Identifikasi steroid teripang pasir dan bioassay produk teripang sebagai sumber aprodisiaka alami dalam uapya peningkatan nilai tambah teripang
PEMILAHAN DAN KARAKTERISASI INHIBITOR
PROTEASE DARI BAKTERI YANG BERASOSIASI
DENGAN SPONS ASAL PERAIRAN
PULAU PANGGANG, KEPULAUAN SERIBU
TATI NURHAYATI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI
DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi yang berjudul Pemilahan dan
Karakterisasi Inhibitor Protease dari Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons Asal
Perairan Pulau Panggang, Kepulauan Seribu adalah benar merupakan hasil karya
saya sendiri dan belum pernah diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan
tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Bogor, Agustus 2006
Tati Nurhayati
NIM. F 226010011
ABSTRACT
TATI NURHAYATI. Screening and Characterization of Protease Inhibitor from
Bacteria-Associated with Sponge, from Pulau Panggang Waters, Seribu Islans.
Supervised by MAGGY T. SUHARTONO, LILIS NURAIDA, and SRI BUDIARTI
POERWANTO.
The important causing cause foodborne diseases are Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Listeria spp. and Pseudomonas aeruginosa. Protease
produced by these bacteria are involved in the molecular mechanisms of the
diseases. Therefore, there has been rapidly increase concern on proteases as
medical target for bacterium diseases. Various sponges has been reported to
produce protease inhibitor which could inhibit protease activity of pathogenic
bacteria. The previous research showed that bacteria-associated with sponge could
produce bioactive compound similar with their host. Therefore, there is a possibility
that the bacteria also produce protease inhibitor. The purposes of this research
were to screen potential microbes-associated with sponge as producer of protease
inhibitor, to optimize conditions for the inhibitor production, to purify protease
inhibitor from the selected microbe and to study the characteristics of the protease
inhibitor. Among the isolates, Chromohalobacter sp. 6A3 was identified as the most
potential protease inhibitor producer. Identification of the isolate was based on
biochemical characteristics of the isolate and sequence of the gene encoding 16S
rRNA. The optimum medium for producing protease inhibitor consisted of special
peptone 0.5 % (w/v), yeast extract 0.1 % (w/v), trace element 0.2 % (v/v), NaCl 2 %
(w/v), glucose 0.05 % (w/v), and incubation was conducted at 30 oC for 12 hours at
150 rpm. The protein was extracted by 30 % (v/v) acetone, purified by gel filtration
(Sephadex G-75) and finally, purified by anion exchanger (Sephadex A-50). The
molecular weight of the purified protease inhibitor after gel filtration was estimated
as 21,31 kDa and 17,05 kDa, but anion exchanger gave protein with estimated
molecular weight of 21,31 kDa The optimum temperature and pH were 30 oC and 5
respectively. The protease inhibitor could resist heating at 40 oC for 10 minutes
(crude extract and acetone precipitated), and 30 oC for 10 minutes (purified). The
inhibitor incubated at 30 oC, pH 5, was still active until 8 hours (crude extract), 6
hours (acetone precipitated), and 3 hours (purified). The purified enzyme inhibitor
was still active when incubated at pH from 5 to 6 for 1 hour. The most susceptible
substrate (enzyme) for the inhibitor was protease from P. aeruginosa. The protease
inhibitor was inhibited by metal ions except Na+ 1mM. The inhibitor was activated 2
fold by SDS 5 mM. IC 50 of the protease inhibitor was 24.2 nM (crude extract) and
3.48 nM (purified) . The protease inhibitor inhibited the enzyme uncompetitively.
Keywords: characteristics, marine bacteria, protease inhibitor, screening, sponge
ABSTRAK
TATI NURHAYATI. Pemilahan dan Karakterisasi Inhibitor Protease dari Bakteri
yang Berasosiasi dengan Spons, asal Perairan Pulau Panggang, Kepulauan Seribu.
Dibimbing oleh MAGGY T. SUHARTONO, LILIS NURAIDA, DAN SRI BUDIARTI
POERWANTO.
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Listeria sp., dan Pseudomonas
aeruginosa merupakan bakteri patogen yang penting sebagai penyebab foodborne
disease. Bakteri ini menghasilkan protease yang terlibat dalam mekanisme
molekular penyebab penyakit. Oleh karena itu, saat ini protease menjadi mendapat
perhatian penting sebagai target pengobatan penyakit yang disebabkan oleh
bakteri. Berbagai spons telah dilaporkan menghasilkan inhibitor protease yang
dihasilkan oleh bakteri patogen. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa
bakteri yang berasosiasi dengan spons dapat menghasilkan komponen bioaktif
yang mirip dengan inangnya. Oleh karena itu, diduga bakteri yang berasosiasi
dengan spons juga menghasilkan inhibitor protease. Tujuan penelitian ini adalah
memilah bakteri yang berasosiasi dengan spons sebagai penghasil inhibitor
protease yang potensial, mengoptimasi kondisi produksi inhibitor protease,
memurnikan inhbitor protease asal bakteri yang terpilih, serta mempelajari
karakteristik inhibitor protease. Diantara isolat yang positif menghasilkan inhibitor
protease berdasarkan hasil pemilahan, Chromohalobacter sp. 6A3 merupakan
bakteri yang paling potensial sebagai penghasil inhibitor protease. Isolat tersebut
diidentifikasi melalui karakteristik biokimiawi dan sekuens gen yang mengkodekan
16S rRNA. Medium yang optimum untuk menghasilkan inhibitor protease terdiri
atas special peptone 0,5 % (w/v), yeast extract 0,1 % (w/v), trace element 0,2 %
(v/v), NaCl 2 % (w/v), glukosa 0,05 % (w/v), dan inkubasi dilakukan pada suhu
30 oC selama 12 jam pada kecepatan 150 rpm. Protein tersebut diekstrak
menggunakan aseton 30 % (v/v), dimurnikan dengan filtrasi gel (Sephadex G-75),
dan terakhir dimurnikan menggunakan penukar ion (Sephadex A-50). Berat molekul
inhibitor protease setelah dimurnikan dengan filtrasi gel, yaitu 21,31 kDa dan 17,05
kDa, namun setelah dimurnikan dengan penukar ion, sekitar 21,31 kDa. Suhu dan
pH optimum inhibitor protease adalah 30 oC dan 5. Inhibitor protease stabil pada
inkubasi 40 oC selama 10 menit (ekstrak kasar dan hasil pengendapan aseton), dan
30 oC selama 10 menit (murni). Inhibitor protease yang diikubasi pada kondisi
optimum (suhu 30 oC, pH 5) masih stabil selama 8 jam (ekstrak kasar), 6 jam (hasil
pengendapan aseton), dan 3 jam (murni). Inhibitor murni masih aktif ketika
diinkubasi pada pH 5-6 selama 1 jam. Substrat yang paling cocok untuk inhibitor
protease tersebut adalah protease dari Pseudomonas aeruginosa.
Inhibitor
protease dihambat oleh ion-ion logam kecuali Na+ 1 mM, ditingkatkan aktivitasnya
oleh SDS hinga 2 kali lipat. IC50 inhibitor protease adalah 24,2 nM (ekstrak kasar)
dan 3,48 mM (murni). Pola penghambatan inhibitor tersebut adalah uncompetitive.
Katakunci: karakteristik, bakteri laut, inhibitor protease, pemilahan, spons
© Hak cipta milik Institut Pertanian Bogor tahun 2006
Hak cipta dilindungi
Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis dari
Institut Pertanian Bogor, sebagian atau seluruhnya dalam
bentuk apapun, baik cetak, fotokopi, mikrofilm, dan sebagainya
PEMILAHAN DAN KARAKTERISASI INHIBITOR
PROTEASE DARI BAKTERI YANG BERASOSIASI
DENGAN SPONS ASAL PERAIRAN
PULAU PANGGANG, KEPULAUAN SERIBU
TATI NURHAYATI
Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor
pada Program Studi Ilmu Pangan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
Judul
:
Nama Mahasiswa
NIM
:
:
Pemilahan dan Karakterisasi Inhibitor Protease dari
Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons Asal Perairan
Pulau Panggang, Kepulauan Seribu
Tati Nurhayati
F 226010011
Disetujui
Komisi Pembimbing
Prof. Dr. Ir. Maggy Thenawidjaja Suhartono
Ketua
Dr. Ir. Lilis Nuraida
Anggota
Dr.dr. Sri Budiarti Poerwanto
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Ilmu Pangan
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Betty Sri Laksmi Jenie, M.S
Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S
Tanggal Ujian: 27 Juni 2006
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Segala puji bagi Allah swt yang telah melimpahkan rahmat dan hidayahNya sehingga penulis dapat menyelesaikan disertasi yang berjudul Pemilahan dan
Karakterisasi Inhibitor Protease dari Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons Asal
Perairan Pulau Panggang, Kepulauan Seribu. Disertasi ini dibuat sebagai salah
satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Program Studi Ilmu Pangan,
Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Selama menjalani perkuliahan hingga terselesaikannya Disertasi ini,
tentunya banyak pihak yang telah membantu penulis.
Oleh karena itu dengan
segala ketulusan hati penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya
kepada:
Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono selaku ketua komisi pembimbing yang
telah memberikan ilmu, arahan dan masukan selama penulis melaksanakan kuliah,
penelitian, hingga terselesaikannya disertasi ini.
Beliau pulalah yang telah
membuka wawasan penulis dan akhirnya mengarahkan penulis untuk membuat
proposal penelitian Hibah Bersaing XI untuk keperluan penyelesaian program S3.
Beliau juga telah mengijinkan penulis untuk melakukan penelitian di Laboratorium
Mikrobiologi dan Biokimia, Pusat Penelitian Bioteknologi dan Biologi, IPB.
Dr. Ir. Lilis Nuraida selaku anggota komisi pembimbing yang telah banyak
mengarahkan penulis selama penelitian dan penyusunan disertasi.
Dr. dr. Sri Budiarti Poerwanto selaku anggota komisi pembimbing yang
telah banyak mengarahkan penulis selama penelitian dan penulisan disertasi.
Beliau juga telah mengijinkan penulis untuk penelitian di Laboratorium Bioteknologi
Hewan dan Biomedis, Pusat Penelitian Bioteknologi dan Biologi, IPB.
Berkat
rekomendasi beliau penulis memperoleh isolat bakteri patogen dari Rumah Sakit
Pusat Pertamina. Beliau juga selalu memberikan semangat kepada penulis saat
penulis sedang ragu untuk melangkah.
Dr. Ir. Sugiono, MAppSc yang telah menyediakan waktu untuk menguji
penulis saat ujian Preliminary. Prof. Dr. Ir. Suminar Setiati Achmadi yang telah
bersedia menguji penulis pada Sidang Tertutup.
Dr. Ir. Linawati Hardjito dan
Debbie S. Retnoningrum, Ph.D selaku Penguji Luar Komisi pada Sidang Terbuka.
Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc selaku Ketua Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan
yang telah hadir pada Sidang Tertutup dan Sidang Terbuka.
Dr. Ir. Mita Wahyuni selaku kolega di Departemen Teknologi Hasil
Perairan yang telah memperkenalkan penulis kepada Dr. Chiaki Imada di Tokyo
University of Fisheries dan atas rekomendasinyalah penulis dapat menyelesaikan
analisis 16S rRNA di Jepang melalui program JSPS.
Ir. Bustami Ibrahim, MSc yang telah memberikan kesempatan bagi penulis
untuk melanjutkan S3 di IPB.
Saat itu beliau menjabat sebagai Ketua Jurusan
Teknologi Hasil Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, IPB.
Dekan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, saat itu dijabat oleh Dr. Ir.
Enang Harris, MS; juga kepada Rektor IPB yang saat itu dijabat oleh Prof. Dr. Ir.
Aman Wirahadikusuma, MSc yang telah memberikan kesempatan kepada penulis
untuk melanjutkan program S3.
Seluruh staf pengajar Program Studi Ilmu Pangan yang telah banyak
memberikan ilmu kepada penulis selama menjalani perkuliahan.
Dikti, yang telah memberikan Beasiswa Program Pascasarjana (BPPS),
juga memberikan dana penelitian melalui program Hibah Bersaing XI.
Adikku tercinta, Fazria Amalia, S.Si, yang selalu setia membantu penulis
melaksanakan penelitian hingga akhir.
Semua laboran di Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi,
serta
laboran
di
Seafast
Center
yang
telah
membantu
penulis
selama
melaksanakan penelitian.
Suamiku tercinta Ir. Muryanto MP dan juga ananda Nurma Murti Hapsari
atas kasih sayang dan doa, serta keikhlasannya untuk
selalu mendorong dan
memberi semangat kepada penulis untuk menyelesaikan kuliah S3.
Kedua orang tua penulis (Bapak Abdul Syahri dan Sutarsih (Alm)) beserta
keluarga besar Abd. Syahri, dan keluarga besar Daromi Nanto Miharjo yang
senantiasa memberikan doa dan dukungan kepada penulis
Dr. Ir. Linawati Hardjito, MSc selaku Ketua Departemen THP yang
senantiasa mendorong penulis untuk menyelesaikan kuliah dan juga rekan-rekan
staf Departemen THP atas kerjasamanya selama ini sehingga penulis dapat
menyelesaikan kuliah S3.
Semua rekan-rekan di IPN, khususnya Bu Asriani dan Bu Rifda, atas
kerjasamanya selama ini.
Akhir kata penulis mohon maaf atas segala kekurangan, semoga disertasi
ini bermaanfat bagi pembaca dan memberikan ide bagi pembaca untuk melanjutkan
penelitian ini, sehingga akan didapatkan hasil yang lebih sempurna.
Bogor, Agustus 2006
Tati Nurhayati
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta, 7 Agustus 1970 sebagai anak keempat dari
tujuh bersaudara dengan ayah bernama Abdul Syahri dan ibu bernama Sutarsih
(Alm). Pada tahun 1998 penulis menikah dengan Ir. Muryanto MP dan dikarunia
seorang anak yang bernama Nurma Murti Hapsari (1999).
Sejak tahun 1996
penulis bekerja sebagai staf pengajar pada Jurusan Pengolahan Hasil Perikanan,
yang sekarang namanya berganti menjadi Departemen Teknologi Hasil Perairan.
Sejak Bulan Oktober 2005 penulis mendapat amanah untuk menjadi Sekretaris
pada Departemen Teknologi Hasil Perairan.
Penulis menyelesaikan program Sarjana pada Jurusan Pengolahan Hasil
Perikanan, Fakultas Perikanan tahun 1995. Dua tahun kemudian penulis
melanjutkan pendidikan pada Program Pascasarjana (S2) Institut Pertanian Bogor,
Program Studi Ilmu Pangan dan lulus tahun 2000. Pada tahun 2001 penulis
melanjutkan ke Program Doktor pada Program Studi yang sama, dengan Sub
Program Studi Bioteknologi Pangan, di Institut Pertanian Bogor.
Beasiswa
diperoleh penulis dari Beasiswa Program Pascasarjana (BPPS) dari tahun 20012004. Dana Penelitian diperoleh dari Dikti, Depdiknas, melalui Hibah Bersaing XI
tahun 2003-2004.
Selama
mengikuti
pendidikan
S3,
penulis
aktif
sebagai
angota
Perhimpunan Mikrobiologi Indonesia (PERMI) dan sebagai dewan redaksi Buletin
Teknologi Hasil Perikanan.
Penulis telah menyajikan makalah yang merupakan
bagian dari disertasi dalam beberapa kegiatan ilmiah, seperti pada Seminar
Nasional Permi tahun 2003, Seminar Nasional dan Kongres PATPI tahun 2004,
Seminar Nasional Hibah IX tahun 2004, Asean Food Conference tahun 2005, serta
International Seminar and Workshop Marine Biodiversity and their Potential for
Developing Bio-Pharmaceutical Industry in Indonesia tahun 2006. Selain itu telah
mempublikasikan artikel yang juga merupakan bagian Disertasi dalam Buletin
Teknologi Hasil Perikanan Volume VII tahun 2004 dan Volume VIII tahun 2005,
serta pada Jurnal Hayati Volume XIII No. 2 Bulan Juni tahun 2006.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL...................................................................................................
viii
DAFTAR GAMBAR ..............................................................................................
ix
DAFTAR LAMPIRAN............................................................................................
xii
PENDAHULUAN ..................................................................................................
1
Latar Belakang ...............................................................................................
1
Tujuan ............................................................................................................
3
Luaran ............................................................................................................
3
TINJAUAN PUSTAKA ..........................................................................................
4
Keterlibatan protease dalam Mekanisme Patogenisitas ................................
Inhibitor dari Spons ........................................................................................
Inhibitor Protease dari Mikroorganisme..........................................................
Hubungan antara Spons dan Bakteri yang Bersimbiosis ...............................
Mikroorganisme yang Bersimbiose dengan Spons ........................................
Penggolongan Inhibitor Enzim .......................................................................
Penggolongan inhibitor enzim berdasarkan mekanisme kerjanya........
Penggolongan inhibitor enzim berdasarkan spesifisitas kerjanya..........
Pemurnian Inhibitor Enzim .............................................................................
Ekstraksi inhibitor enzim........................................................................
Fraksinasi menggunakan kolom kromatografi.......................................
4
5
7
9
10
12
12
13
14
15
15
METODOLOGI .....................................................................................................
17
Waktu dan Tempat Penelitian ........................................................................
17
Bahan dan Alat...............................................................................................
17
Metode Penelitian...........................................................................................
18
Penelitian tahap I isolasi dan identifikasi bakteri serta pemilahan
bakteri yang berasosiasi dengan spons sebagai penghasil
inhibitor protease ...................................................................................
Penelitian tahap II optimasi media yang digunakan untuk produksi
inhibitor protease ...................................................................................
Penelitian tahap III pemurnian inhibitor protease ..................................
Penelitian tahap IV karakterisasi inhibitor protease..............................
24
25
26
Analisis........ ...................................................................................................
29
Aktivitas protease (Walter 1984) ...........................................................
Konsentrasi protein (Metode Bradford dalam Hammond dan Kruger
1988) ...................................................................................................
Analisis inhibitor protease (Imada et al. 1985c).....................................
29
29
30
Analisis Data ..................................................................................................
31
HASIL DAN PEMBAHASAN ..........................................................................
32
Penelitian Tahap I Isolasi dan Identifikasi Bakteri serta Pemilahan
Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons sebagai Penghasil Inhibitor
Protease
...................................................................................................
32
vi
20
Halaman
Pengumpulan spons..............................................................................
Pemilahan dan pemurnian bakteri yang berasosiasi dengan
spons ...................................................................................................
Pemilahan bakteri penghasil inhibitor protease.....................................
Karakterisasi bakteri penghasil inhibitor protease..................................
Penentuan bakteri penghasil inhibitor protease tertinggi dalam
media marine broth................................................................................
Identifikasi bakteri penghasil inhibitor protease tertinggi .......................
32
41
46
Penelitian Tahap II Optimasi Media yang Digunakan untuk Produksi
Inhibitor Protease ...........................................................................................
49
34
36
38
Penelitian Tahap III Pemurnian Inhibitor Protease…………………………….. 59
Ekstraksi inhibitor protease …………………………………………………
Dialisis dan pengeringan beku ..............................................................
Pemurnian inhibitor protease dengan kolom kromatografi ....................
Produksi inhibitor protease ....................................................................
Penelitian Tahap IV Karakterisasi Inhibitor Protease .....................................
59
61
62
63
64
Penentuan suhu optimum inhibitor protease ......................................... 65
Penentuan pH optimum......................................................................... 66
Stabilitas terhadap panas ...................................................................... 67
Stabilitas terhadap panas pada kondisi optimum .................................. 69
Stabilitas terhadap pH ........................................................................... 70
Pengaruh berbagai substrat terhadap aktivitas inhibitor protease ........ 70
Pengaruh ion logam .............................................................................. 71
Pengaruh SDS, mercaptoetanol, dan inhibitor ...................................... 72
Penentuan IC50 ...................................................................................... 74
Penentuan bobot molekul...................................................................... 77
Zimogram .............................................................................................. 80
Model penghambatan............................................................................ 82
Mekanisme penghambatan ................................................................... 83
KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................................
87
Kesimpulan ...................................................................................................
Saran
...................................................................................................
87
88
DAFTAR PUSTAKA .............................................................................................
89
LAMPIRAN
95
...................................................................................................
vii
DAFTAR TABEL
Halaman
1. Spons dan inhibitor enzim yang dihasilkan .................................................
6
2. Sponge dan mikroorganisme simbion penghasil produk alami ...................
12
3. Metode kromatografi untuk fraksinasi protein .............................................
15
4. Metode ekstraksi dan pemurnian inhibitor enzim dari mikroorganisme ......
16
5. Tahapan penelitian......................................................................................
18
6. Jenis dan nomor akses bakteri yang digunakan untuk pembuatan
pohon filogenetik .........................................................................................
24
7. Prosedur untuk mengukur aktivitas protease ..............................................
29
8. Prosedur pengukuran aktivitas inhibitor protease .......................................
31
9. Jumlah bakteri yang tumbuh dari masing-masing spons ............................
34
10. Hasil pemilahan bakteri yang potensial sebagai penghasil inhibitor protease 38
11. Karakteristik taksonomi bakteri penghasil inhibitor protease ......................
39
12. Waktu produksi optimum isolat penghasil inhibitor protease pada media
marine broth ...............................................................................................
42
13. Aktivitas protease dari bakteri patogen .......................................................
42
14. Aktivitas inhibitor protease (U/ml) maksimum pada konsentrasi NaCl yang
berbeda .......................................................................................................
46
15. Data sepuluh organisme yang memiliki kemiripan terdekat dengan
isolate 6A3 yang dihasilkan oleh program BLAST. No akses merupakan
kode untuk mengakses data urutan nukelotida dari mikroorganisme pada
situs www.ncbi.nlm.nih.gov. ........................................................................
47
16. Perbandingan karakteristik isolat 6A3 dengan genus Chromohalobacter
yang lain ......................................................................................................
48
17. Aktivitas inhibitor protease maksimum pada perlakuan yeast extract (YE)
dan pH berbeda, dibandingkan dengan marine broth .................................
54
18. Aktivitas inhibitor maksimum pada media dengan glukosa 0,05% dan
yeast extract 0,1-0,4%.................................................................................
57
19. Pengendapan dengan ammonim sulfat.......................................................
60
20. Pengendapan dengan aseton .....................................................................
60
21. Peningkatan aktivitas inhibitor protease pada berbagai tahapan pemurnian
64
22. Karakteristik inhibitor protease isolat 6A3 dan beberapa inhibitor protease
lainnya .........................................................................................................
74
23. Perbandingan aktivitas inhibitor protease dari isolat 6A3 dengan PMSF
dan EDTA....................................................................................................
74
24. Penentuan IC50 inhibitor protease ekstrak kasar .........................................
75
25. Bobot molekul inhibitor protease pada setiap tahap pemurnian .................
79
26. Pengamatan tingkat penghambatan pertumbuhan P. aeruginosa inhibitor
protease ......................................................................................................
viii
84
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1. Diagram hubungan simbiotik antara sponge dan mikroorganisme
(Lee et al. 2001) ..........................................................................................
10
2. Protease dan inhibitornya yang ber-BM rendah (Aoyagi dan Takeuchi 1989) 14
3. Jenis spongs yang digunakan untuk pemilahan inhibitor protease .............
33
4. Penghambatan hidrolisa susu skim oleh inhibitor protease yang
diproduksi oleh isolat: A (1A12) dengan waktu inkubasi 48 jam, bakteri uji
S. aureus; B (6A3) dengan waktu inkubasi 72 jam, bakteri uji P. aeruginosa;
C (10A6) dengan waktu inkubasi 72 jam, bakteri uji P. aeruginosa ...........
37
5. Isolat 6A3 menggunakan mikroskop elektron (10.000x) .............................
40
6. Optimasi waktu produksi inhibitor protease oleh isolate (A) 6A3, (B) 10A6,
(C) 9A51, (D) 1A12; -▲- penghambatan, -●- OD, -♦- pH, -■- konsentrasi
protein pada media marine broth (yeast extract 0,2 % w/v)…………………
43
7. Pengaruh konsentrasi NaCl terhadap pertumbuhan bakteri penghasil
inhibitor protease.........................................................................................
45
8. Pengaruh konsentrasi NaCl terhadap aktivitas inhibitor protease................
45
9. Hasil amplifikasi dan gen penyandi 16S rRNA dari isolat 6A3 (+ 1,5 kb)....
46
10. Pohon filogenetik bakteri isolat 6A3 dari spons Xetospongia testudinaria
hasil analisis pengurutan DNA parsial 16S rRNA. Angka pada percabangan
adalah nilai bootstrap dengan 100 kali replikasi...........................................
47
11. Aktivitas inhibitor protease (U/mg), protein, pH pada media glukosa 0,1% (w/v)
special peptone 0,5 %(w/v); yeast extract 1,0 %(w/v); trace element 0,2 %(v/v)
(A) pH awal 7 (G01-172); (B) pH awal 8 (G01-182) ; -▲- penghambatan,
-●- OD, ♦- pH, -■- konsentrasi protein ........................................................
50
12. Aktivitas inhibitor protease (U/mg), protein, pH pada media glukosa
0,1 %(w/v); special peptone 0,5 %(w/v); yeast extract 0,5 %(w/v);
trace element 0,2 %(v/v) (A) pH awal 7 (G01-272 (YE0,5)); (B) pH awal 8
(G01-282 (YE0,5)) -▲- penghambatan, -●- OD, -♦- pH,
-■- konsentrasi protein………………. ..........................................................
51
13. Aktivitas inhibitor protease (U/mg), protein, pH pada media glukosa
0,1 %(w/v); special peptone 0,5 %(w/v); yeast extract 0,1 %(w/v);
trace element 0,2 %(v/v) (A) pH awal 7 (G01-272); (B) pH awal 8
(G01-282; -▲- penghambatan, -●- OD; -♦- pH, -■- konsentrasi protein....
53
14. Aktivitas inhibitor protease (U/mg), protein, pH pada media (MB) (glukosa
0,05 %(w/v); special peptone 0,5 %(w/v); yeast extract 0,2 %(w/v);
NaCl 2 %(w/v), trace element 0,2%(v/v); -▲- penghambatan, -●- OD;
-♦- pH, -■- konsentrasi protein.....................................................................
54
15. Aktivitas inhibitor protease (U/mg) dan optical density (OD), pH awal media
7 (yeast extract 1 % (A); 0,5 % (B); 0,1 % (C)), pada pH awal media 8
(yeast extract 1 % (A); 0,5 % (B); 0,1 % (C)), dan MB+glukosa 0,05%,
-■- OD, ♦- aktivitas inhibitor protease (U/mg) ..............................................
56
ix
Halaman
16. Aktivitas inhibitor protease (U/mg), OD, pH, dan protein pada media
glukosa 0,05%w/v, special peptone 0,5%w/v; trace element 0,2%v/v,
pH 7, yeastextract (A) 0,1%w/v, (B) 0,2%w/v, (C) 0,3%w/v, (D) 0,4%w/v;
-▲- penghambatan, -●- OD; -♦- pH, -■- konsentrasi protein.....................
58
17. (A) Konsentrasi protein setelah pengendapan dengan ammonium sulfat;
(B) Aktivitas inhibitor protease setelah pengendapan ammonium sulfat.....
60
18. (A) Konsentrasi protein setelah pengendapan denganaseton; (B) Aktivitas
inhibitor protease setelah pengendapan aseton .........................................
60
19. Aktivitas spesifik inhibitor pada berbagai bentuk.........................................
61
20. Pemurnian inhibitor protease menggunakan filtrasi gel ..............................
62
21. Pemurnian inhibitor protease menggunakan ion exchange
▲ OD 280 nm; ● aktivitas inhibitor; ♦ gradien NaCl………………………….
62
22. Pengaruh suhu terhadap aktivitas inhibitor protease (A) ekstrak kasar;
(B) hasil pengendapan dengan aseton; (C) hasil filtrasi gel ........................
65
23. Pengaruh pH terhadap aktivitas inhibitor protease (A) ekstrak kasar,
(B) hasil pengendapan aseton, (C) hasil filtrasi gel.....................................
67
24. Stabilitas panas inhibitor protease (A) ekstrak kasar, (B) hasil pengendapan
aseton, (C) hasil filtrasi gel ..........................................................................
68
25. Stabilitas panas inhibitor protease pada 30 oC(A) ekstrak kasar,
(B) hasil pengendapan aseton, (C) hasil filtrasi gel.....................................
69
26. Stabilitas terhadap pH inhibitor protease hasil filtrasi gel...........................
70
27. Variasi substrat inhibitor enzim hasil filtrasi gel...........................................
71
28. Pengaruh jenis ion logam terhadap aktivitas inhibitor .................................
72
29. Pengaruh SDS dan β-mercaptoetanol terhadap aktivitas inhibitor protease
73
30. Penentuan IC50: (A) konsentrasi ekstrak inhibitor 500 µl; (B) konsentrasi
ekstrak inhibitor 1000, 1500, dan 2000 µl; (C) konsentrasi ekstrak inhibitor
2500 µl.........................................................................................................
76
31. Pengaruh konsentrasi protein terhadap aktivitas inhibitor protease............
76
32. Penentuan IC50 inhibitor protease murni .....................................................
76
33. Elektroforesis I: (M) Marker, (1) ekstrak aksar, (2) pengendapan aseton;
(3) freeze drying, (4,5,6) filtrasi gel..............................................................
78
34. Elektroforesis III: (M) Marker, (1-4) pengendapan aseton, (5-7) freeze drying 78
35. Elektroforesis III: (M) Marker, (1-2) filtrasi gel, (3-7) penukar ion ................
78
36. Zimogram inhibitor dengan waktu inkubasi 30 menit ..................................
81
37. Zimogram inhibitor dengan waktu inkubasi 1 jam .......................................
81
38. Zimogram inhibitor dengan waktu inkubasi 1,5 jam ....................................
81
39. Model penghambatan inhibitor protease .....................................................
82
x
40. Pengamatan OD P. aeruginosa yang diberi inhibitor protease
dengan konsentrasi yang berbeda -■- kontrol, -●- perlakuan inhibitor 1,01
µg/ml, -▲- perlakuan inhibitor 1,285 µg/ml .................................................
83
41. Pengamatan kecepatan pertumbuhan sel P. aeruginosa yang diberi inhibitor
protease dengan konsentrasi yang berbeda berbeda -■- kontrol,
-●- perlakuan inhibitor 1,01µg/ml, -▲- perlakuan inhibitor 1,285 µg/ml ......
84
42. Pengamatan kecepatan pertumbuhan sel P. aeruginosa yang diberi inhibitor
protease dengan konsentrasi yang berbeda -■- kontrol, -●- perlakuan
inhibitor 1,01µg/ml, -▲- perlakuan inhibitor 1,285 µg/ml.............................
84
43. Aktivitas protease P. aeruginosa yang diberi inhibitor protease selama
kultivasi berbeda -■- kontrol, -●- perlakuan inhibitor 1,01µg/ml,
-▲- perlakuan inhibitor 1,285 µg/ml .............................................................
xi
85
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1. Komposisi media yang digunakan...............................................................
95
2. Bahan-bahan untuk pengukuran aktivitas protease dan inhibitor protease
95
3. Peta lokasi pengambilan sampel spons ......................................................
97
4. Komposisi gel dan pereaksi untuk elektroforesis, pereaksi yang digunakan
untuk pewarnaan silver dan kurva standar berat molekul penanda (marker)
untuk elektroforesis .....................................................................................
98
5. Kurva standar penentuan protein menurut metode Bradford (1976)...........
100
6. Optimasi assay............................................................................................
101
7. Isolat bakteri laut yang digunakan untuk pemilahan ...................................
102
8. Sekuen dan hasil blast isolat 6A3 ...............................................................
103
9. Contoh publikasi..........................................................................................
113
xii
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Spons yang hidup di laut mempunyai metabolit sekunder yang aktif secara
hayati. Di antara organisme yang hidup di laut, spons mengandung komponen
bioaktif terbesar (Mayer dan Lehmann 2000). Beberapa komponen bioaktif yang
ada pada spons meliputi inhibitor enzim, inhibitor pembelahan sel, antiviral,
antifungi, antiimflamatori, antitumor, dan sitotoksik (Lee et al. 2001).
Hasil
penelitian menunjukkan bahwa bakteri yang berasosiasi dengan spons juga
menghasilkan komponen bioaktif (Webster et al. 2001). Hal ini mungkin karena
jumlah koloni bakteri dan cyanobacteria yang ada di spons, terutama Aplysina
aerophoba, dapat mencapai 40% dari biomasa spons (Ahn et al. 2003).
Mikroorganisme tersebut membentuk suatu simbiotik dengan spons baik di dalam
inti sel (simbiosis intranukleus), di dalam sitoplasama sel tubuh spons (simbiosis
intraseluler), di sisi dalam tubuh spons (endosimbiosis ekstraseluler), dan di bagian
luar tubuh spons (eksosimbiosis ekstraseluler). Hubungan simbiotik ini bisa terjadi
mengingat spons merupakan hewan yang memakan makanan dengan cara filter
feeder, dalam hal ini mikroorganisme dapat menjadi nutrisi bagi spons. Metabolit
yang dihasilkan oleh spons merupakan hasil biosintesis simbionnya sehingga dapat
dimungkinkan bahwa spons mengandung komponen bioaktif yang sama dengan
simbionnya (Lee et al. 2001).
Sebagai contoh Micrococcus sp. menghasilkan
komponen diketopiperazin, yang sebelumnya telah dilaporkan dihasilkan oleh spons
inangnya yaitu Tedania ignis. Simbion bakteri yang lain, yaitu Vibrio sp.
memproduksi bifenil eter bromina, yang juga dihasilkan oleh inangnya yaitu Dysidea
sp. Simbiotik Vibrio sp. menghasilkan komponen bioaktif berupa peptida anti
Bacillus yang juga dihasilkan oleh inangnya yaitu ekstrak spons Hyatella sp. (Stierle
et al. 1988; Elyakov et al. 1991; Oclarit
et al. 1994, diacu dalam Lee et al. 2001).
Flowers et al. (1998) melaporkan bahwa simbion spons Oscillatoria spongeliae,
mengandung senyawa diketopiperazin klorina yang juga dihasilkan oleh inangnya
yaitu Dysidea herbacea .
Foodborne disease yang diperantarai oleh mikroorganisme patogen atau
toksin mikroba merupakan masalah kesehatan masyarakat yang penting. Penyakit
ini oleh WHO didefinisikan sebagai penyakit infeksi atau keracunan toksin alami
yang disebabkan oleh konsumsi makanan atau minuman.
Di Amerika, telah
diestimasi bahwa terdapat berjuta-juta mikroorganisme penyebab foodborne
disease, beberapa ribu di antaranya menyebabkan kematian, terutama pada anak-
2
anak dibawah 5 tahun.
Penyebabnya adalah makanan yang dikonsumsi
terkontaminasi oleh bakteri patogen dan toksin yang dihasilkan oleh
bakteri
patogen (WHO 1997, diacu dalam Johnson 2003). Penyakit tersebut diklasifikasikan menjadi 2 golongan, yaitu infeksi dalam saluran pencernaan dan keracunan
akibat mengkonsumsi racun yang dihasilkan mikroba patogen dalam makanan.
Bakteri patogen dalam menjalankan aksinya menggunakan beberapa
cara, yang dikenal dengan istilah faktor virulensi, di antaranya dengan
mensekresikan protease ke dalam inangnya. Mengingat pentingnya protease dalam
mekanisme terjadinya penyakit maka dalam dasawarsa terakhir ini perhatian
terhadap protease sebagai target senyawa obat bagi penyakit asal bakteri (seperti
pneumonia, kolera, tifus, gonorrhoe), virus (seperti influenza dan HIV), dan malaria
serta kanker, bahkan penyakit degeneratif seperti Alzheimer meningkat pesat
(Suhartono 2000). Saat ini obat-obatan yang beberapa di antaranya mempunyai
mekanisme inhibitor protease telah tersedia luas di pasaran, seperti Elafin (inhibitor
elastase dari kulit manusia), antileuko protease, inhibitor serum ayam, dan inhibitor
protease alkalin dari Streptomyces.
Indonesia mempunyai biodiversitas dan keanekaragaman hayati yang
tinggi, salah satunya adalah spons.
Hampir di tiap wilayah perairan Indonesia
memiliki spons dengan tingkat penutupan dan keragaman yang berbeda. Pulau
Panggang di Kepulauan Seribu, merupakan salah satu pulau yang perairannya
masih cukup baik. Hal ini ditandai dengan penutupan karangnya yang termasuk
kategori sedang sampai baik (34,72-62,86 %) dan indeks keanekaragaman yang
rendah hingga tinggi yaitu berkisar 0,2-2,81 (Mahaza 2003). Oleh karena itu dari
perairan ini, diharapkan akan didapatkan suatu senyawa yang dapat menghambat
aktivitas protease dari bakteri patogen.
Data di atas menunjukkan menunjukkan bahwa sudah cukup banyak
simbion yang teridentifikasi positif menghasilkan komponen bioaktif yang sama
dengan inangnya, namun belum pernah dilaporkan tentang inhibitor protease dari
simbion spons yang berupa protein, meskipun telah dilaporkan bahwa spons
menghasilkan inhibitor protease. Dengan demikian penelitian ini dilakukan untuk
mencari simbion spons yang potensial sebagai penghasil inhibitor terhadap
protease bakteri patogen, sehingga diharapkan akan dapat memutus salah satu
jalan bagi bakteri patogen untuk menyebabkan penyakit.
3
Tujuan
Tujuan penelitian ini meliputi :
(1). memilah mikroba yang berasosiasi dengan spons sebagai penghasil inhibitor
protease;
(2). mengoptimasi kondisi produksi inhibitor protease;
(3). memurnikan inhibitor protease dari mikroba yang berasosiasi dengan spons;
(4). mengkarakterisasi inhibitor protease yang dihasilkan.
Luaran
Luaran penelitian ini adalah mendapatkan mikroba yang berasosiasi dengan
spons sebagai penghasil inhibitor protease, kondisi produksi yang tepat untuk
menghasilkan inhibitor protease, metode yang tepat untuk memurnikan inhibitor
protease, dan juga informasi mengenai karakteristik inhibitor enzim yang
mempunyai aktivitas terhadap protease tertentu.
TINJAUAN PUSTAKA
Keterlibatan Protease dalam Mekanisme Patogenisitas
Protease yang dihasilkan oleh mikroorganisme terlibat baik langsung
maupun tidak langsung dalam mekanisme patogenesis baik pada manusia, hewan,
maupun tanaman.
Beberapa bakteri yang menghasilkan protease penyebab
penyakit, diantaranya Clostridium, Staphylococcus spp, Strepcoccus spp. dan
Listeria
spp.
Clostridium
memproduksi
protease
penyebab
penyakit.
C. befermetans menghasilkan protease logam ekstraseluler bersifat toksin dan
merupakan faktor virulensi (Hase dan Finklestein 1993).
C. perfringens
menghasilkan lambda toksin sebagai penyebab penyakit enteritis (Fu Jin et al.
1996). Staphylococcus menghasilkan protease ekstraseluler jenis protease logam
yang
bersifat
toksin.
Streptococcus
sanguis,
Ureaplasma
urealyticum,
Haemophillus influenza, Streptococcus pneumonia memproduksi IgA ekstraseluler
yang digolongkan protease logam.
Listeria monocytogenes sebagai penyebab
penyakit listeriosis juga menghasilkan protease ekstraseluler (Hase dan Finklestein
1993, Johannson et al. 1999, Killian et al. 1979, Stenberg et al. 1996).
Streptococcus pyogenes menghasilkan protease sistein (streptococcal pyrogenic
exotoxin B, SpeB) yang merupakan faktor virulensi (Gubba et al. 2000).
Bakteri gram negatif yang menghasilkan protease adalah Pseudomonas
spp. dan Legionella spp. (Hase dan Finklestein 1993). P. aeruginosa bersifat
patogen, yaitu menginfeksi inang dengan dengan memproduksi elastase (A dan B)
yang dikarakteristik sebagai eksoenzim. Elastase merupakan protease logam yang
mengandung zink, mempunyai kemampuan mendegradasi substansi hayati penting
elastin, lamiarin, fibrin, kolagen manusia dan immunoglobulin.
Selain itu juga
terdapat protease alkalin dan elastase yang dihasilkan dalam paru-paru pasien
dengan cystic fibrosis dan menyebabkan kerusakan epitel respirasi. P. aeruginosa
juga menghasilkan protease IV yang merupakan faktor virulensi di kornea (Engel
et al . 1998). Protease IV merupakan endoprotease (PrpL) (Wilderman et al. 2001).
L. pneumophila merupakan bakteri fakultatif penyebab pneumonitis dengan
mensekresikan protease logam zink netral (Hase dan Finklestein 1993).
Escherichia coli jenis Enteropatogenik yang diisolasi dari penderita diare di
Indonesia ditemukan menghasilkan protease serin yang aktivitasnya berkorelasi
dengan tingkat infeksi yang ditimbulkan. Protease ini mampu mendegradasi musin
(Budiarti dan Suhartono 1999).
Protease sebagai antigen yang dihasilkan oleh
bakteri ini termasuk kelompok protease serin zink (Nurhayati 2000). Protease ini
5
selain dapat mendegradasi musin, juga mampu mendegradasi laktoferin yang telah
dipotong terlebih dahulu oleh tripsin (Suhardi 2004).
Bakteri lain yang
menghasilkan protease sebagai toksin adalah V. cholera (menghasilkan protease
logam yang membutuhkan zink sebagai kofaktor dan kalsium), Aeromonas
hydrophylla (protease logam), Serratia spp. (menghasilkan protease logam zink
ekstraseluler yang berfungsi sebagai antiinflamatori), dan Erwinia spp. (protease
logam) (Hase dan Finklestein 1993).
Parasit Toxoplasma gondii menghasilkan protease logam netral yang
tergantung ion kalsium. Protease ini berperan dalam degradasi membran sel inang
(Song dan Nam 2003).
Sementara itu Entamoeba hystolytica menghasilkan
proteinase sistein yang terlibat dalam pembentukan abses pada hati (Susanto dan
Supali 1999).
Inhibitor dari Spons
Carrol et al. (2002) menemukan dynosin A dari spons Australia yang
termasuk famili Dysideideae.
Komponen tersebut berperan untuk menghambat
faktor kaskade VIIa dan merupakan inhibitor
protease serin trombin. Inhibitor
tersebut menghambat faktor VIIa dengan konstanta penghambatan (Ki) 10 8 nM
dan trombin dengan konstanta penghambatan (Ki) 452 nM.
Spons dari New Zealand, Tethya ingalii, mengandung protein yang aktif
secara hayati yaitu inhibitor protease tethya (Tethya Protease Inhibitor, TPI),
bersifat toksik terhadap sel terutama sel tumor tertentu, dengan cara melisis sel
darah merah. Komponen tersebut diekstrak dengan menggunakan air (O’Keefe
et al. 1997).
Pada tahun 1998 peneliti yang sama menemukan protein yang
berfungsi sebagai inhibitor HIV, yaitu adociavirin, yang diekstrak dengan
menggunakan air (O’Keefe et al. 1998). Komponen tersebut diekstrak dari spons
Adocia sp. Mekanismenya yaitu mempunyai aktivitas antisitopatik dalam sel CEMSS yang diinfeksi oleh HIV-1 dan 2 dengan nilai EC50 0,4 mM sampai > 400 nM.
Potensi HIV ini tergantung pada tipe sel inang, bersifat sangat sensitif terhadap
kultur makrofag dan sangat resisten terhadap sel darah putih.
Spons yang hidup di laut, Aplysinella shax, menghasilkan inhibitor kitinase,
yaitu psammaplin A, dengan komponen penyusunnya yaitu tirosin bromina.
Komponen tersebut menghambat endokitinase dari Streptomyces dengan IC50
50 µM, menghambat kitinase B dari Serratia marcescens dengan nilai IC50 100 µM.
Dengan demikian, inhibitor tersebut menghambat Serratia marcescens secara
moderat (Tabudravu et al. 2002). Hori et al. (1993) menemukan inhibitor spesifik
terhadap aktomyosin ATPase, yaitu mycalolida-B. Inhibitor tersebut berasal dari
6
spons yang hidup di laut. Inhibitor tersebut menghambat kontraksi yang diinduksi
oleh ion Ca2+ di otot halus yang permiabel. Komponen spons laut, genus Stelletta,
yaitu stellettamida-A, dilaporkan mempunyai kemampuan menghambat kontraksi
yang diinduksi ion K+ dalam otot halus dengan nilai IC50 88 µM (Abe et al. 1997).
Tabel 1 Spons dan inhibitor enzim yang dihasilkan
Jenis sponge
Jenis komponen
Aktivitas biologis
Batzella sp.
Diskorhabdin
Sitotoksik, inhibitor
enzim
Halichondria okadai
Asam okadaic
Inhibitor fosfatase
Haliclona asiris
Osirisin
Inhibitor ATPase
Cacospongia
linteiformis
Petrosia sp.
Siklolinteinon,
Sesterpen
Petrosiasetilen
Inhibitor NO sintase
Plakinastrella sp.
Asam elenat
Inhibitor
topoisomerase II
Coscinoderma
mathewsi
Suvanin
Inhibitor protease
serin
Anthoigmella cf.
raromicrosclera
Piridin1
Inhibitor proteinase
sistein
Spongosorites sp.
Indol
Inhibitor fosfatase
Reniera sarai
Irchinia sp.
Polimer alkilpiridinium
Heksaprenilhidrokuinon
Theonella sp.
Peptida
Antikolinesterase
Inhibitor HIV reverse
transkriptase
Inhibitor protease
serin
Xetospongia exigua
Poliketida
halenakuinon
Sesterpen
Manoalida
Luffariella variabilis
Inhibitor ATPase
Inhibitor tirosin
kinase
Inhibitor fosfolipase
Referensi
Gunasekera et al.
(1999), diacu dalam
Lee et al. (2001)
Bialojan dan Takai
(1988)
Shin et al. (1998a),
diacu dalam Lee et
al. (2001)
D’acquisto et al.
(2000)
Seo et al. (1998),
diacu dalam Lee et
al. (2001)
Juagdan
et
al.
(1995), diacu dalam
Lee et al. (2001)
Kimura
et
al.
(1998), diacu dalam
Mayer
dan
Lehmann (2000)
Matsunaga et al.
(1998), diacu dalam
Mayer
dan
Lehmann (2000)
Capon
et
al.
(1998b),
diacu
dalam Mayer dan
Lehmann (2000)
Sepcic et al. (1997)
Loya et al. (1997)
Nakao et al. (1998),
diacu dalam Mayer
dan
Lehmann
(2000)
Haefner (2003)
Haefner (2003)
Tsukamoto et al. (2005) melaporkan bahwa spons laut dari genus Mycale
menghasilkan inhibitor proteasom baru, yaitu secomycalolida A.
tersebut mempunyai nilai IC50 11-45 µg/ml.
Komponen
Proteasom tersebut memainkan
peranan penting untuk mendegradasi protein secara selektif dan mengatur kejadian
berbagai sel termasuk pertumbuhan sel dan apoptosis. Dengan demikian inhibitor
7
proteasom mempunyai aktivitas antitumor pada berbagai sel tumor yang resisten
terhadap kemoterapi konvensional. Inhibitor enzim dari jenis spons lain disajikan
pada Tabel 1.
Inhibitor Protease dari Mikroorganisme
Serratia marcescens menghasilkan protein inhibitor protease logam yang
dikenal dengan nama SmaPI. Inhibitor tersebut dihasilkan dalam jumlah kecil
menunjukkan penghambatan terhadap protease logam S. marcescens yang
mempunyai bobot molekul 50 kDa. Protein tersebut berlokasi di bagian periplasma
sel dalam suhu pertumbuhan sel 25
membawa plasmid PSP2
o
C. Rekombinan S. marcescens yang
yang mengkodekan SMP dan SmaPI menghasilkan
SmaPI pada suhu pertumbuhan sel 25 oC. Namun pada suhu pertumbuhan 37 oC
SmaPI justru dihasilkan secara ekstraseluler. SmaPI tersebut mempunyai pI sekitar
10,0, dan merupakan protein monomer dengan bobot molekul 10.000 Dalton.
SmaPI stabil dalam air rebusan selama 30 menit dan mempunyai penghambatan
yang spesifik terhadap protease logam yang berasal dari S. marcescens (Kim et al.
1995).
Inhibitor protease juga dihasilkan oleh Gliocladium sp. yang disebut
dengan inhibitor proteinase sistein, TMC-52A-D. Berdasarkan hasil analisis
spektrofotometer dan degradasi kimia menunjukkan bahwa TMC-52A-D merupakan
peptida epoksisuksinil. Inhibitor tersebut kuat menghambat protease sistein,
terutama katepsin L dengan IC50 pada konsentrasi 13 nM, 10 nM, dan 6 nM (Isshiki
et al. 1998).
Saruno et al. (1980) menemukan inhibitor nuklease dari Monascus
purpureus. Adapun aktivitasnya mereduksi nuklease monascus dan nuklease P1
dengan substrat RNA atau DNA yang didenaturasi. Model aksi inhibitor itu adalah
penghambatan non kompetitif sehingga dinamakan inhibitor NMP. Murao et al.
(1982) melakukan isolasi inhibitor proteinase logam yang dihasilkan oleh mikroba
yaitu Streptomyces rishiriensis. Inhibitor tersebut dikenal dengan nama Fungal
Metallo-Proteinase Inhibitor (FMPI). Inhibitor tersebut menunjukkan aktivitas yang
baik pada proteinase logam dari Aspergillus oryzae dan mempunyai aktivitas
sedang terhadap mikroba lainnya. FMPI mempunyai bobot molekul yang rendah
dan stabil pada pH alkali (pH > 11).
Inhibitor protease juga telah ditemukan dari mikroba asal laut seperti yang
telah dilaporkan oleh Imada et al. (1985a,b,c) dan Imada (2000). Pencarian inhibitor
dari mikroba laut diawali dengan pemilahan bakteri penghasil inhibitor protease
menggunakan lapisan ganda kasein. Seluruh strain penghasil inhibitor bersifat
8
aerob, mempunyai flagella, gram negatif, mempunyai kandungan G+C yang rendah
pada DNA-nya. Mikroba tersebut membutuhkan NaCl untuk pertumbuhannya.
Seluruh strain menghidrolisis kasein, DNA, gelatin, dan pati. Berdasarkan hasil
identifikasi menunjukkan bahwa mikroba tersebut adalah Alteromonas sp.. Strain
B-10-31 adalah untuk membedakan dari 2 strain lainnya (Imada et al, 1985a;
Imada, 2000).
Imada et al. (1985b) dan Imada (2000) menemukan marinostatin, suatu
inhibitor yang dihasilkan dari Alteromonas sp. B-10-31. Inhibitor tersebut dihasilkan
secara optimal bila bakteri penghasilnya ditumbuhkan dalam medium yang
optimum. Sumber nitrogen dan karbon yang optimum untuk tujuan tersebut adalah
0,6 % polipepton dan 0,05 % glukosa. Produksi maksimum dihasilka
PROTEASE DARI BAKTERI YANG BERASOSIASI
DENGAN SPONS ASAL PERAIRAN
PULAU PANGGANG, KEPULAUAN SERIBU
TATI NURHAYATI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI
DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi yang berjudul Pemilahan dan
Karakterisasi Inhibitor Protease dari Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons Asal
Perairan Pulau Panggang, Kepulauan Seribu adalah benar merupakan hasil karya
saya sendiri dan belum pernah diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan
tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Bogor, Agustus 2006
Tati Nurhayati
NIM. F 226010011
ABSTRACT
TATI NURHAYATI. Screening and Characterization of Protease Inhibitor from
Bacteria-Associated with Sponge, from Pulau Panggang Waters, Seribu Islans.
Supervised by MAGGY T. SUHARTONO, LILIS NURAIDA, and SRI BUDIARTI
POERWANTO.
The important causing cause foodborne diseases are Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Listeria spp. and Pseudomonas aeruginosa. Protease
produced by these bacteria are involved in the molecular mechanisms of the
diseases. Therefore, there has been rapidly increase concern on proteases as
medical target for bacterium diseases. Various sponges has been reported to
produce protease inhibitor which could inhibit protease activity of pathogenic
bacteria. The previous research showed that bacteria-associated with sponge could
produce bioactive compound similar with their host. Therefore, there is a possibility
that the bacteria also produce protease inhibitor. The purposes of this research
were to screen potential microbes-associated with sponge as producer of protease
inhibitor, to optimize conditions for the inhibitor production, to purify protease
inhibitor from the selected microbe and to study the characteristics of the protease
inhibitor. Among the isolates, Chromohalobacter sp. 6A3 was identified as the most
potential protease inhibitor producer. Identification of the isolate was based on
biochemical characteristics of the isolate and sequence of the gene encoding 16S
rRNA. The optimum medium for producing protease inhibitor consisted of special
peptone 0.5 % (w/v), yeast extract 0.1 % (w/v), trace element 0.2 % (v/v), NaCl 2 %
(w/v), glucose 0.05 % (w/v), and incubation was conducted at 30 oC for 12 hours at
150 rpm. The protein was extracted by 30 % (v/v) acetone, purified by gel filtration
(Sephadex G-75) and finally, purified by anion exchanger (Sephadex A-50). The
molecular weight of the purified protease inhibitor after gel filtration was estimated
as 21,31 kDa and 17,05 kDa, but anion exchanger gave protein with estimated
molecular weight of 21,31 kDa The optimum temperature and pH were 30 oC and 5
respectively. The protease inhibitor could resist heating at 40 oC for 10 minutes
(crude extract and acetone precipitated), and 30 oC for 10 minutes (purified). The
inhibitor incubated at 30 oC, pH 5, was still active until 8 hours (crude extract), 6
hours (acetone precipitated), and 3 hours (purified). The purified enzyme inhibitor
was still active when incubated at pH from 5 to 6 for 1 hour. The most susceptible
substrate (enzyme) for the inhibitor was protease from P. aeruginosa. The protease
inhibitor was inhibited by metal ions except Na+ 1mM. The inhibitor was activated 2
fold by SDS 5 mM. IC 50 of the protease inhibitor was 24.2 nM (crude extract) and
3.48 nM (purified) . The protease inhibitor inhibited the enzyme uncompetitively.
Keywords: characteristics, marine bacteria, protease inhibitor, screening, sponge
ABSTRAK
TATI NURHAYATI. Pemilahan dan Karakterisasi Inhibitor Protease dari Bakteri
yang Berasosiasi dengan Spons, asal Perairan Pulau Panggang, Kepulauan Seribu.
Dibimbing oleh MAGGY T. SUHARTONO, LILIS NURAIDA, DAN SRI BUDIARTI
POERWANTO.
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Listeria sp., dan Pseudomonas
aeruginosa merupakan bakteri patogen yang penting sebagai penyebab foodborne
disease. Bakteri ini menghasilkan protease yang terlibat dalam mekanisme
molekular penyebab penyakit. Oleh karena itu, saat ini protease menjadi mendapat
perhatian penting sebagai target pengobatan penyakit yang disebabkan oleh
bakteri. Berbagai spons telah dilaporkan menghasilkan inhibitor protease yang
dihasilkan oleh bakteri patogen. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa
bakteri yang berasosiasi dengan spons dapat menghasilkan komponen bioaktif
yang mirip dengan inangnya. Oleh karena itu, diduga bakteri yang berasosiasi
dengan spons juga menghasilkan inhibitor protease. Tujuan penelitian ini adalah
memilah bakteri yang berasosiasi dengan spons sebagai penghasil inhibitor
protease yang potensial, mengoptimasi kondisi produksi inhibitor protease,
memurnikan inhbitor protease asal bakteri yang terpilih, serta mempelajari
karakteristik inhibitor protease. Diantara isolat yang positif menghasilkan inhibitor
protease berdasarkan hasil pemilahan, Chromohalobacter sp. 6A3 merupakan
bakteri yang paling potensial sebagai penghasil inhibitor protease. Isolat tersebut
diidentifikasi melalui karakteristik biokimiawi dan sekuens gen yang mengkodekan
16S rRNA. Medium yang optimum untuk menghasilkan inhibitor protease terdiri
atas special peptone 0,5 % (w/v), yeast extract 0,1 % (w/v), trace element 0,2 %
(v/v), NaCl 2 % (w/v), glukosa 0,05 % (w/v), dan inkubasi dilakukan pada suhu
30 oC selama 12 jam pada kecepatan 150 rpm. Protein tersebut diekstrak
menggunakan aseton 30 % (v/v), dimurnikan dengan filtrasi gel (Sephadex G-75),
dan terakhir dimurnikan menggunakan penukar ion (Sephadex A-50). Berat molekul
inhibitor protease setelah dimurnikan dengan filtrasi gel, yaitu 21,31 kDa dan 17,05
kDa, namun setelah dimurnikan dengan penukar ion, sekitar 21,31 kDa. Suhu dan
pH optimum inhibitor protease adalah 30 oC dan 5. Inhibitor protease stabil pada
inkubasi 40 oC selama 10 menit (ekstrak kasar dan hasil pengendapan aseton), dan
30 oC selama 10 menit (murni). Inhibitor protease yang diikubasi pada kondisi
optimum (suhu 30 oC, pH 5) masih stabil selama 8 jam (ekstrak kasar), 6 jam (hasil
pengendapan aseton), dan 3 jam (murni). Inhibitor murni masih aktif ketika
diinkubasi pada pH 5-6 selama 1 jam. Substrat yang paling cocok untuk inhibitor
protease tersebut adalah protease dari Pseudomonas aeruginosa.
Inhibitor
protease dihambat oleh ion-ion logam kecuali Na+ 1 mM, ditingkatkan aktivitasnya
oleh SDS hinga 2 kali lipat. IC50 inhibitor protease adalah 24,2 nM (ekstrak kasar)
dan 3,48 mM (murni). Pola penghambatan inhibitor tersebut adalah uncompetitive.
Katakunci: karakteristik, bakteri laut, inhibitor protease, pemilahan, spons
© Hak cipta milik Institut Pertanian Bogor tahun 2006
Hak cipta dilindungi
Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis dari
Institut Pertanian Bogor, sebagian atau seluruhnya dalam
bentuk apapun, baik cetak, fotokopi, mikrofilm, dan sebagainya
PEMILAHAN DAN KARAKTERISASI INHIBITOR
PROTEASE DARI BAKTERI YANG BERASOSIASI
DENGAN SPONS ASAL PERAIRAN
PULAU PANGGANG, KEPULAUAN SERIBU
TATI NURHAYATI
Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor
pada Program Studi Ilmu Pangan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
Judul
:
Nama Mahasiswa
NIM
:
:
Pemilahan dan Karakterisasi Inhibitor Protease dari
Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons Asal Perairan
Pulau Panggang, Kepulauan Seribu
Tati Nurhayati
F 226010011
Disetujui
Komisi Pembimbing
Prof. Dr. Ir. Maggy Thenawidjaja Suhartono
Ketua
Dr. Ir. Lilis Nuraida
Anggota
Dr.dr. Sri Budiarti Poerwanto
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Ilmu Pangan
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Betty Sri Laksmi Jenie, M.S
Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S
Tanggal Ujian: 27 Juni 2006
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Segala puji bagi Allah swt yang telah melimpahkan rahmat dan hidayahNya sehingga penulis dapat menyelesaikan disertasi yang berjudul Pemilahan dan
Karakterisasi Inhibitor Protease dari Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons Asal
Perairan Pulau Panggang, Kepulauan Seribu. Disertasi ini dibuat sebagai salah
satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Program Studi Ilmu Pangan,
Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Selama menjalani perkuliahan hingga terselesaikannya Disertasi ini,
tentunya banyak pihak yang telah membantu penulis.
Oleh karena itu dengan
segala ketulusan hati penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya
kepada:
Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono selaku ketua komisi pembimbing yang
telah memberikan ilmu, arahan dan masukan selama penulis melaksanakan kuliah,
penelitian, hingga terselesaikannya disertasi ini.
Beliau pulalah yang telah
membuka wawasan penulis dan akhirnya mengarahkan penulis untuk membuat
proposal penelitian Hibah Bersaing XI untuk keperluan penyelesaian program S3.
Beliau juga telah mengijinkan penulis untuk melakukan penelitian di Laboratorium
Mikrobiologi dan Biokimia, Pusat Penelitian Bioteknologi dan Biologi, IPB.
Dr. Ir. Lilis Nuraida selaku anggota komisi pembimbing yang telah banyak
mengarahkan penulis selama penelitian dan penyusunan disertasi.
Dr. dr. Sri Budiarti Poerwanto selaku anggota komisi pembimbing yang
telah banyak mengarahkan penulis selama penelitian dan penulisan disertasi.
Beliau juga telah mengijinkan penulis untuk penelitian di Laboratorium Bioteknologi
Hewan dan Biomedis, Pusat Penelitian Bioteknologi dan Biologi, IPB.
Berkat
rekomendasi beliau penulis memperoleh isolat bakteri patogen dari Rumah Sakit
Pusat Pertamina. Beliau juga selalu memberikan semangat kepada penulis saat
penulis sedang ragu untuk melangkah.
Dr. Ir. Sugiono, MAppSc yang telah menyediakan waktu untuk menguji
penulis saat ujian Preliminary. Prof. Dr. Ir. Suminar Setiati Achmadi yang telah
bersedia menguji penulis pada Sidang Tertutup.
Dr. Ir. Linawati Hardjito dan
Debbie S. Retnoningrum, Ph.D selaku Penguji Luar Komisi pada Sidang Terbuka.
Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc selaku Ketua Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan
yang telah hadir pada Sidang Tertutup dan Sidang Terbuka.
Dr. Ir. Mita Wahyuni selaku kolega di Departemen Teknologi Hasil
Perairan yang telah memperkenalkan penulis kepada Dr. Chiaki Imada di Tokyo
University of Fisheries dan atas rekomendasinyalah penulis dapat menyelesaikan
analisis 16S rRNA di Jepang melalui program JSPS.
Ir. Bustami Ibrahim, MSc yang telah memberikan kesempatan bagi penulis
untuk melanjutkan S3 di IPB.
Saat itu beliau menjabat sebagai Ketua Jurusan
Teknologi Hasil Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, IPB.
Dekan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, saat itu dijabat oleh Dr. Ir.
Enang Harris, MS; juga kepada Rektor IPB yang saat itu dijabat oleh Prof. Dr. Ir.
Aman Wirahadikusuma, MSc yang telah memberikan kesempatan kepada penulis
untuk melanjutkan program S3.
Seluruh staf pengajar Program Studi Ilmu Pangan yang telah banyak
memberikan ilmu kepada penulis selama menjalani perkuliahan.
Dikti, yang telah memberikan Beasiswa Program Pascasarjana (BPPS),
juga memberikan dana penelitian melalui program Hibah Bersaing XI.
Adikku tercinta, Fazria Amalia, S.Si, yang selalu setia membantu penulis
melaksanakan penelitian hingga akhir.
Semua laboran di Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi,
serta
laboran
di
Seafast
Center
yang
telah
membantu
penulis
selama
melaksanakan penelitian.
Suamiku tercinta Ir. Muryanto MP dan juga ananda Nurma Murti Hapsari
atas kasih sayang dan doa, serta keikhlasannya untuk
selalu mendorong dan
memberi semangat kepada penulis untuk menyelesaikan kuliah S3.
Kedua orang tua penulis (Bapak Abdul Syahri dan Sutarsih (Alm)) beserta
keluarga besar Abd. Syahri, dan keluarga besar Daromi Nanto Miharjo yang
senantiasa memberikan doa dan dukungan kepada penulis
Dr. Ir. Linawati Hardjito, MSc selaku Ketua Departemen THP yang
senantiasa mendorong penulis untuk menyelesaikan kuliah dan juga rekan-rekan
staf Departemen THP atas kerjasamanya selama ini sehingga penulis dapat
menyelesaikan kuliah S3.
Semua rekan-rekan di IPN, khususnya Bu Asriani dan Bu Rifda, atas
kerjasamanya selama ini.
Akhir kata penulis mohon maaf atas segala kekurangan, semoga disertasi
ini bermaanfat bagi pembaca dan memberikan ide bagi pembaca untuk melanjutkan
penelitian ini, sehingga akan didapatkan hasil yang lebih sempurna.
Bogor, Agustus 2006
Tati Nurhayati
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta, 7 Agustus 1970 sebagai anak keempat dari
tujuh bersaudara dengan ayah bernama Abdul Syahri dan ibu bernama Sutarsih
(Alm). Pada tahun 1998 penulis menikah dengan Ir. Muryanto MP dan dikarunia
seorang anak yang bernama Nurma Murti Hapsari (1999).
Sejak tahun 1996
penulis bekerja sebagai staf pengajar pada Jurusan Pengolahan Hasil Perikanan,
yang sekarang namanya berganti menjadi Departemen Teknologi Hasil Perairan.
Sejak Bulan Oktober 2005 penulis mendapat amanah untuk menjadi Sekretaris
pada Departemen Teknologi Hasil Perairan.
Penulis menyelesaikan program Sarjana pada Jurusan Pengolahan Hasil
Perikanan, Fakultas Perikanan tahun 1995. Dua tahun kemudian penulis
melanjutkan pendidikan pada Program Pascasarjana (S2) Institut Pertanian Bogor,
Program Studi Ilmu Pangan dan lulus tahun 2000. Pada tahun 2001 penulis
melanjutkan ke Program Doktor pada Program Studi yang sama, dengan Sub
Program Studi Bioteknologi Pangan, di Institut Pertanian Bogor.
Beasiswa
diperoleh penulis dari Beasiswa Program Pascasarjana (BPPS) dari tahun 20012004. Dana Penelitian diperoleh dari Dikti, Depdiknas, melalui Hibah Bersaing XI
tahun 2003-2004.
Selama
mengikuti
pendidikan
S3,
penulis
aktif
sebagai
angota
Perhimpunan Mikrobiologi Indonesia (PERMI) dan sebagai dewan redaksi Buletin
Teknologi Hasil Perikanan.
Penulis telah menyajikan makalah yang merupakan
bagian dari disertasi dalam beberapa kegiatan ilmiah, seperti pada Seminar
Nasional Permi tahun 2003, Seminar Nasional dan Kongres PATPI tahun 2004,
Seminar Nasional Hibah IX tahun 2004, Asean Food Conference tahun 2005, serta
International Seminar and Workshop Marine Biodiversity and their Potential for
Developing Bio-Pharmaceutical Industry in Indonesia tahun 2006. Selain itu telah
mempublikasikan artikel yang juga merupakan bagian Disertasi dalam Buletin
Teknologi Hasil Perikanan Volume VII tahun 2004 dan Volume VIII tahun 2005,
serta pada Jurnal Hayati Volume XIII No. 2 Bulan Juni tahun 2006.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL...................................................................................................
viii
DAFTAR GAMBAR ..............................................................................................
ix
DAFTAR LAMPIRAN............................................................................................
xii
PENDAHULUAN ..................................................................................................
1
Latar Belakang ...............................................................................................
1
Tujuan ............................................................................................................
3
Luaran ............................................................................................................
3
TINJAUAN PUSTAKA ..........................................................................................
4
Keterlibatan protease dalam Mekanisme Patogenisitas ................................
Inhibitor dari Spons ........................................................................................
Inhibitor Protease dari Mikroorganisme..........................................................
Hubungan antara Spons dan Bakteri yang Bersimbiosis ...............................
Mikroorganisme yang Bersimbiose dengan Spons ........................................
Penggolongan Inhibitor Enzim .......................................................................
Penggolongan inhibitor enzim berdasarkan mekanisme kerjanya........
Penggolongan inhibitor enzim berdasarkan spesifisitas kerjanya..........
Pemurnian Inhibitor Enzim .............................................................................
Ekstraksi inhibitor enzim........................................................................
Fraksinasi menggunakan kolom kromatografi.......................................
4
5
7
9
10
12
12
13
14
15
15
METODOLOGI .....................................................................................................
17
Waktu dan Tempat Penelitian ........................................................................
17
Bahan dan Alat...............................................................................................
17
Metode Penelitian...........................................................................................
18
Penelitian tahap I isolasi dan identifikasi bakteri serta pemilahan
bakteri yang berasosiasi dengan spons sebagai penghasil
inhibitor protease ...................................................................................
Penelitian tahap II optimasi media yang digunakan untuk produksi
inhibitor protease ...................................................................................
Penelitian tahap III pemurnian inhibitor protease ..................................
Penelitian tahap IV karakterisasi inhibitor protease..............................
24
25
26
Analisis........ ...................................................................................................
29
Aktivitas protease (Walter 1984) ...........................................................
Konsentrasi protein (Metode Bradford dalam Hammond dan Kruger
1988) ...................................................................................................
Analisis inhibitor protease (Imada et al. 1985c).....................................
29
29
30
Analisis Data ..................................................................................................
31
HASIL DAN PEMBAHASAN ..........................................................................
32
Penelitian Tahap I Isolasi dan Identifikasi Bakteri serta Pemilahan
Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons sebagai Penghasil Inhibitor
Protease
...................................................................................................
32
vi
20
Halaman
Pengumpulan spons..............................................................................
Pemilahan dan pemurnian bakteri yang berasosiasi dengan
spons ...................................................................................................
Pemilahan bakteri penghasil inhibitor protease.....................................
Karakterisasi bakteri penghasil inhibitor protease..................................
Penentuan bakteri penghasil inhibitor protease tertinggi dalam
media marine broth................................................................................
Identifikasi bakteri penghasil inhibitor protease tertinggi .......................
32
41
46
Penelitian Tahap II Optimasi Media yang Digunakan untuk Produksi
Inhibitor Protease ...........................................................................................
49
34
36
38
Penelitian Tahap III Pemurnian Inhibitor Protease…………………………….. 59
Ekstraksi inhibitor protease …………………………………………………
Dialisis dan pengeringan beku ..............................................................
Pemurnian inhibitor protease dengan kolom kromatografi ....................
Produksi inhibitor protease ....................................................................
Penelitian Tahap IV Karakterisasi Inhibitor Protease .....................................
59
61
62
63
64
Penentuan suhu optimum inhibitor protease ......................................... 65
Penentuan pH optimum......................................................................... 66
Stabilitas terhadap panas ...................................................................... 67
Stabilitas terhadap panas pada kondisi optimum .................................. 69
Stabilitas terhadap pH ........................................................................... 70
Pengaruh berbagai substrat terhadap aktivitas inhibitor protease ........ 70
Pengaruh ion logam .............................................................................. 71
Pengaruh SDS, mercaptoetanol, dan inhibitor ...................................... 72
Penentuan IC50 ...................................................................................... 74
Penentuan bobot molekul...................................................................... 77
Zimogram .............................................................................................. 80
Model penghambatan............................................................................ 82
Mekanisme penghambatan ................................................................... 83
KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................................
87
Kesimpulan ...................................................................................................
Saran
...................................................................................................
87
88
DAFTAR PUSTAKA .............................................................................................
89
LAMPIRAN
95
...................................................................................................
vii
DAFTAR TABEL
Halaman
1. Spons dan inhibitor enzim yang dihasilkan .................................................
6
2. Sponge dan mikroorganisme simbion penghasil produk alami ...................
12
3. Metode kromatografi untuk fraksinasi protein .............................................
15
4. Metode ekstraksi dan pemurnian inhibitor enzim dari mikroorganisme ......
16
5. Tahapan penelitian......................................................................................
18
6. Jenis dan nomor akses bakteri yang digunakan untuk pembuatan
pohon filogenetik .........................................................................................
24
7. Prosedur untuk mengukur aktivitas protease ..............................................
29
8. Prosedur pengukuran aktivitas inhibitor protease .......................................
31
9. Jumlah bakteri yang tumbuh dari masing-masing spons ............................
34
10. Hasil pemilahan bakteri yang potensial sebagai penghasil inhibitor protease 38
11. Karakteristik taksonomi bakteri penghasil inhibitor protease ......................
39
12. Waktu produksi optimum isolat penghasil inhibitor protease pada media
marine broth ...............................................................................................
42
13. Aktivitas protease dari bakteri patogen .......................................................
42
14. Aktivitas inhibitor protease (U/ml) maksimum pada konsentrasi NaCl yang
berbeda .......................................................................................................
46
15. Data sepuluh organisme yang memiliki kemiripan terdekat dengan
isolate 6A3 yang dihasilkan oleh program BLAST. No akses merupakan
kode untuk mengakses data urutan nukelotida dari mikroorganisme pada
situs www.ncbi.nlm.nih.gov. ........................................................................
47
16. Perbandingan karakteristik isolat 6A3 dengan genus Chromohalobacter
yang lain ......................................................................................................
48
17. Aktivitas inhibitor protease maksimum pada perlakuan yeast extract (YE)
dan pH berbeda, dibandingkan dengan marine broth .................................
54
18. Aktivitas inhibitor maksimum pada media dengan glukosa 0,05% dan
yeast extract 0,1-0,4%.................................................................................
57
19. Pengendapan dengan ammonim sulfat.......................................................
60
20. Pengendapan dengan aseton .....................................................................
60
21. Peningkatan aktivitas inhibitor protease pada berbagai tahapan pemurnian
64
22. Karakteristik inhibitor protease isolat 6A3 dan beberapa inhibitor protease
lainnya .........................................................................................................
74
23. Perbandingan aktivitas inhibitor protease dari isolat 6A3 dengan PMSF
dan EDTA....................................................................................................
74
24. Penentuan IC50 inhibitor protease ekstrak kasar .........................................
75
25. Bobot molekul inhibitor protease pada setiap tahap pemurnian .................
79
26. Pengamatan tingkat penghambatan pertumbuhan P. aeruginosa inhibitor
protease ......................................................................................................
viii
84
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1. Diagram hubungan simbiotik antara sponge dan mikroorganisme
(Lee et al. 2001) ..........................................................................................
10
2. Protease dan inhibitornya yang ber-BM rendah (Aoyagi dan Takeuchi 1989) 14
3. Jenis spongs yang digunakan untuk pemilahan inhibitor protease .............
33
4. Penghambatan hidrolisa susu skim oleh inhibitor protease yang
diproduksi oleh isolat: A (1A12) dengan waktu inkubasi 48 jam, bakteri uji
S. aureus; B (6A3) dengan waktu inkubasi 72 jam, bakteri uji P. aeruginosa;
C (10A6) dengan waktu inkubasi 72 jam, bakteri uji P. aeruginosa ...........
37
5. Isolat 6A3 menggunakan mikroskop elektron (10.000x) .............................
40
6. Optimasi waktu produksi inhibitor protease oleh isolate (A) 6A3, (B) 10A6,
(C) 9A51, (D) 1A12; -▲- penghambatan, -●- OD, -♦- pH, -■- konsentrasi
protein pada media marine broth (yeast extract 0,2 % w/v)…………………
43
7. Pengaruh konsentrasi NaCl terhadap pertumbuhan bakteri penghasil
inhibitor protease.........................................................................................
45
8. Pengaruh konsentrasi NaCl terhadap aktivitas inhibitor protease................
45
9. Hasil amplifikasi dan gen penyandi 16S rRNA dari isolat 6A3 (+ 1,5 kb)....
46
10. Pohon filogenetik bakteri isolat 6A3 dari spons Xetospongia testudinaria
hasil analisis pengurutan DNA parsial 16S rRNA. Angka pada percabangan
adalah nilai bootstrap dengan 100 kali replikasi...........................................
47
11. Aktivitas inhibitor protease (U/mg), protein, pH pada media glukosa 0,1% (w/v)
special peptone 0,5 %(w/v); yeast extract 1,0 %(w/v); trace element 0,2 %(v/v)
(A) pH awal 7 (G01-172); (B) pH awal 8 (G01-182) ; -▲- penghambatan,
-●- OD, ♦- pH, -■- konsentrasi protein ........................................................
50
12. Aktivitas inhibitor protease (U/mg), protein, pH pada media glukosa
0,1 %(w/v); special peptone 0,5 %(w/v); yeast extract 0,5 %(w/v);
trace element 0,2 %(v/v) (A) pH awal 7 (G01-272 (YE0,5)); (B) pH awal 8
(G01-282 (YE0,5)) -▲- penghambatan, -●- OD, -♦- pH,
-■- konsentrasi protein………………. ..........................................................
51
13. Aktivitas inhibitor protease (U/mg), protein, pH pada media glukosa
0,1 %(w/v); special peptone 0,5 %(w/v); yeast extract 0,1 %(w/v);
trace element 0,2 %(v/v) (A) pH awal 7 (G01-272); (B) pH awal 8
(G01-282; -▲- penghambatan, -●- OD; -♦- pH, -■- konsentrasi protein....
53
14. Aktivitas inhibitor protease (U/mg), protein, pH pada media (MB) (glukosa
0,05 %(w/v); special peptone 0,5 %(w/v); yeast extract 0,2 %(w/v);
NaCl 2 %(w/v), trace element 0,2%(v/v); -▲- penghambatan, -●- OD;
-♦- pH, -■- konsentrasi protein.....................................................................
54
15. Aktivitas inhibitor protease (U/mg) dan optical density (OD), pH awal media
7 (yeast extract 1 % (A); 0,5 % (B); 0,1 % (C)), pada pH awal media 8
(yeast extract 1 % (A); 0,5 % (B); 0,1 % (C)), dan MB+glukosa 0,05%,
-■- OD, ♦- aktivitas inhibitor protease (U/mg) ..............................................
56
ix
Halaman
16. Aktivitas inhibitor protease (U/mg), OD, pH, dan protein pada media
glukosa 0,05%w/v, special peptone 0,5%w/v; trace element 0,2%v/v,
pH 7, yeastextract (A) 0,1%w/v, (B) 0,2%w/v, (C) 0,3%w/v, (D) 0,4%w/v;
-▲- penghambatan, -●- OD; -♦- pH, -■- konsentrasi protein.....................
58
17. (A) Konsentrasi protein setelah pengendapan dengan ammonium sulfat;
(B) Aktivitas inhibitor protease setelah pengendapan ammonium sulfat.....
60
18. (A) Konsentrasi protein setelah pengendapan denganaseton; (B) Aktivitas
inhibitor protease setelah pengendapan aseton .........................................
60
19. Aktivitas spesifik inhibitor pada berbagai bentuk.........................................
61
20. Pemurnian inhibitor protease menggunakan filtrasi gel ..............................
62
21. Pemurnian inhibitor protease menggunakan ion exchange
▲ OD 280 nm; ● aktivitas inhibitor; ♦ gradien NaCl………………………….
62
22. Pengaruh suhu terhadap aktivitas inhibitor protease (A) ekstrak kasar;
(B) hasil pengendapan dengan aseton; (C) hasil filtrasi gel ........................
65
23. Pengaruh pH terhadap aktivitas inhibitor protease (A) ekstrak kasar,
(B) hasil pengendapan aseton, (C) hasil filtrasi gel.....................................
67
24. Stabilitas panas inhibitor protease (A) ekstrak kasar, (B) hasil pengendapan
aseton, (C) hasil filtrasi gel ..........................................................................
68
25. Stabilitas panas inhibitor protease pada 30 oC(A) ekstrak kasar,
(B) hasil pengendapan aseton, (C) hasil filtrasi gel.....................................
69
26. Stabilitas terhadap pH inhibitor protease hasil filtrasi gel...........................
70
27. Variasi substrat inhibitor enzim hasil filtrasi gel...........................................
71
28. Pengaruh jenis ion logam terhadap aktivitas inhibitor .................................
72
29. Pengaruh SDS dan β-mercaptoetanol terhadap aktivitas inhibitor protease
73
30. Penentuan IC50: (A) konsentrasi ekstrak inhibitor 500 µl; (B) konsentrasi
ekstrak inhibitor 1000, 1500, dan 2000 µl; (C) konsentrasi ekstrak inhibitor
2500 µl.........................................................................................................
76
31. Pengaruh konsentrasi protein terhadap aktivitas inhibitor protease............
76
32. Penentuan IC50 inhibitor protease murni .....................................................
76
33. Elektroforesis I: (M) Marker, (1) ekstrak aksar, (2) pengendapan aseton;
(3) freeze drying, (4,5,6) filtrasi gel..............................................................
78
34. Elektroforesis III: (M) Marker, (1-4) pengendapan aseton, (5-7) freeze drying 78
35. Elektroforesis III: (M) Marker, (1-2) filtrasi gel, (3-7) penukar ion ................
78
36. Zimogram inhibitor dengan waktu inkubasi 30 menit ..................................
81
37. Zimogram inhibitor dengan waktu inkubasi 1 jam .......................................
81
38. Zimogram inhibitor dengan waktu inkubasi 1,5 jam ....................................
81
39. Model penghambatan inhibitor protease .....................................................
82
x
40. Pengamatan OD P. aeruginosa yang diberi inhibitor protease
dengan konsentrasi yang berbeda -■- kontrol, -●- perlakuan inhibitor 1,01
µg/ml, -▲- perlakuan inhibitor 1,285 µg/ml .................................................
83
41. Pengamatan kecepatan pertumbuhan sel P. aeruginosa yang diberi inhibitor
protease dengan konsentrasi yang berbeda berbeda -■- kontrol,
-●- perlakuan inhibitor 1,01µg/ml, -▲- perlakuan inhibitor 1,285 µg/ml ......
84
42. Pengamatan kecepatan pertumbuhan sel P. aeruginosa yang diberi inhibitor
protease dengan konsentrasi yang berbeda -■- kontrol, -●- perlakuan
inhibitor 1,01µg/ml, -▲- perlakuan inhibitor 1,285 µg/ml.............................
84
43. Aktivitas protease P. aeruginosa yang diberi inhibitor protease selama
kultivasi berbeda -■- kontrol, -●- perlakuan inhibitor 1,01µg/ml,
-▲- perlakuan inhibitor 1,285 µg/ml .............................................................
xi
85
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1. Komposisi media yang digunakan...............................................................
95
2. Bahan-bahan untuk pengukuran aktivitas protease dan inhibitor protease
95
3. Peta lokasi pengambilan sampel spons ......................................................
97
4. Komposisi gel dan pereaksi untuk elektroforesis, pereaksi yang digunakan
untuk pewarnaan silver dan kurva standar berat molekul penanda (marker)
untuk elektroforesis .....................................................................................
98
5. Kurva standar penentuan protein menurut metode Bradford (1976)...........
100
6. Optimasi assay............................................................................................
101
7. Isolat bakteri laut yang digunakan untuk pemilahan ...................................
102
8. Sekuen dan hasil blast isolat 6A3 ...............................................................
103
9. Contoh publikasi..........................................................................................
113
xii
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Spons yang hidup di laut mempunyai metabolit sekunder yang aktif secara
hayati. Di antara organisme yang hidup di laut, spons mengandung komponen
bioaktif terbesar (Mayer dan Lehmann 2000). Beberapa komponen bioaktif yang
ada pada spons meliputi inhibitor enzim, inhibitor pembelahan sel, antiviral,
antifungi, antiimflamatori, antitumor, dan sitotoksik (Lee et al. 2001).
Hasil
penelitian menunjukkan bahwa bakteri yang berasosiasi dengan spons juga
menghasilkan komponen bioaktif (Webster et al. 2001). Hal ini mungkin karena
jumlah koloni bakteri dan cyanobacteria yang ada di spons, terutama Aplysina
aerophoba, dapat mencapai 40% dari biomasa spons (Ahn et al. 2003).
Mikroorganisme tersebut membentuk suatu simbiotik dengan spons baik di dalam
inti sel (simbiosis intranukleus), di dalam sitoplasama sel tubuh spons (simbiosis
intraseluler), di sisi dalam tubuh spons (endosimbiosis ekstraseluler), dan di bagian
luar tubuh spons (eksosimbiosis ekstraseluler). Hubungan simbiotik ini bisa terjadi
mengingat spons merupakan hewan yang memakan makanan dengan cara filter
feeder, dalam hal ini mikroorganisme dapat menjadi nutrisi bagi spons. Metabolit
yang dihasilkan oleh spons merupakan hasil biosintesis simbionnya sehingga dapat
dimungkinkan bahwa spons mengandung komponen bioaktif yang sama dengan
simbionnya (Lee et al. 2001).
Sebagai contoh Micrococcus sp. menghasilkan
komponen diketopiperazin, yang sebelumnya telah dilaporkan dihasilkan oleh spons
inangnya yaitu Tedania ignis. Simbion bakteri yang lain, yaitu Vibrio sp.
memproduksi bifenil eter bromina, yang juga dihasilkan oleh inangnya yaitu Dysidea
sp. Simbiotik Vibrio sp. menghasilkan komponen bioaktif berupa peptida anti
Bacillus yang juga dihasilkan oleh inangnya yaitu ekstrak spons Hyatella sp. (Stierle
et al. 1988; Elyakov et al. 1991; Oclarit
et al. 1994, diacu dalam Lee et al. 2001).
Flowers et al. (1998) melaporkan bahwa simbion spons Oscillatoria spongeliae,
mengandung senyawa diketopiperazin klorina yang juga dihasilkan oleh inangnya
yaitu Dysidea herbacea .
Foodborne disease yang diperantarai oleh mikroorganisme patogen atau
toksin mikroba merupakan masalah kesehatan masyarakat yang penting. Penyakit
ini oleh WHO didefinisikan sebagai penyakit infeksi atau keracunan toksin alami
yang disebabkan oleh konsumsi makanan atau minuman.
Di Amerika, telah
diestimasi bahwa terdapat berjuta-juta mikroorganisme penyebab foodborne
disease, beberapa ribu di antaranya menyebabkan kematian, terutama pada anak-
2
anak dibawah 5 tahun.
Penyebabnya adalah makanan yang dikonsumsi
terkontaminasi oleh bakteri patogen dan toksin yang dihasilkan oleh
bakteri
patogen (WHO 1997, diacu dalam Johnson 2003). Penyakit tersebut diklasifikasikan menjadi 2 golongan, yaitu infeksi dalam saluran pencernaan dan keracunan
akibat mengkonsumsi racun yang dihasilkan mikroba patogen dalam makanan.
Bakteri patogen dalam menjalankan aksinya menggunakan beberapa
cara, yang dikenal dengan istilah faktor virulensi, di antaranya dengan
mensekresikan protease ke dalam inangnya. Mengingat pentingnya protease dalam
mekanisme terjadinya penyakit maka dalam dasawarsa terakhir ini perhatian
terhadap protease sebagai target senyawa obat bagi penyakit asal bakteri (seperti
pneumonia, kolera, tifus, gonorrhoe), virus (seperti influenza dan HIV), dan malaria
serta kanker, bahkan penyakit degeneratif seperti Alzheimer meningkat pesat
(Suhartono 2000). Saat ini obat-obatan yang beberapa di antaranya mempunyai
mekanisme inhibitor protease telah tersedia luas di pasaran, seperti Elafin (inhibitor
elastase dari kulit manusia), antileuko protease, inhibitor serum ayam, dan inhibitor
protease alkalin dari Streptomyces.
Indonesia mempunyai biodiversitas dan keanekaragaman hayati yang
tinggi, salah satunya adalah spons.
Hampir di tiap wilayah perairan Indonesia
memiliki spons dengan tingkat penutupan dan keragaman yang berbeda. Pulau
Panggang di Kepulauan Seribu, merupakan salah satu pulau yang perairannya
masih cukup baik. Hal ini ditandai dengan penutupan karangnya yang termasuk
kategori sedang sampai baik (34,72-62,86 %) dan indeks keanekaragaman yang
rendah hingga tinggi yaitu berkisar 0,2-2,81 (Mahaza 2003). Oleh karena itu dari
perairan ini, diharapkan akan didapatkan suatu senyawa yang dapat menghambat
aktivitas protease dari bakteri patogen.
Data di atas menunjukkan menunjukkan bahwa sudah cukup banyak
simbion yang teridentifikasi positif menghasilkan komponen bioaktif yang sama
dengan inangnya, namun belum pernah dilaporkan tentang inhibitor protease dari
simbion spons yang berupa protein, meskipun telah dilaporkan bahwa spons
menghasilkan inhibitor protease. Dengan demikian penelitian ini dilakukan untuk
mencari simbion spons yang potensial sebagai penghasil inhibitor terhadap
protease bakteri patogen, sehingga diharapkan akan dapat memutus salah satu
jalan bagi bakteri patogen untuk menyebabkan penyakit.
3
Tujuan
Tujuan penelitian ini meliputi :
(1). memilah mikroba yang berasosiasi dengan spons sebagai penghasil inhibitor
protease;
(2). mengoptimasi kondisi produksi inhibitor protease;
(3). memurnikan inhibitor protease dari mikroba yang berasosiasi dengan spons;
(4). mengkarakterisasi inhibitor protease yang dihasilkan.
Luaran
Luaran penelitian ini adalah mendapatkan mikroba yang berasosiasi dengan
spons sebagai penghasil inhibitor protease, kondisi produksi yang tepat untuk
menghasilkan inhibitor protease, metode yang tepat untuk memurnikan inhibitor
protease, dan juga informasi mengenai karakteristik inhibitor enzim yang
mempunyai aktivitas terhadap protease tertentu.
TINJAUAN PUSTAKA
Keterlibatan Protease dalam Mekanisme Patogenisitas
Protease yang dihasilkan oleh mikroorganisme terlibat baik langsung
maupun tidak langsung dalam mekanisme patogenesis baik pada manusia, hewan,
maupun tanaman.
Beberapa bakteri yang menghasilkan protease penyebab
penyakit, diantaranya Clostridium, Staphylococcus spp, Strepcoccus spp. dan
Listeria
spp.
Clostridium
memproduksi
protease
penyebab
penyakit.
C. befermetans menghasilkan protease logam ekstraseluler bersifat toksin dan
merupakan faktor virulensi (Hase dan Finklestein 1993).
C. perfringens
menghasilkan lambda toksin sebagai penyebab penyakit enteritis (Fu Jin et al.
1996). Staphylococcus menghasilkan protease ekstraseluler jenis protease logam
yang
bersifat
toksin.
Streptococcus
sanguis,
Ureaplasma
urealyticum,
Haemophillus influenza, Streptococcus pneumonia memproduksi IgA ekstraseluler
yang digolongkan protease logam.
Listeria monocytogenes sebagai penyebab
penyakit listeriosis juga menghasilkan protease ekstraseluler (Hase dan Finklestein
1993, Johannson et al. 1999, Killian et al. 1979, Stenberg et al. 1996).
Streptococcus pyogenes menghasilkan protease sistein (streptococcal pyrogenic
exotoxin B, SpeB) yang merupakan faktor virulensi (Gubba et al. 2000).
Bakteri gram negatif yang menghasilkan protease adalah Pseudomonas
spp. dan Legionella spp. (Hase dan Finklestein 1993). P. aeruginosa bersifat
patogen, yaitu menginfeksi inang dengan dengan memproduksi elastase (A dan B)
yang dikarakteristik sebagai eksoenzim. Elastase merupakan protease logam yang
mengandung zink, mempunyai kemampuan mendegradasi substansi hayati penting
elastin, lamiarin, fibrin, kolagen manusia dan immunoglobulin.
Selain itu juga
terdapat protease alkalin dan elastase yang dihasilkan dalam paru-paru pasien
dengan cystic fibrosis dan menyebabkan kerusakan epitel respirasi. P. aeruginosa
juga menghasilkan protease IV yang merupakan faktor virulensi di kornea (Engel
et al . 1998). Protease IV merupakan endoprotease (PrpL) (Wilderman et al. 2001).
L. pneumophila merupakan bakteri fakultatif penyebab pneumonitis dengan
mensekresikan protease logam zink netral (Hase dan Finklestein 1993).
Escherichia coli jenis Enteropatogenik yang diisolasi dari penderita diare di
Indonesia ditemukan menghasilkan protease serin yang aktivitasnya berkorelasi
dengan tingkat infeksi yang ditimbulkan. Protease ini mampu mendegradasi musin
(Budiarti dan Suhartono 1999).
Protease sebagai antigen yang dihasilkan oleh
bakteri ini termasuk kelompok protease serin zink (Nurhayati 2000). Protease ini
5
selain dapat mendegradasi musin, juga mampu mendegradasi laktoferin yang telah
dipotong terlebih dahulu oleh tripsin (Suhardi 2004).
Bakteri lain yang
menghasilkan protease sebagai toksin adalah V. cholera (menghasilkan protease
logam yang membutuhkan zink sebagai kofaktor dan kalsium), Aeromonas
hydrophylla (protease logam), Serratia spp. (menghasilkan protease logam zink
ekstraseluler yang berfungsi sebagai antiinflamatori), dan Erwinia spp. (protease
logam) (Hase dan Finklestein 1993).
Parasit Toxoplasma gondii menghasilkan protease logam netral yang
tergantung ion kalsium. Protease ini berperan dalam degradasi membran sel inang
(Song dan Nam 2003).
Sementara itu Entamoeba hystolytica menghasilkan
proteinase sistein yang terlibat dalam pembentukan abses pada hati (Susanto dan
Supali 1999).
Inhibitor dari Spons
Carrol et al. (2002) menemukan dynosin A dari spons Australia yang
termasuk famili Dysideideae.
Komponen tersebut berperan untuk menghambat
faktor kaskade VIIa dan merupakan inhibitor
protease serin trombin. Inhibitor
tersebut menghambat faktor VIIa dengan konstanta penghambatan (Ki) 10 8 nM
dan trombin dengan konstanta penghambatan (Ki) 452 nM.
Spons dari New Zealand, Tethya ingalii, mengandung protein yang aktif
secara hayati yaitu inhibitor protease tethya (Tethya Protease Inhibitor, TPI),
bersifat toksik terhadap sel terutama sel tumor tertentu, dengan cara melisis sel
darah merah. Komponen tersebut diekstrak dengan menggunakan air (O’Keefe
et al. 1997).
Pada tahun 1998 peneliti yang sama menemukan protein yang
berfungsi sebagai inhibitor HIV, yaitu adociavirin, yang diekstrak dengan
menggunakan air (O’Keefe et al. 1998). Komponen tersebut diekstrak dari spons
Adocia sp. Mekanismenya yaitu mempunyai aktivitas antisitopatik dalam sel CEMSS yang diinfeksi oleh HIV-1 dan 2 dengan nilai EC50 0,4 mM sampai > 400 nM.
Potensi HIV ini tergantung pada tipe sel inang, bersifat sangat sensitif terhadap
kultur makrofag dan sangat resisten terhadap sel darah putih.
Spons yang hidup di laut, Aplysinella shax, menghasilkan inhibitor kitinase,
yaitu psammaplin A, dengan komponen penyusunnya yaitu tirosin bromina.
Komponen tersebut menghambat endokitinase dari Streptomyces dengan IC50
50 µM, menghambat kitinase B dari Serratia marcescens dengan nilai IC50 100 µM.
Dengan demikian, inhibitor tersebut menghambat Serratia marcescens secara
moderat (Tabudravu et al. 2002). Hori et al. (1993) menemukan inhibitor spesifik
terhadap aktomyosin ATPase, yaitu mycalolida-B. Inhibitor tersebut berasal dari
6
spons yang hidup di laut. Inhibitor tersebut menghambat kontraksi yang diinduksi
oleh ion Ca2+ di otot halus yang permiabel. Komponen spons laut, genus Stelletta,
yaitu stellettamida-A, dilaporkan mempunyai kemampuan menghambat kontraksi
yang diinduksi ion K+ dalam otot halus dengan nilai IC50 88 µM (Abe et al. 1997).
Tabel 1 Spons dan inhibitor enzim yang dihasilkan
Jenis sponge
Jenis komponen
Aktivitas biologis
Batzella sp.
Diskorhabdin
Sitotoksik, inhibitor
enzim
Halichondria okadai
Asam okadaic
Inhibitor fosfatase
Haliclona asiris
Osirisin
Inhibitor ATPase
Cacospongia
linteiformis
Petrosia sp.
Siklolinteinon,
Sesterpen
Petrosiasetilen
Inhibitor NO sintase
Plakinastrella sp.
Asam elenat
Inhibitor
topoisomerase II
Coscinoderma
mathewsi
Suvanin
Inhibitor protease
serin
Anthoigmella cf.
raromicrosclera
Piridin1
Inhibitor proteinase
sistein
Spongosorites sp.
Indol
Inhibitor fosfatase
Reniera sarai
Irchinia sp.
Polimer alkilpiridinium
Heksaprenilhidrokuinon
Theonella sp.
Peptida
Antikolinesterase
Inhibitor HIV reverse
transkriptase
Inhibitor protease
serin
Xetospongia exigua
Poliketida
halenakuinon
Sesterpen
Manoalida
Luffariella variabilis
Inhibitor ATPase
Inhibitor tirosin
kinase
Inhibitor fosfolipase
Referensi
Gunasekera et al.
(1999), diacu dalam
Lee et al. (2001)
Bialojan dan Takai
(1988)
Shin et al. (1998a),
diacu dalam Lee et
al. (2001)
D’acquisto et al.
(2000)
Seo et al. (1998),
diacu dalam Lee et
al. (2001)
Juagdan
et
al.
(1995), diacu dalam
Lee et al. (2001)
Kimura
et
al.
(1998), diacu dalam
Mayer
dan
Lehmann (2000)
Matsunaga et al.
(1998), diacu dalam
Mayer
dan
Lehmann (2000)
Capon
et
al.
(1998b),
diacu
dalam Mayer dan
Lehmann (2000)
Sepcic et al. (1997)
Loya et al. (1997)
Nakao et al. (1998),
diacu dalam Mayer
dan
Lehmann
(2000)
Haefner (2003)
Haefner (2003)
Tsukamoto et al. (2005) melaporkan bahwa spons laut dari genus Mycale
menghasilkan inhibitor proteasom baru, yaitu secomycalolida A.
tersebut mempunyai nilai IC50 11-45 µg/ml.
Komponen
Proteasom tersebut memainkan
peranan penting untuk mendegradasi protein secara selektif dan mengatur kejadian
berbagai sel termasuk pertumbuhan sel dan apoptosis. Dengan demikian inhibitor
7
proteasom mempunyai aktivitas antitumor pada berbagai sel tumor yang resisten
terhadap kemoterapi konvensional. Inhibitor enzim dari jenis spons lain disajikan
pada Tabel 1.
Inhibitor Protease dari Mikroorganisme
Serratia marcescens menghasilkan protein inhibitor protease logam yang
dikenal dengan nama SmaPI. Inhibitor tersebut dihasilkan dalam jumlah kecil
menunjukkan penghambatan terhadap protease logam S. marcescens yang
mempunyai bobot molekul 50 kDa. Protein tersebut berlokasi di bagian periplasma
sel dalam suhu pertumbuhan sel 25
membawa plasmid PSP2
o
C. Rekombinan S. marcescens yang
yang mengkodekan SMP dan SmaPI menghasilkan
SmaPI pada suhu pertumbuhan sel 25 oC. Namun pada suhu pertumbuhan 37 oC
SmaPI justru dihasilkan secara ekstraseluler. SmaPI tersebut mempunyai pI sekitar
10,0, dan merupakan protein monomer dengan bobot molekul 10.000 Dalton.
SmaPI stabil dalam air rebusan selama 30 menit dan mempunyai penghambatan
yang spesifik terhadap protease logam yang berasal dari S. marcescens (Kim et al.
1995).
Inhibitor protease juga dihasilkan oleh Gliocladium sp. yang disebut
dengan inhibitor proteinase sistein, TMC-52A-D. Berdasarkan hasil analisis
spektrofotometer dan degradasi kimia menunjukkan bahwa TMC-52A-D merupakan
peptida epoksisuksinil. Inhibitor tersebut kuat menghambat protease sistein,
terutama katepsin L dengan IC50 pada konsentrasi 13 nM, 10 nM, dan 6 nM (Isshiki
et al. 1998).
Saruno et al. (1980) menemukan inhibitor nuklease dari Monascus
purpureus. Adapun aktivitasnya mereduksi nuklease monascus dan nuklease P1
dengan substrat RNA atau DNA yang didenaturasi. Model aksi inhibitor itu adalah
penghambatan non kompetitif sehingga dinamakan inhibitor NMP. Murao et al.
(1982) melakukan isolasi inhibitor proteinase logam yang dihasilkan oleh mikroba
yaitu Streptomyces rishiriensis. Inhibitor tersebut dikenal dengan nama Fungal
Metallo-Proteinase Inhibitor (FMPI). Inhibitor tersebut menunjukkan aktivitas yang
baik pada proteinase logam dari Aspergillus oryzae dan mempunyai aktivitas
sedang terhadap mikroba lainnya. FMPI mempunyai bobot molekul yang rendah
dan stabil pada pH alkali (pH > 11).
Inhibitor protease juga telah ditemukan dari mikroba asal laut seperti yang
telah dilaporkan oleh Imada et al. (1985a,b,c) dan Imada (2000). Pencarian inhibitor
dari mikroba laut diawali dengan pemilahan bakteri penghasil inhibitor protease
menggunakan lapisan ganda kasein. Seluruh strain penghasil inhibitor bersifat
8
aerob, mempunyai flagella, gram negatif, mempunyai kandungan G+C yang rendah
pada DNA-nya. Mikroba tersebut membutuhkan NaCl untuk pertumbuhannya.
Seluruh strain menghidrolisis kasein, DNA, gelatin, dan pati. Berdasarkan hasil
identifikasi menunjukkan bahwa mikroba tersebut adalah Alteromonas sp.. Strain
B-10-31 adalah untuk membedakan dari 2 strain lainnya (Imada et al, 1985a;
Imada, 2000).
Imada et al. (1985b) dan Imada (2000) menemukan marinostatin, suatu
inhibitor yang dihasilkan dari Alteromonas sp. B-10-31. Inhibitor tersebut dihasilkan
secara optimal bila bakteri penghasilnya ditumbuhkan dalam medium yang
optimum. Sumber nitrogen dan karbon yang optimum untuk tujuan tersebut adalah
0,6 % polipepton dan 0,05 % glukosa. Produksi maksimum dihasilka