Selection and Optimization of Lactic Acid Bacteria having Antifungal Properties

SELEKSI DAN OPTIMASI BAKTERI ASAM LAKTAT
PENGHASIL SENYAWA ANTIKAPANG

Rohmatussolihat

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Seleksi dan Optimasi Bakteri
Asam Laktat Penghasil Senyawa Antikapang adalah benar karya saya dengan
arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Juli 2013

Rohmatussolihat
NIM P051100091

RINGKASAN
ROHMATUSSOLIHAT. Seleksi dan Optimasi Bakteri Asam Laktat Penghasil
Senyawa Antikapang. Dibimbing oleh NISA RACHMANIA MUBARIK dan
ENDANG SUKARA.
Silase merupakan pengawetan hijauan pakan melalui proses fermentasi
anaerobik oleh bakteri asam laktat (BAL). Jika ada oksigen maka mikrob selain
BAL menjadi aktif dan tumbuh berkembangbiak sehingga menyebabkan
kegagalan proses fermentasi silase. Kapang merupakan mikrob yang sering
menjadi kontaminan silase dan bertanggung jawab terhadap kegagalan proses
pembuatan silase. Pencegahan terjadinya kontaminasi silase oleh kapang di
Indonesia sangat penting dalam upaya mendukung usaha peternakan. Salah satu
upaya yang dapat dilakukan dengan menggunakan inokulum BAL yang
mempunyai kemampuan menghasilkan senyawa antikapang.
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan galur BAL yang mampu
menghambat pertumbuhan kapang, identifikasi BAL terseleksi, dan optimasi
medium untuk produksi senyawa antikapang (asam laktat) dari BAL terseleksi
dengan menggunakan Response Surface Method (RSM).

Penapisan awal dengan menggunakan plate assay method (kondisi aerobik)
yaitu BAL, Aspergillus fumigatus, A. flavus, dan Penicillium ditumbuhkan pada
media de Man Rogosa Sharpe (MRSA), dan diverifikasi dengan menggunakan
deep tube technique (kondisi anerobik). Hasil penapisan menunjukan bahwa isolat
DR 1-6-2 mampu menghambat kapang A. fumigatus dan A. flavus pada kondisi
aerobik dengan persentase penghambatan masing-masing sebesar 41% and 32%.
Pada kondisi anaerobik isolat DR-1-6-2 tidak hanya mampu menghambat A.
fumigatus dan A. flavus tetapi juga Penicillium. Identifikasi BAL terseleksi
berdasarkan sekuen gen 16S rRNA dengan menggunakan primer 27F dan1492R.
Berdasarkan analisis molekuler, isolat DR 1-6-2 adalah Lactobacillus plantarum
dengan nilai homologi sebesar 98%. Optimasi produksi senyawa antikapang dari
BAL terseleksi menggunakan Response Surface Method (RSM) dan rancangan
percobaan Central Composite Design (CCD) dengan lima variabel (glukosa,
ekstrak khamir, CH3COONa, K2HPO4, dan Tween 80) dan lima taraf kombinasi.
Hasil analisis statistik menunjukkan bahwa produksi antikapang yang
direpresentasikan dengan produksi total asam laktat dari BAL terseleksi secara
signifikan dipengaruhi oleh glukosa, kombinasi glukosa dan K2HPO4, kombinasi
ekstrak khamir dan K2HPO4, dan Tween 80. Konsentrasi optimum dari glukosa
sebesar 2,91%, 0,58% ekstrak khamir, 0,29% K2HPO4, dan 0,19% Tween 80
dengan prediksi maksimum asam laktat sebesar 2,61%, meningkat sebesar 59%.

Hasil tersebut telah dikonfirmasi menggunakan media pada kondisi optimum.
Produksi asam laktat meningkat sebesar 58%.
Manfaat dari penelitian ini ialah penggunaan isolat BAL sebagai produsen
senyawa antikapang dan atau sebagai inokulum silase dapat menekan kontaminasi
kapang sehingga diperoleh silase dengan kualitas yang baik. Pemanfaatan BAL ini
mampu memicu produksi silase yang pada akhirnya dapat meningkatkan
penggunaan silase untuk pakan ternak, meningkatkan produksi daging, dan dapat
mendukung upaya pemerintah untuk memenuhi kebutuhan daging nasional.

Dalam pembuatan silase dengan menggunakan L. plantarum DR 1-6-2,
kondisi anerobik merupakan syarat yang perlu diperhatikan. Identifikasi lebih
lanjut senyawa antikapang lainnya yang diproduksi oleh L. plantarum DR 1-6- 2
perlu dilakukan.
Kata Kunci : Antikapang, bakteri asam laktat, response surface method

SUMMARY
ROHMATUSSOLIHAT. Selection and Optimization of Lactic Acid Bacteria
having Antifungal Properties. Supervised by NISA RACHMANIA MUBARIK
and ENDANG SUKARA.
Silage is the forage preservation product through anaerobic fermentation by

using lactic acid bacteria (LAB). The presence of oxygen may activate the other
microbe that could be contaminate and interrupt the silage processing. Fungi is a
microbe that often contaminate silage processing. In Indonesia, prevention of
silage contamination by fungi is necessary in order to support livestock business.
By using the inoculum that able to produce antifungal compounds, the fungi
contamination could be prevented. This research was dedicated to screen LAB
having antifungal properties, taxonomic study and optimization of antifungal
production.
Screening of antifungal producing LAB was initiated by growing LAB on
de Man Rogosa Sharpe Agar (MRSA) against Aspergillus fumigatus, A. flavus,
and Penicillium by plate assay method (aerobic condition) and verified by deep
tube technique (anerobic condition). The results showed that strain DR 1-6-2
could inhibit A. fumigatus and A. flavus in aerobic condition with percentage of
inhibition was 41% and 32 %, respectively. In anaerobic condition, strain DR 1-62 could inhibit not only A. fumigatus, A. flavus, but also Penicillium.
Identification of selected LAB was carried out using 16S rRNA gene sequencing
with 27F and 1492R primer. Based on molecular analysis, strain DR 1-6-2 is
belong to Lactobacillus plantarum with the degree of homology of 98%.
Optimization of antifungal production by selected LAB was carried out using
Response Surface Method (RSM) with Central Composite Design (CCD) on five
variables (glucose, yeast extract, CH3COONa, K2HPO4, Tween 80) and five level

combinations. From statistical analysis, the production of antifungal which is
represented by the total lactic acid production of selected LAB is significantly
influenced by glucose, combination of glucose and K2HPO4, combination of yeast
extract and K2HPO4 and Tween 80. The optimum concentration of glucose is
2.91%, yeast extract 0.58%, K2HPO4 0.29% and Tween 80 0.19% with a
maximum predicted lactic acid yield of 2.61%, which is increased by 59%. This
result is confirmed when the optimum concentration of nutritions used. The
production of lactic acid increased by 58%.
Benefit of this research is utilization of indegenous LAB isolates as the
silage inoculum and antifungi to prevention of contamination and to obtain a good
silage quality. This LAB utilization is capable to trigger the silage production,
which in turn could increase the silage utilization as animal feed, increasing the
production of meat, and could support the government's efforts to achieve the
national demand of meat product.
In silage fermentation using L. plantarum DR 1-6-2, anaerobic condition is
a requirement to be considered. Identification of other antifungal compounds
produced by L. plantarum DR1-6-2 is need to be studied.
Keywords: Antifungal, lactic acid bacteria, response surface method

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2013

Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

SELEKSI DAN OPTIMASI BAKTERI ASAM LAKTAT
PENGHASIL SENYAWA ANTIKAPANG

ROHMATUSSOLIHAT

Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Bioteknologi

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

Penguji pada Ujian : Prof Dr Djumali Mangunwidjaja

Judul Tesis : Seleksi dan Optimasi Bakteri Asam Laktat Penghasil Senyawa
Antikapang
Nama
: Rohmatussolihat
NIM
: P051100091

Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

ｾ＠

-Pi of)Or EndaI1iSllkafrL
Anggota

Ketua

Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Bioteknologi

Prof Dr Suharsono DEA

Tanggal Ujian:
1 Juli 2013

Tanggal Lulus:

rO1 AUG 2011

Judul Tesis : Seleksi dan Optimasi Bakteri Asam Laktat Penghasil Senyawa
Antikapang
Nama

: Rohmatussolihat
NIM
: P051100091
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

Dr Nisa Rachmania Mubarik
Ketua

Prof Dr Endang Sukara
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Bioteknologi

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof Dr Suharsono DEA

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian:
1 Juli 2013

Tanggal Lulus:
……………………………

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan April 2012 ini adalah teknologi pakan,
dengan judul Seleksi dan Optimasi Bakteri Asam Laktat Penghasil Senyawa
Antikapang.
Dengan Segala kerendahan hati, penulis menghaturkan terima kasih dan rasa
hormat yang sebesar-besarnya kepada Ibu Dr Nisa Rachmania Mubarik dan Prof
Dr Endang Sukara sebagai komisi pembimbing yang dengan penuh kesabaran
meluangkan waktu dan memberikan motivasi, bimbingan, arahan dan masukan
pada penulis, serta Ibu Dr Yantyati Widyastuti yang telah banyak memberi saran.
Penulis menghaturkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Prof Dr

Djumali Mangunwidjaja sebagai penguji atas masukan dan sarannya. Penulis juga
mengucapkan terima kasih kepada Kementrian Negara Riset dan Teknologi
(KNRT) atas bantuan dana dan kesempatan yang diberikan kepada penulis
melalui program Beasiswa KNRT 2010. Terima kasih yang sebesar-besarnya
kepada Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) yang telah memberikan
tugas belajar bagi penulis.
Terima kasih kepada saudari Yulianti Hasanah dari Stat Center Dramaga
yang telah membantu mengolah data serta Gytha Nafisah Sukara atas bantuannya
dalam pengambilan foto hasil penelitian. Terima kasih juga kepada teman-teman
di program Studi Bioteknologi IPB dan di Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI.
Ungkapan terima kasih disampaikan kepada Bapak, Mama, Suami, adik-adik serta
seluruh keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Juli 2013
Rohmatussolihat

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
2 TINJAUAN PUSTAKA
Bakteri Asam Laktat
Produk Fermentasi Bakteri Asam Laktat
Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Produksi Senyawa Antikapang
Mekanisme Penghambatan Senyawa Antikapang
Response Surface Method (RSM)
3 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Bahan
Prosedur Analisis Data
Pemeliharaan dan Pertumbuhan Mikroorganisme
Penapisan Beberapa Galur BAL Penghasil Senyawa Antikapang
Identifikasi Bakteri Asam Laktat Terseleksi
Optimasi Produksi Senyawa Antikapang
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Penapisan Beberapa Galur Bakteri Asam Laktat Penghasil
Senyawa Antikapang
Identifikasi Bakteri Asam Laktat Terseleksi
Optimasi Produksi Senyawa Antikapang
Pembahasan
5 SIMPULAN DAN SARAN
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN

xii
xii
xiii
1
1
3
3
3
4
4
5
7
8
8
9
9
9
9
9
10
10
11
12
12
12
13
14
20
23
25
30

DAFTAR TABEL
1
2
3

Kombinasi lima variabel dan lima tingkat kombinasi percobaan
dengan Central Composite Design
Isolat bakteri asam laktat yang mempunyai kekerabatan yang dekat
dengan isolat DR-1--6-2
ANOVA untuk Response Surface Quadratic

11
14
15

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4

5
6
7
8
9
10

Jalur fermentasi bakteri asam laktat homofermentatif (a) dan jalur
fermentasi bakteri asam laktat heterofermentatif (b)
Ringkasan dari beberapa senyawa antikapang dari BAL
Pengujian penghambatan pertumbuhan A. fumigatus, A.flavus, dan
Penicillium oleh enam galur BAL pada media MRS agar, diinkubasi
pada suhu 30 °C selama lima hari
Pengujian penghambatan A. fumigatus, A. flavus, dan Penicillium
oleh isolat BAL DR 1-6-2 menggunakan media MRSA tegak. Isolat
BAL DR 1-6-2 dan kapang uji ditumbuhkan bersamaan pada
MRSA dan diinkubasi pada suhu 30 °C selama lima hari
Pita gen 16S rRNA berukuran ± 1600 basa dari isolat DR-1-6-2
menggunakan gel elektroforesis
Pohon filogenetik dari isolat DR 1-6-2
Response surface plots bentuk tiga dimensi (a) dan bentuk contour
(b) yang menggambarkan pengaruh konsentrasi glukosa dan Tween
80 terhadap konsentrasi total asam laktat tertitrasi
Response surface plots bentuk tiga dimensi (a) dan bentuk contour
(b) yang menggambarkan pengaruh konsentrasi glukosa dan
K2HPO4 terhadap konsentrasi total asam laktat tertitrasi
Response surface plots bentuk tiga dimensi (a) dan bentuk contour
(b) yang menggambarkan pengaruh konsentrasi ekstrak khamir dan
K2HPO4 terhadap konsentrasi total asam laktat tertitrasi
Pengaruh konsentrasi glukosa terhadap konsentrasi total asam laktat
tertitrasi

5
7
12
13

13
14
17
18
19
20

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6

Rumus Penghitungan indeks penghambatan dan persentase
penghambatan (Fokkema 1973)
Indeks penghambatan dan persentase penghambatan (metode
Fokkema 1973) dari hasil penapisan dengan menggunakan metode
plate assay method
Kromatogram dari gen penyandi 16S rRNA isolat DR 1-6-2
Hasil amplifikasi dari gen penyandi 16S rRNA isolat DR 1-6-2
Central Composite Design (CCD) lima variabel dengan lima level
Kombinasi
Koefisien regresi & signifikansi dari model Response Surface
Quadratic

30
30
31
32
33
34

1

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kebutuhan pakan ternak di Indonesia semakin meningkat seiring dengan
peningkatan jumlah peternak untuk memenuhi semakin tingginya kebutuhan
daging nasional. Pakan ternak yang umumnya digunakan oleh peternak ialah
hijauan, yaitu rumput, jagung, legum, jerami, dan alfalfa. Ketersediaan pakan
ternak di Indonesia umumnya melimpah pada saat musim hujan namun berkurang
pada musim kemarau. Untuk memenuhi ketersediaan pakan sepanjang tahun,
diperlukan teknologi tertentu untuk mengawetkan cadangan pakan yang diperoleh
selama musim hujan. Pengawetan pakan melalui proses fermentasi anaerob oleh
bakteri asam laktat (BAL) yang kemudian dikenal dengan silase merupakan cara
yang paling banyak dipraktekkan. Pada kenyataannya, pengawetan seperti ini
telah digunakan di seluruh dunia karena teknologinya sederhana dan efektif untuk
mengawetkan pakan ternak.
Proses ensilase didasarkan pada prinsip fermentasi asam laktat secara alami
oleh mikrob yang dijumpai di hijauan, yaitu BAL di bawah kondisi anaerobik.
Proses ini dapat menurunkan pH sampai pada tingkat Clostridial dan kapang
terhambat pertumbuhannya (Sparo dan Mallo 2001; Storm et al. 2008). Proses
fermentasi silase dilakukan dalam kondisi anaerob atau tidak ada oksigen. Jika
ada oksigen maka mikrob selain BAL menjadi aktif dan tumbuh berkembangbiak.
Kondisi ini berkaitan dengan terkonsumsinya nutrisi terutama karbohidrat oleh
mikrob selain BAL untuk proses pertumbuhannya. Dengan demikian, jumlah
nutrisi untuk pertumbuhan BAL berkurang drastis dan produksi asam laktat tidak
sesuai dengan harapan. Jika ini terjadi, maka proses pembuatan silase terganggu
bahkan berujung pada kegagalan.
Kapang merupakan salah satu mikrob yang sering mengkontaminasi silase
dan bertanggung jawab terhadap kegagalan proses pembuatan silase. Kapang yang
umum dijumpai mengganggu proses pembuatan silase di antaranya ialah genus
Fusarium, Penicillium, Aspergillus, Alternaria, Mucor, dan Rhizopus (Adams
2008; Storm et al. 2008). Storm et al. (2008) dan Whitlow dan Hagler (2010)
lebih jauh, melaporkan bahwa Aspergillus dapat menghasilkan toksin
(mikotoksin) yaitu aflatoksin, deoksinivalenol, zearalenon, dan T2 toksin.
Sementara itu, Fusarium menghasilkan fumonisin, kapang Penicillium
menghasilkan okratoksin, asam mikofenolat dan roquefortin C. Kehadiran toksin
(mikotoksin) di dalam pakan ternak sangat tidak menguntungkan. Oleh karena itu,
kehadiran kapang tidak hanya menyebabkan proses pembentukan silase tidak
terjadi, tetapi juga dapat mengganggu kesehatan ternak. Jika hal ini terjadi,
dipastikan akan mengakibatkan kerugian ekonomi yang besar di bidang
peternakan (Schnürer dan Magnuson 2005).
Senyawa toksin (mikotoksin) yang dihasilkan oleh kapang dapat
mengakibatkan gangguan kesehatan berupa mikosis bagi hewan. Mikosis dapat
menginfeksi paru-paru, kelenjar susu, rahim, dan usus atau hemorrhagic bowel
syndrome (HBS) (Santos et al. 2002; Whitlow dan Hagler 2010). Pada hewan
seperti sapi perah, babi, dan unggas, kehadiran mikotoksin mengurangi efisiensi
pertumbuhan, menurunkan konversi pakan dan tingkat reproduksi, penurunan

2

produksi susu pada sapi perah, menurunkan ketahanan terhadap infeksi penyakit,
mengurangi efektivitas vaksinasi, dan menginduksi kerusakan pada hati dan organ
lainnya (Coulombe 1993; Ranjit dan Kung 2000; Adams 2008). Selain itu, juga
dapat beresiko terhadap manusia melalui susu dan daging yang dikonsumsi
(Storm et al. 2008).
Di alam, pertumbuhan kapang dan produksi mikotoksin biasanya
berhubungan dengan kondisi cuaca yang ekstrem yang menyebabkan tanaman
menjadi stres. Pertumbuhan kapang juga dapat dipicu jika terjadi proses hidrasi
bahan pakan, penyimpanan pakan yang buruk, dan masalah transportasi (Whitlow
dan Hagler 2010). Iklim tropis yang dimiliki Indonesia dengan curah hujan, suhu,
dan kelembaban yang tinggi juga sangat mendukung pertumbuhan kapang
tersebut.
Pencegahan terjadinya kontaminasi silase oleh kapang di Indonesia sangat
penting dalam upaya mendukung usaha peternakan. Salah satu upaya yang dapat
dilakukan adalah dengan menggunakan inokulum BAL pada proses pembuatan
silase. Penambahan BAL sebagai inokulum silase juga bertujuan untuk
memastikan fermentasi berlangsung dengan baik, meningkatkan produksi asam
laktat, menurunkan pH, meningkatkan nilai gizi dan dapat menghambat
mikroorganisme lain (Parvin et al. 2010).
Penggunaan BAL pada proses pembuatan silase akan menjadi sangat
menarik karena beberapa galur BAL diketahui memiliki kemampuan
menghasilkan senyawa antikapang sehingga mampu menghambat pertumbuhan
kapang. Lavermicocca et al. (2000) dan Prema et al. (2010), melaporkan bahwa
L. plantarum mampu menghasilkan asam laktat, asam asetat, asam 4-hidroksi
fenillaktat, dan asam fenillaktat yang ke empat-empatnya mampu menghambat
pertumbuhan kapang Penicillium, Aspergillus, Eurotium, dan Fusarium. Hal ini
diperkuat oleh penelitian Peláez et al. (2012) yang menjelaskan bahwa terdapat
hubungan yang sinergis antara asam asetat dan asam laktat dalam menghambat
pertumbuhan kapang A. flavus.
Sementara itu Magnuson et al. (2003) melaporkan bahwa L. plantarum
yang diisolasi dari silase mempunyai kemampuan menghasilkan dipeptida siklik
yang juga bersifati senyawa antikapang. Lactobacillus plantarum MiLAB 14 telah
berhasil diisolasi dari bunga lila mempunyai kemampuan menghasilkan senyawa
antikapang yaitu asam 3-(R)-hidroksidekanoat, asam 3-hidroksi-5-cis-dodekenoat,
asam 3-(R) hidroksidodekanoat dan asam 3-(R) hidroksitetradekanoat. Senyawa
tersebut dapat menghambat kapang A. fumigatus (Sjögren et al. 2003).
Senyawa antikapang yang dihasilkan oleh BAL tidak hanya penting dalam
proses pembuatan silase. Senyawa ini dapat juga digunakan sebagai pengganti
pengawet kimia pada berbagai produk makanan seperti keju, roti, cereal atau
gandum, dan daging. Penggunaan BAL dan antikapang yang dihasilkannya
kemungkinan besar dapat dimanfaatkan dalam industri pakan dan pangan.
Penelitian yang dilakukan oleh Rizzello et al. (2011) mengungkapkan bahwa
gandum yang difermentasi oleh sourdough (SFWG) yang mempunyai
kemampuan menghasilkan senyawa antikapang digunakan sebagai bahan untuk
membuat roti. Roti yang ditambahkan 4% SFWG, tidak menunjukkan
kontaminasi kapang setelah 28 hari penyimpanan di suhu ruang. Penelitian yang
dilakukan oleh Ryan et al. (2011) menjelaskan bahwa roti yang dibuat dengan
menggunakan sourdough yang difermentasi dengan L. amylovorus memiliki daya

3

simpan lebih lama dibandingkan dengan menggunakan kalsium propionat.
Cizeikiene et al. (2013), menjelaskan bahwa senyawa antikapang yang dihasilkan
BAL memiliki kemampuan untuk menghambat kontaminasi kapang pada gandum
yang akan dipakai sebagai bahan baku pembuatan roti. Senyawa antikapang yang
dihasilkan oleh L. plantarum mampu meningkatkan kualitas dan masa simpan roti
gandum (Bello et al. 2007). Penelitian yang dilakukan oleh Illaningtyas (2003)
mengungkapkan senyawa antikapang yang dihasilkan oleh BAL mampu
menghambat pertumbuhan kapang yang mengkontaminasi keju.
Beberapa galur BAL yang dimiliki oleh Biotechnology Culture Collection
(BTCC) Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI telah digunakan sebagai inokulum
untuk pembuatan silase. Penambahan inokulum mikrob tersebut mampu
menghasilkan silase dengan kualitas yang baik dan tidak terjadi kontaminasi oleh
kapang (Ratnakomala et al. 2006; Ridwan et al. 2005). Namun demikian
penelitian tentang kemampuan BAL koleksi BTCC sebagai penghasil senyawa
antikapang belum dilakukan. Oleh karena itu, penelitian yang lebih mendalam
terhadap beberapa galur BAL koleksi BTCC terutama optimasi produksi senyawa
antikapang menggunakan metode respon permukaan (RSM) penting dilakukan.
Penggunaan RSM bertujuan untuk mengoptimalkan respon dalam percobaan atau
untuk membuat suatu model empirik untuk mengoptimasi kondisi produksi.
Perumusan Masalah
Silase sering terkontaminasi kapang sehingga proses pembentukan silase
tidak terjadi. Silase yang terkontaminasi jika dikonsumsi ternak akan mengganggu
kesehatan ternak. Beberapa galur BAL diketahui memiliki kemampuan
menghasilkan senyawa antikapang sehingga aplikasi senyawa antikapang dan atau
galur BAL ini mampu menghambat pertumbuhan kapang pada proses pembuatan
silase dan memberikan jaminan keberhasilan produksi silase lebih tinggi.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan galur BAL yang mampu
menghambat pertumbuhan kapang, identifikasi BAL terseleksi, dan optimasi
medium untuk produksi senyawa antikapang (asam laktat) dari BAL terseleksi
dengan menggunakan Response Surface Method (RSM).
Manfaat Penelitian
Manfaat dari penelitian ini ialah penggunaan isolat BAL sebagai produsen
senyawa antikapang dan atau sebagai inokulum silase dapat menekan kontaminasi
kapang sehingga diperoleh silase dengan kualitas yang baik. Pemanfaatan BAL
ini mampu memicu produksi silase yang pada akhirnya dapat meningkatkan
penggunaan silase untuk pakan ternak, meningkatkan produksi daging, dan dapat
mendukung upaya pemerintah untuk memenuhi kebutuhan daging nasional.

4

2 TINJAUAN PUSTAKA
Bakteri Asam Laktat
Taksonomi
Bakteri asam laktat merupakan grup bakteri Gram positif, tidak berspora,
berbentuk bulat atau batang, dan menghasilkan asam laktat sebagai produk akhir
selama fermentasi karbohidrat. Bakteri asam laktat berkaitan erat dengan bakteri
yang terlibat dalam fermentasi makanan dan pakan, termasuk bakteri yang
berhubungan dengan permukaan mukosal pada manusia dan hewan.
Bakteri asam laktat dikelompokan menjadi 21 genus yaitu Lactobacillus,
Carnobacterium, Leuconostoc, Oenococcus, Weissella, Pediococcus, Aerococcus,
Tetragenoecuccus, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Vagococcus,
Alloiococcus, Dolosigranulum, Globicatella, Lactosphaera, Dossilococcus,
Eremococcus, Facklamia, Helcococcus,dan Ignavigranum (Axelsson 2004).
Pengelompokan BAL secara klasik yaitu berdasarkan morfologi, fermentasi
glukosa, pertumbuhan pada suhu yang berbeda, konfigurasi asam laktat yang
dihasilkan, kemampuan tumbuh pada konsentrasi garam yang tinggi, dan tahan
terhadap asam dan basa. Pendekatan baru berdasarkan kemotaksonomi seperti
komposisi asam lemak, motilitas, sekuens rRNA, dan homologi DNA-DNA
(Axelsson 2004).
Metabolisme Bakteri Asam Laktat
Berdasarkan hasil metabolisme glukosa, BAL terbagi menjadi dua
golongan, yaitu homofermentatif dan heterofermentatif (Axelsson 2004). Bakteri
asam laktat yang hanya memproduksi asam laktat melalui jalur glikolisis disebut
homofermentatif, sedangkan yang memproduksi zat-zat lain di samping asam
laktat (asam laktat terbanyak) melalui fosfoketolase disebut heterofermentatif
(Gambar 1). Bakteri asam laktat yang termasuk dalam kelompok homofermentatif
yaitu Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus, and grup I
Lactobacilli. Leuconostoc, Oenococci, Weissela dan beberapa Lactobacilli
termasuk kelompok bakteri heterofermentatif (Axelsson 2004). Bakteri asam
laktat homoferementatif mengubah satu mol glukosa menjadi dua mol piruvat
yang selanjutnya diubah menjadi laktat melalui jalur Embden-Meyerhof-Parnas.
Proses tersebut menghasilkan 2 ATP dari satu mol glukosa yang dikonsumsi
tetapi tidak menghasilkan CO2.
Metabolisme glukosa dari BAL heterofermentatif menggunakan jalur 6fosfoglukonat/fosfoketolase. Selain menghasilkan asam laktat, BAL
heterofermentatif juga menghasilkan etanol, CO2, asam asetat, dan manitol serta
1mol ATP dari heksosa dan tidak mempunyai enzim aldolase (Axelsson 2004).

5

(a)

(b)
Gambar 1 Jalur fermentasi bakteri asam laktat homofermentatif (a), jalur
fermentasi bakteri asam laktat heterofermentatif (b) (Axelsson 2004).
Produk Fermentasi Bakteri Asam Laktat
Asam organik
Asam organik merupakan produk akhir dari metabolisme karbohidrat yang
dihasilkan oleh BAL. Asam laktat dan asetat adalah produk utama dari fermentasi
karbohidrat BAL (Magnuson 2003; Prema et al. 2010; Pelaez et al. 2012).
Bakteri asam laktat heterofermentatif menghasilkan asam asetat dalam
jumlah yang relatif tinggi dengan adanya akseptor elektron eksternal, sedangkan
asam propionat hanya diproduksi dalam jumlah yang sedikit dan memiliki nilai
pKa lebih tinggi dari asam laktat. Hampir sama dengan asam laktat, asam asetat
dan propionat berinteraksi dengan membran sel untuk menetralkan gradien proton
elektrokimia, tetapi pengaruh dari asam asetat dan propionat sering tergantung
pada penurunan pH yang disebabkan oleh asam laktat. Asam propionat secara
negatif mempengaruhi pertumbuhan jamur, terutama pada pH rendah, dan
mempengaruhi membran kapang pada nilai pH di bawah 4,5. Asam propionat dan
asetat juga mampu menghambat penyerapan asam amino. Beberapa garam dari
asam propionat, seperti natrium propionat dan amonium propionat menunjukkan
efek yang sama terhadap khamir dan kapang pada pH rendah (Magnuson 2003;
Ouwehand dan Vesterlund 2004).
Hidrogen Peroksida
Sebagian besar BAL memiliki flavoprotein oksidase dan NADH
peroksidase, dengan adanya oksigen memungkinkan BAL untuk menghasilkan
hidrogen peroksida (H2O2). Hidrogen peroksida terakumulasi di lingkungan
karena BAL tidak menghasilkan katalase (Condon 1987). Pengaruh antimikrob
dari hidrogen peroksida dihubungkan dengan pengaruh oksidasi yang kuat pada
sel bakteri, serta penghancuran struktur molekul dasar seluler protein. Pengaruh
antimikrob dari hidrogen peroksida diperkuat oleh adanya laktoperoksidase dan
tiosianat dalam lingkungan alami seperti susu dan air liur (Condon 1987;
Ouwehand dan Vesterlund 2004). Reaksi hidrogen peroksida dan tiosianat
dikatalisis oleh laktoperoksidase. Produk perantara seperti hipothiosianat
bertindak sebagai penghambat mikroorganisme lainnya (Magnuson 2003;
Ouwehand dan Vesterlund 2004).

6

Diasetil
Diasetil (2,3-butanadion) merupakan molekul yang bertanggung jawab atas
karakteristik aroma mentega. Senyawa tersebut dihasilkan oleh galur dari semua
genera BAL selama fermentasi sitrat. Pengaruh antimikrob dari diasetil terutama
pada pH di bawah 7,0, diperlukan jumlah diasetil yang tinggi (± 200 mM) untuk
aktivitas antimikrob, tetapi dapat mengubah rasa dan aroma produk (Ouwehand
dan Vesterlund 2004).
Senyawa Proteinaceous
Banyak sekali hasil penelitian mengenai bakteriosin yang sudah
dikarakterisasi yang dihasilkan oleh BAL. Sebaliknya hanya beberapa laporan
mengenai produksi peptida antikapang yang diproduksi oleh BAL. Beberapa
penulis telah melaporkan bahwa aktivitas antikapang dari BAL hilang setelah
perlakuan dengan enzim proteolitik. Roy et al. (1996) telah mengisolasi
Lactococcus lactis subsp. lactis dengan aktivitas antagonis terhadap beberapa
kapang. Setelah perlakuan secara enzimatik dengan kimotripsin, tripsin dan
pronase E, aktivitas antikapang menghilang. Hal tersebut menunjukkan bahwa
senyawa antikapang ialah protein. Beberapa galur BAL seperti L. lactis subsp.
lactis, L. casei subsp. Pseudoplantarum dan P. pentosaceous menghasilkan
metabolit antikapang yang sensitif terhadap enzim proteolitik.
Magnuson dan Schnürer (2001) menemukan senyawa proteinaceous
dihasilkan oleh L. coryniformis subsp. coryniformis strain Si3 yang mempunyai
pengaruh antikapang terhadap beberapa kapang dan khamir Debaromyces
hansenii dan Kluyveromyces marxianus. Peptida tersebut mempunyai ukuran yang
kecil (kira-kira 3 kDa), tahan terhadap panas, aktif pada kisaran pH 3-6 dan akan
menjadi tidak aktif oleh proteinase K atau tripsin. Jika kultur L. coryniformis galur
Si3 ditambahkan etanol, asam format atau asetat maka jumlah peptida antikapang
meningkat (Magnuson 2003).
Senyawa dengan Berat Molekul (BM) Rendah
Beberapa penulis telah melaporkan senyawa antikapang yang memiliki BM
rendah seperti reuterin dan asam lemak, tetapi hanya sedikit yang melakukan
pemurnian dan karakterisasi senyawa tersebut.
Reuterin
Reuterin (3–hidroksipropionaldehid) merupakan salah satu contoh senyawa
dengan BM rendah. Reuterin merupakan produk dari fermentasi gliserol yang
dihasilkan oleh L. coryniformis (Magnusson et al. 2003), L. reuteri, L. brevis, L.
buchneri, L. collinoides dalam kondisi anaerobik (Dalie et al. 2010). Senyawa ini
mampu menekan aktivitas enzim ribonuklease yang terlibat dalam biosintesis
DNA. Reuterin telah dilaporkan dapat menghambat pertumbuhan Aspergillus dan
Fusarium.

7

Asam Lemak
Beberapa BAL dapat menghasilkan asam lemak. Asam kaproat diisolasi
dari L. sanfrancisco CB1 adalah antikapang yang ampuh. Senyawa ini bersinergi
dengan asam lainnya seperti propionat, asam butirat dan asam valerat. Sjögren et
al. (2003) menemukan senyawa asam lemak yaitu asam 3-hidroksidekanoat
(mirmikasin, 3-HDA), asam 3-hidroksidodekanoat, asam 3-hidroksitetradekanoat
dan asam 3-hidroksi-5-cis-dodekanoat yang diisolasi dari supernatan BAL.
Dipeptida Siklik dan Senyawa Penghambat dengan BM Rendah Lainnya
Beberapa penelitian mengungkapkan bahwa BAL menghasilkan senyawa
dipeptida siklik dan senyawa penghambat dengan BM rendah. Lactobacillus
plantarum VTT E-78076 menghasilkan senyawa antimikrob yaitu asam benzoat,
5-metil-2-4-imidazolidinedion (metilhidantoin), siklo (glisil-L-leusil) dan
tetrahidro-4-hidroksi-4-metil-2H-pyran-2-one (mevalonolakton) dan 3-(2methylpropyl)-2,5-piperazindion (Niku-Paavola et al. 1999). Sedangkan
penelitian Ström et al. (2002) melaporkan L. plantarum MiLAB 393
memproduksi 2 siklik siklo dipeptida yaitu Phe-Pro dan Phe-OH-Pro.
Lavermicocca et al. (2000) mengungkapkan bahwa L. plantarum 21b
menghasilkan asam fenillaktik dan asam 4-hidroksifenillaktik yang mempunyai
aktivitas antikapang.

Gambar 2 Ringkasan dari beberapa senyawa antikapang dari bakteria asam laktat
(Magnuson 2003).
Faktor-Faktor Yang Mempengaruhi Produksi Senyawa Antikapang
Media Pertumbuhan
Beberapa informasi yang diketahui tentang dampak dari medium
pertumbuhan pada produksi metabolit antikapang oleh BAL. Media Elliker broth
merupakan media terbaik untuk produksi senyawa antikapang yang dihasilkan
oleh L. lactis subsp. lactis terhadap A. flavus dibandingkan dengan media M17
dan MRS. Selain itu, dalam kultur media susu, L. lactis subsp. diacetylactis
menghasilkan sejumlah kecil senyawa antikapang terhadap A. fumigatus (Dalie et
al. 2010).

8

Nutrisi
Beberapa penelitian menunjukkan bahwa ekstrak khamir, glukosa, NaCl dan
CaCl2 memodulasi produksi antikapang. Penambahan sampai dengan 1% dan 2%
glukosa menyebabkan bertambahnya produksi metabolit antikapang oleh P.
acidilactic dan L. rhamnosus (Dalie et al. 2010).
Suhu dan Waktu Inkubasi
Suhu dan masa inkubasi merupakan faktor penting yang memodulasi
pertumbuhan BAL dan secara signifikan mempengaruhi jumlah metabolit
antikapang yang dihasilkan.
pH
Kondisi pH sangat memodulasi produksi metabolit antikapang. L. lactis
subsp. diacetylactis mampu menghasilkan antikapang dalam rentang pH (5,5-7),
meskipun produksi maksimal terjadi pada pH 6,8. Efek pH terbukti terkait dengan
banyak faktor seperti substrat, periode inkubasi, suhu, galur kapang, dan
terjadinya persaingan mikroflora (Dalie et al. 2010).
Mekanisme Penghambatan Senyawa Antikapang
Menurut Magnusson et al. (2003), terdapat tiga mekanisme yang
menjelaskan efisiensi antimikrob dari BAL yaitu asam organik yang dihasilkan,
kompetisi nutrisi, dan produksi senyawa antagonis. Senyawa yang dapat
menghambat pertumbuhan kapang sangat penting untuk mengontrol patogen pada
manusia dan hewan serta pencegahan terhadap pertumbuhan kapang pada
makanan dan pakan (silase).
Antimikrob (antikapang) didefinisikan sebagai senyawa yang diproduksi
oleh mikroorganisme yang dapat membunuh atau menghambat pertumbuhan
mikroorganisme lain pada konsentrasi rendah. Beberapa senyawa antikapang
mempunyai situs khusus dalam aksi penghambatannya terhadap kapang. Target
penghambatan senyawa antikapang yaitu dinding sel, sel membran, sintesis
protein dan pembelahan sel. Senyawa antikapang menghambat sintesis β-glukan
dan kitin sintetase dari dinding sel, mengikat sterol atau menghambat biosintesis
sterol pada membran sel, menghambat sintesis protein melalui pengikatan
ribosom dan penghambatan terhadap pembelahan sel dengan mengganggu
pembentukan mikrotubuli (Ström 2005).
Response Surface Method (RSM)
Response Surface Method merupakan gabungan dari teknik matematika dan
statistik untuk melihat hubungan antara satu atau lebih variabel pelakuan
berbentuk kuantitatif dengan variabel respon. Penggunaan RSM ini bertujuan
untuk mengoptimalkan respon tersebut dalam percobaan atau untuk membuat
suatu model empirik untuk mengoptimasi kondisi produksi beberapa hasil
industri, seperti bahan kimia dan enzim. Tujuan dari optimasi dengan
menggunakan Response surface method ialah untuk memilih atau mencari
kombinasi taraf dari beberapa faktor sehingga dapat mengoptimalkan variabel

9

respon atau untuk mengoptimasi media fermentasi dalam memproduksi senyawa
biokimia (Mu et al. 2009).
Kelebihan optimasi dengan statistik di samping proses penapisan yang
cepat, juga menggambarkan peran setiap komponen. Response surface method
membantu memahami interaksi antara parameter pada berbagai tingkat dan
perhitungan tingkat optimal dari setiap parameter. Aplikasi dari teknik desain
eksperimental secara statistik dalam pengembangan proses fermentasi yaitu dapat
meningkatkan hasil produk, mengurangi proses variabilitas, serta mengurangi
waktu dan biaya. Response surface method secara luas digunakan untuk
mempelajari pengaruh dari beberapa variabel untuk mencari kondisi optimal.
Keberhasilan penerapan Response surface method untuk meningkatkan
produk fermentasi dengan mengoptimalkan media kultur telah banyak dilaporkan
(Nawani dan Kapadnis 2004; Khurana et al. 2007; Yuan et al. 2008). Response
surface method juga telah berhasil diaplikasikan dalam mengoptimasi senyawa
antikapang asam fenillaktik dari Lactobacillus sp. SK007 (Mu et al. 2009),
optimasi produksi asam laktat dari L. rhamnosus CGMCC (Yu et al. 2008).

3 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Industri, Pusat
Penelitian Bioteknologi-LIPI. Waktu Penelitian mulai dari bulan April 2012Januari 2013.
Bahan
Mikroorganisme yang digunakan adalah BAL dan kapang. Galur BAL yang
digunakan ialah 1BL-2, DSK-3, DP 1-4-2, TSD-10, 1A-2, dan DR 1-6-2. Kapang
uji yang digunakan ialah Aspergillus fumigatus IPBCC-88.03, A. flavus, dan
Penicillium sp. SR-3. Isolat BAL dan Penicillium sp. SR-3 merupakan koleksi
Biotechnology Culture Collection (BTCC), sedangkan kapang uji A. fumigatus
dan A. flavus merupakan koleksi IPB Culture Collection.
Prosedur Analisis Data
Pemeliharaan dan Pertumbuhan Mikroorganisme
Media yang digunakan untuk pemeliharaan BAL ialah agar-agar de Man
Rogosa Sharpe (MRSA). Komposisi agar-agar MRS (pH 6,9) yaitu 1% pepton,
0,8% Lab. lemco powder, 0,4% ekstrak khamir, 2% glukosa, 0,2% K2HPO4,
0,315% natrium asetat, 0,2% diamonium sitrat, 0,02% MgSO4.7H2O, 0,005%
MnSO4.H2O, 0,1% Tween 80, 0,5% CaCO3 dan 2% agar-agar. Medium
disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121 ºC selama 15 menit. Setelah
selesai sterilisasi, tabung reaksi diposisikan tegak. Inokulasi dilakukan dengan
menggunakan metode deep agar, yaitu inokulasi dilakukan dengan menusukkan
ose yang sudah ada mikrobnya ke media agar-agar MRS tegak (Lee et al. 2006).
Selanjutnya inkubasi dilakukan pada suhu 30 °C selama 48 jam.

10

Media yang digunakan untuk pertumbuhan kapang uji ialah agar-agar Malt
Extract (MEA). Sebanyak 1,7 g MEA dilarutkan dalam 100 ml air, kemudian
dipanaskan. Sebanyak 5 ml media tersebut diisikan ke tabung reaksi. Selanjutnya
disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121 °C selama 15 menit. Setelah
dimiringkan, kapang uji diinokulasi pada media tersebut, selanjutnya diinkubasi
pada suhu 30 °C selama 5 hari. Setelah isolat bakteri asam laktat dan kapang
tumbuh, isolat disimpan pada suhu 4 °C dan digunakan sebagai working culture.
Stock culture disimpan pada larutan 20 % gliserol pada suhu -80 °C.
Penapisan Beberapa Galur BAL Penghasil Senyawa Antikapang
Bakteri asam laktat ditumbuhkan di media MRSA. Selanjutnya 20 µl
suspensi kapang uji diinokulasi pada kertas cakram yang sudah diletakkan di atas
media. Biakan diinkubasi pada suhu 30 °C selama lima hari. Persentase
penghambatan dihitung dengan menggunakan metode Fokkema (1973) (Lampiran
1). Kontrol negatif yang digunakan ialah media MRS tanpa diinokulasi dengan
bakteri asam laktat. Metode ini selanjutnya disebut plate assay method. Tahap
selanjutnya yaitu mencampurkan kapang uji (1x 104 spora/ml) dan 5% (1 x 108
CFU/ml) BAL terseleksi pada media MRSA tegak. Biakan diinkubasi pada suhu
30 °C selama lima hari (Schillinger dan Villarreal 2010). Penghambatan terhadap
pertumbuhan kapang diamati.
Identifikasi Bakteri Asam Laktat Terseleksi
Bakteri asam laktat terseleksi diidentifikasi menggunakan metode koloni
PCR berdasarkan sekuen gen 16S rRNA (Sheu et al. 2000). Satu koloni BAL
terseleksi dimasukkan ke dalam tabung PCR, selanjutnya dimasukkan ke dalam
microwave selama 1 menit dengan kondisi suhu level tinggi (± 80-100 °C).
Kemudian ditambahkan 50 µl campuran reaksi PCR yang berisi 25 µl taq RM
(KAPA), 0,4 µl 100 pmol primer 27F (5’-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3’), 0,4
µl 100 pmol primer 1492R (5’- GGTTACCTTGTTACGACTT-3’) dan 24,2 µl
H2O. Kondisi PCR yang digunakan adalah sebagai berikut: pre heat 96 °C selama
5 menit, denaturasi 96 °C selama 30 detik, annealing 55 °C selama 30 detik,
elongasi 72 °C selama1 menit, ekstensi 72 °C selama 7 menit sebanyak 25 kali
putaran.
Produk PCR dipisahkan pada alat elektroforesis menggunakan 1% agarose
dan larutan bufer 1x TAE (Tris asetat-EDTA). Elektroforesis dilakukan pada
kondisi 100 V selama 30 menit. Hasil elektroforesis diamati dengan menggunakan
gel iluminator di bawah sinar UV. Produk PCR selanjutnya disekuen secara
parsial dengan menggunakan 2 primer yang sama pada saat PCR. Hasil sekuen
tersebut selanjutnya dibandingkan dengan data di GenBank menggunakan
BLAST. Sekuen DNA isolat terseleksi disejajarkan dengan sekuen DNA type
strain BAL dari database ribosom menggunakan program CLUSTAL X.
Escherchia coli digunakan sebagai mikrob outgroup. Topologi pohon filogenetik
dari sekuen DNA BAL terseleksi dievaluasi menggunakan analisis bootstrap
dengan software NJPlot (Pang et al. 2011).

11

Optimasi Produksi Senyawa Antikapang
Optimasi produksi senyawa antikapang (asam laktat) dari BAL terseleksi
dilakukan dengan menggunakan Response surface method (RSM) dengan
rancangan percobaan Central Composite Design (CCD). Analisis dilakukan
menggunakan Software Statistic Design-ExpertR 7 (Stat-Ease Inc., USA, 2009).
Parameter yang dibuat ialah lima variabel, yaitu glukosa (X1), ekstrak khamir
(X2), CH3COONa (X3), K2HPO4 (X4), dan Tween 80 (X5) dengan kombinasi lima
tingkat dosis (Tabel 1). Model yang digunakan ialah response surface mengikuti
persamaan:
+
Y adalah total senyawa antikapang/asam laktat tertitrasi yang diproduksi,
sedangkan Xi…, Xj merupakan variabel yang diuji dan β0 adalah intercept serta
βi....,, βij. adalah koefisien regresi.
Isolat BAL terseleksi diinokulasikan ke dalam 25 ml media MRS cair,
kemudian diinkubasi secara statik pada suhu 30 °C selama 48 jam dan selanjutnya
dipakai sebagai inokulum. Sebanyak 5 % inokulum berisi ± 1 x 108 CFU/ml
diinokulasi ke 50 ml media produksi, diinkubasi secara statik pada suhu 30 °C
selama 48 jam. Kultur disentrifugasi pada kecepatan 7840 g pada suhu 4 °C
selama 15 menit. Verifikasi atau validasi terhadap kondisi optimum dilakukan
dengan menginokulasikan 5 % inokulum isolat BAL terseleksi ke dalam 50 ml
media MRS cair optimum.
Tabel 1 Kombinasi lima variabel dan lima tingkat kombinasi percobaan dengan
Central Composite Design (CCD)
Variabel
Glukosa (% w/v) (X1)
Ekstrak khamir (% w/v) (X2)
CH3COONa (% w/v) (X3)
K2HPO4 (% w/v) (X4)
Tween-80 (% v/v) (X5)

–1,8
1,089
0,2179
0,1329
0,1089
0,0089

Level code variable
–1
0
+1
1,5
2
2,5
0,3
0,4
0,5
0,215 0,315 0,415
0,15
0,2
0,25
0,05
0,1
0,15

+1,8
2,911
0,5821
0,4971
0,2911
0,1911

Analisis asam laktat dilakukan dengan menggunakan metode titrimetri
(Apriyantoro et al. 1989). Sebanyak 10 ml supernatan dititrasi dengan 0,1 N
NaOH yang sebelumnya sudah distandarisasi oleh 0,1 N asam oksalat. Indikator
yang digunakan yaitu fenolftalin. Hasilnya dinyatakan sebagai persen asam laktat
(Apriyantono et al. 1989). Penghitungan persen asam laktat menggunakan rumus:
Selanjutnya data yang diperoleh dianalisis menggunakan Software Statistic
Design-ExpertR 7.

12

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Penapisan Beberapa Galur BAL Penghasil Senyawa Antikapang
Penapisan dilakukan terhadap enam galur BAL yaitu isolat DSK3 yang
berasal dari dadih Sulawesi Selatan, isolat DR1-6-2 dan DP1-4-2 berasal dari
dadih Riau, isolat 1A-2 berasal dari tapai, isolat TSD-10 berasal dari kotoran sapi,
dan isolat 1BL-2 berasal dari buah strawberi. Sedangkan kapang uji yang
digunakan yaitu A. fumigatus IPBCC-88.03, A. flavus, dan Penicillium sp. SR-3.
Hasil penapisan menunjukkan isolat BAL DR 1-6-2 dapat menghambat
pertumbuhan A. fumigatus IPBCC-88.03 dan A. flavus (Gambar 3) masing-masing
dengan persentase penghambatan sebesar 41% dan 32%. Hal ini terlihat dengan
tidak tumbuhnya A. fumigatus IPBCC-88.03 dan A. flavus di sekitar koloni BAL
DR 1-6-2. Isolat BAL TSD-10 dan DP 1-4-2 dapat menghambat pertumbuhan A.
flavus (Gambar 1) dengan persentase penghambatan masing-masing sebesar 32%.
Dari keenam isolat BAL yang ditapis, tidak ada yang mampu menghambat
Penicillium sp.SR-3.
Galur bakteri asam laktat
Kontrol -

DR 1-6-2

1A-2

DSK-3

TSD-10

DP 1-4-2

1BL-2

Kapang
yang
diujikan

Aspergillus
fumigatus

A. flavus

Penicillium

Gambar 3 Pengujian penghambatan pertumbuhan A. fumigatus, A.flavus, dan
Penicillium oleh enam galur BAL pada media MRS agar, diinkubasi
pada suhu 30 °C selama lima hari.
Pengujian BAL dengan metode agar tegak dengan cara menginokulasi BAL
dan kapang uji bersamaan (Gambar 4). Pada pengujian ini, isolat DR 1-6-2 tidak
hanya mampu menghambat A. fumigatus, A. flavus, tetapi juga Penicillium. Hal
tersebut ditunjukkan dengan tidak adanya pertumbuhan ketiga kapang uji tersebut.
Pada kontrol negatif yang tidak diinokulasi dengan BAL dan hanya ditambahkan
kapang uji, kapang tampak tumbuh merata dipermukaan medium.

13

A. fumigatus

Kontrol -

DR 1-6-2

Penicillium

A. flavus

Kontrol -

DR 1-6-2

Kontrol -

DR 1-6-2

Gambar 4 Pengujian penghambatan A. fumigatus, A. flavus, dan Penicillium oleh
isolat BAL DR 1-6-2 menggunakan media MRSA tegak. Isolat BAL
DR 1-6-2 dan kapang uji ditumbuhkan bersamaan pada MRSA dan
diinkubasi pada suhu 30 °C selama lima hari.
Identifikasi Bakteri Asam Laktat Terseleksi
Isolat BAL terseleksi yaitu DR 1-6-2 diidentifikasi dengan menggunakan
pendekatan molekuler sekuen gen 16S rRNA. Pita gen 16S rRNA dari isolat DR16-2 menggunakan gel elektroforesis yang mempunyai ukuran ±1600 basa
nukleotida (Gambar 5).
10000

3000
1500
1000
750
500
250
Marker 1 kb

DR 1-6-2

Gambar 5 Pita gen 16S berukuran ± 1600 basa rRNA dari isolat DR-16-2
menggunakan gel elektroforesis
Produk PCR selanjutnya dianalisis sekuen DNA. Sekuen nukleotida yang
diperoleh selanjutnya dianalisis BLAST dan pohon filogenetik (Gambar 6).
Berdasarkan hasil BLAST dan pohon filogenetik, isolat DR 1-6-2 dengan L.
plantarum memiliki nilai homologi sebesar 98% dari total 1454 nukleotida.
Kekerabatan yang dekat antara isolat DR 1-6-2 dengan beberapa isolat L.
plantarum mempunyai homologi 98% (Tabel 2).

14

Gambar 6 Pohon filogenetik dari isolat DR 1-6-2.
Tabel 2 Isolat bakteri asam laktat yang mempunyai kekerabatan yang dekat
dengan isolat BAL DR-16-2
No.
Nama spesies
Homologi (%)
Nomor akses
1.
L. plantarum galur KCC-10
98
KC422325.1
2.
L. plantarum galur KCC-9
98
KC422324.1
3.
L. plantarum galur KCC-8
98
KC422323.1
4.
L. plantarum galur KCC-6
98
KC422321.1
5.
L. plantarum galur KCC-3
98
KC422318.1
6.
L. plantarum galur KCC-1
98
KC422316.1
7.
L. plantarum galur PON10014
98
KC416990.1
8.
L. plantarum galur qz-572-1
98
HF562939.1
9.
L. plantarum galur CTBRBL22
98
JX426117.1
10.
L. plantarum galur G8
98
JX183220.1
Berdasarkan analisis pohon filogenetik, isolat DR-1-6-2 termasuk famili
bakteri asam laktat dan genus Lactobacillus yang ditandai dengan terpisahnya
cabang dan masuk ke dalam klaster L. plantarum.
Optimasi Produksi Senyawa Antikapang
Media yang digunakan untuk optimasi adalah MRS cair dengan beberapa
variabel dan level konsentrasi. Variabel yang dipilih untuk produksi senyawa

15

antikapang/asam laktat dari BAL DR 1-6-2 yaitu glukosa, ekstrak khamir, sodium
asetat dan Tween 80. Pengaruh variabel-variabel tersebut dianalisis menggunakan
response surface method (RSM). Analisis regresi menggunakan software DesignExpert 7. Rancangan percobaan optimasi asam laktat dari isolat DR 1-6-2
menggunakan CCD (Lampiran 4).
Hasil optimasi produksi senyawa antikapang (asam laktat) dianalisis dengan
analisis varian. Glukosa, Tween 80, interaksi glukosa dan ekstrak khamir,
interaksi ekstrak khamir dan K2HPO4 secara signifikan mempengaruhi produksi
asam laktat oleh L. plantarum DR 1-6-2 (Tabel 3). Berdasarkan hasil ANOVA,
model regresi terbaik dengan nilai regresi (R2) sebesar 0,99 adalah sebagai
berikut:
Y = 1,65 + 0,288 X1 - 0,023 X12 + 0,041 X5 + 0,047X1X4 + 0,049 X2X4
Pada persamaan tersebut, X1, X2, X4, X5 masing- masing menunjukkan
glukosa, ekstrak khamir, K2HPO4, Tween 80, dan Y adalah total asam laktat
tertitrasi.
Tabel 3 ANOVA untuk Response Surface Quadratic
Sumber

Model
X1-Glukosa
X2-Ekstrak Khamir
X3-CH3COONa
X4-K2HPO4
X5-Tween80
X1X2
X1X3
X1X4
X1X5
X2X3
X2X4
X2X5
X3X4
X3X5
X4X5
X12
X22
X32
X42
X52
Residual
Lack of Fit
Pure Error
Cor Total

Sum of
Squares
1,454
0,551
0,002
0,001
0,001
0,011
0,003
0,001
0,007
0,004
0,001
0,007
0,001
0,000
0,002
0,003
0,011
0,000
0,000
0,004
0,001
0,005
0,002
0,003
1,459

db
20
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
5
1
4
25

Mean
Nilai
Nilai P
Keterangan
Square
F
Prob > F
Signifikan
0,073 75,39 < 0,0001
0,551 571,51 < 0,0001
0,002
1,87
0,2302
0,001
0,83
0,4042
0,001
1,30
0,3065
0,011 11,66
0,0189
0,003
2,80
0,1552
0,001
1,41
0,2888
0,007
6,92
0,0465
0,004
4,45
0,0886
0,001
0,55
0,4899
0,007
7,46
0,0412
0,001
0,55
0,4914
0,000
0,26
0,6332
0,002
1,82
0,2350
0,003
3,62
0,1154
0,011 11,28
0,0202
0,000
0,24
0,6481
0,000
0,00
0,9673
0,004
4,13
0,0979
0,001
1,32
0,3029
0,001
0,002
2,18
0,2136 Tidak signifikan
0,001

Keterangan:
Cetak tebal dipergunakan dalam pengembangan model regresi untuk produksi senyawa asam laktat

16

Hasil grafik dari percobaan divisualisasikan dalam bentuk tiga dimensi dan
plot contour dari response surface yang menunjukkan hubungan antara dua faktor
yang saling berinteraksi terhadap total asam laktat tertitrasi (Yu et al. 2010).
Konsentrasi glukosa dan Tween 80 dan interaksinya berpengaruh signifikan
terhadap konsentrasi asam laktat yang dihasilkan (Gambar 7). Demikian pula
konsentrasi glukosa dan K2HPO4 dan interaksinya (Gambar 8) serta konsentrasi
ekstrak khamir dan K2HPO4 dan interaksinya (Gambar 9) berpengaruh signifikan
terhadap konsentrasi asam laktat yang dihasilkan. Pengaruh konsentrasi glukosa
terhadap konsentrasi total asam laktat tertitrasi (Gambar 10).
Hasil analisis data optimasi menggunakan software statistik Design-ExpertR
7 (Stat-Ease, Inc., USA, 2009) menunjukkan bahwa kondisi optimal untuk
produksi asam laktat ialah 2,91% glukosa, 0,58% ekstrak khamir, 0,29% K2HPO4
dan 0,19% Tween 80. Berdasarkan kondisi tersebut, perhitungan dari persamaan
yang diperoleh konsentrasi total asam laktat tertitrasi yaitu sebesar 2,61%. Hasil
optimasi tersebut meningkat 59% jika dibandingkan dengan produksi di media
MRS cair tanpa optimasi yang memiliki konsentrasi total asam laktat tertitrasi
sebesar 1,64%. Hasil percobaan verifikasi kondisi optimum diperoleh konsentrasi
total asam laktat tertitrasi yaitu 2,59% atau meningkat 58% dari kondisi tanpa
optimasi. Nilai dari hasil verifikasi tersebut mendekati nilai perkiraan. Dengan
demikian, model regresi yang digunakan tersebut adalah ideal untuk produksi
asam laktat dari isolat DR 1-6-2.

TAT

17

Tween 80 (%)

Glukosa (%)

Tween 80 (%)

(a)

Glukosa (%)

(b)
Gambar 7 Response surface plots bentuk tiga dimensi (a) dan bentuk contour (b)
yang menggambarkan pengaruh konsentrasi glukosa dan Tween 80
terhadap konsentrasi total asam laktat tertitrasi.

TAT (%)

18

K2HPO4 (%)

Glukosa (%)

K2HPO4 (%)

(a)

Glukosa (%)

(b)
Gambar 8 Response surface plots bentuk tiga dimensi (a) dan bentuk contour (b)
yang menggambarkan pengaruh konsentrasi glukosa dan K2HPO4
terhadap konsentrasi total asam laktat tertitrasi.

TAT (%)

19