Potential of Kaempferol Soursop Leaves as Inhibitor Raji Cancer Cell Proliferation
i
POTENSI KAEMPFEROL DAUN SIRSAK SEBAGAI
PENGHAMBAT PROLIFERASI SEL KANKER RAJI
BAIQ AYU APRILIA MUSTARIANI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
ii
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Potensi Kaempferol Daun Sirsak
sebagai Penghambat Proliferasi Sel Kanker Raji adalah karya saya dengan arahan
dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Juli 2011
Baiq Ayu Aprilia Mustariani
NIM G451090041
iii
ABSTRACT
BAIQ AYU A. MUSTARIANI. Potential of Kaempferol Soursop Leaves as
Inhibitor Raji Cancer Cell Proliferation. Under direction of SUMINAR S.
ACHMADI, IRMA H. SUPARTO, and SILMI MARIYA.
Leaves of soursop (Annona muricata) has been widely studied, particularly
as anti-cancer, but research on flavonoids as anticancer partion isolated from the
leaves of the soursop has not been found. Therefore, the purpose of this study is to
determine the effectiveness of flavonoids isolated from leaves of the soursop in
inhibiting cancer cell proliferation using Raji cells (ATCC CCL-86), Extraction
was done by maceration technique using successive solvents, i.e. n-hexane,
CH2Cl2 and MeOH-H2O. Separation of active extract used preparative thin layer
chromatography. Methanolic activity assay extract was performed on normal cells
to determination initial concentration on cancer cells showed, that the lowest
inhibition was at concentrations of 1000 µg mL-1 − 500 µg mL-1 with percent
inhibition 48% and 31%, respectively. The flavonoids produced a single spot on
thin layer chromatograph with Rf value of 0.87. Identification of flavonoids by
UV-Vis spectrometer and high performance liquid chromatography confirmed
that the flavonoid was kaempferol. Kaempferol extract obtained wastested on Raji
cells and Vero cells. For Raji cells the methanolic extract inhibited 76% of the
cells at concentration of 250 µg mL-1 but for the normal cells it only inhibited
20%. These results suggest that kaempferol from the soursop leaf can inhibit cell
proliferation of Raji cells but gives minimal toxic effect on Vero cells.
Keywords: Annona muricata, flavonoids, kaempferol, cancer cell proliferation.
iv
RINGKASAN
BAIQ AYU A. MUSTARIANI. Potensi Kaempferol Daun Sirsak sebagai
Penghambat Proliferasi Sel Kanker Raji. Dibimbing oleh SUMINAR S.
ACHMADI, IRMA H. SUPARTO, dan SILMI MARIYA.
Sirsak (Annona muricata) merupakan salah satu tanaman dari famili
Annonaceae yang sangat potensial dalam mengobati penyakit kanker. Biji dan
daun sirsak sebagai antikanker secara empiris telah banyak digunakan, akan tetapi
senyawa yang lebih banyak diteliti sebagai agen antikanker pada sirsak adalah
senyawa asetogenin yang merupakan suatu poliketida, yaitu salah satu metabolit
sekunder dari famili Annonaceae. Penelitian tentang senyawa-senyawa lain dalam
tanaman ini yang diperkirakan aktif sebagai antikanker belum banyak ditelusuri di
antaranya ialah senyawa flavonoid. Beberapa penelitian melaporkan bahwa
senyawa flavonoid dari genus sirsak memiliki aktivitas dalam menghambat sel
kanker. Senyawa flavonoid yang berpotensi menghambat sel kanker pada famili
Annonaceae di antaranya ialah kaempferol. Penelitian terhadap daun sirsak sendiri
lebih banyak dilaporkan dalam bentuk ekstrak kasarnya sehingga masih perlu
dilakukan penelusuran lebih lanjut tentang aktivitas senyawa flavonoid dari daun
sirsak dengan menguji pada sel kanker. Oleh sebab itu tujuan penelitian ini ialah
ingin mengisolasi potensi senyawa flavonoid kaempferol dari daun sirsak yang
berpotensi sebagai antikanker dengan menguji efektivitas isolat flavonoid dari
daun sirsak dalam menghambat pertumbuhan sel kanker Raji.
Metode isolasi flavonoid dari daun sirsak terdiri atas beberapa tahap, yaitu
pemilihan tumbuhan dan subjek uji, penentuan kadar air, uji flavonoid, ekstraksi
flavonoid kaempferol, pemilihan eluen terbaik, fraksinasi menggunakan
kromatografi lapis tipis preparatif, dan uji aktivitas penghambatan proliferasi
terhadap sel Vero (ATCC CCl-81) dan sel Raji (ATCC CCL 86).
Kandungan flavonoid ditentukan dalam serbuk daun dan dalam ekstrak
kasar daun. Berdasarkan uji fitokimia secara kualitatif, serbuk daun dan ekstrak
kasar daun sirsak positif mengandung flavonoid. Proses ekstraksi senyawa
flavonoid dilakukan dengan metode maserasi dengan n-heksana dan metanol yang
dilanjutkan dengan partisi menggunakan diklorometana dan campuran metanol
air. Dari hasil ekstraksi ini diperoleh rendemen sebesar 10.62%. Ekstrak kasar
diujikan terlebih dahulu pada sel Vero untuk menentukan konsentrasi yang tepat
guna diujicobakan pada sel kanker yang tidak merusak sel normal. Berdasarkan
hasil pengujian ekstrak kasar, ekstrak hasil fraksinasi daun sirsak yang diujikan
adalah di bawah 500 µg mL-1 agar tidak menghambat proliferasi sel normal.
Pemilihan eluen terbaik untuk mengisolasi senyawa kaempferol
menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) dan diperoleh spot tunggal dengan
eluen HCO2H-H2O-MeOH. Ekstrak kasar selanjutnya dihidrolisis dengan HCl
untuk melepaskan ikan glikosida yang terikat dengan flavonoid menjadi
aglikonnya. Dari 5 g ekstrak kasar metanol yang dihidrolisis diperoleh rendemen
sebesar 34.61%. Ekstrak kasar dipisahkan melalui kromatografi lapis tipis
preparatif (KLTP) menggunakan eluen dari hasil KLT. Hasil pemisahan dengan
KLTP selanjutnya diuapkan hingga pekat dan diperoleh rendemen sebesar
23.45%. Hasil identifikasi dengan spektrometer UV-Vis menunjukkan satu
v
puncak serapan maksimum di daerah panjang gelombang 250-280 nm.
Kaempferol merupakan salah satu jenis dari aglikon flavonoid flavonol. Aglikon
flavonoid, yaitu flavonol, teridentifikasi pada serapan di daerah panjang
gelombang 250-280 nm. Spektrum kromatografi cair kinerja tinggi menguatkan
bahwa senyawa yang dihasilkan merupakan senyawa kaempferol dengan waktu
retensi yang hampir sama antara waktu retensi kaempferol standar dengan
kaempferol dari ekstrak hasil KLTP (kromatografi lapis tipis preparatif).
Dari hasil uji pada sel Vero, kaempferol sampai dengan konsentrasi 250 µg
mL-1 minimal menghambat proliferasi sel sebesar 19.77% sedangkan konsentrasi
di bawah 100 µg mL-1 tidak menunjukkan penghambatan. Akan tetapi pada
konsentrasi 250 µg mL-1 terjadi peningkatan hambatan proliferasi sel Raji sampai
76.36%. Data penghambatan sel kanker tersebut menunjukkan bahwa kaempferol
dari daun sirsak toksisitasnya kecil terhadap sel Vero dan memberi penghambatan
yang besar pada pertumbuhan sel kanker Raji. Berdasarkan hasil perhitungan nilai
IC50, hasil uji penghambatan terhadap sel Vero memperlihatkan bahwa ekstrak
kasar, baru dapat menghambat sel normal di atas 500 µg mL-1 dengan nilai IC50
922.88 µg mL-1.. Dari uji kaempferol hasil fraksinasi dengan KLTP pada sel Vero
dan sel Raji terlihat bahwa persen penghambatan pada sel kanker Raji lebih besar
daripada sel Vero bahkan pada sel Vero dapat dikatakan tidak memiliki IC50
karena pada konsentrasi 250 µg mL-1 ekstrak kaempferol hanya menghambat
proliferasi sel sebesar 19.77%. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa
aktivitas ekstrak kaempferol terhadap sel hanya spesifik menghambat proliferasi
sel kanker Raji akan tetapi tidak menghambat proliferasi sel Vero.
Kata kunci: Annona muricata, flavonoid, kaempferol, proliferasi sel kanker.
vi
© Hak Cipta Milik IPB, tahun 2011
Hak Cipta dilindungi Undang-undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruhnya karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumber. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
yang wajar IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
dalam bentuk laporan apapun tanpa izin IPB
vii
POTENSI KAEMPFEROL DAUN SIRSAK SEBAGAI
PENGHAMBAT PROLIFERASI SEL KANKER RAJI
BAIQ AYU APRILIA MUSTARIANI
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Kimia
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
viii
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Laksmi Ambarsari, M.S.
ix
HALAMAN PENGESAHAN
Judul Tesis
Nama
NRP
Program Studi
: Potensi Kaempferol Daun Sirsak sebagai Penghambat
Proliferasi Sel Kanker Raji
: Baiq Ayu Aprilia Mustariani
: G451090041
: Kimia
Disetujui
Komisi Pembimbing
Prof. Dr. Ir. Suminar S. Achmadi
Ketua
Dr. dr. Irma H. Suparto, M.S
Anggota
Silmi Mariya, S.Si, M.Si
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi
Kimia
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Purwantiningsih Sugita, M.S
Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr.
Tanggal Ujian: 14 Juli 2011
Tanggal Lulus:
x
PRAKATA
Puji dan syukur saya panjatkan ke hadirat Allah SWT atas rahmat dan
karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Tema yang dipilih
dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Desember sampai Juni 2011 ini
ialah Potensi Kaempferol Daun Sirsak sebagai Penghambat Proliferasi Sel Kanker
Raji.
Ucapan terima kasih yang tulus kepada Ibu Prof. Dr. Ir. Suminar S.
Achmadi selaku Ketua Komisi Pembimbing, Ibu Dr. dr. Irma H. Suparto, M.S,
dan Ibu Silmi Mariya S.Si, M.Si selaku Anggota Komisi Pembimbing, atas segala
curahan waktu, bimbingan, arahan, serta dorongan moral kepada saya, serta
kepada Ibu Dr. Laksmi Ambarsari, M.S. selaku penguji luar komisi yang telah
memberikan banyak saran untuk perbaikan tesis saya. Di samping itu,
penghargaan penulis sampaikan pada Pusat Studi Satwa Primata Institut Pertanian
Bogor yang telah menyediakan sarana pengujian bahan. Ungkapan terima kasih
juga disampaikan kepada mamiq, mama serta seluruh keluarga, atas segala doa
dan kasih sayangnya serta kepada Kementerian Agama Republik Indonesia yang
telah mendanai pendidikan penulis selama menjalani Program Pascasarjana
Kimia.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat
Bogor, Juli 2011
Baiq Ayu Aprilia Mustariani
xi
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Darmaji pada tanggal 09 April 1984 dari pasangan
Bapak H. L. Mustajab AMa.Pd. dan Ibu Baiq Husnin AMa. Penulis merupakan
anak kedua dari dua bersaudara.
Tahun 2002, penulis lulus dari MAN 2 Mataram dan pada tahun yang sama
lulus seleksi masuk Universitas Mataram melalui jalur Seleksi Penerimaan
Mahasiswa Baru. Pendidikan sarjana ditempuh di Program Studi Pendidikan
Kimia Universitas Mataram, lulus pada tahun 2007. Pada tahun 2009, penulis
mengikuti seleksi Beasiswa Utusan Daerah (BUD) yang diselenggarakan oleh
Kementerian Agama Republik Indonesia dan diterima di Program Studi Kimia
pada Program Pascasarjana IPB. Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi
asisten mata kuliah Kimia Dasar pada tahun ajaran 2010/2011.
xii
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ......................................................................................xiv
DAFTAR GAMBAR .................................................................................xiv
DAFTAR LAMPIRAN ..............................................................................xv
PENDAHULUAN .....................................................................................1
Latar Belakang ..................................................................................1
Tujuan Penelitian ..............................................................................2
Manfaat .............................................................................................2
BAHAN DAN METODE ..........................................................................3
Tempat Penelitian .............................................................................3
Bahan Tumbuhan dan Subjek Uji .....................................................3
Penentuan Kadar Air ........................................................................3
Uji Flavonoid ....................................................................................4
Ekstraksi Flavonoid Kaempferol ......................................................4
Pemilihan Eluen Terbaik ..................................................................5
Fraksionasi Menggunakan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif .....5
Uji Aktivitas Penghambatan Proliferasi terhadap Sel Vero dan Sel
Raji ....................................................................................................5
HASIL ........................................................................................................7
Kadar Air ............................................................................................7
Kandungan Flavonoid ........................................................................7
Ekstrak Flavonoid ..............................................................................7
Efektivitas Metanol Terhadap Proliferasi Sel Vero ............................8
Kaempferol Hasil Kromatografi Lapis Tipis Preparatif .....................8
Identitas Flavonoid .............................................................................9
Penghambatan Proliferasi Sel Vero dan Sel Raji ...............................11
PEMBAHASAN ........................................................................................15
SIMPULAN DAN SARAN .......................................................................18
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................19
LAMPIRAN ...............................................................................................21
xiii
DAFTAR TABEL
Halaman
1
Penghambatan proliferasi ekstrak kasar daun sirsak terhadap sel
Vero ..................................................................................... ................
2
Nilai IC50 dari ekstrak kasar dan ekstrak keampferol terhadap sel
Vero dan Sel Raji ................................................................................
8
14
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Hasil uji fitokimia flavonoid pada serbuk daun dan ekstrak
metanolik .............................................................................................
7
2
Profil KLT eluen terbaik ekstrak kasar daun sirsak ...........................9
3
Spektrum UV-Vis ekstrak daun sirsak dalam metanol .......................
4
Kromatogram KCKT standar kaempferol dan ekstrak hasil KLTP ....10
5
Kurva penghambatan proliferasi ekstrak hasil KLTP daun sirsak
terhadap sel Vero dan sel Raji .............................................................11
6
Sel Raji tanpa pemberian ekstrak dan sel Raji yang diberi ekstrak
kaempferol 250 µg mL-1 .....................................................................12
7
Sel Vero normal (kontrol) pada uji MTT dan sel Vero setelah
pemberian ekstrak ..............................................................................12
8
Sel Raji normal (kontrol) pada uji MTT dan sel Raji setelah
pemberian ekstrak .............................................................. ................
10
13
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
Hasil determinasi tanaman sirsak ........................................................21
2
Bagan alir penelitian ...........................................................................
3
Bagan alir metode MTT ......................................................................
23
4
Data hasil uji penghambatan ekstrak kasar terhadap sel Vero ............
24
5
Kromatogram standar kaempferol pada konsentrasi 10 µg mL-1 ........25
6
Kromatogram hasil KLTP daun sirsak ................................................26
7
Penentuan kadar kaempferol dalam daun sirsak hasil KLTP .............
8
9
22
Data hasil penghambatan flavonoid kaempferol dari daun sirsak
terhadap proliferasi sel Vero ...............................................................
27
28
Data hasil penghambatan flavonoid kempferol dari daun sirsak
terhadap proliferasi sel Raji ................................................................39
10 Gambar sel Vero .................................................................................30
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Sirsak (Annona muricata) merupakan salah satu tanaman famili dari
Annonaceae yang sangat potensial dalam mengobati penyakit kanker. Biji dan
daun sirsak sebagai antikanker secara empiris telah banyak digunakan, akan tetapi
senyawa yang lebih banyak diteliti sebagai agen antikanker pada sirsak adalah
senyawa annonaceous asetogenin yang merupakan suatu poliketida, salah satu
metabolit sekunder dari famili Annonaceae (Etcheverry et al.1994, Coloma et al.
2002). Penelitian tentang senyawa-senyawa lain dalam tanaman ini yang
diperkirakan aktif sebagai antikanker belum banyak ditelusuri di antaranya ialah
senyawa flavonoid.
Hasil penelitian Vega et al. (2007) menunjukkan bahwa golongan flavonoid
daun A. dioca, salah satu genus dari sirsak memiliki aktivitas dalam menghambat
pertumbuhan sel kanker karsinoma Ehrlich. Hasil ini membuktikan bahwa
senyawa flavonoid famili Annonaceae memiliki aktivitas farmakologis sebagai
antikanker. Penelitian yang dilakukan oleh Santos & Salatino (2000)
menunjukkan bahwa kandungan golongan flavonoid daun genus Annona di
antaranya adalah kuersetin dan kaempferol. Kedua senyawa ini diduga berpotensi
sebagai antikanker sebagaimana diindikasikan oleh Liu et al. (2005), Vega et al.
(2007), Yoshida et al. (2008), dan, Luo et al. (2010).
Penelitian terhadap daun sirsak sendiri lebih banyak dilaporkan dalam
bentuk ekstrak kasarnya. Dilaporkan bahwa ekstrak etanol dari daun sirsak
menunjukkan aktivitas antihiperglikemik yang kuat dan dapat digunakan sebagai
antinosiseptif dan anti peradangan pada beberapa hewan model (Olawale et al.
2009; Adewole & Ojewole 2009; De Sausa et al. 2010). Vega et al. (2007) telah
berhasil mengisolasi senyawa kaempferol dan menguji aktivitasnya dalam
menghambat sel kanker karsinoma Erlich sehingga masih perlu dilakukan
penelusuran lebih lanjut tentang aktivitas senyawa flavonoid daun sirsak dengan
menguji pada sel kanker lain, yaitu sel kanker Raji. Oleh sebab itu penelitian
mengenai potensi senyawa flavonoid dari daun sirsak sebagai antikanker perlu
dilakukan.
2
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan menguji efektivitas isolat flavonoid dari daun sirsak
dalam menghambat pertumbuhan sel kanker Raji secara in vitro.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan bermanfaat memberikan informasi ilmiah
mengenai senyawa flavonoid dari daun sirsak sebagai antikanker.
3
BAHAN DAN METODE
Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Kimia Organik, Departemen Kimia,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahun Alam, Institut Pertanian Bogor (IPB).
Uji penghambatan proliferasi terhadap sel secara in vitro dilakukan di Pusat Studi
Satwa Primata (PSSP) IPB.
Bahan Tumbuhan dan Subjek Uji
Bahan yang digunakan adalah daun sirsak tua yang diperoleh dari kebun
Pusat Studi Biofarmaka IPB. Untuk keperluan identifikasi tumbuhan, sampel
dikirim ke Herbarium Bogoriense, Bogor. Pada tahap awal daun sirsak
dibersihkan dengan air. Selanjutnya daun dikeringkan dalam oven dengan suhu
40 ºC selama 72 jam, lalu dijadikan serbuk untuk kemudian diekstraksi. Subjek uji
yang digunakan adalah penghambatan aktivitas sel Vero (ATCC CCL-81) dan sel
Raji (ATCC CCL-86). Kedua jenis sel ini diperoleh dari PSSP
Penentuan Kadar Air
Cawan porselin dikeringkan pada suhu 105 °C dalam oven selama 30 menit,
kemudian didinginkan dalam eksikator dan ditimbang. Sebanyak 5 g serbuk daun
sirsak dimasukkan ke dalam cawan dan dipanaskan dalam oven pada suhu 105 °C
selama 3 jam, kemudian cawan diangkat dan didinginkan dalam eksikator selama
30 menit. Cawan dengan sampel ditimbang hingga diperoleh bobot konstan
(AOAC 2006). Persen kadar air dihitung dengan persamaan:
% Kadar air = 100%
Dengan:
a = bobot sampel sebelum dikeringkan (g)
b = bobot sampel setelah dikeringkan (g)
4
Uji Flavonoid
Uji kualitatif flavonoid dilakukan mengacu pada Harborne (1987).
Sebanyak 1 g sampel berupa serbuk kering ditambahkan 10 mL air panas
kemudian dididihkan selama 5 menit dan disaring. Sebanyak 10 mL filtrat
ditambahkan 0.5 gram serbuk Mg, 1 mL HCl pekat, dan 1 mL amil alkohol
kemudian dikocok dengan kuat. Uji positif ditandai dengan munculnya warna
merah, kuning, atau jingga pada lapisan amil alkohol.
Ekstraksi Flavonoid Kaempferol
Ekstraksi flavonoid (Lampiran 1) mengacu pada Vega et al. (2007). Serbuk
daun sirsak kering diekstraksi dengan maserasi menggunakan pelarut n-heksana
dan metanol. Ekstraksi diawali dengan menggunakan pelarut n-heksana untuk
menghilangkan kandungan lemak, selanjutnya sampel disaring dan dipisahkan.
Ekstrak n-heksana dibuang dan residu dari hasil maserasi dengan n-heksana
dikeringkan dengan diangin-anginkan di udara terbuka. Ekstraksi dilanjutkan
dengan menggunakan pelarut metanol. Residu dari pelarut n-heksana dimaserasi
dengan metanol dan selanjutnya ekstrak metanol dipartisi dengan diklorometana
dan campuran metaol air dengan nisbah 2:1 untuk memberikan fraksi
hidroalkohol dan diklorometana. Fraksi diklorometana dibuang dan yang
digunakan adalah fraksi metanolik. Sebagian fraksi metanolik dipisahkan untuk
uji hayati dan uji flavonoid, dan sebagian lain dihidrolisis dengan HCl 1.8 N.
Larutan yang dihasilkan diekstraksi dengan amil alkohol. Selanjutnya fase organik
diambil dan dicuci dengan air sampai pH fase organik konstan. Hasil hidrolisis
diuapkan dengan penguap putar pada suhu 40 ºC dan dilakukan uji flavonoid dan
uji penghambatannya terhadap sel kanker. Rendemen ekstrak dihitung dengan
persamaan:
% Rendemen ekstrak =
dengan
a
: bobot ekstrak (g)
b
: bobot sampel kering (g)
ka
: kadar air
× 100 %
5
Pemilihan Eluen Terbaik
Eluen terbaik untuk mengisolasi senyawa kaempferol dipilih dengan
menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT). Pelat KLT yang digunakan adalah
jenis silika G60F254. Ekstrak pekat ditotolkan pada pelat KLT, setelah kering,
langsung dielusi dalam ruang elusi yang telah dijenuhkan oleh uap eluen
pengembang. Eluen yang digunakan yaitu HCO2H-H2O-MeOH. Noda hasil elusi
diamati di bawah lampu UV pada panjang gelombang 254 dan 366 nm.
Fraksionasi Menggunakan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Ekstrak metanol hasil hidrolisis dipisahkan dengan menggunakan
kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP). Fraksi yang diperoleh selanjutnya
dikerok, dilarutkan, dan didekantasi dengan pelarut awalnya, yaitu metanol,
kemudian disaring lalu diuapkan. Hasil fraksinasi dengan KLTP kemudian
diidentifikasi kandungan senyawa flavonoidnya dengan spekrofotometer
kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dan diuji aktivitas antikankernya pada sel
kanker secara in vitro.
Uji aktivitas Penghambatan Proliferasi terhadap Sel Vero dan Sel Raji
Uji aktivitas penghambatan kanker dari sel Raji dilakukan merujuk pada Sajuthi
(2001) dan Wang et al. (2009). Sel Vero dan sel Raji ditumbuhkan terlebih
dahulu. Media tumbuh yang digunakan ialah DMEM (Dulbecco’s Modified
Eagle’s Medium) untuk sel Vero dan RPMI (Roswell Park Memorial Institute)-
1640 untuk sel Raji dengan penambahan masing-masing 10% FBS dan 1%
penisilin-streptomisin. Sel didistribusikan ke dalam pelat kultur jaringan 96 sumur
dengan konsentrasi sel yang digunakan ialah 2×103 sel/mL per sumur. Selanjutnya
sel diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator CO2 dengan konsentrasi 5% pada
suhu 37 °C. Kepada sel kemudian ditambahkan ekstrak flavonoid dari daun sirsak
dengan konsentrasi 3, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 125, dan 250 µg mL-1. Sebagai
pembanding, dibuat kontrol (berisi media DMEM tanpa ekstrak untuk sel Vero
dan RPMI-1640 tanpa ekstrak untuk sel Raji). Setelah itu, sel diinkubasi kembali
pada suhu 37 °C pada kondisi yang sama selama 48 jam. Selanjutnya
ditambahkan MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
6
(Sigma, USA) sebanyak 10 µL/sumur selama 4 jam hingga terbentuk formazan
berwarna ungu pada sel hidup. Selanjutnya ditambahkan HCl ke dalam
isopropanol 0.1 N sebanyak 100 µL/sumur kemudian diinkubasi kembali selama
10 menit dan dibaca serapannya dengan menggunakan spektrofotometer ELISA
reader dengan panjang gelombang 595 nm. Penghambatan pertumbuhan sel
kanker dihitung menggunakan rumus berikut:
% penghambatan = Serapan kontrol – serapan perlakuan
Serapan kontrol
× 100 %
Dari % penghambatan yang diperoleh selanjutnya ditentukan penghambatan
sel kanker dari setiap konsentrasi senyawa flavonoid yang diujikan dan ditentukan
aktivitas penghambatan yang terbesar dari senyawa flavonoid yang diperoleh.
Nilai IC50 ditentukan dari grafik persen sel hidup vs log konsentrasi sampel
uji (Wang et al. 2009). Nilai IC50 ditentukan dengan menggunakan persamaan
regresi linaer yang menyatakan hubungan antara konsentrasi sampel uji (sebagai
sumbu x) dan persentase inhibisi (sebagai sumbu y).
7
HASIL
Kadar Air
Kadar air sampel daun sirsak adalah, 5.24 %. Kadar air dalam suatu bahan yang
dapat mengurangi aktivitas mikrob 3-7%. Kadar air pada kisaran tersebut juga
lebih stabil dan terhindar dari enzim oksidasi.
Kandungan Flavonoid
Kandungan flavonoid ditentukan dalam dua tahap, yaitu pada serbuk daun
dan ekstrak metanolik daun. Berdasarkan uji flavonoid dengan uji fitokimia secara
kualitatif, serbuk daun dan ekstrak metanolik daun sirsak positif mengandung
flavonoid. Secara kualitatif dapat dilihat dari intensitas warna ekstrak metanolik
dan serbuk yang tidak berbeda dari intensitas warna serbuk daun. Hal ini
menunjukkan bahwa pelarut metanol yang telah dipartisi dengan diklorometana
dan air efektif dalam mengekstrak flavonoid dari daun sirsak. Intensitas warna
flavonoid yang terkandung dalam daun sirsak dapat dilihat pada Gambar 1.
A
B
Gambar 1 Hasil uji fitokimia flavonoid pada serbuk daun (A) dan ekstrak
metanol (B).
Ekstrak Flavonoid
Setelah terbebas dari senyawa nonpolar melalui maserasi dengan n-heksana,
ekstrak metanolik selanjutnya dipekatkan dengan alat pengering beku. Ekstrak
metanolik yang diperoleh dari hasil maserasi 650 g serbuk daun, rendemen yang
diperoleh 10.62%.
8
Efektivitas Ekstrak Metanol terhadap Proliferasi sel Vero
Ekstrak metanolik diujikan terlebih dahulu pada sel normal. Uji
pendahuluan ini dilakukan untuk menentukan konsentrasi yang diperlukan guna
diujicobakan pada sel kanker yang tidak merusak sel normal.
Uji pendahuluan dari ekstrak metanolik pada sel Vero menggunakan
berbagai konsentrasi, mulai dari 25000 µg mL-1 sampai 500 µg mL-1. Hasilnya
dapat dilihat pada Tabel 1. Semakin tinggi konsentrasi ekstrak semakin besar pula
penghambatannya pada proliferasi sel Vero. Penghambatan ekstrak metanolik
daun sirsak menurun pada konsentrasi 1000 µg mL-1 dan 500 µg mL-1 dengan
penghambatan masing-masing 47.65% dan 31.49%. Berdasarkan hasil ini, ekstrak
hasil fraksinasi daun sirsak yang diujikan adalah di bawah 500 µg mL-1 agar tidak
menghambat proliferasi sel normal.
Tabel 1 Penghambatan proliferasi ekstrak kasar daun sirsak terhadap sel Vero.
Konsentrasi ekstrak
µg mL-1
25000
15000
10000
5000
1500
1000
500
Rata-rata
serapan
0.032
0.037
0.033
0.042
0.046
0.085
0.112
% Penghambatan
proliferasi
80.37
77.1
79.96
74.03
71.98
47.65
31.49
Kaempferol Hasil Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Ekstrak metanolik daun difraksinasi atau dipisahkan lebih lanjut untuk
mendapatkan flavonoid yang diinginkan, yaitu senyawa kaempferol. Dengan
eluen campuran asam format:air:metanol. Dihasilkan spot tunggal dengan nilai Rf
0.87 (Gambar 2A) dengan campuran pelarut ini. Ekstrak metanolik selanjutnya
dihidrolisis dengan HCl 1.8 N untuk melepaskan ikatan glikosida yang terikat
dengan flavonoid menjadi aglikonnya. Dari 5 g ekstrak kasar metanolik yang
dihidrolisis, diperoleh rendemen sebesar 34.61%. Nilai Rf yang sama, yaitu 0.72,
diperoleh juga dengan membandingkan senyawa standar kaempferol (Gambar
2B;a) dengan setelah ekstrak dihidrolisis (Gambar 2B;b).
9
a
b
A
B
Gambar 2 Profil KL eluen terbaik ekstraak kasar dauun sirsak (A menggunnakan
LT
A)
eluen HCCO2H:H2O:MeOH dan profil KLT setelah hidrolisis (B).
Eksstrak kasar dipisahkann menggunnakan KLTPP dengan eluen dari hasil
KLT, yaittu HCO2H:H2O:MeOH untuk meemperoleh senyawa kaaempferol. Hasil
pemisahan dengan KLTP selaanjutnya diiuapkan hinngga pekat dan dipeeroleh
rendemen sebanyak 223.45%.
Iddentitas Flaavonoid
Flavvonoid yangg dicari, yaiitu kaempfeerol, diidenntifikasi unttuk mendappatkan
gambaran yang jelaas tentang struktur senyawa yyang diingiinkan. Sennyawa
flavonoid yang terkaandung di ddalam daun sirsak dideeteksi dengaan menggunnakan
spektromeeter UV-Vis dan KCKT Kondisi untuk KCK dilakukaan dengan kolom
T.
KT
C18, pada laju alir 1ml/menit, detektor UV 370 nm, dengan eluuen MeOH danH,
asam fosffat 0.5%. Hasil identiffikasi dengaan spektrommeter Uv-VVis
menunjuukkan
satu puncaak serapan maksimum di daerah panjang geloombang 250 sampai 00 nm
30
(Gambar 33).
10
Gambar 3 Spektrum UV-Vis ekstrak daun sirsak dalam metanol.
Hasil analisis menunjukkan bahwa ekstrak yang diperoleh memiliki waktu
retensi yang hampir sama dengan standar kaempferol (≥ 90%) yang diperoleh dari
Sigma-Aldrich, USA, sehingga diyakini bahwa senyawa yang diperoleh
merupakan senyawa kaempferol (Gambar 4). Gambar hasil KCKT menunjukkan
bahwa waktu retensi yang diperoleh dari ekstrak hasil KLTP ialah 3.395 dan
standar kaempferol memiliki waktu retensi 3.384.
A
B
mV
DetectorACh2:370nm
40
35
30
20
15
10
5
0
-5
-10
mV
DetectorACh2:370nm
45
15.0
12.5
10.0
25
5.0
2.5
0.0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min
7.5
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min
0.0
Gambar 4 Kromatogram KCKT standar kaempferol (A) dan ekstrak hasil
KLTP daun sirsak (B).
11
Penghambatan Proliferasi sel Vero dan sel Raji
Hasil pemisahan ekstrak daun sirsak dengan KLTP diuji daya hambat
proliferasinya pada sel Vero dan Raji. Konsentrasi ekstrak yang digunakan ialah
3, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 125, dan 250 µg mL-1. Konsentrasi tertinggi pada 250
µg mL-1 dipilih berdasarkan hasil uji in vitro pada ekstrak kasar terhadap sel Vero.
Hasil pada konsentrasi tersebut ialah konsentrasi tertinggi yang minimal
toksisitasnya terhadap sel Vero.
%Penghambatan
100
80
60
40
20
0
0 50 100 150 200 250
‐20
Konsentrasi (µg/mL)
‐40
Sel Vero
Sel Raji
Gambar 5 Kurva penghambatan proliferasi ekstrak hasil KLTP daun sirsak
terhadap sel Raji (A) dan sel Vero (B).
Dari hasil uji pada sel Vero (Gambar 5), diperoleh bahwa kaempferol
sampai dengan konsentrasi 250 µg mL-1 minimal menghambat proliferasi sel
sebesar 19.77% sedangkan konsentrasi di bawah 100 µg mL-1 tidak ada
penghambatan. Akan tetapi, pada uji sel Raji pada konsentrasi di atas 100 µg mL-1
mengalami peningkatan hambatan proliferasi sampai dengan 76.36% pada
konsentrasi 250 µg mL-1 .
Dari pengamatan secara makroskopis, ekstrak kaempferol dapat mengurangi
populasi sel Raji yang berarti dapat menghambat pertumbuhan sel. Gambar 6
memperlihatkan bahwa populasi sel Raji yang diberi ekstrak kaempferol
berkurang dan terlihat mengalami perubahan morfologi.
12
A
B
Gambar 6 Sel Raji tanpa pemberian ekstrak (A) dan sel Raji yang diberi ekstrak
kaempferol 250 µg mL-1 (B) (Perbesaran 8×10).
Berdasarkan hasil uji MTT, secara makroskopis (Gambar 7) pada sel Vero
menghasilkan warna ungu yang hampir sama dengan kontrol sel normal yang
tidak diberi ekstrak.
A
B
Gambar 7 Sel Vero (kontrol) pada uji MTT (A) dan sel Vero setelah
pemberian ekstrak (B).
Berbeda dengan pemberian ekstrak kaempferol pada sel Raji (Gambar 8),
sel Raji menghasilkan warna ungu yang sedikit dibandingkan dengan kontrol sel
yang tidak diberi ekstrak. Dari gambar terlihat penurunan populasi sel
13
dibandingkan dengan kontrol, namun tidak dapat dihitung berapa jumlah
penurunan sel yang mati, karena metode MTT tidak dapat digunakan untuk
menghitung jumlah sel yang mati, hanya dapat menentukan persen penghambatan
saja.
A
B
Gambar 8
Sel Raji (kontrol) pada uji MTT (A) dan sel raji setelah
pemberian ekstrak (B) (perbesaran 8×10).
Berdasarkan hasil perhitungan nilai IC50, hasil uji penghambatan terhadap
sel Vero memperlihatkan bahwa ekstrak kasar baru dapat menghambat sel normal
di atas 500 µg mL-1 dengan nilai IC50 922.88 µg mL-1.. Dari uji kaempferol hasil
fraksinasi dengan KLTP pada sel normal dan sel kanker Raji, terlihat bahwa
persen penghambatan pada sel kanker Raji lebih besar daripada sel Vero bahkan
pada sel Vero dapat dikatakan tidak memiliki IC50 karena pada konsentrasi 250 µg
mL-1 ekstrak kaempferol hanya menghambat proliferasi sel sebesar 19.77%.
Berbeda dengan sel Vero, dengan pemberian ekstrak kaempferol 125 µg
mL-1 pada sel Raji, diperoleh 48.18% sel Raji yang mengalami kematian, dan
pada dosis 250 µg mL-1 persentase sel Raji yang mati meningkat dengan tajam,
yaitu 76.36% dengan IC50 110.82 µg mL-1. Nilai IC50 dari ekstrak kasar dan
ekstrak kaempferol dapat dilihat pada Tabel 2.
14
Tabel 2. Nilai IC50 dari ekstrak kasar dan ekstrak kaempferol terhadap sel
Vero dan sel Raji
Perlakuan
Ekstrak metanolik pada sel
Vero
Ekstrak kaempferol pada sel
Vero
Ekstrak kaempferol pada sel
Raji
Persamaan garis
R2
IC50
y=11.13 Ln x-25.99 0.759 922.86
y=7.52 Ln x-29.04 0.763 -
y=13.97 Ln x-15.77 0.866 110.82
15
PEMBAHASAN
Uji fitokimia pada serbuk daun dan ekstrak daun sirsak bertujuan
mendeteksi keberadaan flavonoid pada sampel awal daun sirsak sebelum tahap
ekstraksi, sedangkan uji pada ekstrak kasar dilakukan untuk mengevaluasi
efektivitas pelarut dalam mengekstrak flavonoid. Hasil uji fitokimia flavonoid,
baik serbuk daun maupun ekstrak metanol, menyatakan kandungan flavonoid
pada sampel, hal ini sesuai dengan penelitian Santos & Salatino (2000) yang
melaporkan 31 spesies dari famili Annonaceae memiliki kandungan flavonoid di
antaranya adalah kaempferol dan kuersetin. Namun, penelitian Pathak et al.
(2010) melaporkan bahwa dari uji fitokimia tidak terdeteksi flavonoid dalam daun
sirsak. Perbedaan laporan ini kemungkinan disebabkan perbedaan tempat tumbuh
sehingga isolat yang dihasilkan juga berbeda-beda.
Proses ekstraksi senyawa flavonoid dilakukan dengan metode maserasi.
Ekstraksi awal dilakukan dengan pelarut n-heksana yang bersifat nonpolar.
Tujuan penggunaan pelarut ini adalah untuk menghilangkan kandungan lemak
yang ada dalam daun sirsak. Selain itu untuk memudahkan perolehan senyawa
flavonoid yang pada umumnya bersifat polar. Oleh karena itu dengan
menggunakan pelarut n-heksana, ekstrak terbebas dari lemak. Partisi dengan
diklorometana yang bersifat semipolar dilakukan untuk memisahkan senyawa-
senyawa yang bersifat semipolar, sedangkan campuran metanol-air bertujuan
memperoleh senyawa flavonoid yang lebih banyak karena sebagian besar senyawa
flavonoid di alam ditemukan dalam bentuk glikosida, yaitu satu unit flavonoid
terikat pada suatu gula. Adanya gula yang terikat pada flavonoid cenderung
menyebabkan flavonoid lebih mudah larut dalam air, dengan demikian campuran
pelarut metanol dengan air merupakan pelarut yang lebih baik untuk melarutkan
glikosida (Harborne 1987).
Hasil identifikasi dengan spektrometer UV-Vis menunjukkan satu puncak
serapan maksimum di daerah panjang gelombang 250 sampai 300 nm.
Kaempferol merupakan salah satu kelompok aglikon flavonoid flavonol. Menurut
Markham (1988) aglikon flavonoid, yaitu flavonol, teridentifikasi pada serapan di
daerah panjang gelombang 250-280 nm. Kromatogram KCKT menguatkan bahwa
16
senyawa yang dihasilkan merupakan senyawa kaempferol dengan waktu retensi
yang hampir sama antara waktu retensi kaempferol standar dengan kaempferol
dari ekstrak hasil KLTP. Bila dibandingkan dengan standar kaempferol dengan
konsentrasi 90%, hasil yang diperoleh sedikit sekitar 0.22 µg mL-1 dalam 10 µg
mL-1 hasil KLTP. Penelitian Vega et al. (2007) tidak melaporkan rendemen,
kaempferol namun dari dosis ekstrak kaempferol yang diberikan pada sel kanker
karsinoma Erlich dapat diketahui, kadar kaempferol sebanyak 0.022 µg mL-1.
Berdasarkan perbandingan perolehan kaempferol ini dapat disimpulkan bahwa
kaempferol yang diperoleh pada daun A.muricata lebih banyak daripada A. dioca.
Berdasarkan pengamatan secara makroskopis, bentuk dan ukuran sel lebih
besar daripada sel normal. Kemungkinan senyawa kaempferol masuk ke dalam
mitokondria dari sel kanker dan merusak sel sehingga ukuran sel menjadi besar
yang menyebabkan sel menjadi mati. Dari Gambar 6 disimpulkan, kemungkinan
kematian sel terjadi melalui proses nekrosis. Nekrosis merupakan proses
kerusakan sel yang dapat ditandai dengan meningkatnya volume sel (Nursid et al.
2006). Sel yang mengalami nekrosis akan terlihat membengkak untuk kemudian
mengalami lisis. Nekrosis disebabkan oleh faktor eksternal di antaranya, yaitu
infeksi, toksiksitas, trauma sel, dan kematian prematur pada sel (Prasetyo 2008).
Nilai IC50 akibat pemberian ekstrak kaempferol pada sel kanker Raji sangat
berbeda dengan ekstrak kaempferol hasil penelitian Vega et al. (2007) yang diuji
pada sel kanker karsinoma Erlich dengan IC50 0.022 µg mL-1. IC50 pada sel kanker
Raji sebesar 110.82 µgmL-1. Nilai IC50 ekstrak daun A. dioca yang diperoleh Vega
et al. (2007), lebih rendah daripada ekstrak A.muricata yang berarti ekstrak daun
A. dioca lebih toksik dibandingkan daun sirsak. Hal tersebut kemungkinan
disebabkan beberapa hal diantaranya karena perbedaan sel kanker yang diuji, dan
perbedaan sampel tanaman meskipun masih satu genus. Kemungkinan yang lain
juga disebabkan flavonoid yang dihasilkan mempunyai aktivitas yang berbeda
terhadap berbagai jenis sel kanker.
Data penghambatan sel kanker menunjukkan bahwa kaempferol dari daun
sirsak toksisitasnya sangat kecil terhadap sel Vero dan memberi penghambatan
yang besar pada pertumbuhan sel kanker Raji. Pemberian ekstrak kaempferol
daun sirsak pada sel Vero menunjukkan bahwa ekstrak memberi efek
17
penghambatan yang kecil pada proliferasi sel Vero karena tidak memiliki IC50
pada rentang dosis ekstrak yang diberikan. Secara statistik, ekstrak keampferol
akan memiliki IC50 pada konsentrasi 36601.47 µg mL-1 sehingga dapat
disimpulkan, aktivitas ekstrak kaempferol terhadap sel hanya spesifik
menghambat proliferasi sel kanker Raji akan tetapi tidak menghambat proliferasi
sel Vero. Hasil ini diperkuat dari beberapa penelitian yan