Inducing the Variability of Embryogenic Callus of Mandarin Citrus cv Garut to Obtained Putative Mutants through Gamma Rays Irradiation

INDUKSI KERAGAMAN KALUS EMBRIOGENIK
UNTUK MENDAPATKAN MUTAN PUTATIF JERUK
KEPROK GARUT ( Citrus reticulata L. ) MELALUI
IRADIASI SINAR GAMMA

KARYANTI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Induksi Keragaman Kalus
Embriogenik untuk Mendapatkan Mutan Putatif Jeruk Keprok Garut (Citrus
reticulata L.) melalui Iradiasi Sinar Gamma adalah karya saya dengan arahan
komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk karya apapun kepada
perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor,

Januari 2013

Karyanti
NRP: A253100221

ABSTRACT

KARYANTI Inducing the Variability of Embryogenic Callus of Mandarin Citrus
cv. Garut to Obtained Putative Mutants through Gamma Rays Irradiation.
Supervised by AGUS PURWITO and ALI HUSNI

Mandarin Citrus cv. Garut is one of local citrus which has some several
superiority such as easy to peel, fresh and sweet flavour, yellowish green skin and
containt 12-15 seeds per fruit, but can it not compete with citrus from other
countries. Quality improvement have been the subject of citrus breeding
programme. The objective of this research is to increase genetic variability of
Mandarin Citrus cv. Garut through gamma rays irradiation on embryogenic callus.

Callus was irradiated at doses of 0, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 and 100 Gy and
regenerated through somatic embryogenesis. The result of radiosensitivity dose
for Growth Reduction (GR50) analyzed by Curve Expert 1.4 software was 75.31
Gy. Observation on the growth of callus showed variation on morphology and
weight of callus. At doses 0–50 Gy callus growth was not inhibited, but at doses
60–100 Gy callus growth was inhibited. Gamma irradiation also affected the
formations of somatic embryos. After six weeks on maturation medium produced
the highest of embryo somatic at dose of 20 and 100 Gy and on germination
medium produced planlet highest at dose of 20 and 40 Gy. Based on
morphological characters selected 10 regenerants with variability of 0–58% and
genetic variability with ISSR markers by 0–26%. The number of mutan putative
produced were M30/2, M50/1, M80/3 and M100/1 comformed by ISSR. After
four week grafting between putative mutan shoots as scion and Japansche Citroen
as rootstock it was obtainted the growth percentage 37.5-50% on Ex Vitro
Grafting and 75% on In Vitro Grafting.
Keywords: mutation breeding, somatic embryo, Growth Reduction (GR50),
maturation, grafting

RINGKASAN

KARYANTI. Induksi Keragaman Kalus Embriogenik untuk Mendapatkan Mutan
Putatif Jeruk Keprok Garut (Citrus reticulata L.) Melalui Iradiasi Sinar Gamma.
Dibimbing oleh AGUS PURWITO and ALI HUSNI
Buah jeruk merupakan salah satu buah komoditas unggulan. Buah jeruk
banyak digemari karena rasanya dan kandungan vitamin A dan C yang tinggi.
Buah jeruk dapat dikonsumsi segar ataupun dibuat makanan olahan. Jeruk keprok
banyak digemari karena karakternya sesuai dengan selera konsumen seperti warna
buahnya menarik, kulitnya mudah dikupas, rasanya manis asam menyegarkan dan
bijinya sedikit (Seedless). Peningkatan kualitas jeruk dapat dilakukan melalui
seleksi varietas-varietas unggul lokal. Salah satu varietas unggul lokal yang dapat
dimanfaatkan adalah jeruk keprok Garut. Untuk meningkatkan kualitas jeruk
keprok Garut sesuai selera konsumen dapat melalui pendekatan bioteknologi dan
pemuliaan mutasi. Kombinasi metode kultur jaringan menggunakan sel somatik
dan mutasi menggunakan mutagen sinar gamma diharapkan mampu
meningkatkan keragaman dan memunculkan karakter-karakter yang diharapkan.
Penelitian ini bertujuan untuk meningkatkan keragaman genetik tanaman
jeruk keprok Garut menggunakan mutagen sinar gamma, memperoleh Growth
Reduction (GR50) kalus embriogenik jeruk keprok Garut dan menghasilkan tunas
mutan putatif. Penelitian terdiri atas empat tahap. Tahap pertama yaitu proliferasi
kalus dalam media dasar MS (Murashige dan Skoog) yang dikombinasikan

dengan vitamin MW (Morel & Wetmore) dan 300 mgL-1 Casein hydrolisat. Kalus
hasil proliferasi selanjutnya diberikan perlakuan iradiasi sinar gamma dengan
memasukan kalus ke dalam alat Gamma Chamber Co-60. Kalus diberikan iradiasi
pada dosis 0, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 dan 100 Gy. Kalus hasil iradiasi
ditanam dalam media MS tanpa zat pengatur tumbuh. Tahap dua, kalus hasil
iradiasi diregenerasi dalam media pendewasaan yaitu media dasar MS yang
ditambahkan vitamin MW, 2.5 mgL-1 ABA dan 300 mgL-1 Casein hydrolisat.
Embrio somatik yang terbentuk ditanam dalam media perkecambahan yaitu media
dasar MS yang ditambahkan vitamin MW dan 2.5 mgL-1 GA3. Kecambah yang
dihasilkan ditanam dalam media MS tanpa zat pengatur tumbuh dan menghasilkan
tunas regeneran dengan morfologi beragam. Tahap tiga, identifikasi tunas
regeneran berdasarkan penanda morfologi dan molekuler. Tahap empat,
penyambungan secara in vitro dan ex vitro. Penyambungan dengan batang atas
yang digunakan adalah tunas mutan putatif hasil iradiasi dan batang bawah yang
digunakan adalah jeruk Japansche Citroen (JC). Hasil pengamatan dan analisis
yang dilakukan diperoleh bahwa peningkatan dosis iradiasi sinar gamma pada
kalus yang ditanam dalam media tanpa zat pengatur tumbuh menyebabkan
terjadinya perubahan warna kalus dan menurunya berat kalus pada minggu ke-6
setelah tanam. Data hasil pengamatan proliferasi kalus di analisis dengan program
Curve Expert 1.4 dan diperoleh Growth Reduction (GR50). Kalus embriogenik

jeruk hasil iradiasi menghasilkan GR50 di sekitar dosis 75.31 Gy. Pada tahap
regenerasi tidak semua kalus mampu membentuk embrio somatik dan
berkecambah. Jumlah embrio somatik terbanyak dihasilkan pada dosis 20 dan 100

Gy. Pembentukan kecambah dan tunas regeneran menghasilkan pola yang tidak
teratur. Jumlah kecambah dan tunas regeneran terbanyak dihasilkan pada dosis 20
dan 40 Gy. Hasil regenerasi kecambah menjadi tunas dalam media MS tanpa zat
pengatur tumbuh dihasilkan 46 tunas regeneran yang dapat diidentifikasi secara
morfologi. Dipilih 10 tunas regeneran yang mewakili karakter-karakter yang
diamati. Keragaman dari 10 tunas regeneran berdasarkan analisis UPGMA pada
penanda morfologi adalah sebesar 0–58% dan keragaman genetik berdasarkan
penanda ISSR sebesar 0–26%. Hasil konfirmasi melalui penanda ISSR diperoleh
tunas mutan putatif yaitu individu M30/2, M50/1, M80/3 dan M100/1. Metode
penyambungan antara tunas mutan putatif sebagai batang atas dan Japansche
Citroen sebagai batang bawah secara in vitro menghasilkan persentase
pertumbuhan tanaman sambung sebesar 75% dan secara ex vitro sebesar 37.5 –
50%.

Kata kunci: Pemuliaan mutasi, embrio somatik, Growth Reduction (GR50),
pendewasaan, penyambungan

©Hak Cipta Milik IPB, tahun 2013
Hak Cipta Dilindungi Undang-undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karyatulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.

INDUKSI KERAGAMAN KALUS EMBRIOGENIK
UNTUK MENDAPATKAN MUTAN PUTATIF JERUK
KEPROK GARUT( Citrus reticulata L. ) MELALUI
IRADIASI SINAR GAMMA

KARYANTI

Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada

Mayor Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr. Syarifah Iis Aisyah, M.Sc.Agr

Judul Tesis

: Induksi Keragaman Kalus Embriogenik Untuk Mendapatkan
Mutan Putatif Jeruk Keprok Garut (Citrus reticulata L.) Melalui
Iradiasi Sinar Gamma

Nama

:

Karyanti

NIM

:

A253100221

Disetujui,
Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Agus Purwito, M.Sc.Agr
Ketua

Dr. Drs. Ali Husni, M.Si
Anggota

Mengetahui,

Ketua Mayor
Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr. Ir. Trikoesoemaningtyas, M.Sc

Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc. Agr

Tanggal Ujian : 29 Januari 2013

Tanggal Lulus :

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL.............................................................................................

xix

DAFTAR GAMBAR........................................................................................

xxi

DAFTAR LAMPIRAN....................................................................................

xxiii

PENDAHULUAN
Latar Belakang..............................................................................................
Tujuan...........................................................................................................
Hipotesis.......................................................................................................
Kerangka Berpikir.........................................................................................

1
2
3
3

TINJAUAN PUSTAKA
Botani Tanaman Jeruk..................................................................................
Jeruk Keprok.................................................................................................
Japanesche Citroen.......................................................................................
Pemuliaan Mutasi..........................................................................................

Pemuliaan Mutasi Tanaman Jeruk................................................................
Mutagen Sinar Gamma.................................................................................
Teknik Kultur Jaringan pada Tanaman Jeruk...............................................
Penyambungan (Grafting).............................................................................
Analisis Keragaman......................................................................................

5
7
8
9
10
11
12
13
14

BAHAN DAN METODOLOGI
Waktu dan Tempat Penelitian.......................................................................
Bahan dan Alat.............................................................................................
Metode Penelitian.........................................................................................

17
17
17

HASIL DAN PEMBAHASAN
Proliferasi Kalus Embriogenik......................................................................
Pengaruh Iradiasi Sinar Gamma terhadap Pertumbuhan Kalus....................
Regenerasi Kalus Hasil Iradiasi Sinar Gamma.............................................
Analisis Keragaman Tunas Regeneran berdasarkan Penanda Morfologi.....
Analisis Keragaman Tunas Regeneran berdasarkan Penanda Molekuler.....
Penyambungan Tunas Mutan Putatif dengan Japanesche Citroen...............

25
26
29
36
44
48

PEMBAHASAN UMUM.................................................................................

53

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan....................................................................................................... 65
Saran.............................................................................................................. 65
DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................

xvii

67

xviii

DAFTAR TABEL
Halaman
1

Kandungan vitamin dan zat mineral lainnya setiap 100 gram buah jeruk...................

7

2

Nama dan susunan basa primer yang digunakan analisis ISSR...................................

22

3

Pertumbuhan kalus embriogenik jeruk keprok Garut dalam media proliferasi............

25

4

Persentase perubahan warna kalus 6 minggu setelah iradiasi sinar gamma................

27

5

Rata-rata jumlah dan efisiensi pembentukan embrio somatik umur 6 MST................

31

6

Jumlah embrio somatik, embrio berkecambah dan persentase embrio berkecambah
hasil iradiasi sinar gamma............................................................................................

33

Data kisaran, rataan, ragam dan standar deviasi karakter tinggi tunas, jumlah akar,
Jumlah daun, jumlah cabang, panjang stomata dan lebar stomata...............................

38

8

Hasil pengamatan keragaman morfologi tunas regeneran............................................

40

9

Rata-rata jumlah, kerapatan, panjang dan lebar stomata 10 tunas regeneran...............

41

10

Rekapitulasi jumlah amplifikasi pita DNA 10 tunas regeneran jeruk keprok Garut
pada 7 primer.................................................................................................................

45

Data hasil penyambungan secara in vitro dan ex vitro .................................................

48

7

11

xix

xx

xxi

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1

Skema kerangka pemikiran penelitian...................................................

4

2

Tahapan dan alur penelitian induksi mutasi pada kalus embriogenik
jeruk keprok Garut dengan iradiasi sinar gamma.................................

18

3

Kalus dan perlakuan iradiasi sinar gamma............................................

19

4

Kalus embriogenik jeruk keprok Garut.................................................

25

5

Perubahan warna kalus hasil iradiasi ....................................................

26

6

Grafik rata-rata pertambahan berat kalus jeruk keprok Garut umur 6
minggu setelah iradiasi..........................................................................

27

7

Kurva pengaruh iradiasi terhadap persentase proliferasi kalus.............

28

8

Pertumbuhan proembrio dalam media pendewasaan............................

29

9

Perkembangan kalus hasil iradiasi sinar gamma dalam media
pendewasaan..........................................................................................

29

10 Grafik persentase kalus membentuk embrio somatik dalam media
pendewasaan..........................................................................................

30

11 Pertumbuhan dan perkembangan embrio somatik ................................

32

12 Keragaman pertumbuhan populasi kecambah.......................................

34

13 Jumlah tunas regeneran yang dihasilkan SK1 –SK4.............................

35

14 Perkembangan kecambah menjadi tunas regeneran..............................

36

15 Keragaman morfologi sepuluh tunas regeneran terpilih........................

39

16 Perbedaan morfologi daun tunas regeneran...........................................

40

17 Perbedaan ketegakan tunas regeneran...................................................

41

18 Jumlah stomata tunas regeneran pada ukuran 100 µm dengan
pembesaran 400 x..................................................................................

42

19 Stomata tunas regeneran hasil iradiasi sinar gamma.............................

43

xxi

20 Dendogram kemiripan berdasarkan penanda morfologi padai 10
tunas regeneran in vitro hasil iradiasi sinar gamma .............................

43

21 Karakter pola pita 10 tunas regeneran hasil iradiasi .............................

45

22 Karakter pola pita 10 tunas regeneran hasil iradiasi..............................

46

23 Dendogram kemiripan berdasarkan penanda molekuler melalui ISSR
dari 10 tunas regeneran in vitro dengan menggunakan 7 primer..........

47

24 Hasil penyambungan in vitro.................................................................

49

25 Hasil penyambungan ex vitro................................................................

50

26 Penyambungan gagal dan potongan melintang bagian sambungan.....

50

27 Penampang potongan melintang tanaman jeruk batang atas dan
bawah ...................................................................................................

51

28 Penyambungan berhasil dan potongan melintang ................................

51

xxii

xxiii

PRAKATA

Syukur alhamdulilah penulis panjatkan kepada ALLAH SWT, karena atas
rahmat dan pertolongan-Nya sehingga penelitian dan penulisan tugas akhir ini dapat
diselesaikan. Tesis ini merupakan syarat untuk mendapatkan gelar Magister di Institut
Pertanian Bogor (IPB), dengan judul “Induksi Keragaman Kalus Embriogenik Untuk
Mendapatkan Mutan Putatif Jeruk Keprok Garut (Citrus reticulata L.) Melalui
Iradiasi Sinar Gamma”.
Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang tulus kepada:
1.

Dr. Ir. Agus purwito, M.Sc. Agr dan Dr. Drs. Ali Husni, M.Si atas bimbingan,
saran, ilmu, waktu, dana dan perhatiannya dalam pelaksanaan penelitian sampai
penulisan tesis ini dapat diselesaikan dengan baik.

2.

Dekan Sekolah Pascasarjana IPB dan Dr. Ir. Trikoesoemaningtyas, M.Sc selaku
ketua program studi Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman, IPB, seluruh staf
pengajar dan semua teknisi yang telah memberikan bantuan selama penulis
belajar di IPB.

3.

Kegiatan Hibah Pasca LPPM IPB, atas dukungan dana penelitian sehingga
penelitian ini dapat berjalan dan diselesaikan dengan baik.

4.

Kepala BB-Biogen Pertanian, atas izin dan bantuannya dalam melakukan
evaluasi molekuler di Laboratorium Biologi Molekuler.

5.

Kepala Balai Pengkajian Bioteknologi-BPPT dan Kepala Seksi Pertanian Balai
Pengkajian Bioteknologi-BPPT yang telah memberikan izin untuk melanjutkan
studi S2.

6.

Kepala Pusdiklat Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi dan Bapak Bony
Benyamin atas beasiswa dan arahannya selama masa studi di IPB.

7.

Bapak dan ibu tercinta atas doa yang ikhlas, dorongan, bantuan, keringat dan
semangatnya yang tak ternilai. Dengan hati yang tulus seiring kupanjatkan doa
untuk almarhumah ibu mertuaku yang selalu memberi semangat dan menjadi
inspirasiku untuk menjadi ibu dan istri yang terbaik.

8.

Suamiku Masduki, M.Si dan kedua putriku yang cantik Shafira Aliifa dan
Shaliha Azzahra atas dukungan, doa, pengorbanan, kritikan dan semangatnya
sehingga tesis ini dapat diselesaikan.

9.

Adik-adik ku (Aris, Yuli dan Yudi) yang selalu memberi warna dalam perjalanan
hidupku, kakak iparku (Kak Wati, Kak Syarifah) dan adik iparku (Rohimah dan
Chairiyah) yang selalu membantu dalam suka maupun duka.

10. Teman-teman terbaikku PBT angkatan 2010, Aida Wulansari, M.Si, Irni
Furnawanthi, SP, Linda Novita S.Si, Juwartina Ida Royani, M.Si, Rismayanti,
SP, Hayat Khairiyah, SP, Mbak Tati Sukarnih, teh Juju Juariyah, teh Iif, Mas
Joko dan Mas Yudi.
11. Prof.Dr. Nadirman Haska, M.Si , Drs.Minaldi, Dr. Teuku Tajuddin, Yusuf Sigit,
S.Hut dan tim sagu atas kerjasama, dukungan, bantuan dan dorongan
semangatnya.
10 Rekan-rekan seperjuangan yang saling mendukung dan memberikan semangat
selama masa studi di IPB.
Penulis berharap seluruh kegiatan yang dilakukan selama studi bernilai ibadah
dan menjadi ilmu yang bermanfaat. Semoga tulisan ini dapat menjadi inspirasi untuk
perkembangan penelitian tanaman jeruk di masa depan.

Bogor, Januari 2013

Karyanti

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Solo tanggal 03 April 1975 dari ayah Ngatimin dan ibu
Suwarsih. Penulis merupakan anak pertama dari empat bersaudara. Jenjang
pendidikan penulis adalah lulusan sekolah dasar SD Negeri Bondongan III Bogor
tahun 1986, lulusan SMP Negeri 9 Bogor tahun 1990, lulusan Sekolah Menengah
Analis Kimia Bogor (SMAKBo) tahun 1994 dan tahun 2001 mendapatkan gelar S1
dari Universitas Muhammadiyah Jakarta. Penulis bekerja di Balai Pengkajian
Bioteknologi BPPT sejak tahun 1994 sampai sekarang. Tahun 1999 penulis menikah
dengan H. Masduki, M.Si dan dikaruniai dua orang putri, yaitu Shafira Aliifa (12
tahun) dan Shaliha Azzahra (7 tahun). Tahun 2010 penulis melanjutkan studi S2 pada
Sekolah Pascasarjana IPB dengan program studi Pemuliaan dan Bioteknologi
Tanaman.

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman
Lampiran 1. Media dasar Murashige dan Skoog, vitamin MW...............

77

Lampiran 2. Hasil analisis sidik ragam data berat kalus dan jumlah embrio
somatik..........................................................................................

78

Lampiran 3. Matrik kemiripan 10 tunas regeneran berdasarkan penanda
morfologi dan molekuler...............................................................
Lampiran 4. Data biner hasil pengamatan morfologi tunas regeneran..............

79
80

Lampiran 5. Data biner hasil pengamatan berdasarkan penanda ISSR ............

81

Lampiran 6. Tahapan analisis stomata...............................................................

82

xxiii

xxiv

PENDAHULUAN

Latar Belakang
Jeruk keprok Garut merupakan salah satu jenis jeruk unggulan nasional.
Berdasarkan SK Menteri Pertanian No.760 tahun 1999 menetapkan jenis jeruk
tersebut sebagai varietas unggul. Deskripsi keprok Garut mempunyai rasa asam
manis menyegarkan, kulitnya mudah dikupas, warna kulit hijau kekuningan dan
mempunyai lebih dari 12-15 biji per buah (Balitbangtan 1999). Berdasarkan
agroklimatnya varietas tersebut menghasilkan buah terbaik jika ditanam di dataran
tinggi sekitar 700 -1200 meter di atas permukaan laut. Hal ini merupakan salah
satu pembatas produksi varietas jeruk tersebut sehingga ketersediaannya tidak
selalu ada setiap tahun (AAK 1994).
Menurut Spiegel-Roy dan Goldschmidt (1996), kriteria buah jeruk yang
digemari oleh konsumen dan pasar global adalah buah jeruk yang mempunyai biji
sedikit atau tanpa biji (seedless), mudah dikupas dan memiliki warna yang
menarik. Beberapa kriteria tersebut belum dimiliki oleh keprok Garut sehingga
kalah bersaing di pasar global. Untuk meningkatkan kualitas mutu buah jeruk
keprok Garut yang telah memiliki karakter buah unggul dapat memanfaatkan
teknik pemuliaan mutasi.
Aplikasi pemuliaan mutasi dapat dilakukan secara in vitro dan in vivo.
Aplikasi pemuliaan mutasi secara kultur in vitro memiliki keunggulan karena
dapat menggunakan bahan tanaman seperti kalus embriogenik. Beberapa
keuntungan menggunakan bahan tanaman kalus embriogenik yaitu dapat
mengurangi terjadinya kimera, dapat dilakukan pada populasi yang besar, dan
dapat dikerjakan dalam ruang yang terbatas (Witjaksono & Litz 2002). Setiap
individu kalus embriogenik akan menghasilkan embrio somatik dan tumbuh
menjadi satu tanaman.
Mutasi dapat terjadi secara spontan dan buatan. Mutasi spontan merupakan
mutasi yang terjadi secara alami dengan peluang kejadian sangat kecil yaitu 10-6 10-7 (IAEA 1977 dalam Aisyah 2006). Sedangkan mutasi buatan merupakan
mutasi yang terjadi karena terinduksi oleh mutagen. Beberapa mutagen yang
mampu menginduksi keragaman adalah mutagen fisik dan kimia. Untuk mutagen

2

fisik umumnya dapat digunakan sinar gamma (cobalt 60) sedangkan untuk
mutagen kimia dapat digunakan EMS (Ethyl Methane Sulphonate) (Van Harten
1998). Induksi mutasi secara fisik dapat menyebabkan terjadinya mutasi struktur
dan jumlah kromosom, sedangkan mutasi secara kimia dapat menyebabkan
terjadinya mutasi gen. Evaluasi keragaman genetik yang muncul dapat dilakukan
secara morfologi dan molekuler.
Perlakuan mutagen dengan kultur in vitro dapat meningkatkan peluang
terjadinya mutasi. Aplikasi induksi mutasi dengan kultur in vitro pada tanaman
telah banyak menghasilkan keragaman genetik. Beberapa tanaman yang berhasil
diinduksi keragamannya dengan memanfaatkan mutagen fisik dan kimia di
antaranya pada tanaman pisang (Imelda 2000),

gandum (Ali 2002), alpukat

(Yenisbar 2005), manggis (Qosim 2006), jeruk (Grosser 2007).
Mutan “Mor” merupakan salah satu mutan hasil induksi mutasi pada jeruk
mandarin Murcott dengan sinar gamma pada dosis 35 Gy. Dihasilkan varian baru
dengan rata-rata jumlah biji sekitar 0-2 biji per buah, dari rata-rata jumlah biji
awal sekitar 20- 25 biji per buah pada tanaman aslinya dan produktivitasnya tetap
sama dengan tanaman aslinya (Vardi et al. 1993).
Dalam peningkatan kualitas tanaman melalui teknik pemuliaan mutasi
dengan memanfaatkan kultur in vitro, hal utama yang harus dikuasai adalah teknik
regenerasi tanaman tersebut. Kalus jeruk keprok telah berhasil diregenerasi
(Merigo 2011) dan pola regenerasinya telah dapat diulang dengan hasil yang
sama.

Tujuan
Penelitian ini dilakukan dengan tujuan sebagai berikut:
1.

Mendapatkan GR50 (Growth Reduction 50) kalus embriogenik keprok Garut
melalui iradiasi sinar gamma.

2.

Meningkatkan keragaman genetik tanaman jeruk keprok Garut menggunakan
iradiasi sinar gamma.

3.

Menghasilkan tanaman mutan putatif jeruk keprok Garut.

3

Hipotesis
Hipotesis yang diajukan dalam penelitian ini adalah :
1.

Dosis di sekitar GR50 (Growth Reduction 50) pada kalus embriogenik jeruk
keprok Garut hasil iradiasi sinar gamma dapat menginduksi keragaman yang
tinggi.

2.

Iradiasi sinar gamma berpengaruh terhadap pertumbuhan dan regenerasi kalus
embriogenik jeruk keprok Garut.

3.

Penanda morfologi dan molekuler dapat mengidentifikasi keragaman tunas
regeneran yang dihasilkan.

Kerangka Berpikir
Buah jeruk keprok Garut merupakan salah satu buah komoditas unggulan.
Jeruk keprok Garut memiliki karakter unggul tetapi masih memiliki biji yang
cukup banyak. Peningkatan kualitas jeruk keprok Garut agar sesuai dengan selera
konsumen dapat melalui pendekatan Bioteknologi dan Pemuliaan tanaman
melalui mutasi. Kombinasi metode kultur jaringan menggunakan kalus somatik
dengan mutasi menggunakan mutagen sinar Gamma

berpotensi untuk

menghasilkan mutan solid. Media pendewasaan dan perkecambahan yang tepat
mampu meregenerasi kalus hasil iradiasi menjadi tunas regeneran. Identifikasi
melalui pengamatan secara morfologi dan molekuler dengan penanda ISSR (Inter
Simple Sequence Repeat) dapat membedakan keragaman yang dihasilkan.
Berdasarkan identifikasi molekuler dapat dihasilkan tunas-tunas mutan putatif
yang memiliki karakter berbeda. Pertumbuhan tunas mutan putatif akan lebih
cepat dengan melakukan penyambungan. Penyambungan dengan batang bawah
Japansche Citroen (JC) akan dihasilkan tanaman sambung yang memiliki
perakaran yang kuat. Skema kerangka pemikiran tersaji pada Gambar 1.

4

Kalus embriogenik jeruk
keprok garut asal nuselus
yang
telah
memiliki
beberapa karakter unggul
tetapi
masih
memiliki
jumlah biji yang banyak

Regenerasi kalus hasil
iradiasi dalam media
pendewasaan
dan
perkecambahan

Iradiasi sinar
gamma pada kultur
kalus in vitro

Dihasilkan
Populasi tunas regeneran
dengan morfologi yang
bervariasi
Peningkatan keragaman

Tunas Mutan
Putatif

Identifikasi tunas regeneran
secara
morfologi
dan
molekuler dengan ISSR

Penyambungan:
Batang atas tunas
mutan putatif dan
batang bawah
Japansche Citroen
(JC)

TANAMAN SAMBUNG

Gambar 1

Skema kerangka pemikiran penelitian induksi keragaman kalus
embriogenik untuk mendapatkan mutan putatif jeruk keprok Garut
melalui iradiasi sinar gamma

5

6

TINJAUAN PUSTAKA

Botani Tanaman Jeruk
Buah jeruk merupakan salah satu buah yang digemari, saat ini
kebutuhannya semakin meningkat seiring dengan tumbuhnya kesadaran
masyarakat akan pentingnya nilai gizi. Tanaman jeruk banyak tumbuh di daerah
tropis dan sub tropis, menurut sejarah penyebarannya meliputi wilayah Asia
Tenggara, India, Cina Selatan, Semenanjung Indo-Cina dan Malaya kemudian
menyebar ke benua lain (Chapot 1975 dalam Nicolasi 2007).
Menurut Hodgson (1967) tanaman jeruk yang penting secara komersial
dapat dikelompokan menjadi empat kelompok yaitu : orange (jeruk manis),
mandarin (jeruk keprok), pummelo (jeruk besar) dan grapefruit, serta kelompok
common acid (yang terdiri dari citron, lemon dan lime).
Tanaman jeruk mempunyai banyak kultivar, setiap kultivar mempunyai
sifat-sifat tersendiri sehingga tanaman ini dapat ditanam dimana saja baik di
dataran rendah maupun di dataran tinggi. Tanaman jeruk rata-rata berbunga setiap
tahun sehingga buah jeruk dapat tersedia setiap saat (AAK 1994). Taksonomi
tanaman jeruk menurut (Swingle & Reece 1967 dalam Ortiz 2002),

Divisio

: Spermatophyta

Subdivisio

: Angiospermae

Class

: Dicotyledonae

Ordo

: Rutales

Familia

: Rutaceae

SubFamili

: Aurantioideae

Genus

: Citrus

Spesies

: Citrus reticulata/nobilis L.(keprok)

Menurut Swingle (1967) dalam Ortiz (2002), genus citrus dapat dibagi
menjadi dua subgenus yaitu subgenus papeda dan subgenus eucitrus. Tanaman
jeruk yang diklasifikasikan dalam subgenus eucitrus adalah: C. aurantium, C.

6

sinensis, C. reticulata, C. limon, C. medica, C. aurantifolia, C. grandis, C.
paradisi, C. indica dan C. tachibana.
Secara Agronomi subgenus eucitrus dapat dikelompokan menjadi spesies
seperti: jeruk manis (C. sinensis), mandarin (di kelompokan menjadi 4 spesies),
lemon (C. limon), grapefruit (C. paradisi), limes (Aurantifolia), jeruk asam (C.
aurantium), pummelos (C. Grandis), citrons (C. medica) (Ortiz 2002).
Untuk subgenus jeruk manis yang termasuk spesies Citrus sinensis yaitu
jeruk navel, jeruk common, jeruk merah. Sedangkan beberapa spesies yang
termasuk subgenus jeruk mandarin yaitu jeruk satsuma, jeruk tangerine, jeruk
mandarin mediterranean dan jeruk mandarin lain. Spesies mandarin lain seperti
C. reticulata Blanco atau Ponkan, C. temple Hort dan C. nobilis Lour (Ortiz
2002).
Biji tanaman jeruk dapat digolongkan dalam kelompok apomiksis.
Apomiksis adalah reproduksi aseksual yaitu proses reproduksi tanpa terjadinya
fusi gamet betina dan jantan (Nugroho 2006). Apomiksis merupakan
penyimpangan dalam suatu proses reproduksi yang mekanisme perkembangannya
sangat kompleks (Koltunow 1993). Apomiksis menghasilkan embrio yang
memiliki konstitusi genetik yang sama dengan induknya (Koltunow 1993).
Apomiksis dapat dikategorikan menjadi fakultatif dan obligat (Den Nijs & Van
Dijk 1993). Apomiksis obligat adalah bentuk apomiksis yang bijinya terbentuk
tanpa proses fusi gamet betina dan gamet jantan, seperti pada manggis (Koltunow
1996). Apomiksis fakultatif pada biji jeruk disebut sebagai fenomena
poliembrioni, yaitu terjadinya beberapa embrio dalam satu biji. Embrio yang
dihasilkan terdiri dari embrio zigotik dan embrio nuselar. Embrio zigotik
dihasilkan dari fusi gamet jantan dan betina, sedangkan embrio nuselar terbentuk
dari jaringan kantung embrio. Kedua embrio yang dihasilkan memiliki konstitusi
genetik yang berbeda. Dalam perkembangannya kedua embrio tersebut tumbuh
secara beriringan tanpa saling mengganggu (Koltunow 1996).

7

Jeruk Keprok
Jeruk keprok (Citrus Reticulata L.) di Indonesia merupakan jeruk yang
paling populer dan banyak di konsumsi sebagai buah segar dengan rasa manis
menyegarkan. Di Indonesia sejarah asal usulnya jeruk keprok tidak banyak
diketahui. Berbagai jenis keprok saat ini sebagian besar merupakan warisan yang
ditinggalkan Belanda (Sarwono 1994). Saat ini jeruk keprok mulai digemari dan
banyak dicari oleh masyarakat. Jeruk keprok banyak digemari karena warna
buahnya yang menarik, rasanya manis asam menyegarkan, kandungan vitamin A
dan C yang lebih tinggi dibanding jenis jeruk yang lain (Tabel 1).
Indonesia memiliki beragam jeruk keprok varietas unggul lokal yang
berkualitas. Jenis jeruk keprok tersebut seperti jeruk keprok SoE (NTT), Batu 55,
Pulung dan Madura (Jawa Timur), Garut (Jawa Barat), Tejakula (Bali), Siompu
(Sulawesi Tenggara) dan Kelila (Papua). Selain itu terdapat pula beberapa
varietas yang baru dikembangkan seperti keprok Madu Terigas (Kalimantan
Barat), Jeruk Kacang (Sumatera Barat) dan Borneo Prima (Kalimantan Timur)
(Ditjen Hortikultura 2008).

Tabel 1 Kandungan Vitamin dan Zat Mineral Setiap 100 gram Buah Jeruk
Kadar
Vitamin A (I. U.)
Vitamin B (I. U.)
Vitamin C (I. U.)
Protein (gram)
Lemak (gram)
Hidrat arang (gram)
Besi (mgr)
Kapur (mgr)
Phosphor (mgr)

Keprok
400
60
60
0.5
0.1
8
40
20

Manis

Nipis

200
60
30
0.5
0.1
10
0.3
40
20

60
40
0.5
3
0.1
10
10

Grape Fruit
60
50
0.5
4
0.1
20
20

Sumber : AAK 1994

Tanaman jeruk keprok rata-rata mempunyai tinggi 2 - 8 meter. Tanaman
ini ada yang berduri dan ada yang tidak. Tajuk pohon tidak beraturan, dahan kecil
dengan cabang banyak dan tajuknya rindang. Daun berbentuk tunggal, kecil dan

8

bertangkai pendek, warnanya hijau tua mengkilat pada permukaan atas dan hijau
muda pada permukaan bawah, tangkai daun tidak bersayap. Tanaman jeruk
keprok berbunga majemuk, bunga keluar pada ketiak daun atau pada ujung
cabang. Bunganya kecil-kecil dan berbau harum. Berbunga pada akhir musim
kering. Buah jeruk keprok mempunyai ruang antara 9-19 ruangan, tangkai buah
pendek, kulit buah mudah dikupas. Buah yang sudah tua warna kulitnya ada yang
hijau tua, hijau muda dan kuning orange. Tekstur kulitnya mengkilat, licin, penuh
pori-pori dan sedikit berbau harum. Daging buahnya berwarna orange, banyak
mengandung air, baunya enak dengan rasa manis sedikit asam. Tiap ruang (septa
buah) mengandung banyak biji, septa ini mudah dipisah-pisahkan. Tanaman jeruk
jenis ini sangat baik diusahakan ditempat-tempat dengan ketinggian 700-1200
meter di atas permukaan laut (Sarwono 1994). Tanaman jeruk keprok dapat
diperbanyak secara generatif dan vegetatif. Tanaman jeruk umumnya diperbanyak
melalui okulasi dan penyambungan (Sunarjono 2009).

Japansche Citroen
Jeruk Citroen berasal dari Birma Utara dan Cina Selatan. Jeruk ini dapat
tumbuh baik mulai dari dataran rendah sampai tinggi. Tanaman jeruk ini mampu
berbuah sepanjang tahun dengan kadar air tanah yang mencukupi. Tanaman
berupa perdu setinggi 2–3.5 meter, dengan batang yang pendek dan tidak berbulu.
Letak daun berpencar dengan tangkai yang sangat pendek. Daun tipis bertulang
dan jika diremas baunya wangi sekali. Bunganya terletak di ketiak daun dan
jarang muncul di ujung cabang. Bunganya besar dan baunya sangat harum,
sebagian besar bunganya adalah bunga jantan. Jumlah bunga dalam satu tandan
sekitar 1-10 bunga. Bentuk buahnya

ada yang bulat panjang dan ada bulat

membesar. Kulit buahnya berpori-pori, berwarna kuning kemerahan, tebal dan
sulit dikupas. Daging buah berwarna kuning muda, berbau harum, rasanya sangat
asam dan berbiji banyak (Sarwono 1994).
Jeruk Japansche Citroen (JC) merupakan varietas hibrid hasil persilangan
antara Citroes nobilis (keprok) dengan Citroes medica (lemon). Japansche
Citroen mempunyai karakter mirip dengan Rough Lemon, tahan terhadap
kekeringan, dapat merangsang buah lebih awal, mampu menghasilkan produksi

9

tinggi dengan kualitas yang baik serta tahan terhadap serangan virus Exocortis
(Sugiyanto 1994). Japansche Citroen memiliki kevigoran yang tinggi, memiliki
jumlah biji lebih dari 10 per buah, mudah beradaptasi, buah yang dihasilkan
rasanya sangat asam sehingga tidak layak konsumsi. Japansche Citroen memiliki
kompatibilitas yang tinggi dan lebih vigor dibandingkan Rough Lemon (Susanto
2003).

Pemuliaan Mutasi
Pemuliaan tanaman pada dasarnya merupakan aktivitas menyeleksi
tanaman dari populasi yang memiliki keragaman genetik untuk mendapatkan
tanaman yang mempunyai sifat tertentu. Tujuan dari kegiatan pemuliaan tanaman
yaitu menghasilkan varietas tanaman dengan sifat-sifat yang sesuai dengan sistem
budidaya yang ada dan tujuan ekonomi yang diinginkan (Syukur 2009). Untuk
menghasilkan tanaman unggul melalui teknik pemuliaan tanaman dapat melalui
beberapa metode seperti melalui introduksi tanaman dari luar wilayah, melalui
persilangan antar dua spesies, melalui rekayasa genetika dengan memasukan gen
yang diinginkan ke dalam organisme dan melalui mutasi dengan menggunakan
mutagen (Syukur 2009).
Pemuliaan mutasi merupakan perbaikan tanaman melalui aplikasi teknik
mutasi dalam upaya meningkatkan keragaman genetik (Suranto 2003). Menurut
Soeranto (2003) mutasi adalah perubahan secara tiba-tiba dan acak pada materi
genetik yang dapat memunculkan keragaman genetik. Mutasi dapat terjadi pada
setiap bagian tanaman dan fase pertumbuhan tanaman, namun lebih banyak terjadi
pada bagian yang sedang aktif melakukan pembelahan sel seperti tunas dan biji.
Secara umum mutasi dapat dibedakan menjadi dua yaitu mutasi alami
(spontan) dan mutasi buatan. Mutasi alami terjadi secara spontan yang tidak
diketahui penyebabnya dan terjadi secara acak tanpa diketahui kapan terjadinya.
Peluang terjadinya mutasi alami sangat kecil yaitu 10-6 –10-7 (IAEA 1977 dalam
Aisyah 2006). Mutasi alami ini terjadi secara lambat dan terus menerus sehingga
memerlukan waktu yang lama untuk mengakumulasi dalam menghasilkan mutan.
Sedangkan mutasi buatan merupakan mutasi yang terjadi karena adanya perlakuan

10

tertentu baik secara fisik dan kimia. Bahan yang menyebabkan terjadinya mutasi
disebut mutagen.
Mutagen fisik seperti sinar UV, α, ß, γ dan fast neutron sedangkan
mutagen kimia seperti colchisin, dietil sulfat (DES), etilenamin (EI), nitroso etil
urea (ENH) (Van Harten 1998). Mutasi dapat dibedakan berdasarkan beberapa
kategori dan yang paling umum untuk membedakan yaitu berdasarkan besarnya
sekuen DNA yang berubah baik pada tingkat genom, kromosom dan gen
(Soeranto 2003). Mutasi genom merupakan perubahan pada tingkat jumlah
kromosom (ploidi) dan perubahan dapat menyebabkan terjadi poliploid dan
uneuploid. Mutasi kromosom merupakan perubahan pada struktur kromosom
yang mengakibatkan terjadinya delesi, translokasi, substitusi dan inversi. Mutasi
gen merupakan perubahan pada tingkat gen yang menyebabkan terjadinya
penambahan atau pengurangan satu atau beberapa pasangan basa (Van Harten
1998).
Keberhasilan program pemuliaan mutasi sangat tergantung pada pemilihan
mutagen, metode aplikasi, dosis yang digunakan, regenerasi atau pertumbuhan
tanaman tersebut, bagian tanaman yang digunakan dan teknik seleksi pada
generasi berikutnya (Van Harten 1998).

Pemuliaan Mutasi pada Jeruk
Peningkatan kualitas jeruk dengan aplikasi sinar gamma saat ini telah
banyak digunakan. Pemberian mutagen sinar gamma pada biji jeruk limau langkat
dan limau madu menghasilkan informasi bahwa kandungan air dalam biji sangat
berpengaruh pada tingkat kerusakan akibat mutasi (Noor et al. 2009). Di Iran,
mutagen sinar gamma yang diaplikasikan pada tunas aksilar jeruk mandarin lokal
pada dosis 40 Gy dan diperbanyak secara in vitro menghasilkan 6 tanaman dengan
buah tanpa biji dan 5 tanaman tahan suhu dingin (Majid et al. 2009).
Pengembangan jeruk tanpa biji di Israel dengan memanfaatkan jeruk Murcot yang
diinduksi sinar gamma menghasilkan jeruk tanpa biji dengan tetap memiliki
produktivitas yang tinggi (Vardi

et al. 1993).

Peningkatan kualitas jeruk

mandarin Kinnow varietas lokal di Pakistan telah menghasilkan jeruk tanpa biji
melalui aplikasi iradiasi sinar gamma (Altaf 2004). Di Afrika Selatan dihasilkan

11

jeruk mandarin varietas Nova tanpa biji melalui iradiasi sinar gamma pada dosis
disekitar 20 Gy (Vos 2009). Di Cina telah dikembangkan pula jeruk tanpa biji
melalui persilangan tanaman tetraploid dengan diploid, teknologi fusi protoplas
dan pemuliaan mutasi dengan iradiasi (Zhong 2007).
Di Indonesia peningkatan kualitas jeruk telah dilakukan melalui pemuliaan
mutasi dan fusi protoplas. Tunas aksilar jeruk keprok dan jeruk besar asli
Indonesia yang diberikan sinar gamma pada dosis 20 – 40 Gy menghasilkan buah
tanpa biji (Sutarto et al. 2009). Tanaman jeruk keprok Soe, Garut dan Batu 55
yang telah berumur 3 tahun hasil induksi iradiasi sinar gamma di karakterisasi,
dan dihasilkan pada dosis iradiasi 20 Gy tiga tanaman keprok Soe tanpa biji
(Martasari et al. 2005). Kalus embriogenik jeruk siam yang diberikan perlakuan
iradiasi sinar gamma menghasilkan perubahan morfologi daun, pertumbuhan,
anatomi stomata dan tingkat ploidi (Husni & Kosmiatin 2011). Diperoleh tanaman
jeruk dan masih dalam tahap pendewasaan di lapang hasil fusi protoplas jeruk
siam simadu dengan jeruk mandarin satsuma (Husni 2010).

Mutagen Sinar Gamma
Mutagen fisik yang umum digunakan yaitu sinar gamma. Pemilihan sinar
gamma dikarenakan sinar ini mempunyai kelebihan dibandingkan dengan sinar
radioaktif lainnya. Sinar gamma memiliki panjang gelombang yang paling kecil
(0.01 sampai 10 nm) dan energi terbesar dibandingkan spektrum gelombang
elektromagentik yang lain. Selain itu, sinar gamma memiliki daya ionisasi yang
paling rendah namun jangkauan tembus yang paling besar dibandingkan sinar α
dan ß. Karena daya tembusnya yang begitu tinggi, sinar gamma mampu
menembus berbagai jenis bahan kecuali beton. Sejauh ini ada tiga pemancar sinar
gamma yang paling sering digunakan yakni cobalt-60, cesium-137 dan
technetium-99 (Nuke 2009).
Sinar gamma merupakan gelombang elektromagnetik yang mempunyai
sifat radiasi pengion yang mampu mengionisasi materi yang dilewatinya. Radiasi
ionisasi ini mampu menghasilkan energi yamg tinggi dan aktif yang dapat
merusak setiap molekul yang dilewatinya secara langsung dan tidak langsung.

12

Pengaruh radiasi secara langsung yaitu jika ionisasi terjadi didekat kromosom
maka dapat langsung menyebabkan terjadinya mutasi. Pengaruh iradiasi secara
tidak langsung terjadi ketika energi hasil ionisasi berupa elektron bebas dan
radikal positif bereaksi terlebih dahulu dengan air dan oksigen yang ada dalam
sel. Reaksi tersebut menghasilkan radikal positif dan peroksida yang sangat
reaktif sehingga dapat merusak setiap molekul yang ditemuinya dan menyebabkan
mutasi. Adanya kerusakan pada tingkat molekuler inilah yang memunculkan
keragaman pada tanaman yang diberikan perlakuan iradiasi, namun pada keadaan
tertentu kerusakan dapat diperbaiki selama siklus hidupnya, hal ini disebut
sebagai kerusakan fisiologis (Van Harten 1998).
Dalam perkembangannya mutasi dengan mutagen sinar gamma telah
banyak diaplikasikan seperti pada tunas muda kentang, perlakuan iradiasi pada
dosis 2-6 Gy dapat meningkatkan kandungan protein dalam kentang (Li et al.
2005), pada tanaman jeruk, iradiasi biji jeruk pada dosis 50 Gy mampu
meningkatkan total protein terlarut dalam buah jeruk (Ling et al. 2008), iradiasi
kalus manggis pada dosis 25 Gy (Qosim 2006) dan biji manggis pada dosis 50 Gy
(Widiastuti 2010), dapat meningkatkan keragaman tunas regeneran manggis yang
dihasilkan.

Teknik Kultur Jaringan pada Tanaman Jeruk
Teknik kultur jaringan telah banyak diaplikasikan dengan tujuan
perbanyakan bibit tanaman bernilai ekonomis dan peningkatan kulitas tanaman.
Dalam peningkatan kualitas tanaman melalui rekayasa genetik maupun pemuliaan
mutasi melalui teknik kultur jaringan, hal penting yang harus dikuasai adalah
sistem regenerasi dari tanaman tersebut. Metode regenerasi dalam teknik kultur
jaringan dapat melalui embriogenesis. Pola pembentukan embriogenesis terdiri
dari embriogenesis langsung dan tidak langsung. Embriogenesis langsung yaitu
pembentukan embrio somatik langsung dari eksplan, sedangkan embriogenesis
tidak langsung yaitu pembentukan embrio somatik melalui induksi kalus terlebih
dahulu. Embriogenesis somatik merupakan pembentukan embrio dari sel somatik
tunggal. Embrio somatik berasal dari proembrio masses (PEM) yang berasal dari
individu sel yang memiliki struktur bipolar yang akan membentuk tunas dan akar.

13

Pada embriogenesis somatik, embrio berkembang melalui beberapa tahap yaitu
globular, jantung, torpedo, kotiledon dan planlet (Gray 2005).
Jalur embriogenesis banyak digunakan dalam penelitian tanamanan jeruk.
Nuselus jeruk siam Simadu dan Pontianak menghasilkan kalus embriogenik
setelah diinduksi dalam media MS yang dikombinasikan dengan vitamin MW, 3
mgL-1 BA dan 500 mgL-1 malt ekstrak. Kalus embriogenik diregenerasikan dalam
media MS ditambahkan vitamin MW dan 0.5 mgL-1 ABA selanjutnya embrio
somatik yang dihasilkan ditumbuhkan dalam media MS yang ditambahkan
vitamin MW dan 0.5 mgL-1 GA3 (Husni et al. 2010). Begitu pula yang dihasilkan
oleh Merigo (2011) dengan menggunakan nuselus jeruk keprok Batu 55
dihasilkan kalus embriogenik yang diinduksi dalam media MS yang dikombinasi
dengan vitamin MW, 3 mgL-1 BAP dan 300 mgL-1 casein hydrolisat. Kalus
embriogenik ditanam dalam media MS yang dikombinasikan dengan 2.5 mgL-1
ABA, selanjutnya embrio somatik yang dihasilkan ditumbuhkan dalam media MS
yang dikombinasikan dengan vitamin MW dan 2.5 mgL-1 GA3. Embrio jeruk
batang bawah Japansche Citroen (JC) diinduksi dalam media MS yang
dikombinasikan dengan 0.5 mgL-1 2.4D dan 0.05-0.1 mgL-1 BAP dan
menghasilkan kalus embriogenik (Triatminingsih et al. 2003). Regenerasi kalus
menjadi tunas

jeruk batang bawah Citromelo optimal dalam media MS

modifikasi yang ditambahkan 0.5 mgL-1 BAP, 0.02 mgL-1 NAA dan 40 mgL-1
adenin sulfat, sedangkan pada jeruk Japansche Citroen (JC) optimal dalam media
MS modifikasi yang ditambahkan 0.5 mgL-1 BAP, 0.02 mgL-1 NAA
(Triatminingsih et al. 2004). Embrio biji jeruk Japansche Citroen (JC) yang
ditanam dalam media MS yang dikombinasikan dengan vitamin Gambrog-B5, 0.5
mgL-1 2.4 D dan 0.05-0.15 mgL-1 BAP (Karmanah 2009).

Penyambungan (Grafting)
Grafting merupakan metode konvensional yang telah lama digunakan
untuk memperbaiki kualitas dan kuantitas hasil tanaman. Grafting dapat
menghasilkan kombinasi baru dari dua jenis tanaman yang digunakan. Grafting

14

adalah penggabungan dua bagian tanaman yang berlainan sehingga menjadi satu
kesatuan yang utuh dan tumbuh sebagai satu tanaman (Mangoendidjojo 2003).
Penyambungan dapat dilakukan secara in vitro (dalam botol kultur) dan ex
vitro (di lapang). Penyambungan secara in vitro umumnya disebut sebagai
sambung mikro sedangkan penyambungan secar ex vitro umumnya disebut
sebagai sambung pucuk. Dalam budidaya teknik penyambungan yang umum
dilakukan adalah sambung pucuk. Tujuan dilakukannya sambung pucuk adalah
untuk mempercepat waktu berbunga dan berbuah, meningkatkan kualitas dan
kuantitas tanaman, peremajaan tanaman dan menguji keberadaan penyakit akibat
virus (Mangoendidjojo 2003). Tujuan dilakukannya sambung mikro adalah
mempersingkat waktu untuk meremajakan tanaman, meregenerasi tanaman,
menghasilkan tanaman bebas penyakit, menyediakan bibit siap lapang, dapat
mengetahui lebih dini ketidaksesuaian tanaman (Estrada et al. 2002).
Dalam penyambungan hal terpenting adalah kemampuan daya gabung
(kompatibilitas)

dari

kedua

batang

yang

disambungkan.

Kompatibilitas

mempengaruhi kelangsungan hidup tanaman hasil sambungan dan kemampuan
produksinya. Pada penyambungan yang kompatibel, maka kedua bagian yang
disambungkan akan berhasil membentuk suatu kesatuan dan dapat berkembang
menjadi kesatuan yang utuh. Sebaliknya dapat pula terjadi inkompatibilitas yang
disebabkan oleh respon fisiologi yang tidak sesuai antara kedua bagian yang
disambungkan (Handayani 2012).
Teknik penyambungan banyak digunakan dalam perbanyakan tanaman
buah seperti pada alpukat yang bertujuan untuk mempercepat pertumbuhan
tanaman alpokat hasil transformasi (Raharjo & Litz 2003), tanaman cerry untuk
meremajakan tanaman dan menghasilkan tanaman bebas penyakit (Amiri 2006),
tanaman jeruk untuk menghasilkan tanaman bebas virus

(Naz et al. 2007),

Tanaman manggis untuk mengatasi kesulitan perakaran (Handayani 2012), Jeruk
besar Nambangan dan Cikoneng untuk mempercepat pertumbuhan (Putri 2006).

Analisis Keragaman
Peningkatan kualitas dapat dilakukan melalui kombinasi pemuliaan mutasi
dan teknik kultur jaringan. Dengan teknik ini akan dihasilkan tanaman yang

15

beragam. Untuk melihat seberapa besar keragaman yang dihasilkan dapat
dilakukan identifikasi baik secara morfologi dan molekuler. Untuk membedakan
pada tahap awal dapat dilakukan secara morfologi sedangkan untuk lebih
memastikan keragaman yang dihasilkan dapat melalui analisis molekuler.
Deteksi morfologi in vitro dilakukan melalui pengamatan secara visual
terhadap perkembangan yang dihasilkan. Dalam pengamatan ini diperlukan
kejelian dan kecermatan untuk dapat membedakan. Pengamatan dilakukan pada
karakter-karakter kualitatif dan kuantitatif. Untuk memastikan keragaman yang
dihasilkan dapat dilakukan secara molekuler.
Salah satu penanda molekuler yang dapat dimanfaatkan yaitu penanda
ISSR. Penanda ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) merupakan marker yang
berkembang lebih akhir dibanding RAPD (Random Amplified Polymorphic
DNA), RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphisme) dan SSR (Simple
Sequence Repeats) (Azrai 2005). ISSR merupakan penanda DNA berbasis PCR
yang menggunakan sekuen mikrosatelit. Penanda ISSR memiliki keunggulan
seperti aplikasinya sangat sederhana, mudah dilakukan, cepat, melibatkan
kuantitas cetakan DNA rendah (10-30 bp), dapat diulang dan konsisten, tidak
memerlukan banyak informasi untuk mendesain primer, dan mampu membedakan
individu-individu yang memiliki kekerabatan (Zietkiewicz et al. 1994). Penanda
ISSR telah banyak digunakan dalam identifikasi tanaman jeruk seperti pada
keragaman jeruk lemon (Capparelli et al. 2004), beberapa genotipe jeruk
(Shahsavar 2007), keragaman jeruk Soe hasil iradiasi sinar gamma (Yulianti et al.
2010), jeruk Siam hasil iradiasi sinar gamma (Agisimanto et al. 2007) dan jeruk
Siam hasil fusi protoplas (Husni 2010).

BAHAN DAN METODOLOGI

Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan dari Bulan Oktober 2011 sampai Bulan September
2012. Induksi kalus, proliferasi dan regenerasi dilakukan di Laboratorium Kultur
Jaringan,

identifikasi

stomata

dan

pemotongan

jaringan

dilakukan

di

Laboratorium Mikroteknik, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas
Pertanian, IPB. Identifikasi ISSR dilakukan di Laboratorium Molekuler BBBiogen. Sedangkan untuk perlakuan iradiasi sinar gamma di lakukan di Pusat
Aplikasi Teknologi Isotop dan Radiasi, Badan Tenaga Nuklir Nasional (PATIRBATAN).

Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan adalah kalus embriogenik jeruk keprok Garut asal
nuselus yang telah berumur 4 tahun. Media dasar MS yang digunakan sebagai
sumber hara makro dan mikro (Murashige & Skoog) (Lampiran 1), vitamin MW
(Morel & Wetmore) (Lampiran 1), zat pengatur tumbuh BAP (Benzil Amino
Purin), ABA (Absisic Acid) , GA3 (Giberelin Acid), Casein Hydrolisat, gula,
gelrite, dan alkohol 70%, daun tunas regeneran hasil iradiasi in vitro, Japansche
Citroen (JC), solatif, primer ISSR1- ISSR 8.
Alat yang digunakan seperti peralatan iradiasi 60Co, piala gelas, timbangan
analitik, pipet, labu ukur, kompor atau hot plate, botol kultur, pinset, scalpel,
gunting, laminar air flow, mikroskop dan kamera digital (Sony super steady shotDSC T10-7.2 pixels).

Metode Penelitian
Penelitian yang dilakukan terdiri dari empat tahap yaitu 1) proliferasi kalus
embriogenik dan induksi iradiasi sinar gamma, 2) regenerasi kalus hasil iradiasi
melalui tahapan embriogenesis somatik,