ruang. Gambut steril
digunakan sebagai pembawa inokulan B. japonicum dalam pembuatan inokulan
padat. Inokulan disimpan pada dua suhu yang berbeda yaitu pada suhu ruang (±
25 ºC) dan suhu 10 ºC selama 1, 2, dan 3 bulan.
Pengujian viabilitas inokulan dilakukan setiap bulan selama penyimpanan 1,
2, dan 3 bulan, dengan metode hitungan cawan. Parameter yang diamati ialah
jumlah koloni yang tumbuh pada medium YMA.
Pengujian efektivitas simbiotik dilakukan sebelum penyimpanan dan setelah
penyimpanan. Pengujian ini dilakukan di rumah kaca menggunakan Rancangan
Acak Lengkap dengan sepuluh perlakuan termasuk dua jenis kontrol yaitu kontrol
N (kontrol dengan pemberian KNO3) dan kontrol N0 (kontrol tanpa KNO3).
Setiap perlakuan diulang tiga kali.
Parameter yang diukur ialah jumlah bintil, bobot kering bintil, bobot kering
tanaman bagian atas, efektivitas simbiotik, kandungan N total tajuk tanaman,
aktivitas nitrogenase, jumlah polong, jumlah biji, dan bobot biji per tanaman. Data
dianalisis menggunakan program SAS ver 9.1, uji lanjut dengan Duncan Multiple
Range Test (DMRT) pada taraf kepercayaan 95%. Analisis data hasil uji viabilitas
dengan rancangan acak lengkap faktorial in time, hasil uji efektivitas simbiotik
dengan rancangan acak lengkap faktorial.
Hasil penelitian uji viabilitas diperoleh bahwa Bj 11 (19) menunjukkan
peningkatan jumlah sel dari 107 sel/g inokulan menjadi 108 sel/g inokulan dan
jumlah sel Bj 11 (19) relatif stabil selama 3 bulan penyimpanan pada dua suhu
yang berbeda. Bj 11 (5) dan Bj 11 (wt) keduanya menunjukkan penurunan jumlah
sel dari 109 sel/g inokulan menjadi 107 sel/g inokulan. Jumlah sel tertinggi yang
diperoleh yaitu galur Bj 11 (19) masa penyimpanan 2 bulan pada suhu 10 ºC
sebesar 2,5 x 108 sel/g inokulan, sedangkan jumlah sel terendah ditunjukkan oleh
galur Bj 11 (5) masa penyimpanan 2 bulan pada suhu ruang (± 25 ºC) sebesar 2,8
x 107 sel/g inokulan.
Semua galur B. japonicum yang diinokulasikan pada tanaman kedelai
varietas Slamet mampu menginfeksi dan membentuk bintil akar pada kondisi
cekaman asam-Al.
Efektivitas simbiotik sebelum penyimpanan menunjukkan bahwa Bj 11 (5)
adalah yang terbaik demikian pula setelah penyimpanan 1 bulan. Namun setelah
penyimpanan 2 bulan menunjukkan bahwa Bj 11 (19) memberikan hasil terbaik.
Hal ini mengindikasikan bahwa walaupun Bj 11 (5) memiliki kemampuan
nodulasi yang baik namun tidak dapat disimpan lama sehingga bila disimpan
dalam waktu yang lama maka kemampuan nodulasinya akan menurun. Hal
sebaliknya terjadi pada Bj 11 (19), kemampuan nodulasinya selama penyimpanan
tetap baik.
Analisis korelasi antara beberapa parameter hasil inokulasi B. japonicum
baik sebelum penyimpanan, setelah penyimpanan 1 bulan maupun setelah
penyimpanan 2 bulan semuanya menunjukkan bahwa korelasi antara parameter
bobot kering tanaman bagian atas dengan efektivitas simbiotik nilai korelasinya
tergolong kuat sampai korelasi yang sangat kuat.
Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa jumlah sel B. japonicum
dapat berkurang atau bertambah dengan semakin lamanya masa penyimpanan
yang dipengaruhi oleh suhu dan jenis galur. Ada interaksi antara jenis galur
inokulan dan suhu penyimpanan. Suhu 10 ºC cenderung lebih baik untuk
mempertahankan viabilitas sel.
Galur mutan memiliki viabilitas dan efektivitas simbiotik yang lebih baik
dibandingkan tipe liarnya. Bj 11 (19) merupakan galur pilihan untuk dijadikan
pupuk hayati karena memiliki viabilitas dan efektivitas simbiotik tertinggi setelah
penyimpanan.
Kata kunci : Bradyrhizobium japonicum, toleran asam-aluminium, viabilitas,
efektivitas simbiotik, kedelai.
@ Hak Cipta milik IPB, tahun 2009
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan
pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan
kritik atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan
kepentingan yang wajar IPB.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB.
INOKULAN Bradyrhizobium japonicum TOLERAN ASAM-Al :
UJI VIABILITAS DAN EFEKTIVITAS SIMBIOTIK
TERHADAP TANAMAN KEDELAI
LENNY HANDAYANI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister sains pada
Mayor Mikrobiologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
Judul Tesis
Nama
NRP
: Inokulan Bradyrhizobium japonicum Toleran Asam-Al : Uji
Viabilitas dan Efektivitas Simbiotik Terhadap Tanaman
Kedelai.
: Lenny Handayani
: G351070181
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M. Si.
Ketua
Dr. Aris Tri Wahyudi, M. Si.
Anggota
Diketahui
Ketua Mayor Mikrobiologi
Dr. Ir. Gayuh Rahayu
Tanggal Ujian: 10 Agustus 2009
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S.
Tanggal Lulus: 26 Agustus 2009
Penguji Luar Komisi: Dr. Miftahuddin, M.Si
PRAKATA
Alhamdulillah, puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas
segala karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah (tesis)
dengan judul Inokulan Bradyrhizobium japonicum Toleran Asam-Al : Uji
Viabilitas dan Efektivitas Simbiotik Terhadap Tanaman Kedelai. Penelitian ini
didanai oleh Departemen Agama RI dan Program Insentif Ristek Terapan
Kementrian Negara Riset dan Teknologi tahun 2009.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dr. Nisa Rachmania
Mubarik, M.Si dan Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si selaku pembimbing atas
kesediaan dan kesabarannya memberi bimbingan selama penelitian hingga
penulisan tesis ini. Ucapan terima kasih disampaikan pula kepada Dr. Miftahuddin,
M.Si sebagai dosen penguji atas saran dan masukan yang diberikan. Terima kasih
penulis sampaikan kepada Departemen Agama RI yang telah memberikan
beasiswa untuk melanjutkan studi S2 di Sekolah Pascasarjana IPB melalui
Program Peningkatan Mutu Guru Madrasah.
Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Bapak dan Ibu
pengelola Laboratorium Mikrobiologi dan Rumah Kaca Departemen Biologi
FMIPA IPB atas segala bantuan yang diberikan selama penelitian ini dilakukan
dari bulan Oktober 2008 sampai Mei 2009.
Pada kesempatan ini penulis menyampaikan rasa terima kasih yang sangat
tulus kepada orang tua, suami tercinta, dan seluruh keluarga atas doa, motivasi,
dan keikhlasan mereka untuk ditinggalkan selama penulis menempuh pendidikan
di IPB.
Penulis berharap semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.
Bogor, Juli 2009
Lenny Handayani
INOKUL
LAN Bradyyrhizobium
m japonicu
um TOLERAN ASA
AM-Al :
UJII VIABILIITAS DAN
N EFEKT
TIVITAS S
SIMBIOTIIK
TERH
HADAP T
TANAMA
AN KEDELAI
LENNY
Y HANDA
AYANI
SE
EKOLAH
H PASCAS
SARJANA
A
INS
STITUT PERTANIA
AN BOGO
OR
BOGOR
2009
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Inokulan Bradyrhizobium
japonicum Toleran Asam-Aluminium : Uji Viabilitas dan Efektivitas
Simbiotik terhadap Tanaman Kedelai adalah karya saya sendiri dengan arahan
komisi pembimbing dan belum pernah diajukan kepada perguruan tinggi manapun.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam daftar pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Juli 2009
Lenny Handayani
NRP G3510701
ABSTRACT
LENNY HANDAYANI. Inoculant of Acid-Aluminium Tolerant Bradyrhizobium
japonicum : Viability Test and Symbiotic Effectivity Evaluation on Soybean.
Under direction of NISA RACHMANIA MUBARIK and ARIS TRI
WAHYUDI.
Acid soil is limiting factor of growth and production of soybean. Soil acidity
directly can inhibit the growth of soybean and root-nodule bacterium
Bradyrhizobium. This research was aimed to test viability strains of acidaluminium tolerant Bradyrhizobium japonicum after a period of storages (1, 2,
and 3 months) both at room (± 25 ºC) and 10 ºC temperature, and test its
symbiotic effectivity on soybean. Inoculant of B. japonicum wild type Bj 11 (wt),
and its mutants Bj 11 (5) and Bj 11 (19), were tested by using steril peat as carrier.
The experiments was designed as factorial randomized completely design with
three factors. Result of viability test showed that there were an interaction
between strain types, temperature, and a period of storage. Inoculant of Bj 11 (19)
stored at temperature 10 ºC for 2 months showed the highest viability at 2,5 x 108
cell/g inoculant. Inoculant of Bj 11 (5) had the highest result for plant height,
shoot dry weight, symbiotic effectivity, and N-content before storage. Inoculant of
Bj 11 (19) showed the highest result after storage 2 months at room temperature
and temperature 10 ºC. The research showed that mutant strain of acid-Al tolerant
B. japonicum Bj 11 (19) had better viability and higher symbiotic effectivity than
wild-type strain.
Key words : acid-Al tolerant Bradyrhizobium japonicum, cell viability, symbiotic
effectivity, soybean.
RINGKASAN
LENNY HANDAYANI. Inokulan Bradyrhizobium japonicum Toleran Asam-Al :
Uji Viabilitas dan Efektivitas Simbiotik Terhadap Tanaman Kedelai. Dibimbing
oleh NISA RACHMANIA MUBARIK and ARIS TRI WAHYUDI.
Salah satu cara untuk meningkatkan produksi tanaman kedelai di tanah pH
asam (pH 4,0 – 5,0) yaitu menggunakan galur inokulan toleran asam beserta
inangnya. Bradyrhizobium merupakan bakteri tumbuh lambat yang toleran pada
kondisi asam. Beberapa penelitian sebelumnya telah menyeleksi galur B.
japonicum toleran media asam-aluminium dan telah mengkonstruksi mutan B.
japonicum toleran asam-aluminium melalui mutagenesis dengan transposon.
Penelitian ini bertujuan untuk menguji viabilitas inokulan beberapa galur B.
japonicum toleran asam-aluminium dengan menggunakan bahan pembawa
gambut steril yang disimpan selama 1, 2, dan 3 bulan pada suhu ruang (± 25 ºC)
dan suhu 10 ºC serta menguji efektivitas simbiotik inokulan terhadap tanaman
kedelai varietas Slamet sebelum dan setelah beberapa masa penyimpanan.
Peremajaan B. japonicum dilakukan dengan cara menginokulasikan satu lup
dari biakan stok ke dalam media Yeast Mannitol Agar (YMA) yang ditambah
merah kongo 0,0025% dan antibiotik rifampisin 50 µg/ml dengan metode kuadran,
diinkubasi di tempat gelap pada suhu ruang selama 5-7 hari. Satu koloni tunggal
digoreskan pada media agar-agar miring YMA tanpa penambahan merah kongo.
Kultur B. japonicum cair diproduksi pada medium YMB yang diinkubasi
selama 7 hari di atas mesin penggoyang 120 rpm pada suhu ruang. Gambut steril
digunakan sebagai pembawa inokulan B. japonicum dalam pembuatan inokulan
padat. Inokulan disimpan pada dua suhu yang berbeda yaitu pada suhu ruang (±
25 ºC) dan suhu 10 ºC selama 1, 2, dan 3 bulan.
Pengujian viabilitas inokulan dilakukan setiap bulan selama penyimpanan 1,
2, dan 3 bulan, dengan metode hitungan cawan. Parameter yang diamati ialah
jumlah koloni yang tumbuh pada medium YMA.
Pengujian efektivitas simbiotik dilakukan sebelum penyimpanan dan setelah
penyimpanan. Pengujian ini dilakukan di rumah kaca menggunakan Rancangan
Acak Lengkap dengan sepuluh perlakuan termasuk dua jenis kontrol yaitu kontrol
N (kontrol dengan pemberian KNO3) dan kontrol N0 (kontrol tanpa KNO3).
Setiap perlakuan diulang tiga kali.
Parameter yang diukur ialah jumlah bintil, bobot kering bintil, bobot kering
tanaman bagian atas, efektivitas simbiotik, kandungan N total tajuk tanaman,
aktivitas nitrogenase, jumlah polong, jumlah biji, dan bobot biji per tanaman. Data
dianalisis menggunakan program SAS ver 9.1, uji lanjut dengan Duncan Multiple
Range Test (DMRT) pada taraf kepercayaan 95%. Analisis data hasil uji viabilitas
dengan rancangan acak lengkap faktorial in time, hasil uji efektivitas simbiotik
dengan rancangan acak lengkap faktorial.
Hasil penelitian uji viabilitas diperoleh bahwa Bj 11 (19) menunjukkan
peningkatan jumlah sel dari 107 sel/g inokulan menjadi 108 sel/g inokulan dan
jumlah sel Bj 11 (19) relatif stabil selama 3 bulan penyimpanan pada dua suhu
yang berbeda. Bj 11 (5) dan Bj 11 (wt) keduanya menunjukkan penurunan jumlah
sel dari 109 sel/g inokulan menjadi 107 sel/g inokulan. Jumlah sel tertinggi yang
diperoleh yaitu galur Bj 11 (19) masa penyimpanan 2 bulan pada suhu 10 ºC
sebesar 2,5 x 108 sel/g inokulan, sedangkan jumlah sel terendah ditunjukkan oleh
galur Bj 11 (5) masa penyimpanan 2 bulan pada suhu ruang (± 25 ºC) sebesar 2,8
x 107 sel/g inokulan.
Semua galur B. japonicum yang diinokulasikan pada tanaman kedelai
varietas Slamet mampu menginfeksi dan membentuk bintil akar pada kondisi
cekaman asam-Al.
Efektivitas simbiotik sebelum penyimpanan menunjukkan bahwa Bj 11 (5)
adalah yang terbaik demikian pula setelah penyimpanan 1 bulan. Namun setelah
penyimpanan 2 bulan menunjukkan bahwa Bj 11 (19) memberikan hasil terbaik.
Hal ini mengindikasikan bahwa walaupun Bj 11 (5) memiliki kemampuan
nodulasi yang baik namun tidak dapat disimpan lama sehingga bila disimpan
dalam waktu yang lama maka kemampuan nodulasinya akan menurun. Hal
sebaliknya terjadi pada Bj 11 (19), kemampuan nodulasinya selama penyimpanan
tetap baik.
Analisis korelasi antara beberapa parameter hasil inokulasi B. japonicum
baik sebelum penyimpanan, setelah penyimpanan 1 bulan maupun setelah
penyimpanan 2 bulan semuanya menunjukkan bahwa korelasi antara parameter
bobot kering tanaman bagian atas dengan efektivitas simbiotik nilai korelasinya
tergolong kuat sampai korelasi yang sangat kuat.
Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa jumlah sel B. japonicum
dapat berkurang atau bertambah dengan semakin lamanya masa penyimpanan
yang dipengaruhi oleh suhu dan jenis galur. Ada interaksi antara jenis galur
inokulan dan suhu penyimpanan. Suhu 10 ºC cenderung lebih baik untuk
mempertahankan viabilitas sel.
Galur mutan memiliki viabilitas dan efektivitas simbiotik yang lebih baik
dibandingkan tipe liarnya. Bj 11 (19) merupakan galur pilihan untuk dijadikan
pupuk hayati karena memiliki viabilitas dan efektivitas simbiotik tertinggi setelah
penyimpanan.
Kata kunci : Bradyrhizobium japonicum, toleran asam-aluminium, viabilitas,
efektivitas simbiotik, kedelai.
@ Hak Cipta milik IPB, tahun 2009
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan
pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan
kritik atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan
kepentingan yang wajar IPB.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB.
INOKULAN Bradyrhizobium japonicum TOLERAN ASAM-Al :
UJI VIABILITAS DAN EFEKTIVITAS SIMBIOTIK
TERHADAP TANAMAN KEDELAI
LENNY HANDAYANI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister sains pada
Mayor Mikrobiologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
Judul Tesis
Nama
NRP
: Inokulan Bradyrhizobium japonicum Toleran Asam-Al : Uji
Viabilitas dan Efektivitas Simbiotik Terhadap Tanaman
Kedelai.
: Lenny Handayani
: G351070181
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M. Si.
Ketua
Dr. Aris Tri Wahyudi, M. Si.
Anggota
Diketahui
Ketua Mayor Mikrobiologi
Dr. Ir. Gayuh Rahayu
Tanggal Ujian: 10 Agustus 2009
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S.
Tanggal Lulus: 26 Agustus 2009
Penguji Luar Komisi: Dr. Miftahuddin, M.Si
PRAKATA
Alhamdulillah, puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas
segala karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah (tesis)
dengan judul Inokulan Bradyrhizobium japonicum Toleran Asam-Al : Uji
Viabilitas dan Efektivitas Simbiotik Terhadap Tanaman Kedelai. Penelitian ini
didanai oleh Departemen Agama RI dan Program Insentif Ristek Terapan
Kementrian Negara Riset dan Teknologi tahun 2009.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dr. Nisa Rachmania
Mubarik, M.Si dan Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si selaku pembimbing atas
kesediaan dan kesabarannya memberi bimbingan selama penelitian hingga
penulisan tesis ini. Ucapan terima kasih disampaikan pula kepada Dr. Miftahuddin,
M.Si sebagai dosen penguji atas saran dan masukan yang diberikan. Terima kasih
penulis sampaikan kepada Departemen Agama RI yang telah memberikan
beasiswa untuk melanjutkan studi S2 di Sekolah Pascasarjana IPB melalui
Program Peningkatan Mutu Guru Madrasah.
Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Bapak dan Ibu
pengelola Laboratorium Mikrobiologi dan Rumah Kaca Departemen Biologi
FMIPA IPB atas segala bantuan yang diberikan selama penelitian ini dilakukan
dari bulan Oktober 2008 sampai Mei 2009.
Pada kesempatan ini penulis menyampaikan rasa terima kasih yang sangat
tulus kepada orang tua, suami tercinta, dan seluruh keluarga atas doa, motivasi,
dan keikhlasan mereka untuk ditinggalkan selama penulis menempuh pendidikan
di IPB.
Penulis berharap semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.
Bogor, Juli 2009
Lenny Handayani
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Ujung Pandang pada tanggal 26 Agustus 1970 dari
ayah M. Yusri dan ibu Hj. Suarci. Tahun 1988 penulis lulus dari SMA Negeri 2
Ujung Pandang. Pendidikan tinggi ditempuh di Universitas Hasanuddin Jurusan
Biologi Fakultas MIPA lulus tahun 1995.
Tahun 1998 penulis bekerja sebagai guru biologi di SMU Insan Cendekia
Gorontalo. Sejak tahun 2002 sampai sekarang penulis bekerja sebagai guru
biologi pada Madrasah Aliyah Negeri Insan Cendekia Gorontalo.
Pada tahun 2007 penulis mendapat kesempatan untuk melanjutkan studi
pada Sekolah Pascasarjana IPB melalui Program Beasiswa Peningkatan Mutu
Guru Madrasah dari Departemen Agama Republik Indonesia. Selama studi S2
penulis berkesempatan menyampaikan sebagian hasil penelitian ini secara lisan
pada Seminar Nasional Biologi di Universitas Pendidikan Indonesia Bandung
pada bulan Juli 2009.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL .............................................................................................. xi
DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xii
PENDAHULUAN
Latar Belakang ..........................................................................................
Tujuan Penelitian ......................................................................................
1
2
TINJAUAN PUSTAKA
Bakteri Bintil Akar ...................................................................................
Proses Pembentukan Bintil Akar ..............................................................
Faktor-faktor yang Mempengaruhi Pembentukan Bintil Akar .................
Penambatan Nitrogen ...............................................................................
Efektivitas Simbiotik ................................................................................
Kedelai Toleran Asam ..............................................................................
Bahan Pembawa .......................................................................................
Tanah Asam ..............................................................................................
4
5
5
6
8
8
8
9
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian ...................................................................
Bahan ........................................................................................................
Rancangan Percobaan dan Analisis Data .................................................
Penyiapan Inokulan ...................................................................................
Penyiapan Gambut ....................................................................................
Inokulasi Bakteri Bradyrhizobium japonicum ke dalam Gambut
dan Penyimpanan Inokulan .......................................................................
Uji Viabilitas Inokulan .............................................................................
Inokulasi Bradyrhizobium japonicum pada Biji Kedelai dan
Penanaman pada Rumah Kaca .................................................................
Uji Efektivitas Simbiotik ..........................................................................
Penentuan N Total ....................................................................................
Uji Aktivitas Nitrogenase .........................................................................
11
11
11
12
12
12
13
13
14
14
14
HASIL
Uji Viabilitas.............................................................................................. 16
Uji Efektivitas Simbiotik .......................................................................... 17
PEMBAHASAN
Uji Viabilitas.............................................................................................. 26
Uji Efektivitas Simbiotik .......................................................................... 28
SIMPULAN DAN SARAN ............................................................................... 33
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 34
LAMPIRAN ....................................................................................................... 38
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Viabilitas (sel/g inokulan) dari tiga jenis galur B. japonicum yang
disimpan pada suhu ruang (± 25 ºC) dan suhu 10 ºC, masa penyimpanan
1, 2, dan 3 bulan .......................................................................................... 16
2 Indeks penurunan dan kenaikan jumlah sel dari tiga jenis galur B.
japonicum yang disimpan pada suhu ruang (± 25 ºC) dan suhu 10 ºC,
masa penyimpanan 1, 2, dan 3 bulan ......................................................... 17
3 Pengaruh inokulan B. japonicum sebelum penyimpanan terhadap jumlah
bintil, bobot kering bintil, bobot kering tanaman bagian atas, efektivitas
simbiotik, dan kandungan N total tajuk tanaman kedelai varietas Slamet
umur 45 HSTpada media tanah asam pH 4,8 .............................................. 18
4 Pengaruh inokulan B. japonicum yang telah disimpan selama 1 bulan
pada suhu ruang (± 25 ºC) dan suhu 10 ºC terhadap jumlah bintil, bobot
kering bintil akar, bobot kering tanaman bagian atas, efektivitas simbiotik,
dan kandungan N total tajuk tanaman kedelai varietas Slamet umur 45
HST pada media tanah asam pH 4,8..............................................
20
5 Pengaruh inokulan B. japonicum yang telah disimpan selama 1 bulan dan
2 bulan pada suhu ruang (± 25 ºC) dan suhu 10 ºC terhadap jumlah
polong, jumlah biji, dan bobot biji tanaman kedelai varietas Slamet umur
80 HST pada media tanah asam pH 4,8 ...................................................... 21
6 Pengaruh inokulan B. japonicum yang telah disimpan selama 2 bulan
pada suhu ruang (± 25 ºC) dan suhu 10 ºC terhadap jumlah bintil, bobot
kering bintil akar, bobot kering tanaman bagian atas, efektivitas simbiotik,
dan kandungan N total tajuk tanaman kedelai varietas Slamet umur 45
HST pada media tanah asam pH 4,8..............................................
23
7 Korelasi (r) antara beberapa parameter hasil inokulasi B. japonicum
sebelum penyimpanan terhadap tanaman kedelai varietas Slamet umur
45 HST pada media tanah asam pH 4,8....................................................... 24
8 Korelasi (r) antara beberapa parameter hasil inokulasi B. japonicum yang
telah disimpan selama 1 bulan terhadap tanaman kedelai varietas Slamet
umur 45 HST pada media tanah asam pH 4,8 ............................................ 25
9 Korelasi (r) antara beberapa parameter hasil inokulasi B. japonicum yang
telah disimpan selama 2 bulan terhadap tanaman kedelai varietas Slamet
umur 45 HST pada media tanah asam pH 4,8 ......................................... 25
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Hasil analisis kimia media tanah asam dan gambut yang digunakan.......... 39
2 Komposisi media yeast extract mannitol agar (YMA) dan yeast extract
mannitol broth (YMB) untuk 1000 ml media ....................................... 39
3 (A) koloni Bj 11 (19) setelah penyimpanan 2 bulan suhu 10 ºC pada
media YMA + merah kongo 0,0025% + rifampisin sebanyak 50 µg/ml,
(B) koloni Bj 11 (5) setelah penyimpanan 2 bulan suhu ruang (25 ºC)
pada media YMA + merah kongo 0,0025% + rifampisin sebanyak 50
µg/ml, dan (C) kontrol setelah penyimpanan 2 bulan suhu ruang (25 ºC)
pada media YMA + merah kongo 0,0025% + rifampisin sebanyak 50
µg/ml ............ .............................................................................................. 39
4 Tanaman kedelai varietas Slamet umur 45 HST pada media tanah asam
pH 4,8 yang diinokulasi B. japonicum sebelum penyimpanan . ................ 40
5 Akar tanaman kedelai varietas Slamet umur 45 HST pada media tanah
asam pH 4,8 yang diinokulasi B. japonicum sebelum penyimpanan .....
40
6 Tanaman kedelai varietas Slamet umur 45 HST pada media tanah asam
pH 4,8 yang diinokulasi B. japonicum setelah disimpan selama 1 bulan
pada (A) suhu ruang (± 25 ºC) dan (B) suhu 10 ºC...................................... 41
7 Akar tanaman kedelai varietas Slamet umur 45 HST pada media tanah
asam pH 4,8 yang diinokulasi B. japonicum setelah disimpan selama 1
bulan pada (A) suhu ruang (± 25 ºC) dan (B) suhu 10 ºC .......................... 42
8 Tanaman kedelai varietas Slamet umur 45 HST pada media tanah asam
pH 4,8 yang diinokulasi B. japonicum setelah disimpan selama 2 bulan
pada (A) suhu ruang (± 25 ºC) dan (B) suhu 10 ºC ..................................... 43
9 Akar tanaman kedelai varietas Slamet umur 45 HST pada media tanah
asam pH 4,8 yang diinokulasi B. japonicum setelah disimpan selama 2
bulan pada (A) suhu ruang (± 25 ºC) dan (B) suhu 10 ºC ........................... 44
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kedelai (Glycine max) merupakan salah satu anggota leguminosae yang
mengandung protein tinggi dan banyak dikonsumsi oleh penduduk Indonesia,
namun sampai sekarang produksi kedelai nasional masih rendah, hal ini
menyebabkan impor kedelai masih tinggi. Produksi kedelai nasional berkisar
antara 600-700 ribu ton per tahun, sementara kebutuhan telah mencapai 2 juta ton
pada tahun 2007 (Deptan 2008).
Peningkatan produksi kedelai dapat dilakukan dengan cara meningkatkan
produktivitas dan perluasan areal tanam. Lahan sawah, lahan kering, dan lahan
pasang surut memiliki potensi yang cukup besar dikembangkan untuk perluasan
areal kedelai. Dari segi luas, lahan kering asam paling potensial (Deptan 2008).
Luas total daratan Indonesia sekitar 188,2 juta ha, dan sekitar 148 juta ha di
antaranya merupakan lahan kering. Dari luas lahan kering tersebut, yang berupa
tanah asam seluas 102.817.113 ha (69,4%) dan tanah yang tidak asam seluas
45.256.511 ha. Pengelolaan tanah asam lahan kering menghadapi berbagai
kendala antara lain: rendahnya tingkat kesuburan tanah yang berkaitan dengan pH
rendah, tingginya kadar aluminium (Al), kandungan besi dan mangan yang
mendekati batas meracuni, dan populasi organisme tanah yang rendah (Mulyani et
al. 2004).
Tersedianya nitrogen yang cukup merupakan salah satu kunci keberhasilan
dalam usaha peningkatan produktivitas tanaman kedelai. Pada perkembangan
tanaman legum, sumbangan nitrogen terbesar dihasilkan oleh infeksi akar legum
oleh genus bakteri Rhizobium dan Bradyrhizobium (Robert & Tate 2000).
Salah satu cara untuk mengurangi pengaruh negatif dari pH tanah yang asam
yaitu
menggunakan
galur
inokulan
toleran
asam
beserta
inangnya.
Bradyrhizobium merupakan bakteri tumbuh lambat yang toleran pada kondisi
asam (Silvia et al. 2005 ).
Metode inokulasi dengan menggunakan inokulan Rhizobium merupakan
salah satu penunjang untuk meningkatkan produksi tanaman kacang-kacangan
2
seperti kedelai. Rhizobium yang efektif dapat memenuhi kebutuhan tanaman akan
N sebesar 50-75% (Widawati & Rahayu 1995).
Kualitas inokulan tergantung pada galur dan umumnya diseleksi berdasarkan
keragaman karakteristiknya. Kualitas juga tergantung pada jumlah B. japonicum
yang diinokulasikan. Telah dilaporkan bahwa jumlah sel B. japonicum dapat
berkurang selama penyimpanan dan distribusi (Gomez et al. 1997).
Viabilitas inokulan selama proses penyimpanan dalam jangka waktu tertentu,
agar keberadaannya dapat dipertahankan, diperlukan bahan pembawa yang dapat
berfungsi sebagai sumber energi dan tempat tinggal mikrob (Saraswati 1999).
Produksi dan mutu inokulan Rhizobium di beberapa negara berkembang dibatasi
oleh ketersediaan bahan pembawa (carrier) yang sesuai dan keterbatasan
teknologi (Khavasia et al. 2007). Bahan pembawa yang umum digunakan untuk
Rhizobium ialah gambut (India, Indonesia, dan Kanada), lignit (India), dan arang
(India) (Saraswati 1999). Formulasi dengan menggunakan gambut sebagai bahan
pembawa dominan digunakan karena dapat mempertahankan viabilitas bakteri
bintil akar dan mudah menggunakannya (Date 2001).
Beberapa aspek yang dapat mempengaruhi kualitas kultur di dalam gambut
ialah dapat memberikan ketahanan hidup yang lebih baik dalam bahan pembawa
dan pada biji, tingkat pengeringan, rehidrasi, karakteristik bahan pembawa
termasuk bahan tambahan yang diberikan, dan metode inokulasi (Date 2001).
Endarini et al. (1995) telah menyeleksi galur B. japonicum toleran media
asam-Al. Monasari (2007) telah melakukan konstruksi mutan B. japonicum
toleran asam-Al melalui mutagenesis dengan transposon. Galur yang memiliki
efektivitas simbiotik yang tinggi berhasil diperoleh. Penelitian yang dilakukan
oleh Habibah (2008) berhasil memperoleh galur harapan Bj 11 (19) yang
mempunyai efektivitas simbiotik lebih tinggi dari galur Bj standar USDA 110
dari USA.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan menguji viabilitas inokulan beberapa galur B.
japonicum toleran asam-Al dengan menggunakan bahan pembawa gambut steril
yang disimpan selama 1, 2, dan 3 bulan pada suhu ruang dan suhu 10 ºC, serta
2
menguji efektivitas simbiotik inokulan terhadap tanaman kedelai varietas Slamet
sebelum dan setelah beberapa masa penyimpanan. Dari hasil penelitian ini
diharapkan dapat diperoleh inokulan B. japonicum toleran asam-Al yang memiliki
viabilitas yang baik dan efektivitas simbiotik yang tinggi setelah penyimpanan
untuk diaplikasikan sebagai pupuk hayati, khususnya pada lahan asam yang cukup
luas terdapat di Indonesia.
4
TINJAUAN PUSTAKA
Bakteri Bintil Akar
Legum merupakan suatu kelompok tanaman yang memiliki nilai ekonomi
penting seperti kedelai, semanggi, alfalfa, buncis, dan kacang-kacangan.
Rhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, dan Azorhizobium
adalah bakteri Gram negatif, motil dan berbentuk batang yang dapat bersimbiosis
dengan tanaman legum. Infeksi pada akar tanaman legum oleh salah satu spesies
tersebut dapat membentuk nodul (bintil) pada akar yang dapat mengubah nitrogen
dalam bentuk gas menjadi nitrogen terikat, proses ini dinamakan fiksasi nitrogen
(Madigan & Martinko 2000). Fiksasi nitrogen oleh simbiosis legum-Rhizobium
sangat penting bagi pertanian karena dapat meningkatkan nitrogen terikat di
dalam tanah dengan sangat signifikan.
Kira-kira 90% dari seluruh spesies tanaman legum dapat mengalami
nodulasi. Namun terdapat kespesifikan antara legum dan galur Rhizobium. Suatu
galur Rhizobium umumnya dapat menginfeksi spesies legum tertentu dan tidak
pada spesies lain. Kelompok galur Rhizobium yang dapat menginfeksi kelompok
legum yang berkerabat dinamakan kelompok inokulasi silang. Meskipun galur
Rhizobium mampu menginfeksi legum tertentu, tetapi tidak selalu dapat
menghasilkan bintil yang memfiksasi nitrogen (Madigan & Martinko 2000).
Bradyrhizobium japonicum termasuk dalam grup II Rhizobium yang spesifik
menodulasi kedelai. Grup II Rhizobium tumbuh lambat dan menghasilkan basa
(alkali). Anggota dari kelompok Rhizobium ini memerlukan waktu pertumbuhan
3-5 hari pada medium cair dan rata-rata waktu pembelahan 6-7 jam. Kebanyakan
galur dalam kelompok ini tumbuh dengan baik dengan menggunakan pentosa
sebagai sumber karbon. Sel-selnya berbentuk batang, motil mempunyai flagel
tunggal polar atau subpolar (Somasegaran & Hoben 1995).
Rhizobium sebagian besar bersifat kemoorganotrof aerobik dan mudah
dikultur, tumbuh baik dengan keberadaan oksigen, menggunakan karbohidrat dan
asam amino sederhana. Beberapa galur Rhizobium memerlukan vitamin untuk
pertumbuhannya. Pertumbuhan optimum sebagian besar galur pada suhu 25 –
30 °C dan pH 6-7. Meskipun metabolismenya secara aerobik, beberapa galur
4
dapat tumbuh dengan baik pada keberadaan oksigen yang minim (mikroaerofilik)
(Somasegaran & Hoben 1995).
Proses Pembentukan Bintil Akar
Beberapa tahap infeksi dan perkembangan bintil akar (Madigan & Martinko
2000) yaitu : (1) pengenalan bakteri terhadap bagian tanaman pada inang yang
sesuai dan pelekatan bakteri pada rambut akar, (2) invasi bakteri pada rambut
akar dengan membentuk benang-benang infeksi, (3) perluasan infeksi menuju
akar utama melalui benang infeksi, (4) pembentukan sel-sel bakteri di dalam sel
tanaman yang disebut bakteroid dan berkembang pada tahap fiksasi nitrogen, dan
(5) pembelahan sel tanaman dan bakteri membentuk bintil akar dewasa (matang).
Faktor-faktor yang Mempengaruhi Pembentukan Bintil Akar
Pembentukan bintil akar dan fiksasi nitrogen dipengaruhi oleh beberapa
faktor lingkungan yaitu keasaman, suhu, keberadaan garam mineral, salinitas dan
alkalinitas (Silvia et al. 2005).
Keberhasilan penambatan N di udara oleh Rhizobium tergantung pada
interaksi antara faktor-faktor berikut, yaitu keserasian galur Rhizobium dengan
tanaman inang, kemampuan berkompetesi dengan Rhizobium indigenos,
kemampuan tanaman inang untuk menyediakan nutrisi bagi Rhizobium yang
bersimbiosis dengannya, serta faktor lingkungan terutama faktor pembatas dalam
tanah, seperti pH, suhu, kelembaban tanah, dan ketersediaan hara makro dan
mikro (Saraswati et al. 2003).
Simbiosis Rhizobium-Legum dipengaruhi oleh penurunan pH tanah.
Penurunan pH tanah dapat menimbulkan peningkatan konsentrasi proton,
kelarutan logam seperti aluminium yang bersifat toksik terhadap bakteri bintil
akar. Respon bakteri bintil akar terhadap tanah asam tergantung pada interaksi
sejumlah faktor seperti konsentrasi H+, aktivitas Al3+, dan kemampuan kompetisi
dan persistensi dari galur Rhizobium (Tiwari et al. 1992).
Keasaman tanah secara langsung dapat menghambat pertumbuhan
Rhizobium. Kegagalan nodulasi pada tanah asam tidak hanya disebabkan oleh
menurunnya keberadaan Rhizobium, tetapi pH asam juga mempengaruhi
6
pelekatan Rhizobium pada inangnya. Nodulasi pada beberapa galur diperkirakan
bermasalah pada pH di bawah 5,2 (Silvia et al. 2005).
Pada tingkat keasaman tanah yang berbeda, akan timbul permasalahan
mengenai ketersediaan unsur hara tertentu yang dapat mempengaruhi kehidupan
bakteri Rhizobium maupun tanaman kedelai (Widawati & Rahayu 1995). Kondisi
asam dalam tanah berakibat defisiensi kalsium, magnesium, dan kalium.
Seringkali, keasaman tanah berakibat berkurangnya pengambilan molibdenum
(Rao 1994).
Spesies tanaman mempunyai toleransi yang beragam terhadap aluminium
dan mangan tetapi umumnya tanaman lebih dipengaruhi oleh ion-ion ini daripada
Rhizobium. Beberapa Rhizobium toleran pada 100 µM aluminium dan 300 µM
mangan (Silvia et al. 2005).
Beberapa galur B. japonicum toleran terhadap konsentrasi aluminium yang
cukup tinggi sekitar 50 µM yang dibuktikan dengan kemampuannya tumbuh pada
media Ayanaba (Endarini et al. 1995), tetapi tidak semua rhizobia toleran asam
juga toleran Al tinggi (Keyser & Munns 1979). Kandungan mineral N di atas
tingkat tertentu mempengaruhi infeksi pada rambut akar, jumlah bintil, struktur
bintil, dan jumlah nitrogen yang difiksasi (Rao 1994).
Rentangan suhu yang paling menguntungkan untuk pembentukan jaringan
bakteroid di dalam bintil ialah 20 – 30 ºC. Pembentukan bintil tidak terjadi pada
suhu akar di atas 32 ºC (Rao 1994). Suhu rendah dapat memperlambat proses
nodulasi (Silvia et al. 2005).
Penelitian terhadap pembentukan bintil semanggi menunjukkan bahwa
fotoperiode mempengaruhi pembentukan, ukuran, dan jumlah bintil pada sistem
perakaran. Awal pembentukan bintil pada semanggi tertunda apabila panjang hari
ditambah (Rao 1994).
Penambatan Nitrogen
Penambatan N2 secara simbiotik berkaitan dengan aktivitas enzim
nitrogenase, hidrogenase dan protein leghemoglobin. Nitrogenase merupakan
suatu sistem enzim yang terdapat di dalam bakteroid, berfungsi mengkatalisis
penambatan N2 dan merupakan kompleks yang tersusun atas dua komponen
6
logam-protein yakni MoFe-protein dan Fe-protein. MoFe-protein adalah
komponen I disebut molibdoferedoksin atau dinitrogenase, Fe-protein adalah
komponen II disebut azofereredoksin atau dinitrogenase-reduktase. Kedua
komponen protein dibutuhkan bersama-sama untuk aktivitas katalisis nitrogenase
dan masing-masing tidak aktif bila berdiri sendiri. Nitrogenase membutuhkan
ATP dan reduktor potensial rendah untuk aktivitasnya. Reduktor berasal dari
feredoksin atau flavodoksin (Madigan & Martinko 2000).
Sumber energi penambatan nitrogen pada bakteroid tergantung sepenuhnya
pada fotosintat tanaman inang yang ditranspor melalui membran simbiosom
dalam bentuk produk senyawa antara dari siklus asam trikarboksilat (siklus Krebs)
yaitu asam suksinat, fumarat, dan malat yang merupakan donor elektron untuk
menghasilkan ATP dan mereduksi N2. Asam piruvat merupakan reduktan yang
terlibat langsung sebagai donor elektron dalam sistem nitrogenase (Madigan &
Martinko 2000).
Reaksi penambatan N2 yang terjadi di dalam bakteroid sebagai berikut :
nitrogenase
N2 + 8e + 8H+ + 16 MgATP --------------> 2NH3 + H2 + 16 MgADP + 16 Pi
Enzim nitrogenase menggunakan 16 ATP. Untuk mereduksi satu molekul
N2 menjadi dua molekul NH3 dibutuhkan 12 ATP, 4 ATP selebihnya digunakan
untuk mereduksi H+ menjadi H2. Ion Mg+ yang berikatan dengan ATP dibutuhkan
agar nitrogenase dapat berfungsi. Selain dapat mereduksi ikatan rangkap tiga dari
molekul N2 menjadi amonia, enzim nitrogenase dapat pula mereduksi molekul lain
yang juga memiliki ikatan rangkap tiga seperti asetilen, sianida, nitrat oksida, dan
metil isosianida (Somasegaran & Hoben 1995).
Aktivitas nitrogenase akan terhambat apabila terdapat oksigen, namun
oksigen juga diperlukan dalam respirasi aerob B. japonicum untuk menghasilkan
ATP yang mendukung aktivitas nitrogenase. Adanya leghemoglobin yang
terdapat dalam sitoplasma sel nodul dapat mengendalikan keadaan ini.
Leghemoglobin mampu mengikat O2 dengan cepat sekaligus mengendalikan O2
pada taraf yang tidak mengganggu aktivitas nitrogenase (Madigan & Martinko
2000).
8
Efektivitas Simbiotik
Simbiosis antara tanaman kedelai dengan bakteri simbion dalam penambatan
nitrogen (N2) disebut efektivitas simbiotik. Efektivitas simbiotik diuji dengan
beberapa cara, di antaranya dengan penetapan bobot kering tanaman, kandungan
N total dan aktivitas nitrogenase (Somasegaran & Hoben 1995).
Cara yang paling sederhana dalam menguji efektivitas simbiotik ialah
dengan penetapan bobot kering tanaman. Bobot kering tanaman masih relevan
digunakan untuk mengevaluasi efektivitas suatu galur bakteri bintil akar. Hal ini
karena bobot kering tanaman berkorelasi nyata dengan kandungan N total. Bobot
kering tanaman yang dipakai sebagai parameter untuk mengevaluasi penambatan
N2 ialah tanaman bagian atas karena pada dasarnya 70% hasil penambatan
tanaman ditranslokasikan ke tanaman bagian atas.
Bobot kering tanaman
biasanya sangat berkorelasi dengan bobot kering bintil akar (Somasegaran &
Hoben 1995).
Kedelai Toleran Asam
Kedelai varietas Slamet merupakan hasil persilangan antara varietas Wilis
dan Dempo. Biji varietas ini memiliki kadar lemak 15% dan kandungan protein
34%. Karakteristik varietas ini memiliki tinggi tanaman 65 cm, bunga berwarna
ungu, warna biji kuning, kulit polong masak berwarna coklat, bulu juga berwarna
coklat. Tipe tumbuh determinan, mulai berbunga pada umur 37 hari setelah tanam
dan polong masak pada umur 87 hari setelah tanam. Keunggulan varietas ini
yaitu sesuai untuk tanah asam, tahan rebah, cukup tahan terhadap penyakit karat,
dan produksi di tanah tidak asam dapat mencapai 2,26 ton/ha (Somantri et al.
2003).
Bahan Pembawa
Secara tradisional gambut didefinisikan sama dengan turf yang merupakan
jaringan tanaman yang terkarbonisasi sebagian dan terbentuk pada kondisi basah,
melalui proses dekomposisi berbagai tumbuhan dan lumut-lumutan. Tanah
gambut biasa juga didefinisikan sebagai tanah yang mempunyai bahan organik
lebih dari 65 % (Andriesse 2003).
8
Komposisi kimiawi bahan-bahan gambut dipengaruhi terutama oleh vegetasi
asal, derajat dekomposisi, dan lingkungan kimiawi asal. Kandungan senyawasenyawa yang larut air, terutama polisakarida, gula-gula tunggal (mono-sugar),
dan beberapa tanin biasanya bervariasi di antara 5-10% tergantung pada tahap
dekomposisi. Gambut-gambut hutan tropika mempunyai jumlah lignin serta
derivat lignin yang cukup besar. Nilai sebesar 75% untuk gambut dataran rendah
pesisir Indonesia adalah nilai yang sering terjadi, dan nilai yang sama (56-73%)
ditemukan di Malaysia. Di dalam gambut terdapat juga senyawa organik yang
mengandung nitrogen yang jumlahnya kecil kalau dibandingkan fraksi-fraksi lain,
dan kebanyakan bersifat protein (Andriesse 2003).
Nilai karbon organik sebesar 48 - 50% pada gambut yang terdekomposisi
sedikit (fibrik), 53 - 54% pada gambut yang terdekomposisi sedang (mesik), dan
58 - 60% pada gambut yang sangat terdekomposisi (saprik). Persentase nitrogen
gambut berkisar antara 1,53 – 2,87%. Kandungan nitrogen pada lapisan
permukaan gambut-gambut dalam, umumnya lebih tinggi dibanding pada gambutgambut dangkal. Kandungan fosfor total pada gambut-gambut yang ada di
Indonesia sekitar 0,006%. Beberapa tanah gambut terkenal karena kandungan
belerang yang tinggi (Andriesse 2003).
Tanah Asam
Tanah asam didefenisikan sebagai tanah mineral yang mempunyai reaksi
tanah asam (pH < 5,5) dan nilai kejenuhan basa (KB) < 50%, dan khususnya yang
berada pada lahan kering. Tanah-tanah asam tersebut umumnya termasuk ordo
Ultisol, Oxisol, Spodosol, sebagian Entisol dan Inseptisol yang berkembang di
daerah beriklim basah dengan curah hujan tinggi (Setyorini et al. 2004).
Tanah yang bersifat asam mengandung kation-kation kalsium, magnesium,
kalium atau natrium yang rendah, disebabkan unsur-unsur tersebut dibawa aliran
air ke lapisan tanah yang lebih bawah (pencucian) atau hilang diserap tanaman. Di
Indonesia, pH tanah umumnya berkisar antara 3,0 - 9,0, tetapi untuk daerah rawa
seperti tanah gambut ditemukan pH di bawah 3,0 karena banyak mengandung
asam sulfat (Hafsah 2004).
10
Nilai pH tanah dapat digunakan sebagai indikator kesuburan kimiawi tanah,
karena dapat mencerminkan ketersediaan hara dalam tanah tersebut. Pada pH di
bawah 6,5 dapat terjadi defisiensi P, Ca dan Mg serta toksisitas B, Mn, Cu, Zn,
dan Fe. Sumber utama ion-ion H pada tanah asam sedang – kuat, seperti Ultisol,
berasal dari hidrolisis Al yang menghasilkan pH 4,0 – 5,5 (Hanafiah 2005).
Teknologi pengelolaan lahan kering dengan tanah asam untuk tanaman
pangan dan tanaman perkebunan dapat didekati dari dua aspek : (1) aspek tanah
dan air yang bertujuan memperbaiki lingkungan tumbuh tanaman dengan kondisi
air dan hara yang cukup (pemupukan N, P dan K secara berimbang, pengelolaan
bahan organik, pemberian pupuk hayati dan irigasi suplemen, serta menekan
tingkat kejenuhan Al), serta (2) aspek tanaman yang bertujuan memilih varietasvarietas tanaman yang toleran yang sesuai dengan kondisi biofisik lahan.
Pengembangan varietas tanaman yang toleran terhadap keasaman dapat dilakukan
baik secara alami (pemuliaan tanaman) maupun rekayasa genetika (Setyorini et al.
2004).
Beberapa tanaman pangan memiliki tingkat toleransi/kepekaan yang
berbeda terhadap tingkat keasaman tanah. Tanaman yang memiliki tingkat
kepekaan yang rendah adalah kedelai dan kacang-kacangan lainnya diikuti dengan
jagung serta padi maupun ubi kayu, tanaman tersebut masih mampu berproduksi
dengan baik pada tingkat kejenuhan Al di atas 40%. Berdasarkan hasil penelitian
dari Badan Litbang Pertanian menginformasikan bahwa varietas kedelai unggul
seperti Leuser dan Kawi tergolong agak tahan penyakit karat dan sesuai untuk
dikembangkan pada tanah asam (Hafsah 2004).
10
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian
ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Departemen
Biologi FMIPA IPB dan rumah kaca, pada bulan Oktober 2008 – Mei 2009.
Bahan
Galur yang digunakan ialah dua galur mutan terpilih yaitu Bj 11 (5) dan Bj
11 (19) hasil konstruksi Monasari (2007), satu galur tipe liar Bj 11 (wt) hasil
seleksi Endarini et al. (1995). Biakan tersebut diperoleh dari koleksi biakan
Bagian Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA, IPB. Biji tanaman yang
digunakan ialah biji kedelai varietas Slamet koleksi Pusat Penelitian Bioteknologi
dan Genetika Tanaman Bogor. Gambut diperoleh dari Pusat Penelitian
Bioteknologi Perkebunan Bogor. Tanah asam sebagai media pertumbuhan kedelai
diambil dari Desa Cikabayan, Darmaga, Bogor. Komposisi kimia gambut dan
tanah asam dianalisis di Balai Penelitian Tanah, Bogor (Lampiran 1).
Rancangan Percobaan dan Analisis Data
Rancangan percobaan yang digunakan ialah Rancangan Acak Lengkap
Faktorial. Faktor pertama ialah
3 macam galur ditambah kontrol (tanpa
inokulum), faktor kedua ialah waktu penyimpanan (1, 2, dan 3 bulan), faktor
ketiga ialah suhu ruang tempat penyimpanan inokulum suhu ruang (± 25 ºC) dan
suhu 10 ºC. Data dianalisis menggunakan program SAS ver 9.1, uji lanjut dengan
Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada taraf kepercayaan 95%. Analisis data
hasil uji viabilitas dengan rancangan acak lengkap faktorial in time, parameter
yang diukur ialah banyaknya koloni yang tumbuh. Untuk hasil uji efektivitas
simbiotik dengan rancangan acak lengkap faktorial. Parameter yang diukur berupa
tinggi tanaman, berat kering bintil, berat kering tanaman bagian atas (BKTBA),
efektivitas simbiotik, kandungan N total tanaman, dan aktivitas nitrogenase.
12
Penyiapan Inokulan
Masing-masing galur B. japonicum diremajakan dengan metode kuadran
pada media Yeast Mannitol Agar (YMA) (Lampiran 2) yang ditambah merah
kongo sebanyak 0,0025% dan antibiotik rifampisin sebanyak 50 µg/ml, diinkubasi
di tempat gelap pada
LAN Bradyyrhizobium
m japonicu
um TOLERAN ASA
AM-Al :
UJII VIABILIITAS DAN
N EFEKT
TIVITAS S
SIMBIOTIIK
TERH
HADAP T
TANAMA
AN KEDELAI
LENNY
Y HANDA
AYANI
SE
EKOLAH
H PASCAS
SARJANA
A
INS
STITUT PERTANIA
AN BOGO
OR
BOGOR
2009
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Inokulan Bradyrhizobium
japonicum Toleran Asam-Aluminium : Uji Viabilitas dan Efektivitas
Simbiotik terhadap Tanaman Kedelai adalah karya saya sendiri dengan arahan
komisi pembimbing dan belum pernah diajukan kepada perguruan tinggi manapun.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam daftar pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Juli 2009
Lenny Handayani
NRP G3510701
ABSTRACT
LENNY HANDAYANI. Inoculant of Acid-Aluminium Tolerant Bradyrhizobium
japonicum : Viability Test and Symbiotic Effectivity Evaluation on Soybean.
Under direction of NISA RACHMANIA MUBARIK and ARIS TRI
WAHYUDI.
Acid soil is limiting factor of growth and production of soybean. Soil acidity
directly can inhibit the growth of soybean and root-nodule bacterium
Bradyrhizobium. This research was aimed to test viability strains of acidaluminium tolerant Bradyrhizobium japonicum after a period of storages (1, 2,
and 3 months) both at room (± 25 ºC) and 10 ºC temperature, and test its
symbiotic effectivity on soybean. Inoculant of B. japonicum wild type Bj 11 (wt),
and its mutants Bj 11 (5) and Bj 11 (19), were tested by using steril peat as carrier.
The experiments was designed as factorial randomized completely design with
three factors. Result of viability test showed that there were an interaction
between strain types, temperature, and a period of storage. Inoculant of Bj 11 (19)
stored at temperature 10 ºC for 2 months showed the highest viability at 2,5 x 108
cell/g inoculant. Inoculant of Bj 11 (5) had the highest result for plant height,
shoot dry weight, symbiotic effectivity, and N-content before storage. Inoculant of
Bj 11 (19) showed the highest result after storage 2 months at room temperature
and temperature 10 ºC. The research showed that mutant strain of acid-Al tolerant
B. japonicum Bj 11 (19) had better viability and higher symbiotic effectivity than
wild-type strain.
Key words : acid-Al tolerant Bradyrhizobium japonicum, cell viability, symbiotic
effectivity, soybean.
RINGKASAN
LENNY HANDAYANI. Inokulan Bradyrhizobium japonicum Toleran Asam-Al :
Uji Viabilitas dan Efektivitas Simbiotik Terhadap Tanaman Kedelai. Dibimbing
oleh NISA RACHMANIA MUBARIK and ARIS TRI WAHYUDI.
Salah satu cara untuk meningkatkan produksi tanaman kedelai di tanah pH
asam (pH 4,0 – 5,0) yaitu menggunakan galur inokulan toleran asam beserta
inangnya. Bradyrhizobium merupakan bakteri tumbuh lambat yang toleran pada
kondisi asam. Beberapa penelitian sebelumnya telah menyeleksi galur B.
japonicum toleran media asam-aluminium dan telah mengkonstruksi mutan B.
japonicum toleran asam-aluminium melalui mutagenesis dengan transposon.
Penelitian ini bertujuan untuk menguji viabilitas inokulan beberapa galur B.
japonicum toleran asam-aluminium dengan menggunakan bahan pembawa
gambut steril yang disimpan selama 1, 2, dan 3 bulan pada suhu ruang (± 25 ºC)
dan suhu 10 ºC serta menguji efektivitas simbiotik inokulan terhadap tanaman
kedelai varietas Slamet sebelum dan setelah beberapa masa penyimpanan.
Peremajaan B. japonicum dilakukan dengan cara menginokulasikan satu lup
dari biakan stok ke dalam media Yeast Mannitol Agar (YMA) yang ditambah
merah kongo 0,0025% dan antibiotik rifampisin 50 µg/ml dengan metode kuadran,
diinkubasi di tempat gelap pada suhu ruang selama 5-7 hari. Satu koloni tunggal
digoreskan pada media agar-agar miring YMA tanpa penambahan merah kongo.
Kultur B. japonicum cair diproduksi pada medium YMB yang diinkubasi
selama 7 hari di atas mesin penggoyang 120 rpm pada suhu ruang. Gambut steril
digunakan sebagai pembawa inokulan B. japonicum dalam pembuatan inokulan
padat. Inokulan disimpan pada dua suhu yang berbeda yaitu pada suhu ruang (±
25 ºC) dan suhu 10 ºC selama 1, 2, dan 3 bulan.
Pengujian viabilitas inokulan dilakukan setiap bulan selama penyimpanan 1,
2, dan 3 bulan, dengan metode hitungan cawan. Parameter yang diamati ialah
jumlah koloni yang tumbuh pada medium YMA.
Pengujian efektivitas simbiotik dilakukan sebelum penyimpanan dan setelah
penyimpanan. Pengujian ini dilakukan di rumah kaca menggunakan Rancangan
Acak Lengkap dengan sepuluh perlakuan termasuk dua jenis kontrol yaitu kontrol
N (kontrol dengan pemberian KNO3) dan kontrol N0 (kontrol tanpa KNO3).
Setiap perlakuan diulang tiga kali.
Parameter yang diukur ialah jumlah bintil, bobot kering bintil, bobot kering
tanaman bagian atas, efektivitas simbiotik, kandungan N total tajuk tanaman,
aktivitas nitrogenase, jumlah polong, jumlah biji, dan bobot biji per tanaman. Data
dianalisis menggunakan program SAS ver 9.1, uji lanjut dengan Duncan Multiple
Range Test (DMRT) pada taraf kepercayaan 95%. Analisis data hasil uji viabilitas
dengan rancangan acak lengkap faktorial in time, hasil uji efektivitas simbiotik
dengan rancangan acak lengkap faktorial.
Hasil penelitian uji viabilitas diperoleh bahwa Bj 11 (19) menunjukkan
peningkatan jumlah sel dari 107 sel/g inokulan menjadi 108 sel/g inokulan dan
jumlah sel Bj 11 (19) relatif stabil selama 3 bulan penyimpanan pada dua suhu
yang berbeda. Bj 11 (5) dan Bj 11 (wt) keduanya menunjukkan penurunan jumlah
sel dari 109 sel/g inokulan menjadi 107 sel/g inokulan. Jumlah sel tertinggi yang
diperoleh yaitu galur Bj 11 (19) masa penyimpanan 2 bulan pada suhu 10 ºC
sebesar 2,5 x 108 sel/g inokulan, sedangkan jumlah sel terendah ditunjukkan oleh
galur Bj 11 (5) masa penyimpanan 2 bulan pada suhu ruang (± 25 ºC) sebesar 2,8
x 107 sel/g inokulan.
Semua galur B. japonicum yang diinokulasikan pada tanaman kedelai
varietas Slamet mampu menginfeksi dan membentuk bintil akar pada kondisi
cekaman asam-Al.
Efektivitas simbiotik sebelum penyimpanan menunjukkan bahwa Bj 11 (5)
adalah yang terbaik demikian pula setelah penyimpanan 1 bulan. Namun setelah
penyimpanan 2 bulan menunjukkan bahwa Bj 11 (19) memberikan hasil terbaik.
Hal ini mengindikasikan bahwa walaupun Bj 11 (5) memiliki kemampuan
nodulasi yang baik namun tidak dapat disimpan lama sehingga bila disimpan
dalam waktu yang lama maka kemampuan nodulasinya akan menurun. Hal
sebaliknya terjadi pada Bj 11 (19), kemampuan nodulasinya selama penyimpanan
tetap baik.
Analisis korelasi antara beberapa parameter hasil inokulasi B. japonicum
baik sebelum penyimpanan, setelah penyimpanan 1 bulan maupun setelah
penyimpanan 2 bulan semuanya menunjukkan bahwa korelasi antara parameter
bobot kering tanaman bagian atas dengan efektivitas simbiotik nilai korelasinya
tergolong kuat sampai korelasi yang sangat kuat.
Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa jumlah sel B. japonicum
dapat berkurang atau bertambah dengan semakin lamanya masa penyimpanan
yang dipengaruhi oleh suhu dan jenis galur. Ada interaksi antara jenis galur
inokulan dan suhu penyimpanan. Suhu 10 ºC cenderung lebih baik untuk
mempertahankan viabilitas sel.
Galur mutan memiliki viabilitas dan efektivitas simbiotik yang lebih baik
dibandingkan tipe liarnya. Bj 11 (19) merupakan galur pilihan untuk dijadikan
pupuk hayati karena memiliki viabilitas dan efektivitas simbiotik tertinggi setelah
penyimpanan.
Kata kunci : Bradyrhizobium japonicum, toleran asam-aluminium, viabilitas,
efektivitas simbiotik, kedelai.
@ Hak Cipta milik IPB, tahun 2009
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan
pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan
kritik atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan
kepentingan yang wajar IPB.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB.
INOKULAN Bradyrhizobium japonicum TOLERAN ASAM-Al :
UJI VIABILITAS DAN EFEKTIVITAS SIMBIOTIK
TERHADAP TANAMAN KEDELAI
LENNY HANDAYANI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister sains pada
Mayor Mikrobiologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
Judul Tesis
Nama
NRP
: Inokulan Bradyrhizobium japonicum Toleran Asam-Al : Uji
Viabilitas dan Efektivitas Simbiotik Terhadap Tanaman
Kedelai.
: Lenny Handayani
: G351070181
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M. Si.
Ketua
Dr. Aris Tri Wahyudi, M. Si.
Anggota
Diketahui
Ketua Mayor Mikrobiologi
Dr. Ir. Gayuh Rahayu
Tanggal Ujian: 10 Agustus 2009
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S.
Tanggal Lulus: 26 Agustus 2009
Penguji Luar Komisi: Dr. Miftahuddin, M.Si
PRAKATA
Alhamdulillah, puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas
segala karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah (tesis)
dengan judul Inokulan Bradyrhizobium japonicum Toleran Asam-Al : Uji
Viabilitas dan Efektivitas Simbiotik Terhadap Tanaman Kedelai. Penelitian ini
didanai oleh Departemen Agama RI dan Program Insentif Ristek Terapan
Kementrian Negara Riset dan Teknologi tahun 2009.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dr. Nisa Rachmania
Mubarik, M.Si dan Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si selaku pembimbing atas
kesediaan dan kesabarannya memberi bimbingan selama penelitian hingga
penulisan tesis ini. Ucapan terima kasih disampaikan pula kepada Dr. Miftahuddin,
M.Si sebagai dosen penguji atas saran dan masukan yang diberikan. Terima kasih
penulis sampaikan kepada Departemen Agama RI yang telah memberikan
beasiswa untuk melanjutkan studi S2 di Sekolah Pascasarjana IPB melalui
Program Peningkatan Mutu Guru Madrasah.
Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Bapak dan Ibu
pengelola Laboratorium Mikrobiologi dan Rumah Kaca Departemen Biologi
FMIPA IPB atas segala bantuan yang diberikan selama penelitian ini dilakukan
dari bulan Oktober 2008 sampai Mei 2009.
Pada kesempatan ini penulis menyampaikan rasa terima kasih yang sangat
tulus kepada orang tua, suami tercinta, dan seluruh keluarga atas doa, motivasi,
dan keikhlasan mereka untuk ditinggalkan selama penulis menempuh pendidikan
di IPB.
Penulis berharap semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.
Bogor, Juli 2009
Lenny Handayani
INOKUL
LAN Bradyyrhizobium
m japonicu
um TOLERAN ASA
AM-Al :
UJII VIABILIITAS DAN
N EFEKT
TIVITAS S
SIMBIOTIIK
TERH
HADAP T
TANAMA
AN KEDELAI
LENNY
Y HANDA
AYANI
SE
EKOLAH
H PASCAS
SARJANA
A
INS
STITUT PERTANIA
AN BOGO
OR
BOGOR
2009
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Inokulan Bradyrhizobium
japonicum Toleran Asam-Aluminium : Uji Viabilitas dan Efektivitas
Simbiotik terhadap Tanaman Kedelai adalah karya saya sendiri dengan arahan
komisi pembimbing dan belum pernah diajukan kepada perguruan tinggi manapun.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam daftar pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Juli 2009
Lenny Handayani
NRP G3510701
ABSTRACT
LENNY HANDAYANI. Inoculant of Acid-Aluminium Tolerant Bradyrhizobium
japonicum : Viability Test and Symbiotic Effectivity Evaluation on Soybean.
Under direction of NISA RACHMANIA MUBARIK and ARIS TRI
WAHYUDI.
Acid soil is limiting factor of growth and production of soybean. Soil acidity
directly can inhibit the growth of soybean and root-nodule bacterium
Bradyrhizobium. This research was aimed to test viability strains of acidaluminium tolerant Bradyrhizobium japonicum after a period of storages (1, 2,
and 3 months) both at room (± 25 ºC) and 10 ºC temperature, and test its
symbiotic effectivity on soybean. Inoculant of B. japonicum wild type Bj 11 (wt),
and its mutants Bj 11 (5) and Bj 11 (19), were tested by using steril peat as carrier.
The experiments was designed as factorial randomized completely design with
three factors. Result of viability test showed that there were an interaction
between strain types, temperature, and a period of storage. Inoculant of Bj 11 (19)
stored at temperature 10 ºC for 2 months showed the highest viability at 2,5 x 108
cell/g inoculant. Inoculant of Bj 11 (5) had the highest result for plant height,
shoot dry weight, symbiotic effectivity, and N-content before storage. Inoculant of
Bj 11 (19) showed the highest result after storage 2 months at room temperature
and temperature 10 ºC. The research showed that mutant strain of acid-Al tolerant
B. japonicum Bj 11 (19) had better viability and higher symbiotic effectivity than
wild-type strain.
Key words : acid-Al tolerant Bradyrhizobium japonicum, cell viability, symbiotic
effectivity, soybean.
RINGKASAN
LENNY HANDAYANI. Inokulan Bradyrhizobium japonicum Toleran Asam-Al :
Uji Viabilitas dan Efektivitas Simbiotik Terhadap Tanaman Kedelai. Dibimbing
oleh NISA RACHMANIA MUBARIK and ARIS TRI WAHYUDI.
Salah satu cara untuk meningkatkan produksi tanaman kedelai di tanah pH
asam (pH 4,0 – 5,0) yaitu menggunakan galur inokulan toleran asam beserta
inangnya. Bradyrhizobium merupakan bakteri tumbuh lambat yang toleran pada
kondisi asam. Beberapa penelitian sebelumnya telah menyeleksi galur B.
japonicum toleran media asam-aluminium dan telah mengkonstruksi mutan B.
japonicum toleran asam-aluminium melalui mutagenesis dengan transposon.
Penelitian ini bertujuan untuk menguji viabilitas inokulan beberapa galur B.
japonicum toleran asam-aluminium dengan menggunakan bahan pembawa
gambut steril yang disimpan selama 1, 2, dan 3 bulan pada suhu ruang (± 25 ºC)
dan suhu 10 ºC serta menguji efektivitas simbiotik inokulan terhadap tanaman
kedelai varietas Slamet sebelum dan setelah beberapa masa penyimpanan.
Peremajaan B. japonicum dilakukan dengan cara menginokulasikan satu lup
dari biakan stok ke dalam media Yeast Mannitol Agar (YMA) yang ditambah
merah kongo 0,0025% dan antibiotik rifampisin 50 µg/ml dengan metode kuadran,
diinkubasi di tempat gelap pada suhu ruang selama 5-7 hari. Satu koloni tunggal
digoreskan pada media agar-agar miring YMA tanpa penambahan merah kongo.
Kultur B. japonicum cair diproduksi pada medium YMB yang diinkubasi
selama 7 hari di atas mesin penggoyang 120 rpm pada suhu ruang. Gambut steril
digunakan sebagai pembawa inokulan B. japonicum dalam pembuatan inokulan
padat. Inokulan disimpan pada dua suhu yang berbeda yaitu pada suhu ruang (±
25 ºC) dan suhu 10 ºC selama 1, 2, dan 3 bulan.
Pengujian viabilitas inokulan dilakukan setiap bulan selama penyimpanan 1,
2, dan 3 bulan, dengan metode hitungan cawan. Parameter yang diamati ialah
jumlah koloni yang tumbuh pada medium YMA.
Pengujian efektivitas simbiotik dilakukan sebelum penyimpanan dan setelah
penyimpanan. Pengujian ini dilakukan di rumah kaca menggunakan Rancangan
Acak Lengkap dengan sepuluh perlakuan termasuk dua jenis kontrol yaitu kontrol
N (kontrol dengan pemberian KNO3) dan kontrol N0 (kontrol tanpa KNO3).
Setiap perlakuan diulang tiga kali.
Parameter yang diukur ialah jumlah bintil, bobot kering bintil, bobot kering
tanaman bagian atas, efektivitas simbiotik, kandungan N total tajuk tanaman,
aktivitas nitrogenase, jumlah polong, jumlah biji, dan bobot biji per tanaman. Data
dianalisis menggunakan program SAS ver 9.1, uji lanjut dengan Duncan Multiple
Range Test (DMRT) pada taraf kepercayaan 95%. Analisis data hasil uji viabilitas
dengan rancangan acak lengkap faktorial in time, hasil uji efektivitas simbiotik
dengan rancangan acak lengkap faktorial.
Hasil penelitian uji viabilitas diperoleh bahwa Bj 11 (19) menunjukkan
peningkatan jumlah sel dari 107 sel/g inokulan menjadi 108 sel/g inokulan dan
jumlah sel Bj 11 (19) relatif stabil selama 3 bulan penyimpanan pada dua suhu
yang berbeda. Bj 11 (5) dan Bj 11 (wt) keduanya menunjukkan penurunan jumlah
sel dari 109 sel/g inokulan menjadi 107 sel/g inokulan. Jumlah sel tertinggi yang
diperoleh yaitu galur Bj 11 (19) masa penyimpanan 2 bulan pada suhu 10 ºC
sebesar 2,5 x 108 sel/g inokulan, sedangkan jumlah sel terendah ditunjukkan oleh
galur Bj 11 (5) masa penyimpanan 2 bulan pada suhu ruang (± 25 ºC) sebesar 2,8
x 107 sel/g inokulan.
Semua galur B. japonicum yang diinokulasikan pada tanaman kedelai
varietas Slamet mampu menginfeksi dan membentuk bintil akar pada kondisi
cekaman asam-Al.
Efektivitas simbiotik sebelum penyimpanan menunjukkan bahwa Bj 11 (5)
adalah yang terbaik demikian pula setelah penyimpanan 1 bulan. Namun setelah
penyimpanan 2 bulan menunjukkan bahwa Bj 11 (19) memberikan hasil terbaik.
Hal ini mengindikasikan bahwa walaupun Bj 11 (5) memiliki kemampuan
nodulasi yang baik namun tidak dapat disimpan lama sehingga bila disimpan
dalam waktu yang lama maka kemampuan nodulasinya akan menurun. Hal
sebaliknya terjadi pada Bj 11 (19), kemampuan nodulasinya selama penyimpanan
tetap baik.
Analisis korelasi antara beberapa parameter hasil inokulasi B. japonicum
baik sebelum penyimpanan, setelah penyimpanan 1 bulan maupun setelah
penyimpanan 2 bulan semuanya menunjukkan bahwa korelasi antara parameter
bobot kering tanaman bagian atas dengan efektivitas simbiotik nilai korelasinya
tergolong kuat sampai korelasi yang sangat kuat.
Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa jumlah sel B. japonicum
dapat berkurang atau bertambah dengan semakin lamanya masa penyimpanan
yang dipengaruhi oleh suhu dan jenis galur. Ada interaksi antara jenis galur
inokulan dan suhu penyimpanan. Suhu 10 ºC cenderung lebih baik untuk
mempertahankan viabilitas sel.
Galur mutan memiliki viabilitas dan efektivitas simbiotik yang lebih baik
dibandingkan tipe liarnya. Bj 11 (19) merupakan galur pilihan untuk dijadikan
pupuk hayati karena memiliki viabilitas dan efektivitas simbiotik tertinggi setelah
penyimpanan.
Kata kunci : Bradyrhizobium japonicum, toleran asam-aluminium, viabilitas,
efektivitas simbiotik, kedelai.
@ Hak Cipta milik IPB, tahun 2009
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan
pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan
kritik atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan
kepentingan yang wajar IPB.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB.
INOKULAN Bradyrhizobium japonicum TOLERAN ASAM-Al :
UJI VIABILITAS DAN EFEKTIVITAS SIMBIOTIK
TERHADAP TANAMAN KEDELAI
LENNY HANDAYANI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister sains pada
Mayor Mikrobiologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
Judul Tesis
Nama
NRP
: Inokulan Bradyrhizobium japonicum Toleran Asam-Al : Uji
Viabilitas dan Efektivitas Simbiotik Terhadap Tanaman
Kedelai.
: Lenny Handayani
: G351070181
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M. Si.
Ketua
Dr. Aris Tri Wahyudi, M. Si.
Anggota
Diketahui
Ketua Mayor Mikrobiologi
Dr. Ir. Gayuh Rahayu
Tanggal Ujian: 10 Agustus 2009
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S.
Tanggal Lulus: 26 Agustus 2009
Penguji Luar Komisi: Dr. Miftahuddin, M.Si
PRAKATA
Alhamdulillah, puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas
segala karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah (tesis)
dengan judul Inokulan Bradyrhizobium japonicum Toleran Asam-Al : Uji
Viabilitas dan Efektivitas Simbiotik Terhadap Tanaman Kedelai. Penelitian ini
didanai oleh Departemen Agama RI dan Program Insentif Ristek Terapan
Kementrian Negara Riset dan Teknologi tahun 2009.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dr. Nisa Rachmania
Mubarik, M.Si dan Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si selaku pembimbing atas
kesediaan dan kesabarannya memberi bimbingan selama penelitian hingga
penulisan tesis ini. Ucapan terima kasih disampaikan pula kepada Dr. Miftahuddin,
M.Si sebagai dosen penguji atas saran dan masukan yang diberikan. Terima kasih
penulis sampaikan kepada Departemen Agama RI yang telah memberikan
beasiswa untuk melanjutkan studi S2 di Sekolah Pascasarjana IPB melalui
Program Peningkatan Mutu Guru Madrasah.
Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Bapak dan Ibu
pengelola Laboratorium Mikrobiologi dan Rumah Kaca Departemen Biologi
FMIPA IPB atas segala bantuan yang diberikan selama penelitian ini dilakukan
dari bulan Oktober 2008 sampai Mei 2009.
Pada kesempatan ini penulis menyampaikan rasa terima kasih yang sangat
tulus kepada orang tua, suami tercinta, dan seluruh keluarga atas doa, motivasi,
dan keikhlasan mereka untuk ditinggalkan selama penulis menempuh pendidikan
di IPB.
Penulis berharap semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.
Bogor, Juli 2009
Lenny Handayani
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Ujung Pandang pada tanggal 26 Agustus 1970 dari
ayah M. Yusri dan ibu Hj. Suarci. Tahun 1988 penulis lulus dari SMA Negeri 2
Ujung Pandang. Pendidikan tinggi ditempuh di Universitas Hasanuddin Jurusan
Biologi Fakultas MIPA lulus tahun 1995.
Tahun 1998 penulis bekerja sebagai guru biologi di SMU Insan Cendekia
Gorontalo. Sejak tahun 2002 sampai sekarang penulis bekerja sebagai guru
biologi pada Madrasah Aliyah Negeri Insan Cendekia Gorontalo.
Pada tahun 2007 penulis mendapat kesempatan untuk melanjutkan studi
pada Sekolah Pascasarjana IPB melalui Program Beasiswa Peningkatan Mutu
Guru Madrasah dari Departemen Agama Republik Indonesia. Selama studi S2
penulis berkesempatan menyampaikan sebagian hasil penelitian ini secara lisan
pada Seminar Nasional Biologi di Universitas Pendidikan Indonesia Bandung
pada bulan Juli 2009.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL .............................................................................................. xi
DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xii
PENDAHULUAN
Latar Belakang ..........................................................................................
Tujuan Penelitian ......................................................................................
1
2
TINJAUAN PUSTAKA
Bakteri Bintil Akar ...................................................................................
Proses Pembentukan Bintil Akar ..............................................................
Faktor-faktor yang Mempengaruhi Pembentukan Bintil Akar .................
Penambatan Nitrogen ...............................................................................
Efektivitas Simbiotik ................................................................................
Kedelai Toleran Asam ..............................................................................
Bahan Pembawa .......................................................................................
Tanah Asam ..............................................................................................
4
5
5
6
8
8
8
9
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian ...................................................................
Bahan ........................................................................................................
Rancangan Percobaan dan Analisis Data .................................................
Penyiapan Inokulan ...................................................................................
Penyiapan Gambut ....................................................................................
Inokulasi Bakteri Bradyrhizobium japonicum ke dalam Gambut
dan Penyimpanan Inokulan .......................................................................
Uji Viabilitas Inokulan .............................................................................
Inokulasi Bradyrhizobium japonicum pada Biji Kedelai dan
Penanaman pada Rumah Kaca .................................................................
Uji Efektivitas Simbiotik ..........................................................................
Penentuan N Total ....................................................................................
Uji Aktivitas Nitrogenase .........................................................................
11
11
11
12
12
12
13
13
14
14
14
HASIL
Uji Viabilitas.............................................................................................. 16
Uji Efektivitas Simbiotik .......................................................................... 17
PEMBAHASAN
Uji Viabilitas.............................................................................................. 26
Uji Efektivitas Simbiotik .......................................................................... 28
SIMPULAN DAN SARAN ............................................................................... 33
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 34
LAMPIRAN ....................................................................................................... 38
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Viabilitas (sel/g inokulan) dari tiga jenis galur B. japonicum yang
disimpan pada suhu ruang (± 25 ºC) dan suhu 10 ºC, masa penyimpanan
1, 2, dan 3 bulan .......................................................................................... 16
2 Indeks penurunan dan kenaikan jumlah sel dari tiga jenis galur B.
japonicum yang disimpan pada suhu ruang (± 25 ºC) dan suhu 10 ºC,
masa penyimpanan 1, 2, dan 3 bulan ......................................................... 17
3 Pengaruh inokulan B. japonicum sebelum penyimpanan terhadap jumlah
bintil, bobot kering bintil, bobot kering tanaman bagian atas, efektivitas
simbiotik, dan kandungan N total tajuk tanaman kedelai varietas Slamet
umur 45 HSTpada media tanah asam pH 4,8 .............................................. 18
4 Pengaruh inokulan B. japonicum yang telah disimpan selama 1 bulan
pada suhu ruang (± 25 ºC) dan suhu 10 ºC terhadap jumlah bintil, bobot
kering bintil akar, bobot kering tanaman bagian atas, efektivitas simbiotik,
dan kandungan N total tajuk tanaman kedelai varietas Slamet umur 45
HST pada media tanah asam pH 4,8..............................................
20
5 Pengaruh inokulan B. japonicum yang telah disimpan selama 1 bulan dan
2 bulan pada suhu ruang (± 25 ºC) dan suhu 10 ºC terhadap jumlah
polong, jumlah biji, dan bobot biji tanaman kedelai varietas Slamet umur
80 HST pada media tanah asam pH 4,8 ...................................................... 21
6 Pengaruh inokulan B. japonicum yang telah disimpan selama 2 bulan
pada suhu ruang (± 25 ºC) dan suhu 10 ºC terhadap jumlah bintil, bobot
kering bintil akar, bobot kering tanaman bagian atas, efektivitas simbiotik,
dan kandungan N total tajuk tanaman kedelai varietas Slamet umur 45
HST pada media tanah asam pH 4,8..............................................
23
7 Korelasi (r) antara beberapa parameter hasil inokulasi B. japonicum
sebelum penyimpanan terhadap tanaman kedelai varietas Slamet umur
45 HST pada media tanah asam pH 4,8....................................................... 24
8 Korelasi (r) antara beberapa parameter hasil inokulasi B. japonicum yang
telah disimpan selama 1 bulan terhadap tanaman kedelai varietas Slamet
umur 45 HST pada media tanah asam pH 4,8 ............................................ 25
9 Korelasi (r) antara beberapa parameter hasil inokulasi B. japonicum yang
telah disimpan selama 2 bulan terhadap tanaman kedelai varietas Slamet
umur 45 HST pada media tanah asam pH 4,8 ......................................... 25
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Hasil analisis kimia media tanah asam dan gambut yang digunakan.......... 39
2 Komposisi media yeast extract mannitol agar (YMA) dan yeast extract
mannitol broth (YMB) untuk 1000 ml media ....................................... 39
3 (A) koloni Bj 11 (19) setelah penyimpanan 2 bulan suhu 10 ºC pada
media YMA + merah kongo 0,0025% + rifampisin sebanyak 50 µg/ml,
(B) koloni Bj 11 (5) setelah penyimpanan 2 bulan suhu ruang (25 ºC)
pada media YMA + merah kongo 0,0025% + rifampisin sebanyak 50
µg/ml, dan (C) kontrol setelah penyimpanan 2 bulan suhu ruang (25 ºC)
pada media YMA + merah kongo 0,0025% + rifampisin sebanyak 50
µg/ml ............ .............................................................................................. 39
4 Tanaman kedelai varietas Slamet umur 45 HST pada media tanah asam
pH 4,8 yang diinokulasi B. japonicum sebelum penyimpanan . ................ 40
5 Akar tanaman kedelai varietas Slamet umur 45 HST pada media tanah
asam pH 4,8 yang diinokulasi B. japonicum sebelum penyimpanan .....
40
6 Tanaman kedelai varietas Slamet umur 45 HST pada media tanah asam
pH 4,8 yang diinokulasi B. japonicum setelah disimpan selama 1 bulan
pada (A) suhu ruang (± 25 ºC) dan (B) suhu 10 ºC...................................... 41
7 Akar tanaman kedelai varietas Slamet umur 45 HST pada media tanah
asam pH 4,8 yang diinokulasi B. japonicum setelah disimpan selama 1
bulan pada (A) suhu ruang (± 25 ºC) dan (B) suhu 10 ºC .......................... 42
8 Tanaman kedelai varietas Slamet umur 45 HST pada media tanah asam
pH 4,8 yang diinokulasi B. japonicum setelah disimpan selama 2 bulan
pada (A) suhu ruang (± 25 ºC) dan (B) suhu 10 ºC ..................................... 43
9 Akar tanaman kedelai varietas Slamet umur 45 HST pada media tanah
asam pH 4,8 yang diinokulasi B. japonicum setelah disimpan selama 2
bulan pada (A) suhu ruang (± 25 ºC) dan (B) suhu 10 ºC ........................... 44
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kedelai (Glycine max) merupakan salah satu anggota leguminosae yang
mengandung protein tinggi dan banyak dikonsumsi oleh penduduk Indonesia,
namun sampai sekarang produksi kedelai nasional masih rendah, hal ini
menyebabkan impor kedelai masih tinggi. Produksi kedelai nasional berkisar
antara 600-700 ribu ton per tahun, sementara kebutuhan telah mencapai 2 juta ton
pada tahun 2007 (Deptan 2008).
Peningkatan produksi kedelai dapat dilakukan dengan cara meningkatkan
produktivitas dan perluasan areal tanam. Lahan sawah, lahan kering, dan lahan
pasang surut memiliki potensi yang cukup besar dikembangkan untuk perluasan
areal kedelai. Dari segi luas, lahan kering asam paling potensial (Deptan 2008).
Luas total daratan Indonesia sekitar 188,2 juta ha, dan sekitar 148 juta ha di
antaranya merupakan lahan kering. Dari luas lahan kering tersebut, yang berupa
tanah asam seluas 102.817.113 ha (69,4%) dan tanah yang tidak asam seluas
45.256.511 ha. Pengelolaan tanah asam lahan kering menghadapi berbagai
kendala antara lain: rendahnya tingkat kesuburan tanah yang berkaitan dengan pH
rendah, tingginya kadar aluminium (Al), kandungan besi dan mangan yang
mendekati batas meracuni, dan populasi organisme tanah yang rendah (Mulyani et
al. 2004).
Tersedianya nitrogen yang cukup merupakan salah satu kunci keberhasilan
dalam usaha peningkatan produktivitas tanaman kedelai. Pada perkembangan
tanaman legum, sumbangan nitrogen terbesar dihasilkan oleh infeksi akar legum
oleh genus bakteri Rhizobium dan Bradyrhizobium (Robert & Tate 2000).
Salah satu cara untuk mengurangi pengaruh negatif dari pH tanah yang asam
yaitu
menggunakan
galur
inokulan
toleran
asam
beserta
inangnya.
Bradyrhizobium merupakan bakteri tumbuh lambat yang toleran pada kondisi
asam (Silvia et al. 2005 ).
Metode inokulasi dengan menggunakan inokulan Rhizobium merupakan
salah satu penunjang untuk meningkatkan produksi tanaman kacang-kacangan
2
seperti kedelai. Rhizobium yang efektif dapat memenuhi kebutuhan tanaman akan
N sebesar 50-75% (Widawati & Rahayu 1995).
Kualitas inokulan tergantung pada galur dan umumnya diseleksi berdasarkan
keragaman karakteristiknya. Kualitas juga tergantung pada jumlah B. japonicum
yang diinokulasikan. Telah dilaporkan bahwa jumlah sel B. japonicum dapat
berkurang selama penyimpanan dan distribusi (Gomez et al. 1997).
Viabilitas inokulan selama proses penyimpanan dalam jangka waktu tertentu,
agar keberadaannya dapat dipertahankan, diperlukan bahan pembawa yang dapat
berfungsi sebagai sumber energi dan tempat tinggal mikrob (Saraswati 1999).
Produksi dan mutu inokulan Rhizobium di beberapa negara berkembang dibatasi
oleh ketersediaan bahan pembawa (carrier) yang sesuai dan keterbatasan
teknologi (Khavasia et al. 2007). Bahan pembawa yang umum digunakan untuk
Rhizobium ialah gambut (India, Indonesia, dan Kanada), lignit (India), dan arang
(India) (Saraswati 1999). Formulasi dengan menggunakan gambut sebagai bahan
pembawa dominan digunakan karena dapat mempertahankan viabilitas bakteri
bintil akar dan mudah menggunakannya (Date 2001).
Beberapa aspek yang dapat mempengaruhi kualitas kultur di dalam gambut
ialah dapat memberikan ketahanan hidup yang lebih baik dalam bahan pembawa
dan pada biji, tingkat pengeringan, rehidrasi, karakteristik bahan pembawa
termasuk bahan tambahan yang diberikan, dan metode inokulasi (Date 2001).
Endarini et al. (1995) telah menyeleksi galur B. japonicum toleran media
asam-Al. Monasari (2007) telah melakukan konstruksi mutan B. japonicum
toleran asam-Al melalui mutagenesis dengan transposon. Galur yang memiliki
efektivitas simbiotik yang tinggi berhasil diperoleh. Penelitian yang dilakukan
oleh Habibah (2008) berhasil memperoleh galur harapan Bj 11 (19) yang
mempunyai efektivitas simbiotik lebih tinggi dari galur Bj standar USDA 110
dari USA.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan menguji viabilitas inokulan beberapa galur B.
japonicum toleran asam-Al dengan menggunakan bahan pembawa gambut steril
yang disimpan selama 1, 2, dan 3 bulan pada suhu ruang dan suhu 10 ºC, serta
2
menguji efektivitas simbiotik inokulan terhadap tanaman kedelai varietas Slamet
sebelum dan setelah beberapa masa penyimpanan. Dari hasil penelitian ini
diharapkan dapat diperoleh inokulan B. japonicum toleran asam-Al yang memiliki
viabilitas yang baik dan efektivitas simbiotik yang tinggi setelah penyimpanan
untuk diaplikasikan sebagai pupuk hayati, khususnya pada lahan asam yang cukup
luas terdapat di Indonesia.
4
TINJAUAN PUSTAKA
Bakteri Bintil Akar
Legum merupakan suatu kelompok tanaman yang memiliki nilai ekonomi
penting seperti kedelai, semanggi, alfalfa, buncis, dan kacang-kacangan.
Rhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, dan Azorhizobium
adalah bakteri Gram negatif, motil dan berbentuk batang yang dapat bersimbiosis
dengan tanaman legum. Infeksi pada akar tanaman legum oleh salah satu spesies
tersebut dapat membentuk nodul (bintil) pada akar yang dapat mengubah nitrogen
dalam bentuk gas menjadi nitrogen terikat, proses ini dinamakan fiksasi nitrogen
(Madigan & Martinko 2000). Fiksasi nitrogen oleh simbiosis legum-Rhizobium
sangat penting bagi pertanian karena dapat meningkatkan nitrogen terikat di
dalam tanah dengan sangat signifikan.
Kira-kira 90% dari seluruh spesies tanaman legum dapat mengalami
nodulasi. Namun terdapat kespesifikan antara legum dan galur Rhizobium. Suatu
galur Rhizobium umumnya dapat menginfeksi spesies legum tertentu dan tidak
pada spesies lain. Kelompok galur Rhizobium yang dapat menginfeksi kelompok
legum yang berkerabat dinamakan kelompok inokulasi silang. Meskipun galur
Rhizobium mampu menginfeksi legum tertentu, tetapi tidak selalu dapat
menghasilkan bintil yang memfiksasi nitrogen (Madigan & Martinko 2000).
Bradyrhizobium japonicum termasuk dalam grup II Rhizobium yang spesifik
menodulasi kedelai. Grup II Rhizobium tumbuh lambat dan menghasilkan basa
(alkali). Anggota dari kelompok Rhizobium ini memerlukan waktu pertumbuhan
3-5 hari pada medium cair dan rata-rata waktu pembelahan 6-7 jam. Kebanyakan
galur dalam kelompok ini tumbuh dengan baik dengan menggunakan pentosa
sebagai sumber karbon. Sel-selnya berbentuk batang, motil mempunyai flagel
tunggal polar atau subpolar (Somasegaran & Hoben 1995).
Rhizobium sebagian besar bersifat kemoorganotrof aerobik dan mudah
dikultur, tumbuh baik dengan keberadaan oksigen, menggunakan karbohidrat dan
asam amino sederhana. Beberapa galur Rhizobium memerlukan vitamin untuk
pertumbuhannya. Pertumbuhan optimum sebagian besar galur pada suhu 25 –
30 °C dan pH 6-7. Meskipun metabolismenya secara aerobik, beberapa galur
4
dapat tumbuh dengan baik pada keberadaan oksigen yang minim (mikroaerofilik)
(Somasegaran & Hoben 1995).
Proses Pembentukan Bintil Akar
Beberapa tahap infeksi dan perkembangan bintil akar (Madigan & Martinko
2000) yaitu : (1) pengenalan bakteri terhadap bagian tanaman pada inang yang
sesuai dan pelekatan bakteri pada rambut akar, (2) invasi bakteri pada rambut
akar dengan membentuk benang-benang infeksi, (3) perluasan infeksi menuju
akar utama melalui benang infeksi, (4) pembentukan sel-sel bakteri di dalam sel
tanaman yang disebut bakteroid dan berkembang pada tahap fiksasi nitrogen, dan
(5) pembelahan sel tanaman dan bakteri membentuk bintil akar dewasa (matang).
Faktor-faktor yang Mempengaruhi Pembentukan Bintil Akar
Pembentukan bintil akar dan fiksasi nitrogen dipengaruhi oleh beberapa
faktor lingkungan yaitu keasaman, suhu, keberadaan garam mineral, salinitas dan
alkalinitas (Silvia et al. 2005).
Keberhasilan penambatan N di udara oleh Rhizobium tergantung pada
interaksi antara faktor-faktor berikut, yaitu keserasian galur Rhizobium dengan
tanaman inang, kemampuan berkompetesi dengan Rhizobium indigenos,
kemampuan tanaman inang untuk menyediakan nutrisi bagi Rhizobium yang
bersimbiosis dengannya, serta faktor lingkungan terutama faktor pembatas dalam
tanah, seperti pH, suhu, kelembaban tanah, dan ketersediaan hara makro dan
mikro (Saraswati et al. 2003).
Simbiosis Rhizobium-Legum dipengaruhi oleh penurunan pH tanah.
Penurunan pH tanah dapat menimbulkan peningkatan konsentrasi proton,
kelarutan logam seperti aluminium yang bersifat toksik terhadap bakteri bintil
akar. Respon bakteri bintil akar terhadap tanah asam tergantung pada interaksi
sejumlah faktor seperti konsentrasi H+, aktivitas Al3+, dan kemampuan kompetisi
dan persistensi dari galur Rhizobium (Tiwari et al. 1992).
Keasaman tanah secara langsung dapat menghambat pertumbuhan
Rhizobium. Kegagalan nodulasi pada tanah asam tidak hanya disebabkan oleh
menurunnya keberadaan Rhizobium, tetapi pH asam juga mempengaruhi
6
pelekatan Rhizobium pada inangnya. Nodulasi pada beberapa galur diperkirakan
bermasalah pada pH di bawah 5,2 (Silvia et al. 2005).
Pada tingkat keasaman tanah yang berbeda, akan timbul permasalahan
mengenai ketersediaan unsur hara tertentu yang dapat mempengaruhi kehidupan
bakteri Rhizobium maupun tanaman kedelai (Widawati & Rahayu 1995). Kondisi
asam dalam tanah berakibat defisiensi kalsium, magnesium, dan kalium.
Seringkali, keasaman tanah berakibat berkurangnya pengambilan molibdenum
(Rao 1994).
Spesies tanaman mempunyai toleransi yang beragam terhadap aluminium
dan mangan tetapi umumnya tanaman lebih dipengaruhi oleh ion-ion ini daripada
Rhizobium. Beberapa Rhizobium toleran pada 100 µM aluminium dan 300 µM
mangan (Silvia et al. 2005).
Beberapa galur B. japonicum toleran terhadap konsentrasi aluminium yang
cukup tinggi sekitar 50 µM yang dibuktikan dengan kemampuannya tumbuh pada
media Ayanaba (Endarini et al. 1995), tetapi tidak semua rhizobia toleran asam
juga toleran Al tinggi (Keyser & Munns 1979). Kandungan mineral N di atas
tingkat tertentu mempengaruhi infeksi pada rambut akar, jumlah bintil, struktur
bintil, dan jumlah nitrogen yang difiksasi (Rao 1994).
Rentangan suhu yang paling menguntungkan untuk pembentukan jaringan
bakteroid di dalam bintil ialah 20 – 30 ºC. Pembentukan bintil tidak terjadi pada
suhu akar di atas 32 ºC (Rao 1994). Suhu rendah dapat memperlambat proses
nodulasi (Silvia et al. 2005).
Penelitian terhadap pembentukan bintil semanggi menunjukkan bahwa
fotoperiode mempengaruhi pembentukan, ukuran, dan jumlah bintil pada sistem
perakaran. Awal pembentukan bintil pada semanggi tertunda apabila panjang hari
ditambah (Rao 1994).
Penambatan Nitrogen
Penambatan N2 secara simbiotik berkaitan dengan aktivitas enzim
nitrogenase, hidrogenase dan protein leghemoglobin. Nitrogenase merupakan
suatu sistem enzim yang terdapat di dalam bakteroid, berfungsi mengkatalisis
penambatan N2 dan merupakan kompleks yang tersusun atas dua komponen
6
logam-protein yakni MoFe-protein dan Fe-protein. MoFe-protein adalah
komponen I disebut molibdoferedoksin atau dinitrogenase, Fe-protein adalah
komponen II disebut azofereredoksin atau dinitrogenase-reduktase. Kedua
komponen protein dibutuhkan bersama-sama untuk aktivitas katalisis nitrogenase
dan masing-masing tidak aktif bila berdiri sendiri. Nitrogenase membutuhkan
ATP dan reduktor potensial rendah untuk aktivitasnya. Reduktor berasal dari
feredoksin atau flavodoksin (Madigan & Martinko 2000).
Sumber energi penambatan nitrogen pada bakteroid tergantung sepenuhnya
pada fotosintat tanaman inang yang ditranspor melalui membran simbiosom
dalam bentuk produk senyawa antara dari siklus asam trikarboksilat (siklus Krebs)
yaitu asam suksinat, fumarat, dan malat yang merupakan donor elektron untuk
menghasilkan ATP dan mereduksi N2. Asam piruvat merupakan reduktan yang
terlibat langsung sebagai donor elektron dalam sistem nitrogenase (Madigan &
Martinko 2000).
Reaksi penambatan N2 yang terjadi di dalam bakteroid sebagai berikut :
nitrogenase
N2 + 8e + 8H+ + 16 MgATP --------------> 2NH3 + H2 + 16 MgADP + 16 Pi
Enzim nitrogenase menggunakan 16 ATP. Untuk mereduksi satu molekul
N2 menjadi dua molekul NH3 dibutuhkan 12 ATP, 4 ATP selebihnya digunakan
untuk mereduksi H+ menjadi H2. Ion Mg+ yang berikatan dengan ATP dibutuhkan
agar nitrogenase dapat berfungsi. Selain dapat mereduksi ikatan rangkap tiga dari
molekul N2 menjadi amonia, enzim nitrogenase dapat pula mereduksi molekul lain
yang juga memiliki ikatan rangkap tiga seperti asetilen, sianida, nitrat oksida, dan
metil isosianida (Somasegaran & Hoben 1995).
Aktivitas nitrogenase akan terhambat apabila terdapat oksigen, namun
oksigen juga diperlukan dalam respirasi aerob B. japonicum untuk menghasilkan
ATP yang mendukung aktivitas nitrogenase. Adanya leghemoglobin yang
terdapat dalam sitoplasma sel nodul dapat mengendalikan keadaan ini.
Leghemoglobin mampu mengikat O2 dengan cepat sekaligus mengendalikan O2
pada taraf yang tidak mengganggu aktivitas nitrogenase (Madigan & Martinko
2000).
8
Efektivitas Simbiotik
Simbiosis antara tanaman kedelai dengan bakteri simbion dalam penambatan
nitrogen (N2) disebut efektivitas simbiotik. Efektivitas simbiotik diuji dengan
beberapa cara, di antaranya dengan penetapan bobot kering tanaman, kandungan
N total dan aktivitas nitrogenase (Somasegaran & Hoben 1995).
Cara yang paling sederhana dalam menguji efektivitas simbiotik ialah
dengan penetapan bobot kering tanaman. Bobot kering tanaman masih relevan
digunakan untuk mengevaluasi efektivitas suatu galur bakteri bintil akar. Hal ini
karena bobot kering tanaman berkorelasi nyata dengan kandungan N total. Bobot
kering tanaman yang dipakai sebagai parameter untuk mengevaluasi penambatan
N2 ialah tanaman bagian atas karena pada dasarnya 70% hasil penambatan
tanaman ditranslokasikan ke tanaman bagian atas.
Bobot kering tanaman
biasanya sangat berkorelasi dengan bobot kering bintil akar (Somasegaran &
Hoben 1995).
Kedelai Toleran Asam
Kedelai varietas Slamet merupakan hasil persilangan antara varietas Wilis
dan Dempo. Biji varietas ini memiliki kadar lemak 15% dan kandungan protein
34%. Karakteristik varietas ini memiliki tinggi tanaman 65 cm, bunga berwarna
ungu, warna biji kuning, kulit polong masak berwarna coklat, bulu juga berwarna
coklat. Tipe tumbuh determinan, mulai berbunga pada umur 37 hari setelah tanam
dan polong masak pada umur 87 hari setelah tanam. Keunggulan varietas ini
yaitu sesuai untuk tanah asam, tahan rebah, cukup tahan terhadap penyakit karat,
dan produksi di tanah tidak asam dapat mencapai 2,26 ton/ha (Somantri et al.
2003).
Bahan Pembawa
Secara tradisional gambut didefinisikan sama dengan turf yang merupakan
jaringan tanaman yang terkarbonisasi sebagian dan terbentuk pada kondisi basah,
melalui proses dekomposisi berbagai tumbuhan dan lumut-lumutan. Tanah
gambut biasa juga didefinisikan sebagai tanah yang mempunyai bahan organik
lebih dari 65 % (Andriesse 2003).
8
Komposisi kimiawi bahan-bahan gambut dipengaruhi terutama oleh vegetasi
asal, derajat dekomposisi, dan lingkungan kimiawi asal. Kandungan senyawasenyawa yang larut air, terutama polisakarida, gula-gula tunggal (mono-sugar),
dan beberapa tanin biasanya bervariasi di antara 5-10% tergantung pada tahap
dekomposisi. Gambut-gambut hutan tropika mempunyai jumlah lignin serta
derivat lignin yang cukup besar. Nilai sebesar 75% untuk gambut dataran rendah
pesisir Indonesia adalah nilai yang sering terjadi, dan nilai yang sama (56-73%)
ditemukan di Malaysia. Di dalam gambut terdapat juga senyawa organik yang
mengandung nitrogen yang jumlahnya kecil kalau dibandingkan fraksi-fraksi lain,
dan kebanyakan bersifat protein (Andriesse 2003).
Nilai karbon organik sebesar 48 - 50% pada gambut yang terdekomposisi
sedikit (fibrik), 53 - 54% pada gambut yang terdekomposisi sedang (mesik), dan
58 - 60% pada gambut yang sangat terdekomposisi (saprik). Persentase nitrogen
gambut berkisar antara 1,53 – 2,87%. Kandungan nitrogen pada lapisan
permukaan gambut-gambut dalam, umumnya lebih tinggi dibanding pada gambutgambut dangkal. Kandungan fosfor total pada gambut-gambut yang ada di
Indonesia sekitar 0,006%. Beberapa tanah gambut terkenal karena kandungan
belerang yang tinggi (Andriesse 2003).
Tanah Asam
Tanah asam didefenisikan sebagai tanah mineral yang mempunyai reaksi
tanah asam (pH < 5,5) dan nilai kejenuhan basa (KB) < 50%, dan khususnya yang
berada pada lahan kering. Tanah-tanah asam tersebut umumnya termasuk ordo
Ultisol, Oxisol, Spodosol, sebagian Entisol dan Inseptisol yang berkembang di
daerah beriklim basah dengan curah hujan tinggi (Setyorini et al. 2004).
Tanah yang bersifat asam mengandung kation-kation kalsium, magnesium,
kalium atau natrium yang rendah, disebabkan unsur-unsur tersebut dibawa aliran
air ke lapisan tanah yang lebih bawah (pencucian) atau hilang diserap tanaman. Di
Indonesia, pH tanah umumnya berkisar antara 3,0 - 9,0, tetapi untuk daerah rawa
seperti tanah gambut ditemukan pH di bawah 3,0 karena banyak mengandung
asam sulfat (Hafsah 2004).
10
Nilai pH tanah dapat digunakan sebagai indikator kesuburan kimiawi tanah,
karena dapat mencerminkan ketersediaan hara dalam tanah tersebut. Pada pH di
bawah 6,5 dapat terjadi defisiensi P, Ca dan Mg serta toksisitas B, Mn, Cu, Zn,
dan Fe. Sumber utama ion-ion H pada tanah asam sedang – kuat, seperti Ultisol,
berasal dari hidrolisis Al yang menghasilkan pH 4,0 – 5,5 (Hanafiah 2005).
Teknologi pengelolaan lahan kering dengan tanah asam untuk tanaman
pangan dan tanaman perkebunan dapat didekati dari dua aspek : (1) aspek tanah
dan air yang bertujuan memperbaiki lingkungan tumbuh tanaman dengan kondisi
air dan hara yang cukup (pemupukan N, P dan K secara berimbang, pengelolaan
bahan organik, pemberian pupuk hayati dan irigasi suplemen, serta menekan
tingkat kejenuhan Al), serta (2) aspek tanaman yang bertujuan memilih varietasvarietas tanaman yang toleran yang sesuai dengan kondisi biofisik lahan.
Pengembangan varietas tanaman yang toleran terhadap keasaman dapat dilakukan
baik secara alami (pemuliaan tanaman) maupun rekayasa genetika (Setyorini et al.
2004).
Beberapa tanaman pangan memiliki tingkat toleransi/kepekaan yang
berbeda terhadap tingkat keasaman tanah. Tanaman yang memiliki tingkat
kepekaan yang rendah adalah kedelai dan kacang-kacangan lainnya diikuti dengan
jagung serta padi maupun ubi kayu, tanaman tersebut masih mampu berproduksi
dengan baik pada tingkat kejenuhan Al di atas 40%. Berdasarkan hasil penelitian
dari Badan Litbang Pertanian menginformasikan bahwa varietas kedelai unggul
seperti Leuser dan Kawi tergolong agak tahan penyakit karat dan sesuai untuk
dikembangkan pada tanah asam (Hafsah 2004).
10
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian
ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Departemen
Biologi FMIPA IPB dan rumah kaca, pada bulan Oktober 2008 – Mei 2009.
Bahan
Galur yang digunakan ialah dua galur mutan terpilih yaitu Bj 11 (5) dan Bj
11 (19) hasil konstruksi Monasari (2007), satu galur tipe liar Bj 11 (wt) hasil
seleksi Endarini et al. (1995). Biakan tersebut diperoleh dari koleksi biakan
Bagian Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA, IPB. Biji tanaman yang
digunakan ialah biji kedelai varietas Slamet koleksi Pusat Penelitian Bioteknologi
dan Genetika Tanaman Bogor. Gambut diperoleh dari Pusat Penelitian
Bioteknologi Perkebunan Bogor. Tanah asam sebagai media pertumbuhan kedelai
diambil dari Desa Cikabayan, Darmaga, Bogor. Komposisi kimia gambut dan
tanah asam dianalisis di Balai Penelitian Tanah, Bogor (Lampiran 1).
Rancangan Percobaan dan Analisis Data
Rancangan percobaan yang digunakan ialah Rancangan Acak Lengkap
Faktorial. Faktor pertama ialah
3 macam galur ditambah kontrol (tanpa
inokulum), faktor kedua ialah waktu penyimpanan (1, 2, dan 3 bulan), faktor
ketiga ialah suhu ruang tempat penyimpanan inokulum suhu ruang (± 25 ºC) dan
suhu 10 ºC. Data dianalisis menggunakan program SAS ver 9.1, uji lanjut dengan
Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada taraf kepercayaan 95%. Analisis data
hasil uji viabilitas dengan rancangan acak lengkap faktorial in time, parameter
yang diukur ialah banyaknya koloni yang tumbuh. Untuk hasil uji efektivitas
simbiotik dengan rancangan acak lengkap faktorial. Parameter yang diukur berupa
tinggi tanaman, berat kering bintil, berat kering tanaman bagian atas (BKTBA),
efektivitas simbiotik, kandungan N total tanaman, dan aktivitas nitrogenase.
12
Penyiapan Inokulan
Masing-masing galur B. japonicum diremajakan dengan metode kuadran
pada media Yeast Mannitol Agar (YMA) (Lampiran 2) yang ditambah merah
kongo sebanyak 0,0025% dan antibiotik rifampisin sebanyak 50 µg/ml, diinkubasi
di tempat gelap pada