Isolation and Characterization of Acyl Homoserine Lactonase (AHL-lactonase) Producing Bacteria from Agricultural Field in Java

ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI PENGHASIL
ACYL HOMOSERINE LACTONASE (AHL-LAKTONASE) ASAL
LAHAN PERTANIAN DI JAWA

TIRA SITI NUR AFIAH

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011

ABSTRAK
TIRA SITI NUR AFIAH. Isolasi dan Karakterisasi Bateri Penghasil Acyl Homoserine Lactonase
(AHL-laktonase) Asal Lahan Pertanian di Jawa. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan ALINA
AKHDIYA.
Quorum sensing (QS) adalah mekanisme komunikasi bakteri yang bergantung pada jumlah
populasi bakteri tersebut dan akumulasi senyawa autoinducer (AI). Quorum sensing pada
kelompok bakteri Gram negatif melibatkan senyawa acyl homoserine lactone (AHL) untuk
mengatur beberapa ekspresi gen, termasuk gen virulensi. Senyawa anti-QS merupakan senyawa
yang dapat mendegradasi AHL sehingga gen virulensi tidak dapat diekspresikan. Acyl homoserine

lactonase (AHL-laktonase) yang disandikan oleh gen aiiA merupakan salah satu enzim yang dapat
berperan sebagai anti-QS. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi
bakteri penghasil AHL-laktonase yang berasal dari lahan pertanian di Jawa. Bioesei aktivitas
degradasi AHL menggunakan bakteri indikator Chromobacterium violaceum. Verifikasi
keberadaan AHL-laktonase pada isolat-isolat yang menunjukkan hasil bioesei positif dilakukan
dengan amplifikasi gen aiiA. Dari 12 isolat bakteri yang menunjukkan aktivitas degradasi AHL,
terdapat dua isolat yang memiliki gen aiiA yaitu isolat INT1c dan SGT3g. Kedua isolat tersebut
memiliki bentuk sel batang, penataan sel berantai, berendospora, dan termasuk dalam kelompok
bakteri Gram positif. Analisis sekuen gen aiiA menunjukkan bahwa gen aiiA isolat INT1c
memiliki homologi dengan gen aiiA bakteri Bacillus cereus ATTCC 14579 sedangkan isolat
SGT3g memiliki homologi dengan gen aiiA bakteri Bacillus thuringiensis BMB171. Identifikasi
molekuler berdasarkan gen 16S rRNA menunjukkan bahwa isolat INT1c memiliki kemiripan
terdekat dengan bakteri Bacillus cereus strain GM3 (98%) sedangkan isolat SGT3g memiliki
kemiripan terdekat dengan bakteri Bacillus thuringiensis strain A1-1 (99%).
Kata kunci: anti-quorum sensing, AHL-laktonase, gen aiiA.

TIRA SITI NUR AFIAH. Isolation and Characterization of Acyl Homoserine Lactonase (AHLlactonase) Producing Bacteria from Agricultural Field in Java. Under supervision of IMAN
RUSMANA and ALINA AKHDIYA.
Quorum sensing (QS) is a bacterial communication mechanism correlating with the number
of bacterial population and accumulation of autoinducer (AI). Quorum sensing in Gram-negative

bacteria involves a AI group of acyl homoserine lactone (AHL) to regulate the expression of
several genes, including virulence genes. Anti-quorum sensing compounds can degrade AHL so
that virulence genes can not be expressed. Acyl homoserine lactonase (AHL-lactonase) encoded
by the aiiA gene is one enzyme that can act as an anti-quorum sensing. This study aimed to isolate
and characterize the AHL-lactonase producing bacteria isolated from agricultural field in Java.
Activity of AHL degradation bioassay using Chromobacterium violaceum as a bacterial indicator.
Verification the presence of AHL-laktonase was performed by gene aiiA amplification. As many
as 12 bacterial isolates showed AHL degradation activity and two isolates had the aiiA gene i.e.
INT1c and SGT3g isolates. These isolates had bacil cells with chain arrangement and endospores.
They were grouped in Gram-positive bacteria. AiiA gene sequence analysis showed that aiiA gene
of INT1c had homology with aiiA gene of Bacillus cereus ATTCC 14579 while the SGT3g isolate
had homology with aiiA gene of Bacillus thuringiensis BMB171. Molecular identification based
on 16S rRNA gene showed that INT1c isolate had the closest similarity with the Bacillus cereus
strain GM3 (98%) while SGT3g isolate had the closest similarity with the Bacillus thuringiensis
strains A1-1 (99%).
Keywords: Anti-quorum sensing, AHL-lactonase, aiiA gene.

ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI PENGHASIL ACYL
HOMOSERINE LACTONASE (AHL-LAKTONASE) ASAL LAHAN
PERTANIAN DI JAWA

TIRA SITI NUR AFIAH

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011

Judul Skripsi : Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Penghasil Acyl Homoserine
Lactonase (AHL-Laktonase) Asal Lahan Pertanian di Jawa
Nama
: Tira Siti Nur Afiah
NIM
: G34070022

Departemen : Biologi

Disetujui

Pembimbing I

Pembimbing II

Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si
NIP. 196507201991031002

Alina Akhdiya, M.Si
NIP. 196812082001122001

Diketahui
Ketua Departemen Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor

Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.S

NIP. 196410021989031002

Tanggal Lulus :

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas rahmat dan karunia-Nya
sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Tema penelitian ini adalah anti-quorum sensing,
dengan judul Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Penghasil Acyl Homoserine Lactonase (AHLLaktonase) Asal Lahan Pertanian di Jawa. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan November 2010
hingga Mei 2011, bertempat di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Institut Pertanian
Bogor.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si dan Ibu
Alina Akhdiya, M.Si selaku pembimbing. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada
Bapak, Almarhum Mama, serta seluruh keluarga, atas doa dan kasih sayangnya. Di samping itu,
penulis mengucapkan terima kasih kepada Atun, Ka Fina, Bang Jo, Dwi, teman-teman yang
tergabung dalam IR-Crew, teman-teman yang telah bersedia mengambil sampel tanah, temanteman seperjuangan: Bian, Inong, Iyut, Maya, Mayang, Nunu, Tri, dan teman-teman di
laboratorium mikrobiologi yang telah membantu dalam penelitian ini.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Agustus 2011
Tira Siti Nur Afiah

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Cianjur pada tanggal 14 Januari 1990 dari ayah Abdul Madjid dan ibu
Ai Djubaedah. Penulis merupakan anak keempat dari empat bersaudara. Tahun 2007 penulis lulus
dari SMA Negeri 1 Sukanagara. Pada tahun yang sama, penulis lulus seleksi masuk IPB melalui
jalur Undangan Seleksi Masuk IPB pada Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam. Penulis mendapatkan beasiswa Peningkatan Prestasi Akademik (PPA) dari
DIKTI pada tahun 2008-2011.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten mata kuliah Biologi Dasar pada
tahun ajaran 2009/2010 dan 2010/2011, mata kuliah Ekologi Dasar, Genetika Dasar, Biologi
Cendawan, dan Botani Umum pada tahun ajaran 2010/2011. Penulis telah melaksanakan Praktik
Kerja Lapang di perusahaan Bina Usaha Flora dari bulan Juli sampai Agustus 2010 dengan judul
Aklimatisasi dan Pengepakan Bibit Tanaman Hias dan Sayuran di PT Bina Usaha Flora.

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL .............................................................................................................. vi
DAFTAR GAMBAR .......................................................................................................... vi
DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................................... vi
PENDAHULUAN ............................................................................................................... 1
Latar Belakang ............................................................................................................. 1

Tujuan .......................................................................................................................... 1
METODE ...........................................................................................................................
Waktu dan Tempat Penelitian .......................................................................................
Isolasi, Pemurnian, dan Penyimpanan Bakteri ...............................................................
Bioesei Aktivitas Degradasi AHL .................................................................................
Pengamatan Morfologi Sel dan Pewarnaan Gram ..........................................................
Amplifikasi Gen Penyandi AHL-Laktonase ...................................................................
Identifikasi Isolat ..........................................................................................................
Sekuensing DNA dan Analisis Bioinformatika ..............................................................
Konstruksi Pohon Filogenetik .......................................................................................

1
1
1
2
2
2
2
2
2

HASIL ................................................................................................................................
Bioesei Aktivitas Degradasi AHL .................................................................................
Pengamatan Morfologi Sel dan Pewarnaan Gram ..........................................................
Amplifikasi Gen Penyandi AHL-Laktonase ...................................................................
Identifikasi Isolat ..........................................................................................................
Konstruksi Pohon Filogenetik .......................................................................................

2
2
3
4
4
5

PEMBAHASAN ................................................................................................................. 5
SIMPULAN ....................................................................................................................... 6
SARAN .............................................................................................................................. 7
DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................................... 7
LAMPIRAN ....................................................................................................................... 8

DAFTAR TABEL
Halaman
1 Isolat bakteri yang diperoleh dari lahan pertanian di Jawa dan aktivitas degradasi AHL ...... 3
2 Diameter zona degradasi AHL pada 12 isolat .................................................................... 3
3 Karakteristik morfologi sel dan pewarnaan Gram isolat-isolat yang menunjukkan
aktivitas degradasi AHL .................................................................................................... 4
4 Hasil analisis sekuen gen aiiA isolat INT1c & SGT3g dengan menggunakan program
BLAST-N ....................................................................................................................... 5
5 Hasil analisis sekuen gen aiiA isolat INT1c & SGT3g dengan menggunakan program
BLAST-X ....................................................................................................................... 5
6 Hasil analisis sekuen gen 16S rRNA isolat INT1c & SGT3g dengan menggunakan
program BLAST-N .......................................................................................................... 5

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Zona degradasi AHL 12 isolat terpilih .............................................................................. 3
2 Visualisasi amplikon gen aiiA pada gel agarose 1% .......................................................... 4
3 Visualisasi amplikon 16S rRNA pada gel agarose 1% ....................................................... 4
4 Pohon filogenetik berdasarkan sekuen gen aiiA dari isolat INT1c dan SGT3g yang

dibandingkan dengan sekuen gen aiiA dari beberapa spesies bakteri lainnya ...................... 5

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Komposisi media pertumbuhan yang digunakan ............................................................... 9
2 Hasil sekuensing dan analisis bioinformatik gen aiiA dan 16S rRNA dengan program
BLAST-N dan BLAST X ................................................................................................. 10

PENDAHULUAN
Latar belakang
Bakteri fitopatogen merupakan bakteri
yang menyebabkan infeksi atau penyakit
pada tumbuhan. Pengendalian bakteri
patogen
dapat
dilakukan
dengan
menggunakan senyawa antibiotik atau
antimikrob. Masalah yang dihadapi dalam
penggunaan antibiotik adalah timbulnya

resistensi bakteri terhadap antibiotik tersebut.
Hal ini mendorong dilakukannya berbagai
penelitian tentang pengendalian bakteri
patogen yang yang lebih aman dan tidak
dikhawatirkan akan menimbulkan resistensi.
Defoirdt et al. (2004) menyatakan bahwa
ekspresi gen virulensi pada beberapa bakteri
patogen diregulasi oleh proses quorum
sensing. Quorum sensing (QS) adalah
mekanisme komunikasi bakteri sebagai suatu
pengaturan ekspresi gen yang bergantung
pada jumlah populasi bakteri tersebut dan
akumulasi senyawa autoinducer (AI)
(Rukayadi & Hwang 2009). QS terlibat
dalam regulasi fungsi biologi yang penting
seperti luminescence, produksi antibiotik,
transfer plasmid, motilitas, virulensi,
pembentukan biofilm dan berperan dalam
regulasi ekspresi gen-gen patogen pada
Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas
aeruginosa, dan beberapa spesies Erwinia
(Dong et al. 2000; Zang & Dong 2004).
Proses QS melibatkan molekul kimia
yang disebut autoinducer (AI). AI merupakan
molekul
sinyal
yang
disekresikan,
diakumulasi, diserap kembali, dan dikenali
oleh bakteri selama proses QS terjadi
(Rukayadi & Hwang 2009). Salah satu jenis
molekul AI adalah
N-acylhomoserine
lactone (AHL) yang dihasilkan oleh bakteri
Gram negatif, serta digunakan untuk
komunikasi dalam spesies yang sama
(Rukayadi & Hwang 2009).
Salah satu prinsip pengendalian virulensi
bakteri fitopatogen dengan dasar QS adalah
mencegah
akumulasi
AHL
dengan
mendegradasi molekul sinyal tersebut.
Senyawa atau molekul yang dapat
mendegradasi molekul AHL disebut senyawa
anti-QS. Anti-QS memiliki kelebihan dalam
mengontrol infeksi bakteri yaitu tidak
mempengaruhi pertumbuhan, sehingga dapat
menghindarkan timbulnya tekanan seleksi
yang sering menghasilkan generasi patogen
yang lebih resisten terhadap antibiotik (White
& Finan 2009). Beberapa enzim pendegradasi
AHL telah diidentifikasi dari beberapa

bakteri dan memiliki potensi sebagai anti-QS
(Yin et al. 2010).
Salah satu enzim pendegradasi AHL
adalah enzim Acyl Homoserine Lactonase
(AHL-laktonase) (Dong et al. 2000). Enzim
ini disandikan oleh gen aiiA yang dimiliki
oleh Bacillus dan mampu mendegradasi AHL
dengan menghidrolisis ikatan lakton yang
terdapat pada molekul AHL (Dong et al.
2000). AHL-laktonase sebagai salah satu
senyawa anti-QS dapat digunakan sebagai
alternatif dalam pengendalian bakteri
fitopatogen.
Sebagai
salah
satu
negara
megabiodiversity, Indonesia mempunyai
kekayaan dan keragaman sumberdaya
mikroba yang sangat besar dan berpotensi
sebagai penghasil AHL-laktonase. Oleh
karena itu, isolasi dan karakterisasi bakteri
penghasil AHL-laktonase merupakan langkah
awal untuk untuk memanfaatkan potensi
tersebut.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi
dan mengkarakterisasi bakteri penghasil
AHL-laktonase asal lahan pertanian di Jawa.

METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan
November 2010 sampai dengan Mei 2011,
bertempat di Laboratorium Mikrobiologi
Departemen Biologi FMIPA IPB.
Isolasi, Pemurnian, dan Penyimpanan
Bakteri
Isolasi bakteri dilakukan terhadap 27
sampel tanah dan 10 sampel daun yang
berasal dari lahan pertanian di Jawa. Isolasi
bakteri tanah dilakukan dengan metode
cawan sebar pada media nutrient agar (NA)
(Lampiran 1). Sebanyak 1 gram sampel tanah
disuspensikan dengan 9 mL larutan garam
fisiologis 0,85%. Suspensi dienceran serial
sampai pengenceran 10-6, 10-7, dan 10-8. Sisa
suspensi dipanaskan dalam penangas air
selama 10 menit pada suhu 80oC. Sebanyak
0,1 mL dari setiap pengenceran dan suspensi
yang dipanaskan tersebut masing-masing
disebarkan ke media NA, kemudian
diinkubasi selama dua hari pada suhu ruang.
Bakteri filosfer diisolasi dengan cara
membilas sampel daun dengan larutan garam
fisiologis 0,85% dan disebarkan pada media
pertumbuhan King’s B (Lampiran 1). Kolonikoloni
bakteri
yang
tumbuh
dan

2

menunjukkan morfologi yang berbeda
dimurnikan dengan metode cawan gores.
Setelah murni, bakteri disimpan dalam agar
miring.
Bioesei Aktivitas Degradasi AHL
Isolat-isolat murni ditumbuhkan pada
media Luria broth (LB). Setelah 48 jam,
kultur disentrifus selama 10 menit dengan
kecepatan 10000 rpm. Sebanyak 100 μL
supernatant diteteskan pada paper disk dan
diletakkan pada permukaan media cawan
Luria agar (LA) yang mengandung
Chromobacterium violaceum 1%. Cawan
tersebut kemudian diinkubasi pada suhu
ruang selama 24 jam. Media LB steril
digunakan sebagai kontrol. Paper disk yang
dikelilingi oleh zona tidak berwarna ungu
menunjukkan adanya aktivitas degradasi
AHL.
Pengamatan Morfologi Sel dan Pewarnaan
Gram
Isolat-isolat yang menunjukkan hasil
bioesei positif diamati morfologi sel (bentuk
sel, penataan sel, dan endospora) dan reaksi
terhadap pewarnaan Gram.
Amplifikasi Gen Penyandi AHL-laktonase
DNA bakteri diisolasi dengan metode
Lazo (Lazo et al. 1987). Isolat-isolat yang
menunjukkan hasil bioesei degradasi AHL
positif diamplifikasi menggunakan primer
spesifik untuk gen aiiA yaitu aiiAF (5’-ATC
GGA TCC ATG ACA GTA AAG AAG CTT
ATT TCG-3’, dan aiiAR (5’-GTC GAA TTC
CTC AAC AAG ATA CTC CTA ATG
ATGT-3’ (Dong et al. 2000). Campuran PCR
terdiri dari 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs,
0.3 µM masing-masing primer, 0.02 U/µL
Taq DNA polymerase, template DNA,
ddH2O, dan buffer DNA polymerase.
Amplifikasi dilakukan selama 30 siklus PCR
dengan kondisi pra-denaturasi (94oC, 10
menit), denaturasi (94oC, 30 detik), annealing
(52oC, 30 detik), elongasi (72oC, 1 menit),
dan post-PCR (72oC, 5 menit) (Chan et al.
2007). Produk PCR dilarikan pada mini-gel
elektroforesis (agarose 1%) pada tegangan
listrik 50 volt selama 45 menit (Sambrook et
al. 1989). Visualisasi di atas UV
Transiluminator dilakukan dengan pewarnaan
Ethidium Bromida.

Identifikasi Isolat
Isolat-isolat yang menunjukkan hasil
positif pada bioesei degradasi AHL dan
amplifikasi gen aiiA diidentifikasi secara
molekuler (16S rRNA). Amplifikasi gen 16S
rRNA menggunakan primer 63f (5’-CAG
GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3’) dan
1387r (5’-GGG CGG WGT GTA CAA
GGC-3’) (Marchesi et al. 1998). Amplifikasi
dilakukan selama 30 siklus PCR dengan
kondisi pra-PCR (94oC, 2 menit), denaturasi
(92oC, 30 detik), annealing (50oC, 1 menit),
elongasi (72oC, 1 menit), dan post-PCR
(75oC, 5 menit).
Sekuensing
DNA
dan
Analisis
Bioinformatika
Pengurutan DNA hasil amplifikasi
dilakukan
dengan
memanfaatkan
jasa
perusahaan sekuensing 1st Base di Singapura.
Sekuen yang diperoleh dijajarkan dengan data
pada GenBank menggunakan program Basic
Local Alignment Search Tool-Nucleotida
(BLAST-N) dan Basic Local Alignment
Search Tool Nucleotide 6-frame translationprotein (BLAST-X) dari situs National Center
for Biotechnology Information (NCBI) melalui
http://www.ncbi.nlm.nih.gov untuk mengetahui
tingkat kemiripan gen aiiA dan 16S rRNA dari
isolat yang dianalisa.
Konstruksi Pohon Filogenetik
Konstruksi pohon filogenetik dilakukan
dengan metode
Neighbor Joining (NJ)
dengan bootstrap 1000x menggunakan
program MEGA 5.0.

HASIL
Bioesei Aktivitas Degradasi AHL
Isolasi bakteri dari 10 sampel daun dan 27
sampel tanah asal lahan pertanian di Jawa
menghasil 261 isolat (Tabel 1). Dari 261
isolat yang diuji, 12 isolat diantaranya yang
menunjukkan aktivitas degradasi AHL yang
kuat. Aktivitas degradasi ini ditunjukan
dengan terbentuknya zona tidak berwarna
ungu di sekitar paper disk (Gambar 1).

3

Tabel 1 Isolat bakteri yang diperoleh dari lahan pertanian di Jawa dan aktivitas degradasi AHL
Sampel
Jumlah isolat yang
Jumlah isolat
menunjukan ativitas
hasil isolasi
Asal
Jenis
Jumlah
degradasi AHL
Jawa barat:
Bogor
Filosfer
3
12
0
Tanah
3
25
0
Cianjur
Filosfer
7
30
2
Tanah
6
40
1
Indramayu
Tanah
6
69
5
Pangandaran
Tanah
2
22
0
Sukabumi
Tanah
1
3
0
Jawa Timur:
Lamongan
Tanah
1
3
0
Nganjuk
Tanah
1
3
0
Pekalongan
Tanah
2
8
1
Rembang
Tanah
2
12
0
Sragen
Tanah
3
34
3
Total
37
261
12
CJF4a

CJF7b

CJT2e

INT1b

INT1c

INT1d

INT1e

INT1f

SGT3a

SGT3f

PKT2a

SGT3g

Kontrol

Gambar 1 Zona degradasi AHL 12 isolat
terpilih.
Diameter zona degradasi AHL yang
dihasilkan oleh 12 isolat berkisar antara 8
sampai 11 mm (Tabel 2). Isolat yang
menunjukkan diameter zona degradasi AHL
terbesar adalah isolat PKT2a dan SGT3g

yaitu sebesar 11 mm, sedangkan isolat
CJF4a, INT1b, dan INT1f menunjukkan
diameter zona degradasi AHL terkecil yaitu 8
mm.
Tabel 2 Diameter zona degradasi AHL 12
isolat terpilih
Kode Isolat
Diameter zona
degradasi AHL (mm)
CJF4a
8
CJF7b
9
CJT2e
9
INT1b
8
INT1c
10
INT1d
9
INT1e
10
INT1f
8
PKT2a
11
SGT3a
10
SGT3f
10
SGT3g
11
Pengamatan Morfologi Sel dan Pewarnaan
Gram
Tiga isolat yang menunjukkan bioesei
aktivitas degradasi AHL positif termasuk
dalam kelompok Gram negatif sedangkan
sembilan isolat lainnya termasuk dalam
kelompok Gram positif. Isolat INT1d dan
INT1f memiliki bentuk sel bulat dengan
penataan bergerombol sedangkan sepuluh
isolat lainnya memiliki bentuk sel batang
dengan penataan rantai. Tujuh isolat memiliki
endospora, sedangkan lima isolat lainnya
tidak.

4

Tabel 3 Karakteristik morfologi sel dan
pewarnaan Gram isolat-isolat
bakteri yang memiliki aktivitas
degradasi AHL
Kode
Isolat
CJF4a
CJF7b
CJT2e

Bentuk dan
penataan sel
Batang, rantai
Batang, rantai
Batang, rantai

INT1b

Batang, rantai

INT1c
INT1d

PKT2a
SGT3a
SGT3f

Batang, rantai
Bulat,
bergerombol
Batang, rantai
Bulat,
bergerombol
Batang, rantai
Batang, rantai
Batang, rantai

SGT3g

Batang, rantai

INT1e
INT1f

Reaksi Pewarnaan
Gram dan endospora
Positif, berendospora
Positif, berendospora
Negatif, tidak
berendospora
Positif, tidak
berendospora
Positif, berendospora
Negatif, tidak
berendospora
Positif, berendospora
Positif, tidak
berendospora
Positif, berendospora
Positif, berendospora
Negatif, tidak
berendospora
Positif, berendospora

Amplifikasi Gen Penyandi AHL-laktonase
Dari 12 isolat yang mampu mendegradasi
AHL, dua isolat diantaranya (isolat SGT3g
dan INT1c) menunjukkan hasil amplifikasi
gen aiiA berukuran ~0.8 kb (Gambar 2).
1

2

M

Hasil analisis sekuen gen aiiA dengan
menggunakan
program
BLAST-N
menunjukkan bahwa gen aiiA isolat INT1c
memiliki homologi dengan gen aiiA Bacillus
cereus ATTCC 14579 dengan persen
identitas sebesar 96% sedangkan isolat
SGT3g memiliki homologi dengan gen aiiA
Bacillus thuringiensis BMB171 dengan
persen identitas sebesar 95% (Tabel 4).
Analisis sekuen gen aiiA dengan program
BLAST-X menunjukkan bahwa protein yang
disandikan oleh gen aiiA pada kedua isolat
memiliki homologi dengan struktur kristal
AHL-laktonase pada B. thuringiensis (Tabel
5).
Identifikasi Isolat
Identifikasi isolat INT1c dan SGT3g
dilakukan secara molekuler berdasarkan gen
16S rRNA. Visualisasi amplikon di atas UV
transluminator memperlihatkan adanya pita
DNA dengan ukuran ~1.3 kb (Gambar 3).
Analisis kemiripan hasil sekuensing gen 16S
rRNA kedua isolat dengan data di GenBank
dilakukan menggunakan program BLAST-N
(Lampiran 2). Isolat INT1c menunjukkan
kemiripan 98% dengan B. cereus strain GM3
sedangkan isolat SGT3g memiliki kemiripan
99% dengan B. thuringiensis strain A1-1
(Tabel 6).
1

2

M

2.0 kb
1.0 kb
~0.8 kb
0.7 kb

Gambar 2 Visualisasi amplikon gen aiiA pada
gel agarose 1% (M= 1 kb DNA
ladder, Sumur 1= INT1c, Sumur
2= SGT3g).

~1.3 kb

1.0 kb

Gambar 3 Visualisasi amplikon gen 16S
rRNA pada gel agarose 1%
(keterangan: M= 1 kb ladder,
sumur 1= INT1c, sumur 2=
SGT3g).

5

Tabel 4 Hasil analisis sekuen gen aiiA INT1c & SGT3g dengan menggunakan program BLAST-N
Kode isolat
Sekuen bakteri yang homolog
% identitas
Nomor akses
INT1c
Bacillus cereus ATCC 14579
96%
AE016877.1
SGT3g
Bacillus thuringiensis BMB171
95%
CP001903.1
Tabel 5 Hasil analisis sekuen gen aiiA INT1c & SGT3g dengan menggunakan program BLAST-X
%
Nomor
Kode isolat
Sekuen bakteri yang homolog
identitas
akses
INT1c
Crystal Structure Of Quorum-Quenching
82%
2BR6_A
N-Acyl Homoserine Lactone Lactonase in
Bacillus thuringiensis
SGT3g
Crystal Structure Of Quorum-Quenching
98%
2BR6_A
N-Acyl Homoserine Lactone Lactonase in
Bacillus thuringiensis
Tabel 6 Hasil analisis sekuen gen 16S rRNA isolat INT1c & SGT3g dengan menggunakan
program BLAST-N
%
Kode isolat
Sekuen bakteri yang homolog
Nomor akses
identitas
INT1c
Bacillus cereus strain GM3 16S ribosomal
98%
JF837192.1
RNA gene, partial sequence
SGT3g
Bacillus thuringiensis strain A1-1 16S
99%
JF496321.1
ribosomal RNA gene, partial sequence
Konstruksi Pohon Filogenetik
Hasil analisis filogenetik gen aiiA isolat
INT1c dan SGT3g
yang dibandingkan
dengan gen aiiA beberapa spesies bakteri di
GenBank disajikan pada gambar 4.
Bacillus_anthracis_str._A0248
Bacillus_megaterium
Bacillus_amyloliquefaciens
Bacillus_subtilis
INT1c
Bacillus_cereus_ATCC_14579
SGT3g
Bacillus_thuringiensis_BMB171

Gambar 4 Pohon filogenetik berdasarkan
sekuen gen aiiA dari isolat
INT1c
dan
SGT3g
yang
dibandingkan dengan sekuen gen
aiiA dari beberapa spesies bakteri
lainnya.

PEMBAHASAN
Bakteri yang menghasilkan senyawa antiquorum sensing dapat mendegradasi senyawa
Acylhomoserine lactone (AHL). Bakteri ini
dapat ditemukan pada habitat yang sama

dengan bakteri yang ber-quorum sensing
(Chan et al. 2007). Keberadaan kedua jenis
bakteri ini di alam menciptakan suatu
keseimbangan ekosistem. Bakteri fitopatogen
yang dapat ditemukan pada lahan pertanian
mengindikasikan
keberadaan
bakteri
penghasil senyawa anti-QS. Pada penelitian
ini, eksplorasi bakteri filosfer dan tanah dari
10 sampel daun dan 27 sampel tanah yang
berasal dari lahan pertanian di Jawa
menghasilkan 12 isolat bakteri yang
menunjukkan aktivitas degradasi AHL yang
kuat.
Bioesei
aktivitas
degradasi
AHL
dilakukan untuk menyeleksi bakteri-bakteri
yang menghasilkan senyawa pendegradasi
AHL. Bakteri yang digunakan sebagai
indikator terjadinya proses degradasi AHL
adalah bakteri Chromobacterium violaceum.
Bakteri C. violaceum termasuk dalam
kelompok bakteri Gram negatif yang mudah
ditemukan di tanah dan air, serta
memproduksi pigmen ungu spesifik yang
bernama violacein (McClean et al. 1997).
Pigmen violacein diproduksi melalui proses
QS. Penghambatan proses QS pada bakteri
ini menyebabkan bakteri tidak dapat
memproduksi pigmen violacein sehingga
koloni bakteri tidak berwarna ungu.
Degradasi AHL dilakukan menggunakan
supernatant yang diteteskan pada paper disk.
Paper disk yang dikelilingi oleh zona tidak
berwarna ungu menunjukkan adanya aktivitas

6

degradasi AHL oleh senyawa ekstraseluler
yang dihasilkan oleh bakteri. Senyawa
ekstraselular ini dapat berperan sebagai antiQS.
Enzim yang dapat mendegradasi AHL
dikelompokkan menjadi dua enzim utama
yaitu AHL-laktonase dan AHL-acylase
(Czajkowski & Jafra 2009). AHL-laktonase
mampu menghidrolisis cincin lakton pada
AHL dan termasuk ke dalam kelompok
enzim superfamily metallolactamase (Liu et
al. 2008). AHL-laktonase yang disandikan
oleh gen aiiA merupakan anti-QS pertama
yang diaplikasikan untuk mengontrol
virulensi bakteri patogen (Dong et al. 2000).
Bioesei aktivitas degradasi AHL terhadap
260 isolat menunjukkan 12 isolat bakteri
diantaranya mampu mendegradasi AHL.
Paper disk kontrol dikelilingi oleh warna
ungu yang disebabkan oleh pigmen violacein
yang diproduksi bakteri C. violaceum melalui
proses QS. Zona tidak berwarna ungu di
sekeliling paper disk menunjukkan adanya
suatu senyawa pada supernatant kultur yang
dapat mencegah proses QS sehingga pigmen
tersebut tidak dihasilkan. Diameter zona
degradasi AHL yang dihasilkan oleh 12 isolat
bervariasi. Diameter zona degradasi AHL
terbesar dihasilkan oleh isolat PKT2a dan
SGT3g yaitu sebesar 11 mm, sedangkan
isolat CJF4a, INT1b, dan INT1f memiliki
diameter zona degradasi AHL terkecil yaitu
sebesar 8 mm. Hal ini menunjukan perbedaan
aktivitas degradasi AHL oleh senyawa yang
dihasilkan. Suhu dan pH optimum aktivitas
AHL-laktonase adalah 200C dengan pH 8
(Chen et al. 2010). Aktivitas produksi enzim
oleh bakteri juga dipengaruhi oleh beberapa
faktor yaitu kandungan nutrisi, derajat
keasaman media, tekanan osmotik, tingkat
aerasi, suhu, dan kontrol terhadap
kontaminasi selama inkubasi (Pandey et al.
2000).
Verifikasi keberadaan AHL-laktonase
pada isolat-isolat yang menunjukkan hasil
bioesei positif dilakukan dengan amplifikasi
gen penyandi AHL-laktonase yaitu gen aiiA.
Gen aiiA pertama kali ditemukan pada
Bacillus sp. strain 240B1 (Dong et al. 2000).
Homologi gen aiiA kemudian berhasil
ditemukan pada beberapa strain bakteri
seperti Bacillus thuringiensis, B. cereus, B.
mycoides, dan B. amyloliquefaciens (Dong et
al. 2002; Yin et al. 2010). Dari 12 isolat
terpilih, dua isolat diantaranya menunjukkan
amplifikasi gen aiiA yaitu isolat SGT3g dan
INT1c. Amplifikasi gen aiiA pada isolat

INT1c dan SGT3g menghasilkan amplikon
berukuran ~0.8 kb.
Analisis sekuen gen aiiA dengan program
BLAST-X menunjukkan bahwa protein yang
disandikan oleh gen aiiA pada isolat INT1c
dan SGT3g mirip dengan struktur kristal
AHL-laktonase pada B. thuringiensis.
Tingkat kemiripan protein AHL-laktonase
SGT3g sebesar 98% sedangkan tingkat
kemiripan AHL-laktonase INT1c dengan
AHL-laktonase B. thuringiensis hanya
sebesar 82%. Hasil ini didukung oleh analisis
dengan program BLAST-N dimana isolat
SGT3g memiliki kemiripan 95% dengan gen
aiiA pada B. thuringiensis BMB171
sedangkan gen aiiA isolat INT1c lebih mirip
dengan gen aiiA pada Bacillus cereus ATCC
14579
(kemiripan
96%).
Analisis
filogenenetik gen aiiA isolat INT1c dan
SGT3g menunjukkan bahwa isolat INT1c
berkerabat dekat dengan B. cereus ATCC
14579 sedangkan isolat SGT3g berkerabat
dekat dengan B. thuringiensis BMB171.
Identifikasi molekuler berdasarkan gen
16S rRNA menunjukkan bahwa isolat INT1c
menunjukkan kemiripan 98% dengan dengan
bakteri B. cereus strain GM3, sedangkan
isolat SGT3g menunjukkan kemiripan 99%
dengan bakteri B. thuringiensis strain A1-1.
Bacillus cereus dan B. thuringiensis
merupakan anggota genus Bacillus yang
bersifat aerob atau anaerob fakultatif,
termasuk dalam kelompok Gram positif, dan
membetuk spora (Drobniewski 1993). Kedua
bakteri tersebut telah dilaporkan memiliki
gen penyandi AHL-laktonase yang homolog
dengan gen aiiA pada Bacillus strain 240B1
(Dong et al. 2002; Dong et al. 2004). Dong et
al. (2004) juga menyatakan bahwa B.
thuringiensis mampu memproduksi enzim
laktonase yang efektif untuk menginaktivasi
autoinducer pada proses quorum sensing.
Bacillus thuringiensis mampu mendegradasi
AHL di lingkungannya sehingga dapat
digunakan sebagai agen biokontrol terhadap
virulensi bakteri yang dimediasi oleh sinyal
AHL melalui quorum sensing (Dong et al.
2002).

SIMPULAN
Isolasi bakteri filosfer dan tanah asal
lahan pertanian di Jawa menghasilkan 12
isolat bakteri yang menunjukkan aktivitas
degradasi AHL kuat. Dua isolat diantaranya
yaitu isolat INT1c dan SGT1g memiliki gen
penyandi AHL-laktonase (aiiA). Kedua isolat
tersebut memiliki bentuk sel batang dengan

7

penataan berantai, berendospora, dan
termasuk dalam kelompok bakteri Gram
positif. Identifikasi molekuler berdasarkan
gen 16s rRNA menunjukkan bahwa isolat
INT1c memiliki kemiripan terdekat dengan
bakteri Bacillus cereus strain GM3 (98%)
sedangkan isolat SGT3g memiliki kemiripan
terdekat dengan bakteri Bacillus thuringiensis
strain A1-1 (99%).

SARAN
Perlu dilakukan identifikasi molekuler
gen pendegradasi AHL yang disandikan oleh
gen selain aiiA pada sepuluh isolat terpilih
lainnya.

DAFTAR PUSTAKA
Chan KG, Tiew SZ, Ng CC. 2007. Rapid
isolation method of soil bacilli and
screening of their quorum quenching
activity. Asia Pasific J of Mol Biol and
Biotechnol 15: 153-156.
Chen R, Zhou Z, Cao Y, Bai Y, Yao B. 2010.
High yield expression of an AHLlactonase from Bacillus sp. B546 in
Pichia pastoris and its application to
reduse
Aeromonas
hydrophia
mortality in aquaculture. Microbial
Cell Factories 9: 39-49.
Czajkowski R, Jafra S. 2009. Quenching of
acyl-homoserine-dependent quorum
sensing by enzymatic disruption of
signal molecules. Acta Biochimica
Polonica 56: 1-16.
Defoirdt T, Boon N, Bossier P, Verstraete W.
2004. Disruption of bacterial quorum
sensing: an unexplored strategy to
fight infections in aquaculture.
Aquaculture 240: 69-88.
Dong YH, Xu JL, Li XC, Zang LH. 2000.
aiiA, a novel enzyme inactivates acyl
homoserine-lactone
quorum-signal
signal and attenuated the virulence of
Erwinia carotovora. Proc Natl Acad
Sci 97: 3526-3531.
Dong YH, Gusti AR, Zhang Q, Xu JL, Zhang
LH. 2002. Identification of quorum
quenching
N-acyl
homoserine
lactonases from Bacillus species. Appl
Environ Microbiol 68: 1754-1759.

Dong YH, Zhang XF, Xu JL, Zhang LH.
2004. Insecticidal B. thuringiensis
silences Erwinia carotovora virulence
by a new form of microbial
antagonism, signal interference. Appl
Environ Microbiol 70: 954-960.
Drobniewski FA. 1993. Bacillus cereus and
related species. Clinical Microbiol
Reviews 6: 324-338.
Lazo GR, Roffey R, Gabriel DW. 1987.
Conservation of plasmid DNA
sequences and pathovar identification
of strain Xanthomonas campestris.
Pytopathology 77: 1461-1467.
Liu D, et al. 2008. Mechanism of the
quorum-quenching lactonase (AiiA)
from Bacillus thuringiensis. 1.
Product-bound strctures. Biochemistry
47: 7706-7714.
Marchesi JR, et al. 1998. Design and
evaluation of useful bacterium-spesific
PCR primer that amplify genes coding
for bacterial 16S rRNA. Appl Environ
Microbiol 64: 795-799.
McClean KH, et al. 1997. Quorum sensing
and Chromobacterium violaceum:
exploitation of violacein production
and inhibition for the detection of Nacylhomoserine lactones. Microbiol
143: 3703-3711.
Pandey A, et al. 2000. Advances in
microbial amylases. Biotechnol Appl
Biochem 31: 135-152.
Rukayadi Y, Hwang JK. 2009. Pencegahan
quorum sensing: suatu pendekatan
baru dalam mengatasi infeksi bakteri.
Medicinus 22: 22-27.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989.
Molecular Cloning: a Laboratory
Manual. Ed ke-2. New York: Cold
Spring Harbor Laboratory.
White CE, Finan TM. 2009. Quorum sensing
in Agrobacterium tumefaciens: chance
or necessity?. J Bacteriol 191: 11231125.
Yin XT, et al. 2010. Isolation and
characterization of an AHL-lactonase
gene from Bacillus amyloliquefaciens.
World J Microb Biotechnol 26:1361 –
1367.
Zhang LH, Dong YH. 2004. Quorum sensing
and signal interference: diverse
implications. Mol Microbiol 53: 15631571.

8

LAMPIRAN

9

Lampiran 1 Komposisi media pertumbuhan yang digunakan
A. Media nutrien agar (NA)
- Agar
1.5%
- Nutrient broth 0.8%
B. Media King’s B agar
- Agar
1.5%
- Pepton
2%
- K2HPO4
0.15%
- MgSO4.4H2O 0.15%
- Gliserol
1.5%
C. Media luria agar (LA)
- Agar
1.5%
- NaCl
1%
- Tripton
1%
- Yeast extract
0.5%

10

Lampiran 2 Hasil sekuensing dan analisis bioinformatika gen aiiA dan 16S rRNA dengan program
BLAST-N dan BLAST X
A. Urutan nukleotida gen aiiA isolat INT1c
1
71
131
191
251
311
371
431
491

AAAAACACACAAACCTTACGTACTATCAGTTAAACGAAGATAGTTCAAAAAAAGTTTAT
AATTTATTTAAAAAAATTATTTAAACGAAAAAGTCATGAGCACGCGAACTCATGACTTTT
TGCACTATATATACTCAGGGAACACTCTACAACCCTTTTCCTGCTCTATATCATGACCAA
AGAAAACAATTGGTTTCTCTTTCGCCACAACTCCTTTTAAACGTTTAATTGAAGATAAAG
CTAATTCTGGATCAAATCCTGCGTTAAACGGCACTTCATCTTCAAAATTCTCTTTCGTGT
ACGATGCATCAATTGTTAATAAAACTGAGCCGGATTGCTCCGTCTCCAAATGAATAGCGA
CTGATAGGCCTGGAGAATGAATTCCCTGGCGCGAGTATACAATTAATTGAACACCTGGTA
CCACTTCATAATCCCCTTCAATAATTTTGTAGTTCAAATGCGGTAATATACATTCTTTCA
TATATTCTTCTCTATG 495

70
130
190
250
310
370
430
490

B. Analisis sekuen gen aiiA isolat INT1c dengan program BLAST-N
gb|AE016877.1|
>
Length=5411809

Bacillus cereus ATCC 14579, complete genome

Features in this part of subject sequence:
hypothetical protein
N-acyl homoserine lactone hydrolase
Score = 798 bits (432), Expect = 0.0
Identities = 470/485 (97%), Gaps = 15/485 (3%)
Strand=Plus/Plus
Query

11

Sbjct 3409374
3409433
Query

71

Sbjct 3409434
3409493
Query

131

Sbjct 3409494
3409553
Query

191

Sbjct 3409554
3409613
Query

251

Sbjct 3409614
3409670
Query

311

Sbjct 3409671
3409727
Query

371

Sbjct 3409728
3409778
Query

431

Sbjct 3409779
3409838
Query

491

Sbjct

3409839

AAACCTTACGTACTATCAGTTAAACGAAGATAGTTCAAAAAAAGTTTATAATTTATTTAA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AAACCTTACGTACTATCAGTTAAACGAAGATAGTTCAAAAAAAGTTTATAATTTATTTAA

70

AAAAATTATTTAAACGAAAAAGTCATGAGCACGCGAACTCATGACTTTTTGCACTATATA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AAAAATTATTTAAACGAAAAAGTCATGAGCACGCGAACTCATGACTTTTTGCACTATATA

130

TACTCAGGGAACACTCTACAACCCTTTTCCTGCTCTATATCATGACCAAAGAAAACAATT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TACTCAGGGAACACTCTACAACCCTTTTCCTGCTCTATATCATGACCAAAGAAAACAATT

190

GGTTTCTCTTTCGCCACAACTCCTTTTAAACGTTTAATTGAAGATAAAGCTAATTCTGGA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GGTTTCTCTTTCGCCACAACTCCTTTTAAACGTTTAATTGAAGATAAAGCTAATTCTGGA

250

TCAAATCCTGCGTTAAACGGCACTTCATCTTCAAAATTCTCTTTCGTGTACGATGCATCA
|||||||||||| || |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TCAAATCCTGCG--AA-CGGCACTTCATCTTCAAAATTCTCTTTCGTGTACGATGCATCA

310

ATTGTTAATAAAACTGAGCCGGATTGCTCCGTCTCCAAATGAATAGCGACTGATAGGCCT
||||||||||||||||||||||||||||||||||| || ||||||||||||||| |||||
ATTGTTAATAAAACTGAGCCGGATTGCTCCGTCTC-AA-TGAATAGCGACTGAT-GGCCT

370

GGAGAATGAATTCCCTGGCGCGAGTATACAATTAATTGAACACCTGGTACCACTTCATAA
|||||||||
|| |||||
|||||||| |||||||||||||||||||||||||||
GGAGAATGA---CC-TGGCG----TATACAAT-AATTGAACACCTGGTACCACTTCATAA

430

TCCCCTTCAATAATTTTGTAGTTCAAATGCGGTAATATACATTCTTTCATATATTCTTCT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TCCCCTTCAATAATTTTGTAGTTCAAATGCGGTAATATACATTCTTTCATATATTCTTCT

490

CTATG
|||||
CTATG

495
3409843

11

C. Urutan nukleotida gen aiiA isolat SGT3g
1
50
110
170
230
290
348
408
468
528
588
648
708
768
828
888

CGGGATCCCATGACCAGTAAAAGAAGGCTTTTATTTTCCCCCCCCCCCC
TCCCAGCAAGGTCCGTTGTATTGGTTAGATCAATTCTTTCTGTTAATTAGTACACTCCGC
GCCGGGGGAATTTTATTGAACTTTACCTGTATGGTGTTATCTTTTTGGAGACAGAAGAGG
GGCCTATTTTAGTAGATACAGGTATGCCAGAAAGTGCAGTTAATAATGAAGGGATTTTTA
ACGGTACATTTGTTGAAGGACAGATTTTACCGAAAATGACTGAAGAAGATAGAATCGTGA
ATATATTAAAGCGTGTAGGGTATGAGCCGGACGACC-TTT-TATATTATTAGTTCTCACT
TACATTTTGATCATGCAGGAGGAAACGGTGCTTTTACAAATACACCGATTATTGTGCAGC
GAGCGGAATATGAGGCAGCACTTCATAGAGAAGAATATATGAAAGAATGTATATTACCGC
ATTTGAACTACAAAATTATTGAAGGGGATTATGAAGTGGTACCAGGTGTTCAATTATTGT
ATACGCCAGGTCATTCTCCAGGCCATCAGTCGTTATTCATTGAGACGGAGCAATCCGGTT
CAGTTTTATTAACAATTGATGCATCGTACACGAAAGAGAATTTTGAAGATGAAGTGCCGT
TCGCAGGATTTGATCCAGAATTAGCTTTATCTTCAATCAAACGCTTAAAAGAAGTTGTGA
CAAAAGAGAAATCGATTGTTTTCTTTGGTCATGATATAGAGCAGGAAAAAGGGTTGTAGA
GTGTTCCCGGAGTATATATAGTGCAAAAAGTCATGAGTTCGCGTGCTCATGACTTTTTCG
TTTAAATAATTTTTTTTAAATAAATTATAAACTTTTTTTCAAACTATCTTCCGTTTAACT
GGATAGTACGTAAAGTTTTTACATCAATTAAGGAGTATCCTTG 930

49
109
169
229
289
347
407
467
527
587
647
707
767
827
887

D. Analisis sekuen gen aiiA isolat SGT3g dengan program BLAST-N
gb|CP001903.1|
>
Length=5330088

Bacillus thuringiensis BMB171, complete genome

Features in this part of subject sequence:
hypothetical protein
N-acyl homoserine lactone hydrolase
Score = 1404 bits (760), Expect = 0.0
Identities = 846/883 (96%), Gaps = 24/883 (3%)
Strand=Plus/Minus
Query

50

Sbjct 3334673
3334622
Query

110

Sbjct 3334621
3334566
Query

170

Sbjct 3334565
3334506
Query

230

Sbjct 3334505
3334446
Query

290

Sbjct 3334445
3334386
Query

348

Sbjct 3334385
3334326
Query

408

Sbjct 3334325
3334266
Query

468

Sbjct 3334265
3334206

TCCCAGCAAGGTCCGTTGTATTGGTTAGATCAATTCTTTCTGTTAATTAGTACACTCCGC
||||||| |||| ||||||| | |||||||| |||| ||||||||| | ||||||| |||
TCCCAGC-AGGT-CGTTGTA-T-GTTAGATC-ATTC-TTCTGTTAA-TGGTACACT-CGC

109

GCCGGGGGAATTTTATTGAACTTTACCTGTATGGTGTTATCTTTTTGGAGACAGAAGAGG
||| |||||| |||||||||| ||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||
GCC-GGGGAA-TTTATTGAAC-TTACCTGTATGGTGTTATC-TTTTGGAGACAGAAGAGG

169

GGCCTATTTTAGTAGATACAGGTATGCCAGAAAGTGCAGTTAATAATGAAGGGATTTTTA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||
GGCCTATTTTAGTAGATACAGGTATGCCAGAAAGTGCAGTTAATAATGAAGGGCTTTTTA

229

ACGGTACATTTGTTGAAGGACAGATTTTACCGAAAATGACTGAAGAAGATAGAATCGTGA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ACGGTACATTTGTTGAAGGACAGATTTTACCGAAAATGACTGAAGAAGATAGAATCGTGA

289

ATATATTAAAGCGTGTAGGGTATGAGCCGGACGACC-TTT-TATATTATTAGTTCTCACT
|||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||| |||||||||||||||||||
ATATATTAAAGCGTGTAGGGTATGAGCCGGACGACCTTTTATATATTATTAGTTCTCACT

347

TACATTTTGATCATGCAGGAGGAAACGGTGCTTTTACAAATACACCGATTATTGTGCAGC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TACATTTTGATCATGCAGGAGGAAACGGTGCTTTTACAAATACACCGATTATTGTGCAGC

407

GAGCGGAATATGAGGCAGCACTTCATAGAGAAGAATATATGAAAGAATGTATATTACCGC
|| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GAACGGAATATGAGGCAGCACTTCATAGAGAAGAATATATGAAAGAATGTATATTACCGC

467

ATTTGAACTACAAAATTATTGAAGGGGATTATGAAGTGGTACCAGGTGTTCAATTATTGT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATTTGAACTACAAAATTATTGAAGGGGATTATGAAGTGGTACCAGGTGTTCAATTATTGT

527

12

Query

528

Sbjct 3334205
3334146
Query

588

Sbjct 3334145
3334086
Query

648

Sbjct 3334085
3334026
Query

708

Sbjct 3334025
3333967
Query

768

Sbjct 3333966
3333907
Query

828

Sbjct 3333906
3333850
Query

888

Sbjct

3333849

ATACGCCAGGTCATTCTCCAGGCCATCAGTCGTTATTCATTGAGACGGAGCAATCCGGTT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATACGCCAGGTCATTCTCCAGGCCATCAGTCGTTATTCATTGAGACGGAGCAATCCGGTT

587

CAGTTTTATTAACAATTGATGCATCGTACACGAAAGAGAATTTTGAAGATGAAGTGCCGT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CAGTTTTATTAACAATTGATGCATCGTACACGAAAGAGAATTTTGAAGATGAAGTGCCGT

647

TCGCAGGATTTGATCCAGAATTAGCTTTATCTTCAATCAAACGCTTAAAAGAAGTTGTGA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||| ||||||| |||||||
TCGCAGGATTTGATCCAGAATTAGCTTTATCTTCAATTAAACGTTTAAAAGGAGTTGTGG

707

CAAAAGAGAAATCGATTGTTTTCTTTGGTCATGATATAGAGCAGGAAAAAGGGTTGTAGA
| ||||||||| | ||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||
CGAAAGAGAAACCAATTGTTTTCTTTGGTCATGATATAGAGCAGGAAAA-GGGTTGTAGA

767

GTGTTCCCGGAGTATATATAGTGCAAAAAGTCATGAGTTCGCGTGCTCATGACTTTTTCG
|||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTGTTCCCTGAGTATATATAGTGCAAAAAGTCATGAGTTCGCGTGCTCATGACTTTTTCG

827

TTTAAATAATTTTTTTTAAATAAATTATAAACTTTTTTTCAAACTATCTTCCGTTTAACT
|||||||||||||||| |||||||||||||||||||||| || |||||||| ||||||||
TTTAAATAATTTTTTT-AAATAAATTATAAACTTTTTTTGAA-CTATCTTC-GTTTAACT

887

GGATAGTACGTAAAGTTTTTACATCAATTAAGGAGTATCCTTG
| ||||||||||| ||||| |||||| | | |||||||| |||
G-ATAGTACGTAA-GTTTT-ACATCA-TCA-GGAGTATC-TTG

930
3333813

E. Analisis sekuen gen aiiA isolat INT1c dengan program BLAST-X
>
pdb|2BR6|A
Chain A, Crystal Structure Of QuorumQuenching N-Acyl Homoserine Lactone Lactonase
Score = 197 bits (500), Expect = 3e-51
Identities = 102/123 (83%), Positives = 108/123 (88%), Gaps =
5/123 (4%)
Frame = -1
Query 495
HREEYMKECILPHLNYKIIEGDYEVVPGVQLIVYSRQGIHSPGLSVAIHLETEQSGSVLL
HREEYMKECILPHLNYKIIEGDYEVVPGVQL+
HSPG
++
++TEQSGSVLL
Sbjct 135 HREEYMKECILPHLNYKIIEGDYEVVPGVQLLYTPG---HSPGHQSLFIKTEQSGSVLL 190

316

Query 315
TIDASYTKENFEDEVPFNAGFDPELALSSIKRLKGVVAKEKPIVFFGHDIEQEKGCRVFP 136
TIDASYTKENFEDEVPF AGFDPELALSSIKRLK VV KEKPI+FFGHDIEQEK
CRVFP
Sbjct 191 TIDASYTKENFEDEVPFAGFDPELALSSIKRLKEVVKKEKPIIFFGHDIEQEKSCRVFP 249
Query

135

Sbjct

250

EYI
EYI
EYI

127
252

13

F. Analisis sekuen gen aiiA isolat INT1c dengan program BLAST-X
>
pdb|2BR6|A
Chain A, Crystal Structure Of QuorumQuenching N-Acyl Homoserine
Lactone Lactonase
pdb|2BTN|A
Chain A, Crystal Structure And Catalytic
Mechanism Of The QuorumQuenching N-Acyl Homoserine Lactone Hydrolase
Length=252
Sort
alignments for this subject sequence by:
E value
Score

Percent identity

Query
start position Subject start position
Score = 285 bits (728), Expect(4) = 1e-109
Identities = 138/143 (97%), Positives = 140/143 (98%), Gaps =
0/143 (0%)
Frame = +2
Query 329
YIISSHLHFDHAGGNGAFTNTPIIVQRAEYEAALHREEYMKECILPHLNYKIIEGDYEVV
YIISSHLHFDHAGGNGAFTNTPIIVQR
EYEAALHREEYMKECILPHLNYKIIEGDYEVV
Sbjct 101
YIISSHLHFDHAGGNGAFTNTPIIVQRTEYEAALHREEYMKECILPHLNYKIIEGDYEVV

508

160

Query 509
PGVQLLYTPGHSPGHQSLFIETEQSGSVLLTIDASYTKENFEDEVPFAGFDPELALSSIK

688

PGVQLLYTPGHSPGHQSLFI+TEQSGSVLLTIDASYTKENFEDEVPFAGFDPELALSSIK
Sbjct 161
PGVQLLYTPGHSPGHQSLFIKTEQSGSVLLTIDASYTKENFEDEVPFAGFDPELALSSIK

220

Query

689

Sbjct

221

RLKEVVTKEKSIVFFGHDIEQEK
RLKEVV KEK I+FFGHDIEQEK
RLKEVVKKEKPIIFFGHDIEQEK

757
243

Score = 123 bits (308), Expect(4) = 1e-109
Identities = 59/60 (98%), Positives = 60/60 (100%), Gaps = 0/60
(0%)
Frame = +1
Query 154
LETEEGPILVDTGMPESAVNNEGIFNGTFVEGQILPKMTEEDRIVNILKRVGYEPDDLLY

333

LETEEGPILVDTGMPESAVNNEG+FNGTFVEGQILPKMTEEDRIVNILKRVGYEPDDLLY
Sbjct 42
LETEEGPILVDTGMPESAVNNEGLFNGTFVEGQILPKMTEEDRIVNILKRVGYEPDDLLY

101

Score = 25.4 bits (54), Expect(4) = 1e-109
Identities = 9/12 (75%), Positives = 11/12 (92%), Gaps = 0/12
(0%)
Frame = +3

14

Query

750

Sbjct

241

RKKGCRVFPEYI
++K CRVFPEYI
QEKSCRVFPEYI

785
252

Score = 24.6 bits (52), Expect(4) = 1e-109
Identities = 14/33 (42%), Positives = 16/33 (48%), Gaps = 7/33
(21%)
Frame = +3
Query

90

Sbjct

16

C*LVHSA------PGEFY*TLPVWCYLFGDRRG
C L HS+
PG+
LPVWCYL
G
CMLDHSSVNSALTPGKLL-NLPVWCYLLETEEG

170
47

G. Urutan nukleotida gen 16S rRNA isolat INT1c
1
62
122
182
242
302
362
422
482
542
602
662
722
782
813
842
902
962
1022
1082
1142
1202
1262

GGAGAATGATAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGT 61
AACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTT 121
GAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGT
181
CGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAG 241
AGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCCTACGGGGAAGGCAGCC 301
AGTAGGGAATCTTCCGCAATGGAACGATAAGTTCTGACGGAGCAACCGCCGGCGTGAGTG 361
ATGAAGGCCTTTCGGGTTCGTAAAACTCTGTTGTTTAGGGAAAGAACAAGTGCTTAGTTG
421
AATAAGCTGGCACCTTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCA 481
GCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCA 541
GGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAAC
601
TGGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTA 661
GAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGC 721
GCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGA 781
GTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCG
841
GTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCG
872
CCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCG 901
GTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTC
961
TGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTG 1021
TCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCT 1081
TAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGG 1141
TGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGG 1201
ACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTT 1261
CGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCA 1322

H. Analisis sekuen gen 16S rRNA isolat INT1c dengan program BLAST-N
>
gb|JF837192.1|
sequence
Length=1363

Bacillus cereus strain GM3 16S ribosomal RNA gene, partial

Score = 2324 bits (1258), Expect = 0.0
Identities = 1303/1321 (99%), Gaps = 18/1321 (1%)
Strand=Plus/Plus
Query

4

Sbjct

49

Query

62

Sbjct

109

Query

122

Sbjct

169

Query

182

Sbjct

229

Query

242

GAAT-GA-TAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGT
|||| || ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGT

61

AACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTT

121

GAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGT

181

CGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAG

241

AGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCCTACGGGGAAGGCAGCC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||| ||| |||||| |

108

168

228

288
301

15

Sbjct

289

AGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACT-CCTAC-GGG-AGGCAG-C

344

Query

302

361

Sbjct

345

AGTAGGGAATCTTCCGCAATGGAACGATAAGTTCTGACGGAGCAACCGCCGGCGTGAGTG
|||||||||||||||||||||| |||| ||| ||||||||||||| |||| |||||||||
AGTAGGGAATCTTCCGCAATGG-ACGA-AAG-TCTGACGGAGCAA-CGCC-GCGTGAGTG

Query

362

Sbjct

400

Query

422

Sbjct

455

Query

482

Sbjct

514

Query

542

Sbjct

574

Query

602

Sbjct

634

Query

662

Sbjct

693

Query

722

Sbjct

753

Query

782

Sbjct

813

Query

842

Sbjct

873

Query

902

Sbjct

933

Query

962

Sbjct

993

Query

1022

Sbjct

1053

Query

1082

Sbjct

1113

Query

1142

Sbjct

1173

Query

1202

Sbjct

1233

Query

1262

Sbjct

1293

Query

1322

Sbjct

1353

399

ATGAAGGCCTTTCGGGTTCGTAAAACTCTGTTGTTTAGGGAAAGAACAAGTGCTTAGTTG
||||||| |||||||| |||||||||||||||| |||||| |||||||||||| ||||||
ATGAAGG-CTTTCGGG-TCGTAAAACTCTGTTG-TTAGGG-AAGAACAAGTGC-TAGTTG

421

AATAAGCTGGCACCTTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCA
|||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AATAAGCTGGCACC-TTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCA

481

GCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCA

541

GGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAAC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAAC

601

TGGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTA
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
T-GGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTA

661

GAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGC

721

GCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGA

781

GTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAAC