Karakterisasi fisiologi dan genetik pseudomonas sebagai biokontrol penyakit cendawan tular tanah pada tanaman kedelai

KARAKTERISASI FISIOLOGI DAN GENETIK
PSEUDOMONAS sp. SEBAGAI BIOKONTROL PENYAKIT
CENDAWAN TULAR TANAH PADA TANAMAN KEDELAI

ARI SUSILOWATI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011

PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI
DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi ”Karakterisasi Fisiologi dan
Genetik Pseudomonas sp. sebagai Biokontrol Penyakit Cendawan Tular Tanah
pada Tanaman Kedelai” adalah karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi
manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.

Bogor, Juni 2011

Ari Susilowati
NIM: G361060051

ABSTRACT
ARI SUSILOWATI. Physiology and Genetic Characterization of Pseudomonas sp.
for Biocontrol of Soilborne Fungal Pathogen in Soybean Plant. Under direction of
ARIS TRI WAHYUDI, ANTONIUS SUWANTO, SURYO WIYONO and
YULIN LESTARI.

Antagonist bacteria have been recognized playing important role in plant
disease suppression. In Indonesia, the role and potential indigenous soybeans’
rhizobacteria such as antagonist Pseudomonas sp. as biocontrol have not many
been reported. The aims of this study were to screen and characterize a number of
Pseudomonas isolates as biocontrol agent against soilborne fungal pathogens i.e.
Sclerotium rolfsii, Fusarium oxysporum or Rhizoctonia solani in soybean plants.
Eleven isolates of Pseudomonas sp. CRB showed strong inhibition on the growth
of the soilborne pathogenic fungi in vitro. Among of them, 7 isolates produced
siderophore, 2 isolates produced chitinase, and 4 isolates produced hydrogen

cyanide. Amplified rDNA restriction analysis (ARDRA) indicated high genetic
diversity level since 7 ribotype groups were presented. 16S rRNA based
sequences phylogenetic tree formed four clusters. There was a quite overlap
among ARDRA groups and 16S rRNA clusters, suggested that in the same
ARDRA group they were closely related to each other. The sequences of 16S
rRNA gene confirmed that the isolates belonging to Pseudomonas sp. and
similarity percentage varied to various species of Pseudomonas showed their
extensive diversity. Part of antifungal biosynthesis gene encoding phenazine, phzF,
phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate aldolase could be detected and confirmed
in Pseudomonas sp. CRB-80 and CRB-102. Seed coating with the Pseudomonas
sp. CRB demonstrated disease suppression in planta at approximately 14-100% in
sterile soil and 5-53% in non-sterile soil. Pseudomonas sp. CRB-16, CRB-44,
CRB-86, CRB-102 and CRB-109 which maintained moderate disease suppression,
more than 30% in non-sterile soil might be considered for development as
biological control agents to protect soybean from the soilborne fungal disease.
Population density in soybean rhizosphere of Pseudomonas sp. CRB-17, CRB-80
and CRB-102 Rifr were 102-107 cells/g fresh root weight in sterile soil, in contrast
to 0-106 cells/g fresh root weight in non-sterile soil for 6 weeks observation.
Key words: Pseudomonas sp., biocontrol, soybean, genetic diversity, antifungal
genes.

RINGKASAN
ARI SUSILOWATI. Karakterisasi Fisiologi dan Genetik Pseudomonas sp.
sebagai Biokontrol Penyakit Cendawan Tular Tanah pada Tanaman Kedelai.
Dibimbing oleh ARIS TRI WAHYUDI, ANTONIUS SUWANTO, SURYO
WIYONO dan YULIN LESTARI.

Proteksi tanaman modern sangat bergantung pada penggunaan bahan
kimia untuk mengatasi hama dan penyakit. Akan tetapi, meningkatnya perhatian
terhadap kesehatan dan kerusakan lingkungan yang disebabkan oleh penggunaan
bahan kimia untuk pertanian menyebabkan peningkatan tuntutan yang lebih besar
terhadap pertanian yang berkelanjutan. Pada tanah yang menekan penyakit dan
kompos, penekanan penyakit diperoleh tanpa penggunaan bahan kimia.
Penekanan penyakit selalu berhubungan dengan keberadaan bakteri antagonis
yang jumlahnya semakin meningkat di dalam tanah. Bakteri rizosfer antagonis
yang bermanfaat ini dapat dikembangkan sebagai agen pengendali biologi untuk
mengurangi penggunaan bahan kimia di bidang pertanian. Di Indonesia, bakteri
antagonis asli rizosfer tanaman kedelai belum banyak dilaporkan dan potensinya
sebagai agen biokontrol perlu diteliti lebih lanjut. Tujuan penelitian ini adalah
untuk mendapatkan kandidat agen biokontrol terhadap cendawan patogen tular

tanah Sclerotium rolfsii, Fusarium oxysporum atau Rhizoctonia solani untuk
tanaman kedelai.
Delapan puluh satu isolat bakteri rizosfer tanaman kedelai digunakan
dalam penelitian ini. Cendawan patogen tular tanah S. rolfsii, F. oxysporum
diperoleh dari Departemen Proteksi Tanaman, IPB. dan R. solani diperoleh dari
Balai Penelitian Tanah Bogor. Bakteri Pseudomonas chlororaphis DF190 dan
DF202 (Prof. Dr. Dilantha Fernando, University of Manitoba, Kanada);
Pseudomonas aureofaciens 30-84, Pseudomonas fluorescens Q2-87, Q8-R1 dan
Pseudomonas fluorescens Pf-5 (Dr. Linda Thomashow, Agricultural Research
Service - United States Department of Agriculture (ARS-USDA), Washington
State University, Amerika Serikat) disertakan dalam penelitian ini sebagai bakteri
kontrol positif deteksi gen-gen anticendawan.
Uji antagonisme dilakukan dengan menggunakan metode kultur ganda.
Besarnya persentase penghambatan pertumbuhan radial cendawan oleh bakteri
dihitung menggunakan rumus 1-(a/b) x 100%, dengan a menunjukkan jarak antara
titik pusat cendawan ke arah isolat bakteri, b menunjukkan jarak antara titik pusat
cendawan ke sisi yang berlawanan tanpa bakteri. Produksi siderofor oleh isolatisolat dideteksi dengan menggunakan media agar-agar Chrome Azurol S (CAS).
Produksi kitinase ditentukan dengan menggunakan medium sintetik yang
mengandung koloid kitin. Produksi hidrogen sianida diketahui dengan
menggunakan indikator alkali pikrat.

Keragaman genetik berdasarkan amplified rDNA restriction analysis
(ARDRA) dilakukan dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR)
menggunakan primer hulu 63f dan primer hilir 1387r. Primer ini mengamplifikasi
sekitar 1.300 bp konsensus gen 16S rRNA yang bersifat umum untuk domain
bakteri. Produk amplifikasi 16S rDNA yang telah dipurifikasi dipotong dengan
enzim restriksi endonuklease HaeIII, RsaI dan AluI (Fermentas Life Science, Uni

Eropa). Pemotongan oleh enzim restriksi dilakukan pada suhu 37ºC semalam.
Dendrogram filogenetik dibuat dengan menggunakan metode neighbour-joining
dalam software TREECON for Windows 1.3b. Identifikasi molekuler dan analisis
keragaman genetik berdasarkan sekuen gen 16S rRNA dilakukan dengan
pencarian kemiripan sekuen menggunakan program Basic Local Alignment
Search Tool for Nucleotide (BLASTN) yang terdapat di National Center for
Biotechnology Information (NCBI), http://www.ncbi.nlm.gov/BLAST. Untuk
pembuatan pohon filogenetik, sekuen gen 16S rRNA disejajarkan dengan
menggunakan clustalW, dan dianalisis berdasarkan metode neighbour-joining
menurut Jukes dan Cantor dalam program MEGA versi 4.
Deteksi gen yang mengkode sintesis senyawa anticendawan dilakukan
dengan metode PCR. Tujuh pasang primer digunakan untuk mengamplifikasi gen
diacetylphloroglucinol (DAPG), fenazin, pioluteorin dan pirolnitrin. Amplifikasi

dengan PCR (Veriti Thermal Cycler, Applied Biosystems, Amerika Serikat)
dilakukan dalam 25µl campuran reaksi. Selanjutnya, produk amplifikasi
dielektroforesis dengan gel agarosa 1% dalam 1x bufer Tris Boric acid EDTA
(TBE) selama 30 menit 100 V, diwarnai dengan ethidium bromida, dan difoto di
atas ultraviolet transilluminator. Kloning gen penyandi senyawa anticendawan
dilakukan dengan vektor pCR®4Blunt-TOPO (Invitrogen, Jepang) dan pGEM-T
Easy (Promega, Amerika Serikat) menggunakan sel elektro-kompeten Escherichia
coli TOP 10 dan E. coli EPI 300 sebagai sel inang. Sekuensing dikerjakan dengan
ABI 3130 DNA Analyzer (Applied Biosystems, Amerika Serikat). Analisis
bioinformasi pencarian kesamaan sekuen nukleotida dilakukan dengan program
BLASTN dan protein dengan program BLASTX pada situs NCBI.
Perlakuan benih (seed coating) dilakukan dengan melapisi benih dengan
bakteri yang telah disuspensikan ke dalam 0.5% karboksil metilselulosa dengan
konsentrasi bakteri 107-108 sel/ml. Duapuluh empat benih kedelai yang telah
dilapisi dengan masing-masing bakteri ditanam pada tanah yang telah diinfestasi
cendawan patogen (103 cfu/g tanah). Penekanan penyakit dievaluasi setelah satu
minggu kecambah muncul dengan menghitung jumlah tanaman yang sehat dan
tanaman yang menunjukkan gejala karena serangan cendawan patogen pada
kondisi tanah steril dan tanah non steril.
Analisis kemampuan kolonisasi rizosfer dilakukan dengan penandaan

resisten antibiotik rifampisin (Rifr). Perlakuan benih dilakukan dengan cara
merendam biji kedelai dalam suspensi bakteri Pseudomonas sp. CRB-Rifr selama
1 jam. Jumlah awal bakteri adalah 106 sel/benih berdasarkan penghitungan bakteri
menggunakan standard plate count. Pemantauan perkembangan populasi
Pseudomonas sp. CRB-Rifr di rizosfer tanaman kedelai pada tanah steril dan non
steril dilakukan selama 6 minggu. Penghitungan jumlah bakteri dilakukan dengan
metode cawan sebar pada medium agar-agar King’s B yang mengandung
rifampisin 100 µg/ml.
Sebelas isolat dari delapan puluh satu isolat Pseudomonas sp. CRB yang
diisolasi dari rizosfer tanaman kedelai telah diseleksi mempunyai sifat-sifat yang
dapat berperan sebagai biokontrol. Sifat-sifat biokontrol yang dipunyai adalah
menunjukkan penghambatan pertumbuhan radial cendawan patogen akar R. solani,
S. rolfsii atau F. oxysporum in vitro antara 11.1-60%. Di antaranya, 7 isolat
menghasilkan siderofor, 2 isolat menghasilkan kitinase dan 4 isolat menghasilkan
hidrogen sianida.

Pemotongan 16S rDNA dengan tiga enzim restriksi HaeIII, RsaI dan AluI
menghasilkan 3 sampai 5 pita dengan ukuran yang berbeda untuk masing-masing
perlakuan enzim restriksi. Perbedaan pola potongan pita DNA tersebut telah dapat
membedakan isolat satu dengan isolat yang lain. Dendrogram berdasarkan

ARDRA mengungkapkan tingkat keragaman genetik yang cukup tinggi di antara
isolat-isolat Pseudomonas sp. CRB, karena berdasarkan analisis ini tujuh
kelompok ribotipe dapat ditunjukkan. Identifikasi molekuler berdasarkan sekuen
gen 16S rRNA (600 nukleotida) bakteri antagonis Pseudomonas sp. CRB
mengarah ke spesies yang berbeda dengan identifikasi berdasarkan morfologi dan
fisiologis Microgen™ tetapi masih pada genus yang sama yaitu Pseudomonas.
Isolat-isolat Pseudomonas sp. CRB mempunyai kemiripan yang tinggi antara
83-100% terhadap berbagai spesies dalam genus Pseudomonas. Tingkat
kemiripan terhadap berbagai spesies Pseudomonas yang beragam juga
menunjukan keragaman spesiesnya. Pohon filogenetik membentuk empat
kelompok hubungan kekerabatan. Isolat-isolat yang berada dalam kelompok yang
sama mempunyai hubungan kekerabatan yang dekat.
Enam pasang primer yang digunakan berhasil mengamplifikasi gen target
penyandi senyawa anticendawan pada bakteri kontrol positif. Empat pasang
primer menghasilkan pita tidak spesifik pada Pseudomonas sp. CRB. Selanjutnya,
optimasi kondisi PCR dengan primer PHZ1/2 menghasilkan pita spesifik 1.6 kb
lebih besar pada Pseudomonas sp. CRB 80 dan 102 dibandingkan dengan ukuran
yang seharusnya 1.4 kb. BLASTN menunjukkan 785 bp dari sekuen lengkap
tersebut paling mirip 92% dengan nukleotida phospho-2-dehydro-3deoxyheptonate aldolase, class I dari Pseudomonas putida KT2440. BLASTX
protein dari nukleotida yang ditranslasi menunjukkan kemiripan 242 asam amino

dengan phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate aldolase, class I dari Pseudomonas
putida GB-1. Phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate aldolase adalah gen phzF.
PhzF adalah bagian dari 7 gen penyandi biosintesis fenazin pada Pseudomonas
aureofaciens 30-84. Hasil ini menunjukkan bahwa bagian gen penyandi
biosintesis fenazin, phzF, dapat terdeteksi dan terkonfirmasi pada Pseudomonas
sp. CRB-80 dan CRB-102. Pada Pseudomonas sp. CRB yang lain, biosintesis
senyawa anticendawan selain fenazin, pioluteorin, pirolnitrin atau
diasetilfloroglusinol diperkirakan terlibat dalam antibiosis.
Hampir semua Pseudomonas sp. CRB, kecuali CRB-3 pada tanah steril,
dapat mengurangi jumlah tanaman yang menunjukkan gejala penyakit karena
serangan cendawan patogen tular tanah dan memberikan penekanan penyakit.
Perlakuan benih dengan Pseudomonas sp. CRB memberikan penekanan penyakit
in planta sekitar 14.3-100% pada tanah steril dan 5.2-52.6% pada tanah non steril.
Pseudomonas sp. CRB-16, CRB-44, CRB-86, CRB-102 dan CRB-109 yang
masih menunjukkan penekanan penyakit cukup tinggi, lebih dari 30% pada tanah
non steril dapat dipertimbangkan untuk dikembangkan sebagai agen pengendalian
hayati untuk aplikasi ke lapang.
Kerapatan populasi di rizosfer Pseudomonas sp. CRB-17, CRB-80 dan
CRB-102 Rifr yang dipelajari kemampuan kolonisasinya antara 102-107 sel/g berat
akar segar pada tanah steril dan 0-106 sel/g berat akar segar pada tanah non steril.

Jumlah sel Pseudomonas sp. CRB-Rifr berkurang sedikit pada tanah non steril
dibandingkan dengan pada tanah steril karena bakteri harus bertahan dan
berkompetisi dengan mikrob lain yang telah ada di tanah sebelumnya.

© Hak cipta milik IPB, tahun 2011
Hak cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
yang wajar IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

KARAKTERISASI FISIOLOGI DAN GENETIK
PSEUDOMONAS sp. SEBAGAI BIOKONTROL PENYAKIT
CENDAWAN TULAR TANAH PADA TANAMAN KEDELAI

ARI SUSILOWATI

Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor pada
Program Studi Biologi/Mikrobiologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011

Judul Penelitian

: Karakterisasi Fisiologi dan Genetik Pseudomonas sp.
sebagai Biokontrol Penyakit Cendawan Tular Tanah
pada Tanaman Kedelai.

Nama

: Ari Susilowati

NIM

: G361060051

Disetujui
Komisi Pembimbing

Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si
Ketua

Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc
Anggota

Dr. Ir. Suryo Wiyono, M.Sc.Agr
Anggota

Dr. Ir. Yulin Lestari
Anggota
Diketahui

Ketua Program Studi Biologi

Dekan Sekolah Pascasarjana IPB

Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA

Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr

Tanggal ujian: 16 Juni 2011

Tanggal lulus:

Penguji pada Ujian Tertutup: Dr. Ir. Giyanto, M.Si
Dr. Ir. Happy Widiastuti, M.Si

Penguji pada Ujian Terbuka: Dr. Ir. Andi Khaeruni R., M.Si
Dr. Ir. Abjad Asih Nawangsih, M.Si

PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala limpahan
rahmat, kasih sayang dan kemudahan-Nya sehingga disertasi yang berjudul
“Karakterisasi Fisiologis dan Genetik Pseudomonas sp. sebagai Biokontrol
Penyakit Cendawan Tular Tanah pada Tanaman Kedelai”, telah berhasil
diselesaikan.
Terima kasih penulis sampaikan kepada Dr. Aris Tri Wahyudi, Prof. Dr.
Antonius Suwanto, Dr. Suryo Wiyono dan Dr. Yulin Lestari sebagai pembimbing
atas bimbingan dan arahan yang diberikan. Penelitian ini didanai oleh Insentif
Ristek Penelitian Dasar tahun 2007 atas nama Dr. Aris Tri Wahyudi, Beasiswa
Program Pasca Sarjana (BPPS), Sandwich Like Program dari Direktorat Jendral
Pendidikan Tinggi dan Rektor Universitas Sebelas Maret Surakarta. Oleh karena
itu, penulis mengucapkan banyak terima kasih. Terima kasih kepada Kepala dan
seluruh staf Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA IPB,
pengelola rumah kaca di Cikabayan atas segala bantuan, fasilitas dan penggunaan
alat. Terima kasih kepada Prof. Tadashi Matsunaga, Dr. Atsushi Arakaki,
Dr. Masayoshi Tanaka, Dr. Nemoto Michiko dan Dr. Yoshiaki Maeda di
Laboratory of Biotechnology, Tokyo University of Agriculture and Technology,
Japan atas bimbingan dan fasilitas laboratorium molekuler. Kepada Prof. Dr.
Dilantha Fernando dan Dr. Rajesh Ramaratnam, University of Manitoba, Canada;
Dr. Linda Thomashow dan Dr. Dimitri Mavrodi, Agricultural Research Service United States Department of Agriculture (ASR-USDA), Washington State
University, USA untuk pemberian bakteri referensi kontrol positif penghasil
anticendawan dan saran-sarannya dalam deteksi gen penyandi senyawa
anticendawan.
Terima kasih kepada Dr. Giyanto (Departemen Proteksi Tanaman,
Fakultas Pertanian, IPB) dan Dr. Happy Widiastuti (Balai Penelitian Bioteknologi
Perkebunan) sebagai penguji luar komisi pada ujian tertutup atas kesedian sebagai
penguji dan saran perbaikan yang diberikan. Dr. Andi Khaeruni R. (Jurusan
Agroteknologi, Fakultas Pertanian, Universitas Haluoleo) dan Dr. Abjad Asih
Nawangsih (Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, IPB) sebagai
penguji pada ujian terbuka atas kesediaannya sebagai penguji.
Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Bapak dan Ibu serta seluruh
keluarga atas segala doa, curahan kasih sayang dan dukungan yang diberikan.
Terima kasih kepada Rika Indri Astuti M.Si, Jonatan Banoet S.Si, Syamsul Bahri
M.E, Dr. Ratna Setyaningsih dan teman-teman lainnya di Laboratorium
Mikrobiologi atas kebersamaan, suka duka, diskusi, saran-saran, dukungan dan
bantuan yang diberikan selama bekerja di laboratorium.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Juni 2011
Ari Susilowati

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Surakarta pada tanggal 28 April 1969, sebagai anak
ketiga dari Bapak Jarman Soegito dan Ibu Siti Darwati. Pendidikan Sarjana
Biologi dalam bidang Botani diselesaikan di Universitas Gadjah Mada pada tahun
1996. Pendidikan Magister Sain dalam bidang Mikrobiologi diselesaikan di
Institut Teknologi Bandung pada tahun 2001. Selanjutnya, penulis mendapatkan
kesempatan melanjutkan sekolah S3 di Program Studi Biologi/Mikrobiologi,
Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor pada tahun 2006 melalui program
Beasiswa Program Pasca Sarjana (BPPS) Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi.
Penulis adalah staf pengajar di Jurusan Biologi, FMIPA Universitas
Sebelas Maret, Surakarta. Selama menjadi mahasiswa S3, penulis telah
mempresentasikan sebagian dari penelitian disertasi pada Seminar Nasional
Pertemuan Ilmiah Tahunan, Perhimpunan Mikrobiologi Indonesia, tahun 2008 di
Purwokerto, dengan judul “Rhizobacteria Pseudomonas sp. Isolated from
Rhizosphere of Soybean Plant that are Potential as Biocontrol of Phytopathogenic
Fungi”. Pada bulan November 2008 - Februari 2009, mengikuti magang
penelitian dalam Sandwich-Like Program Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi di
Laboratorium Prof. Tadashi Matsunaga, Department of Biotechnology, Tokyo
University of Agriculture and Technology, Japan. Pada tahun 2010, telah
mempublikasikan sebagian hasil penelitian di jurnal Microbiology Indonesia, Vol
4, tahun 2010, dengan judul “Genetic Diversity of Antifungal-Producing
Rhizobacteria of Pseudomonas sp. Isolated from Rhizosphere of Soybean Plant”.

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR ISI .................................................................................................
DAFTAR TABEL .........................................................................................
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................

xxi
xxiii
xxv

BAB 1. PENDAHULUAN UMUM
Latar Belakang ..............................................................................................
Tujuan Penelitian ..........................................................................................
Hipotesis ......................................................................................................
Manfaat Penelitian ........................................................................................
Novelty / Kebaruan .......................................................................................
Kerangka Penelitian ......................................................................................

1
6
7
7
7
8

BAB 2. IDENTIFIKASI DAN SELEKSI KARAKTER BIOKONTROL
ISOLAT BAKTERI DARI RIZOSFER TANAMAN KEDELAI
Pendahuluan ..................................................................................................
Bahan dan Metode
Identifikasi isolat bakteri .........................................................................
Antagonis terhadap cendawan patogen ...................................................
Produksi siderofor ...................................................................................
Produksi kitinase ....................................................................................
Produksi HCN dengan alkali pikrat ........................................................
Hasil
Identitas isolat-isolat dari rizosfer tanaman kedelai ..............................
Antagonisme Pseudomonas sp. CRB terhadap cendawan
patogen tular tanah ................................................................................
Pembahasan ...................................................................................................
Simpulan ........................................................................................................
BAB 3. KERAGAMAN GENETIK BAKTERI ANTAGONIS
PSEUDOMONAS sp. CRB
Pendahuluan ..................................................................................................
Bahan dan Metode
Isolasi DNA genom ...............................................................................
Amplifikasi gen penyandi 16S rRNA .....................................................
Analisis ARDRA ....................................................................................
Analisis sekuen gen 16S rRNA ..............................................................
Hasil
Keragaman genetik berdasarkan ARDRA ..............................................
Keragaman genetik berdasarkan sekuen gen 16S rRNA ........................
Pembahasan ...................................................................................................
Simpulan .......................................................................................................

9
10
11
11
12
12
13
17
19
21

23
24
25
26
27
27
32
35
37

BAB 4. DETEKSI DAN KARAKTERISASI GEN PENYANDI
BIOSINTESIS SENYAWA ANTICENDAWAN
Pendahuluan ..................................................................................................
Bahan dan Metode
Deteksi gen anticendawan dengan PCR .................................................
Kloning DNA dengan vektor pCR®4Blunt-TOPO®................................
Kloning DNA dengan vektor pGEM-T Easy .........................................
Sekuensing DNA .....................................................................................
Hasil
Amplifikasi gen penyandi biosintesis anticendawan .............................
Optimasi PCR gen fenazin …………………………………….…........
Kloning fragmen gen fenazin .................................................................
Sekuen fragmen gen fenazin ...................................................................
Pembahasan ...................................................................................................
Simpulan ........................................................................................................
BAB 5. PENEKANAN PENYAKIT IN PLANTA
Pendahuluan ..................................................................................................
Bahan dan Metode
Asai patogenisitas cendawan patogen terhadap akar tanaman kedelai ...
Penyiapan inokulum cendawan ...............................................................
Perlakuan benih .......................................................................................
Uji penekanan penyakit in planta ...........................................................
Hasil
Patogenisitas cendawan ...........................................................................
Penekanan penyakit .................................................................................
Pembahasan ...................................................................................................
Simpulan ........................................................................................................
BAB 6. KOLONISASI RIZOSFER
Pendahuluan ..................................................................................................
Bahan dan Metode
Mutasi spontan resistensi antibiotik rifampisin ......................................
Pertumbuhan spesifik Pseudomonas sp. CRB Rifr ................................
Kolonisasi rizosfer pada tanah steril dan non steril .................................
Pengamatan kolonisasi rizosfer pada tanaman kedelai ..........................
Hasil ...............................................................................................................
Pembahasan ...................................................................................................
Simpulan .......................................................................................................

39
41
44
47
49
51
55
56
59
62
64

65
66
67
67
68
69
74
74
78

81
83
83
83
84
85
89
90

BAB 7. PEMBAHASAN UMUM ................................................................
SIMPULAN ...........................................................................................
SARAN ..................................................................................................

91
94
95

DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................

97

LAMPIRAN ..................................................................................................

109

DAFTAR TABEL
Halaman
Identifikasi Pseudomonas sp. CRB yang mempunyai karakter
biokontrol menggunakan kit fisiologis Microgen™. Kit Microgen™
terdiri dari 24 sumur (GNA dan GNB) yang berisi substrat biokimia
standar ………………………………………………………………

16

Karakter biokontrol Pseudomonas sp. CRB yang diisolasi dari
rizosfer tanaman kedelai ……………………………………………

18

Fragmen 16S rDNA (bp) hasil pemotongan enzim restriksi AluI,
RsaI dan HaeIII isolat Pseudomonas sp. CRB penghasil
anticendawan .....................................................................................

30

Taxon spesies dalam pusat data GenBank dengan sekuen gen 16S
rRNA yang paling mirip dengan sekuen parsial (600 nukleotida)
masing-masing isolat Pseudomonas sp. CRB ………………………

32

5

Reaksi ligasi menggunakan Zero Blunt TOPO PCR Cloning ............

44

6

Reaksi PCR menggunakan polimerase Prime StarMax .....................

45

7

Reaksi ligasi dengan vektor pGEM-T Easy .......................................

48

8

Campuran reaksi untuk siklus sekuensing menggunakan ABI
BigDye Terminator ............................................................................

49

Produk amplifikasi gen penyandi biosintesis anticendawan dan
primer yang digunakan pada Pseudomonas sp. CRB dan bakteri
kontrol positif Pseudomonas chlororaphis DF190, DF202,
Pseudomonas aureofaciens 30-84, Pseudomonas fluorescens Q2-87,
Q8-R1, Pf-5 .......................................................................................

51

Kemiripan nukleotida fragmen gen PHZ1/PHZ2 dengan pusat data
di GenBank menggunakan Basic Local Alignment Search Tool for
Nucleotide (BLASTN) .......................................................................

59

Kemiripan protein fragmen gen PHZ1/PHZ2 dengan pusat data di
GenBank menggunakan Basic Local Alignment Search Tool for
Protein, using translated nucleotide (BLASTX) .............................

60

Kemiripan nukleotida sekuen lengkap 1.6 kb fragmen gen
PHZ1/PHZ2 dengan pusat data di GenBank menggunakan Basic
Local Alignment Search Tool for Nucleotide (BLASTN) ..................

61

1

2

3

4

9

10

11

12

13

14

Kemiripan protein sekuen lengkap 1.6 kb fragmen gen PHZ1/PHZ2
dengan pusat data di GenBank menggunakan Basic Local Alignment
Search Tool for Protein, using translated nucleotide (BLASTX) ....

62

Penekanan penyakit oleh Pseudomonas sp. CRB pada tanaman
kedelai umur 1 minggu yang ditumbuhkan pada tanah steril dan
tanah non steril, yang diinfestasi dengan cendawan patogen
Sclerotium rolfsii, Fusarium oxysporum atau Rhizoctonia solani
103cfu/g tanah secara buatan ..............................................................

75

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1

2

3

4

5

6

7

8

Morfologi bakteri bentuk batang, Gram negatif dari 11 isolat
antagonis Pseudomonas sp. CRB yang ditunjukkan dengan
pewarnaan Gram. Skala
10µm ………………………………..

14

Antagonis in vitro Pseudomonas sp. CRB-80 terhadap Sclerotium
rolfsii (A), Pseudomonas sp. CRB-86 terhadap Fusarium oxysporum
(B) dan Pseudomonas sp. CRB-102 terhadap Rhizoctonia solani (C)
………………………………………………………………………..

17

Elektroforesis 16S rDNA 11 isolat Pseudomonas sp. CRB penghasil
senyawa anticendawan dengan nomer isolat: 3, 16, 17, 31, 44, 75,
80, 86, 102, 109 dan 112) M = Marker 1 kb DNA ladder
(Fermentas) .........................................................................................

28

Elektroforesis 16S rDNA setelah dipotong dengan menggunakan
enzim restriksi AluI, RsaI dan HaeIII dari 11 isolat Pseudomonas sp.
CRB penghasil anticendawan. M = Marker 1 kb DNA ladder
(Fermentas) .........................................................................................

29

Dendrogram pengelompokan dan elektroforegram Pseudomonas sp.
CRB yang mempunyai karakter biokontrol, berdasarkan profil
restriksi dengan tiga enzim endonuklease HaeIII, RsaI dan AluI.
Masing-masing ribotipe ditandai dengan kurung kanan
………………………………………………………………...……...

31

Pohon filogenetik di antara sebelas isolat Pseudomonas sp. CRB
dengan galur referensi yang mempunyai sifat biokontrol
Pseudomonas fluorescens CHA0 (No akses AJ278812), Pf-5
(CP000076.1) dan Escherichia coli (E24377A) sebagai kelompok γ
proteobacteria berdasarkan sekuen parsial (600 nukleotida) gen 16S
rRNA ..................................................................................................

34

Amplifikasi gen DAPG dengan primer phl2a dan phl2b, kontrol
positif Pf5, Q2-87, dan Q8-R1 teramplifikasi (750 bp),
Pseudomonas sp. CRB-80 teramplifikasi (900 bp). M = marker 1 kb
ladder (Fermentas) ………………………………………………….

52

Amplifikasi gen fenazin dengan primer PHZX/PHZY, kontrol
positif DF190 dan DF202 teramplifikasi (1.1 kb); tetapi tidak
teramplikasi pada Pseudomonas sp. CRB. M = marker 1 kb ladder
(Invitrogen) ………………………………………………………….

52

9

Amplifikasi gen fenazin dengan primer PHZ1/PHZ2, kontrol positif
DF190 dan DF202 teramplifikasi (1.4 kb), pada Pseudomonas sp.
CRB (16, 17, 44, 80, 82, 102) teramplifikasi menghasilkan pita-pita
yang tidak spesifik. M = marker 1 kb ladder (Invitrogen) .................

53

10 Amplifikasi gen pioluteorin dengan primer pltBf/pltBr, kontrol
positif DF190 and DF202 teramplifikasi (773 bp), pada
Pseudomonas sp. CRB (16, 17, 44, 80, 82, 102) teramplifikasi
menghasilkan pita-pita yang tidak spesifik. M = marker 1 kb ladder
(Invitrogen) ........................................................................................

53

11 Amplifikasi gen pirolnitrin dengan primer PRND1/PRND2, kontrol
positif DF190 dan DF202 teramplifikasi (800 bp); tetapi tidak
teramplifikasi pada Pseudomonas sp. CRB. M = marker 1 kb ladder
(Invitrogen) ………………………………………………………….

54

12 Amplifikasi gen pirolnitrin dengan primer prnCf/prnCr,
Pseudomonas sp. CRB (16, 17, 80, and 102) menghasilkan pita-pita
tidak spesifik. Gen target dari Pf5 teramplifikasi menghasilkan 719
bp. M = Marker 1 kb ladder (Fermentas) …………………………..

54

13 Optimasi suhu penempelan primer PHZ1/PHZ2 pada 54, 55, 56, 57,
58°C untuk Pseudomonas sp. CRB 16 (A), 80 (B), dan 102 (C).
Pseudomonas sp. CRB 16 menunjukkan pita tunggal (~2000 bp)
pada 56ºC, 80 (~1600 bp) pada 58ºC dan 102 pada 57ºC. M =
marker 1 kb ladder (Invitrogen) .........................................................

55

14 Amplifikasi gen fenazin dengan primer PHZ1/PHZ2, lajur 1 bakteri
kontrol positif P. aureofaciens 30-84, lajur 2 P. chlororaphis
DF190, lajur 3 DF202 masing-masing teramplifikasi (1.4 kb), lajur
4, 5 Pseudomonas sp. CRB-80, lajur 6, 7 CRB-102 teramplifikasi
(1.6 kb). M = marker 1 kb ladder (Fermentas) ...........................................

56

15 Koloni PCR langsung amplifikasi DNA sisipan PHZ1/PHZ2 (~1 kb)
dan (~2 kb) pada Pseudomonas sp. CRB-16 (A). Amplifikasi DNA
sisipan PHZ1/PHZ2 (1.6 kb) pada Pseudomonas sp. CRB-80 (B,
lajur 1-5), pada Pseudomonas sp. CRB-102 (B, lajur 6-10)
M = marker 1kb ladder (Invitrogen) ..................................................

57

16 Koloni putih biru sel transforman EPI 300 di medium selektif LA
ampisilin/IPTG/X-Gal (A). Gambar yang diperbesar (B) …………..

57

17 Koloni PCR: amplifikasi DNA sisipan PHZ1/PHZ2 (~1.6 kb) pada
Pseudomonas sp. CRB-80 (lajur 1-10) dan CRB-102 (lajur 11-22).
M = Marker 1 kb ladder (Invitrogen) .....................................

58

18 Busuk akar yang disebabkan oleh cendawan patogen di tabung
reaksi dengan medium agar-agar air. Sclerotium rolfsii (A),
Fusarium oxysporum (B), Rhizoctonia solani (C), kontrol tanpa
infeksi cendawan patogen (D) ...........................................................

69

19 Gejala penyakit karena cendawan patogen tular tanah: busuk
kecambah karena R. solani (1), karena S. rolfsii (2); kerusakan
kotiledon dan hipokotil karena R. solani (3) karena S. rolfsii (4) dan
kerusakan kotiledon karena F. oxysporum (5-6) ................................

70

19 (lanjutan) Gejala penyakit karena cendawan patogen tular tanah:
kerusakan kotiledon dan tunas daun karena F. oxysporum (7), karena
R. solani (8); busuk pada pangkal batang yang menyebabkan layu
karena S. rolfsii (9a, 9b, 10) ...............................................................

71

19 (lanjutan) Gejala penyakit karena cendawan patogen tular tanah:
beberapa tanaman yang mengalami infeksi cendawan yang berlanjut
menunjukkan gejala penghambatan pertumbuhan (stunted) di antara
tanaman yang sehat (11). Tanaman sehat, tidak menunjukkan adanya
gejala penyakit (12) …………………………………………………

72

19 (lanjutan) Tanaman sehat; tanaman yang bergejala busuk akar dan
penghambatan pertumbuhan saat tanaman dicabut dari tanahnya,
pada perlakuan asai penekanan penyakit, kecambah kedelai umur 7
hari. A. Tanah steril; B. Tanah non steril ...........................................

73

20 Kurva pertumbuhan Pseudomonas sp. CRB-17, CRB-80, CRB-102
tipe liar dan mutan resisten rifampisin (Rifr) .....................................

85

21 Morfologi koloni Pseudomonas sp. CRB-17 (Rifr), biakan umur 48
jam pada medium King’s B + rifampisin 100 µg/ml (A) dan tipe
liarnya pada medium King’s B (B). Koloni bentuk bulat berwarna
kuning fluoresen .................................................................................

86

22 Antagonisme Pseudomonas sp. CRB-80 Rifr (mutan resisten
rifampisin) terhadap cendawan S. rolfsii (A); Pseudomonas sp.
CRB-17 Rifr terhadap F. oxysporum (B) dan Pseudomonas sp. CRB102 Rifr terhadap R. solani (C) di cawan Petri ..................................

87

23 Kolonisasi rizosfer Pseudomonas sp. CRB-17, CRB-80 dan CRB102 mutan resisten rifampisin (RifR) pada akar tanaman kedelai,
pada tanah steril (A) dan tanah non steril (B) ....................................

88

BAB 1
PENDAHULUAN UMUM
Latar Belakang
Proteksi tanaman modern sangat bergantung pada penggunaan bahan
kimia untuk mengatasi hama dan penyakit (Cook et al. 1996). Akan tetapi,
meningkatnya perhatian terhadap kesehatan dan kerusakan lingkungan yang
disebabkan oleh penggunaan bahan kimia untuk pertanian meningkatkan
kebutuhan yang lebih besar terhadap pertanian yang berkelanjutan. Tanah yang
menekan penyakit (diasease suppressive soil) adalah tanah yang mampu menekan
fitopatogen untuk bertahan lebih lama, atau fitopatogen ada tetapi gagal untuk
menginduksi gejala penyakit yang parah pada tanaman budidaya yang rentan
terhadap patogen (Schroth & Hancock 1982). Meskipun jarang, fenomena ini,
telah diketahui dengan baik dan bukti-bukti yang kuat menunjukkan bahwa
penekanan penyakit merupakan hasil dari keberadaan rizobakteria antagonis.
Mekanisme bakteri antagonis rizosfer memediasi terjadinya penekanan penyakit
telah diteliti secara luas (Cook & Baker 1996; Bloemberg & Lugtenberg 2001;
Haas & Keel 2003).
Penyakit busuk kecambah, busuk akar oleh Rhizoctonia solani, hawar
batang dan layu oleh Sclerotium rolfsii masih disebut sebagai penyakit utama
tanaman kedelai di Indonesia, selain penyakit karat karena Phakospora pachyrhizi,
penyakit pustul bakteri Xanthomonas axonopodis pv glycines, penyakit
antrachnosa Colletotrichum dematium var truncatum dan C. destructivum atau
penyakit karena mosaik virus (Puslitbang Tanaman Pangan 2009; Balai
Pengkajian Teknologi Pertanian, Sumatera Utara 2009). Wrather et al. (2001)
menyatakan bahwa penyakit busuk kecambah karena Rhizoctonia dan Fusarium
spp, busuk akar karena Fusarium spp dan hawar batang karena S. rolfsii
merupakan penyakit yang menyebabkan kehilangan panen kedelai yang cukup
besar yaitu sekitar 12.5 ribu ton dari total kehilangan panen karena penyakit yang
jumlahnya 147.5 ribu ton di Indonesia pada tahun 1998. Kehilangan panen kedelai
terbesar di Indonesia disebabkan karena penyakit karat sebesar 60 ribu ton dan
mosaik virus 50 ribu ton. Kehilangan panenan karena penyakit virus cenderung

2

meningkat dari waktu ke waktu, tetapi kehilangan panenan karena penyakit lain
tidak berubah. Berdasarkan luas daerah penyebaran dan tingkat serangan dapat
dikemukakan bahwa karat daun, bercak daun, downy mildew, bakteri pustul dan
S. rolfsii berstatus penting. Cendawan tular tanah R. solani juga masih
menunjukkan intensitas serangan 15.5% dari total serangan penyakit (Balai
Penelitian Tanaman Kacang-kacangan dan Umbi-umbian 2005).
Pengendalian penyakit tanaman kedelai diperlukan untuk memberikan
pencegahan kehilangan panen. Pengendalian penyakit yang dilakukan di
Indonesia terutama adalah pengendalian penyakit karat daun dengan fungisida
Mancozeb (Dithane 45), penyakit busuk batang dan akar menggunakan jamur
antagonis Thrichoderma harzianum, sedangkan pengendalian virus dengan
mengendalikan vektornya yaitu serangga hama kutu dengan insektisida Decis
(Balai Pengkajian Teknologi Pertanian, Sumatera Utara 2009; Balai Penelitian
Tanaman Kacang-kacangan dan Umbi-umbian 2011). Di beberapa negara lain
seperti di Amerika dan Brazil, untuk melindungi biji dan kecambah kedelai
terhadap serangan Rhizoctonia dan Fusarium dilakukan dengan menggunakan
fungisida. Produk yang mengandung carboxin, pentachloronitrobenzene (PCNB)
atau fludioxonil, seperti ApronMaxx, Delta-Coat AD, Maxim 4FS atau berbagai
produk Vitavax, dapat melindungi biji dan kecambah terhadap Rhizoctonia
(Bradley 2003). Beberapa fungisida yang mengandung bahan aktif carbendazim
dan carboxin serta thiram direkomendasikan sebagai perlakuan benih kedelai
untuk mengurangi patogen biji dan juga serangan patogen tanah seperti R. solani
dan Fusarium spp., terutama pada kondisi kering yang dapat memperlambat
munculnya kecambah. Patogen tersebut dapat mengurangi populasi tanaman
(Embrapa 2008).
Perlakukan biji kedelai dengan fungisida dapat digunakan untuk
melindungi infeksi beberapa cendawan patogen terhadap kecambah, memperbaiki
populasi tanaman dan mengurangi penyebaran penyakit yang terbawa biji. Akan
tetapi, fungisida untuk perlakuan benih pada kedelai mempunyai efek negatif
terhadap inokulan Rhizobium. Sebagian besar fungisida mengurangi viabilitas
Rhizobium (Fox et al. 2009). Fungisida Captan dan PCNB mengurangi daya hidup
Rhizobium dan mengurangi nodulasi pada biji yang diperlakukan dibandingkan

3

dengan biji yang diinokulasi Rhizobium tanpa perlakuan fungisida (Bradley 2003).
Fungisida carbendazim yang ditambah thiram dan carboxin yang ditambah thiram,
keduanya mengurangi

nodulasi oleh Bradyrhizobium elkanii. Fungisida

carbendazim dengan thiram mengurangi nodulasi sekitar 50% dan panen biji lebih
dari 20% (sekitar 700 kg/ha), pada perlakuan inokulasi dengan B. elkanii galur
SEMIA 587 (Zilli et al. 2009). Oleh karenanya, perhatian harus diberikan dalam
pemakaian fungisida sebagai perlakuan benih pada kedelai. Fungisida dapat
menjadi inhibitor potensial dalam nodulasi tanaman kedelai, sebagai akibatnya
adalah gangguan perkembangan tanaman dan penurunan hasil panen.
Pseudomonas, Bacillus dan Streptomyces ialah bakteri yang penting dari
komunitas bakteri di rizosfer. Keberadaannya selalu berhubungan dengan
penekanan penyakit. Kemampuan kelompok Pseudomonas untuk menekan
pertumbuhan mikrob patogen tanah tergantung pada kemampuannya untuk
menghasilkan antibiotik seperti pioluteorin, pirolnitrin, fenazin (Chin-A-Woeng et
al. 2003) dan 2,4-diacetylphloroglucinol (DAPG) (de Souza et al. 2003). Galurgalur dari Pseudomonas fluorescens penghasil senyawa anticendawan merupakan
agen biokontrol yang penting untuk fitopatogen tular tanah. Beberapa
Pseudomonas sp. juga menghasilkan hidrogen sianida (Haas & Keel, 2003),
senyawa berberat molekul rendah yang disebut siderofor (O‟Sullivan & O‟Gara
1992; Loper & Henkels 1999) atau enzim kitinase dan glukanase (Saad 2006).
Pioluteorin adalah antibiotik poliketida terklorinasi, dihasilkan oleh
rizobakteria P. fluorescens Pf-5 (Howel & Stipanovic 1980). Pioluteorin
menunjukkan antagonis terhadap Pythium ultimum dan mampu menekan penyakit
busuk kecambah pada benih tanaman kapas yang disebabkan oleh P. ultimum.
Sepuluh gen yang terlibat dalam sintesis pioluteorin telah dideskripsikan, terdiri
dari delapan gen struktural yaitu pltLABCDEFG dan dua gen regulator transkripsi
yaitu pltR dan pltM (Nowak-Thompson et al. 1999).
Pirolnitrin [3-chloro-4-(2’-nitro-3’chlorophenyl) pyrrole] dideskripsikan
pertama kali pada Burkholderia pyrrocinia (Arima et al. 1964). Selanjutnya,
pirolnitrin ditemukan pada Pseudomonas, Enterobacter, Myxococcus dan Serratia
(Hammer et al. 1997). Pirolnitrin berperan penting dalam aktivitas anticendawan
(Hill et al. 1994; Raaijmakers et al. 2002), juga pada tanah-tanah yang menekan

4

penyakit secara alami terhadap R. solani (Garbeva et al. 2004). Bakteri endofit
tanaman tebu penghasil pirolnitrin, Burkholderia cepacia, menunjukkan
penghambatan terhadap cendawan patogen Fusarium moniliforme (Mendes et al.
2007). Empat gen yang terlibat dalam biosintesis pirolnitrin prnABCD telah
dideskripsikan oleh Hammer et al. (1997). Fungsi masing-masing produk gen
prnABCD dijelaskan oleh Kirner et al. (1998).
Antibiotik fenazin yang dihasilkan oleh galur biokontrol P. fluorescens
2-79 dan P. aureofaciens 30-84 merupakan faktor utama dalam kemampuannya
menghambat pertumbuhan cendawan patogen akar (Mazzola et al. 1992). Hampir
semua jenis fenazin mempunyai spektrum luas terhadap berbagai spesies bakteri
dan cendawan. Aktivitas ini berhubungan dengan senyawa fenazin yang terlibat
dalam transformasi oksidasi-reduksi sehingga menyebabkan terjadinya akumulasi
radikal superoksida yang bersifat racun pada sel target (Hassett et al. 1995; PriceWhelan et al. 2006). Kelompok gen yang berperan dalam biosintesis fenazin
dipaparkan secara lengkap oleh Mavrodi et al. (1998). Gen yang berperan dalam
biosintesis fenazin pada P. fluorescens 2-79 terdiri dari 7 gen yang disebut sebagai
phzABCDEFG. Produk gen phzC, phzD dan phzE mempunyai kemiripan dengan
enzim-enzim dalam metabolisme asam sikimat dan asam korismat dan bersama
dengan phzF dibutuhkan untuk produksi phenazine 1 carboxylic acid (PCA).
PhzG mirip dengan pirodoksamin-5‟-fosfat oksidase dan merupakan sumber
kofaktor enzim-enzim untuk sintesis PCA. Produk gen phzA dan phzB sangat
mirip satu dengan yang lain dan diperkirakan terlibat dalam stabilisasi komplek
multienzim untuk sintesis PCA.
Beberapa

penelitian

telah

mendemonstrasikan

bahwa

beberapa

Pseudomonas sp. dengan kemampuannya menghasilkan metabolit anticendawan
DAPG dapat diisolasi dengan frekuensi yang tinggi dari tanah yang menekan
penyakit busuk akar hitam (black root rot) pada tanaman tembakau (Keel et al.
1992) dan penyakit take-all pada tanaman gandum (Raaijmakers et al. 1997).
Produksi antibiotik DAPG dianggap sebagai metabolit anticendawan yang penting
yang berperan sebagai senyawa biokontrol. Gen phlABCDEF yang terlibat dalam
biosintesis DAPG dari P. fluorescens Q2-87 telah diidentifikasi

dan

dikarakterisasi (Bangera & Thomashow 1999). Gen phlD bertanggungjawab

5

untuk sintesis monoacetylphloroglucinol (MAPG) yang merupakan prekursor
DAPG dari asetil-koenzim A.
Ketersediaan gen biosintesis senyawa anticendawan yang telah diklon dan
disekuen akan memudahkan untuk mengembangkan primer dan probe. Primer
dan probe spesifik dapat digunakan untuk mendeteksi adanya Pseudomonas spp.
penghasil anticendawan (de Souza & Raaijmakers 2003). Dengan bantuan metode
molekuler ini dapat mempercepat deteksi galur-galur penghasil senyawa
anticendawan yang lebih teradaptasi pada kondisi tanah lokal atau pada sistem
tanaman-patogen

tertentu

(Raaijmakers

et

al.

1997).

Oleh

karenanya,

pengembangan bakteri antagonis yang menghasilkan senyawa anticendawan
sebagai agen biokontrol sangat menjanjikan untuk aplikasinya di bidang pertanian.
Di Indonesia, bakteri antagonis dari rizosfer tanaman kedelai asli penghasil
senyawa anticendawan belum banyak dilaporkan dan potensinya sebagai agen
biokontrol perlu diteliti lebih lanjut. Meskipun tujuan utamanya ialah
mendapatkan agen biokontrol, penting juga untuk memahami secara molekuler
gen penyandi biosintesis senyawa anticendawan pada Pseudomonas sp. Informasi
tentang gen yang terlibat dalam biosintesis senyawa anticendawan dapat
digunakan untuk mengembangan sifat-sifat biokontrol secara genetik lebih lanjut
atau mentransfer gen penyandi biosintesis senyawa anticendawan ke galur
penerima.
Pemilihan kandidat agen biokontrol akan lebih leluasa jika keragaman
genetik di antara isolat-isolat bakteri antagonis tinggi. Kelompok bakteri yang
mempunyai tingkat keragaman genetik tinggi di dalam populasinya akan lebih
banyak variasi untuk dipilih di antaranya yang paling sesuai atau dikembangkan
semuanya sekaligus. Lebih jauh lagi, pengetahuan keragaman genetik di antara
kelompok bakteri antagonis dapat membantu untuk mengidentifikasi isolat yang
mempunyai kemampuan menekan cendawan patogen dan kemampuan menjaga
keberadaanya di rizosfer. Hasil penelitian yang menunjukkan sifat-sifat agen
biokontrol yang unggul yang dimiliki oleh isolat-isolat Pseudomonas sp. dari
rizosfer tanaman kedelai diharapkan dapat digunakan untuk melindungi tanaman
kedelai dari serangan cendawan patogen tular tanah dan meningkatkan produksi
kedelai di Indonesia di masa mendatang.

6

Sifat

lain

yang

harus

dimiliki

oleh

bakteri

biokontrol

ialah

kemampuannya mengkolonisasi rizosfer. Kemampuan mengkolonisasi rizosfer
telah dipertimbangkan sebagai faktor utama yang menentukan efektif dan efisien
inokulum bakteri biokontrol untuk mengendalikan penyakit dan peningkatan
produksi tanaman (Compant et al. 2005). Keberhasilan mengkolonisasi rizosfer
dan bertahan hidup oleh bakteri biokontrol telah didemonstrasikan sebagai suatu
persyaratan utama jika bakteri tersebut akan diaplikasikan pada tanaman (Chin-AWoeng et al. 2000). Kemampuan bakteri mencapai jumlah populasi yang cukup
di rizosfer sangat penting dalam memberikan pengaruh sifat-sifat bakteri yang
menguntungkan pada kesehatan tanaman.

Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan kandidat agen biokontrol
terhadap cendawan patogen tular tanah Sclerotium rolfsii, Fusarium oxysporum
atau Rhizoctonia solani pada tanaman kedelai. Tujuan penelitian tersebut dicapai
melalui 5 tahapan penelitian sebagai berikut:
1. Identifikasi dan penapisan karakter biokontrol isolat-isolat dari rizosfer
tanaman kedelai.
2. Analisis keragaman genetik di antara isolat-isolat antagonis terhadap
cendawan patogen tular tanah S. rolfsii, F. oxysporum atau R. solani.
3. Deteksi dan karakterisasi molekuler gen penyandi senyawa anticendawan
pioluteorin, pirolnitrin, fenazin atau 2,4-diasetilfloroglusinol isolat-isolat
yang mempunyai kemampuan menghambat pertumbuhan cendawan
patogen tular tanah secara in vitro.
4. Uji penekanan penyakit yang disebabkan cendawan patogen tular tanah
S. rolfsii, F. oxysporum atau R. solani oleh isolat-isolat antagonis in planta.
5. Kolonisasi rizosfer oleh isolat-isolat antagonis menggunakan penanda
resisten antibiotik rifampisin.

7

Hipotesis
Ditemukan isolat-isolat Pseudomonas sp. dari rizosfer tanaman kedelai
yang mempunyai karakter biokontrol, menunjukkan keragaman genetik tinggi,
terbukti mempunyai gen yang mengkode biosintesis senyawa anticendawan,
memberikan penekanan penyakit yang disebabkan cendawan patogen tular tanah
in planta serta mempunyai kemampuan bertahan dan sifat kompetitif di rizosfer.

Manfaat Penelitian
Tersedia isolat dan informasi mengenai karakter Pseudomonas sp. yang
diisolasi dari rizosfer tanaman kedelai sebagai salah satu kelompok bakteri
berpotensi sebagai agen biokontrol terhadap cendawan patogen tular tanah.
Pseudomonas sp. yang mempunyai karakter biokontrol, menunjukkan penekanan
penyakit in planta, selanjutnya dapat digunakan atau diaplikasikan sebagai agen
hayati untuk menekan penyakit yang disebabkan oleh cendawan patogen tular
tanah. Pemakaian agen hayati sebagai biopestisida akan mendukung pertanian
yang berkelanjutan.

Novelty / Temuan baru
Penemuan isolat Pseudomonas sp. asli dari rizosfer tanaman kedelai
bersifat biokontrol terhadap cendawan patogen tular tanah S. rolfsii, F. oxysporum
atau