Imobilisasi Lipase Rhizopus Oryzae Pada Berbagai Bahan Pendukung Untuk Produksi Diasilgliserol Dari Cpo.

IMOBILISASI LIPASE Rhizopus oryzae PADA BERBAGAI
BAHAN PENDUKUNG UNTUK PRODUKSI
DIASILGLISEROL DARI CPO

SUSY SAADAH

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Imobilisasi Lipase
Rhizopus oryzae pada Berbagai Bahan Pendukung untuk Produksi Diasilgliserol
dari CPO adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2015
Susy Saadah
NIM G851130161

RINGKASAN
SUSY SAADAH. Imobilisasi Lipase Rhizopus oryzae pada Berbagai Bahan
Pendukung untuk Produksi Diasilgliserol dari CPO. Dibimbing oleh MARIA
BINTANG dan TRI PANJI.
Diasilgliserol (DAG) dikategorikan sebagai salah satu minyak sehat yang
telah dijadikan menu diet sehari-hari oleh masyarakat terutama di Jepang. Selain
itu, DAG telah dimanfaatkan sebagai emulsifier dan surfaktan makanan serta
digunakan dalam bidang farmasi dan kedokteran. DAG dapat diproduksi dari Crude
Palm Oil (CPO) yang ketersediannya melimpah di Indonesia. Namun produksi
DAG di Indonesia terkendala oleh tingginya harga lipase yang masih diimpor.
Untuk mengatasi masalah tersebut, telah dilakukan penelitian produksi DAG
menggunakan ekstrak kasar lipase yang dihasilkan oleh fungi lokal Rhizopus oryzae.
Fungi R. oryzae ini bersifat edible sehingga aman untuk dimanfaatkan dalam
produksi produk pangan seperti DAG. Imobilisasi enzim merupakan teknik
perolehan kembali enzim yang menjadi perhatian dalam beberapa tahun belakangan,

dilakukan dengan bantuan bahan pendukung sebagai media yang dapat mencegah
terlarutnya enzim. Beberapa macam pendukung yang digunakan ialah zeolit,
CaCO3, silika gel dan tulang sapi.
Metode imobilisasi yang digunakan dalam penelitian ini ialah metode
adsorpsi, menggunakan lipase spesifik dari R. oryzae. Penentuan protein enzim
dilakukan untuk mengetahui jumlah enzim yang teradsorpsi pada berbagai bahan
pendukung dengan metode Bradford menggunakan spektrofotometri UV-Vis.
Konsentrasi enzim imobil diperoleh dari selisih konsentrasi larutan lipase sebelum
proses imobilisasi, larutan lipase setelah proses imobilisasi dan larutan pencuci.
Dalam penelitian ini, diselidiki faktor dari setiap bahan pendukung seperti pH
optimum, suhu optimum, dan waktu penyimpanan. Aktivitas lipase dihitung dengan
penentuan asam lemak bebas menggunakan metode titrasi. Komposisi asam lemak
bebas, monoasilgliserol, diasilgliserol, dan triasilgliserol pada proses gliserolisis
diidentifikasi menggunakan TLC Scanner.
CaCO3 memiliki kemampuan adsorbsi terbesar (99,46%), lebih besar
dibandingkan zeolit (90,69%), tulang sapi (91,56%), dan silika gel (59,63%).
Lipase bebas bekerja optimal pada pH 7 dan suhu 30 °C. Hasil yang sama
didapatkan untuk lipase terimobilisasi pada tulang sapi. Lipase terimobilisasi pada
CaCO3 bekerja optimal pada pH 8 dan suhu 35 °C. Lipase terimobilisasi pada zeolit
dan silika gel bekerja optimal pada pH 8 dan suhu 30 °C. Lipase imobil lebih stabil

dibandingkan lipase bebas pada penyimpanan lipase di minggu pertama hingga
minggu ke enam, dengan kondisi penyimpanan pada suhu 4 °C dan pH optimum
masing-masing bahan pendukung. Lipase terimobilisasi pada CaCO3 dapat
digunakan kembali hingga tiga kali pengulangan. Konversi gliserolisis lipase
terimobilisasi CaCO3 mencapai 15,02% selama 9 jam lebih rendah dibandingkan
menggunakan lipase bebas sebesar 18,41% selama 15 jam.

Keywords: Diasilgliserol, Imobilisasi, Lipase, Rhizopus oryzae

SUMMARY
SUSY SAADAH. Immobilization of Rhizopus oryzae Lipase on Various
Supporting Materials for Diacylglycerol Production from CPO. Supervised by
MARIA BINTANG and TRI PANJI.
Diacylglycerol (DAG) is categorized as one of the healthy oil types that has
been used in daily diet by the society, especially in Japan. In addition, the DAG has
been used as an emulsifier and surfactant in the food and in pharmaceutical and
medical fields. DAG can be produced from Crude Palm Oil (CPO) that is
abundantly produced in Indonesia. However, DAG production in Indonesia is
constrained by the high cost of lipase that is still imported from abroad. To
overcome this problem, research of DAG production has been conducted using

crude extract of lipase produced by indigenous species of fungi Rhizopus oryzae.
The R. oryzae is edible indicating that it is safe to be used in the production of food
products such as DAG. Enzyme immobilization is a recovery technique that has
been studied in several years, using supporting materials as a medium to help
enzyme dissolutions to the substrate. Several supporting materials such as zeolit,
CaCO3, silica gel, and cow bone were selected by its ability to adsorb lipase.
Immobilization method used in this study was adsorption method, using
spesific lipase from R. oryzae. The protein determination for an enzyme was used
for knowing amount of enzyme which can be adsorbed in various supporting
materials by Bradford method using spectrophotometry UV-Vis. The enzyme
loading value was obtained from the difference among lipase solution before
immobilization process, lipase solution after immobilization process and washing
solution. In this research, condition factors, such as optimum pH, optimum
temperature, and storage ability of the matrix were investigated. The lipase activity
was measured by free fatty acid determination using titrimetric method.
Glycerolysis was analyzed for identifying the compositions of free fatty acid,
monoacylglycerol, diacylglycerol, and triacylglycerol using TLC Scanner.
CaCO3 shows enzyme loading rate respectively 99.46%, giving more lipase
to adsorb than zeolit (90.69%), cow bone (91.56%), and silica gel (59.63%). Free
lipase reacts optimally in pH 7 and temperature 30°C. Identical result showed for

lipase immobilized on cow bone. Lipase on CaCO3 reacts optimally in pH 8 and
temperature 35°C. Lipase on zeolit and silica gel reacts optimally in pH 8 and
temperature 30°C. Immobilized lipase is more stable than free lipase from storage
in the first to six week, in storage condition temperature at 4°C and optimum pH.
Lipase on CaCO3 reaches 15.02% for the conversion of glycerolysis at 9 hours, less
than using free lipase 18.41% at 15 hours.

Keywords: diacylglycerol, immobilized, lipase, Rhizopus oryzae

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau
menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

IMOBILISASI LIPASE Rhizopus oryzae PADA BERBAGAI
BAHAN PENDUKUNG UNTUK PRODUKSI

DIASILGLISEROL DARI CPO

SUSY SAADAH

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Biokimia

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Mega Safithri, S.Si M.Si

Judul Tesis : Imobilisasi Lipase Rhizopus oryzae pada Berbagai Bahan
Pendukung untuk Produksi Diasilgliserol dari CPO
Nama

: Susy Saadah
NIM
: G851130161

Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

Prof Dr drh Maria Bintang, MS
Ketua

Dr Tri Panji MS.APU
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Biokimia

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof Dr drh Maria Bintang, MS

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian:
28 Agustus 2015

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji dan syukur penulis haturkan kepada Tuhan atas segala karunia-Nya
sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Judul karya ilmiah dalam
penelitian yang dilaksanakan sejak September 2014 sampai dengan Maret 2015 ini
ialah Imobilisasi Lipase Rhizopus oryzae pada Berbagai Bahan Pendukung untuk
Produksi Diasilgliserol dari CPO.
Ucapan terima kasih kepada Prof Dr drh Maria Bintang, MS dan Dr Tri Panji,
MS.APU selaku pembimbing atas ilmu, saran dan kesabaran yang telah diberikan.
Terima kasih juga kepada keluarga besar Biokimia (Dosen, Staff TU, Laboran dan
teman-teman Biokimia 2013) yang telah memberikan motivasi dan membantu
penulis dalam menyelesaikan karya ilmiah ini. Ungkapan terima kasih juga

diberikan kepada para teknisi dan teman-teman Pusat Penelitian Bioindustri dan
Bioteknologi Indonesia, terima kasih untuk kerja samanya. Penulis juga
mengucapkan terima kasih kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (DIKTI)
sebagai sponsor Beasiswa Pendidikan Pascasarjana Dalam Negeri 2013. Ucapan
spesial kepada orang tua yang selalu memberikan doa dan dukungannya.
Penulis menyadari bahwa makalah hasil penelitian ini jauh dari
kesempurnaan, oleh sebab itu penulis mengharapkan adanya kritik dan juga saran
yang konstruktif demi perbaikan di masa yang akan datang. Semoga karya ilmiah
ini bermanfaat bagi kita semua.

Bogor, Agustus 2015
Susy Saadah

DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR

vi

DAFTAR LAMPIRAN

vi

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian

1
1
2
3
3
3

2 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Bahan
Alat

Prosedur penelitian

3
3
3
4
4

3 HASIL
Produksi, Pengendapan, dan Analisis Aktivitas Lipase
Imobilisasi Lipase Rhizopus oryzae
Pengaruh pH pada Kestabilan Lipase Imobil
Pengaruh suhu pada Kestabilan Lipase Imobil
Kestabilan Lipase Rhizopus oryzae Imobil
Penggunaan Kembali Lipase Rhizopus oryzae Imobil
Produksi Diasilgliserol, Analisis Produk, dan Perbesaran Skala
Gliserolisis

7
7
7
8
8
9
9
10

4 PEMBAHASAN
Produksi, Pengendapan, dan Analisis Aktivitas Lipase
Imobilisasi Lipase Rhizopus oryzae
Pengaruh pH pada Kestabilan Lipase Imobil
Pengaruh suhu pada Kestabilan Lipase Imobil
Kestabilan Lipase Rhizopus oryzae Imobil
Penggunaan Kembali Lipase Rhizopus oryzae Imobil
Produksi Diasilgliserol, Analisis Produk, dan Perbesaran Skala
Gliserolisis

12
12
12
13
13
13
13

5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

16
16
17

DAFTAR PUSTAKA

17

LAMPIRAN

20

RIWAYAT HIDUP

24

14

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Kurva pengaruh pH pada lipase imobil
8
Kurva pengaruh suhu pada lipase imobil
9
Pengaruh waktu penyimpanan pada lipase imobil
9
Fraksi massa DAG pada penggunaan kembali lipase imobil CaCO3 10
Fraksi massa ALB, MAG, DAG, dan TAG menggunakan lipase
bebas
10
Fraksi massa DAG pada lipase bebas dan lipase imobil
11
Fraksi massa ALB, MAG, DAG, dan TAG pada perbesaran skala
gliserolisis
11
Reaksi hidrolisis trigliserida menjadi diasilgliserol
15
Reaksi hidrolisis TAG oleh lipase
15
Reaksi esterifikasi asam lemak dan gliserolisis oleh lipase
16

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4

Diagram alir penelitian
20
Kurva standar protein
21
Aktivitas lipase bebas
22
Fraksi Massa ALB, MAG, DAG, dan TAG menggunakan lipase
bebas
23

1 PENDAHULUAN

Latar Belakang
Indonesia merupakan salah satu negara produsen utama minyak kelapa sawit
dunia karena setiap tahun luas areal perkebunan kelapa sawit terus meningkat
diiringi dengan peningkatan produksi Crude Palm Oil (CPO) (Anggirasti et al.
2008). CPO merupakan produk turunan minyak sawit, hasil olahan daging buah
kelapa sawit yang dapat dimanfaatkan sebagai bahan baku biodiesel, bahan
makanan seperti minyak goreng dan margarin, maupun produk-produk industri
kimia seperti sabun dan detergen (Kong 2010). Produk olahan CPO klasifikasi
khusus seperti specialty fats, contienary fat, dan minyak sehat (healthy oil)
memiliki harga jauh lebih tingi dibandingkan dengan minyak makan (cooking oil)
atau shortening. Penggunaan CPO untuk produksi diasilgliserol (DAG) memiliki
keunggulan karena ketersediaan CPO di Indonesia melimpah, memiliki kandungan
asam lemak tak jenuh tunggal (asam oleat) yang tinggi sehingga cocok untuk
minyak goreng, mengandung nutrisi penting seperti β-karoten, vitamin E, dan
tokotrienol (Suharyanto et al. 2011).
Diasilgliserol merupakan senyawa ester dari gliserol dimana terdapat dua
gugus hidroksil yang teresterifikasi oleh asam lemak (Kusumo 2008). DAG telah
terbukti secara klinis memiliki berbagai manfaat seperti menurunkan level lipid
postprandial, meningkatkan β-oksidasi lemak yang dapat mencegah obesitas
(Takase 2007). Bahkan, efek kesehatan minyak DAG telah diakui oleh pemerintah
Jepang dengan pemberian status makanan sehat (FOSHU) (Cheong dan Lai 2009).
Diasilgliserol dapat diproduksi secara kimiawi dari minyak atau lemak
nabati dengan gliserol pada suhu tinggi (240–260 °C) menggunakan katalis
anorganik seperti natrium hidroksida, kalium hidroksida atau kalsium hidroksida.
Namun teknik tersebut memiliki kelemahan, yaitu pemakaian energi yang tinggi,
terbentuknya produk samping hasil reaksi peroksidasi dan polimerisasi yang
bersifat toksik bagi kesehatan manusia serta produk yang diperoleh berwarna gelap
(Elisabeth et al. 1999). Selain itu proses gliserolisis pada suhu tinggi dapat merusak
kandungan senyawa-senyawa minor dalam CPO seperti tokoferol, tokotrienol dan
karoten (Suharyanto et al. 2011). Untuk mengatasi kerusakan minyak dan senyawa
minor dalam produksi monoasilgliserol (MAG) dan DAG, Hasanuddin et al. (2003)
telah mengembangkan proses etanolisis pada suhu ruang. Pramana dan Mulyani
(2007) juga telah melakukan proses gliserolisis dengan katalis MgO dan pelarut
Tert-butanol pada suhu 70-90 °C dan dapat meningkatkan konversi produk hingga
97 %. Akan tetapi, proses pemecahan ikatan ester pada minyak dengan proses kimia
seperti ini tetap memiliki kelemahan meskipun telah dicoba dilakukan pada suhu
lebih rendah, karena proses kimia berlangsung secara acak sehingga masih sulit
untuk memperoleh produk DAG yang murni dan terkontrol (Suharyanto et al. 2011).
Alternatif lain dalam produksi DAG adalah dengan melakukan proses
gliserolisis secara enzimatik menggunakan lipase sebagai biokatalisator.
Pemanfaatan enzim lipase sebagai katalis memiliki beberapa keuntungan, yakni
spesifitas yang tinggi, kondisi operasional pada suhu dan tekanan yang rendah,

2
biaya pengolahan limbah yang murah dan produk yang dihasilkan lebih aman
(Suharyanto et al. 2011)
Lipase banyak ditemukan di alam baik pada hewan, tumbuhan, maupun
mikroorganisme. Lipase komersial pada umumnya berasal dari jamur (Rhiomur,
Rhyomur, dan Candida) dan bakteri (Pseudomonas dan Chromobacterium) (Shah
et al. 2009). Harga lipase komersial biasanya sangat tinggi karena proses
produksinya yang sulit dan memerlukan waktu yang lama (Kirk et al. 2002). Untuk
mengatasi masalah tersebut diperlukan suatu metode dalam memproduksi lipase
dengan murah. Salah satunya dapat dilakukan dengan memfermentasikan mikroba
tertentu yang mampu menghasilkan lipase (Palilingan 2013). Panji et al. (2008)
telah melakukan fermentasi CPO dengan Neurospora sitophila dan dilaporkan
mampu memproduksi lipase spesifik 1,3-gliserida. Kapang lokal jenis ini dikenal
aman (edible) karena biasa digunakan dalam pembuatan oncom merah. Kapang
lokal lain yang juga aman adalah Rhizopus sp yang dikenal sebagai jamur tempe
kedelai. Perwitasari (2008) telah melakukan optimasi produksi DAG dengan lipase
dari Rhizopus oryzae melalui gliserolisis hingga didapatkan rendemen DAG sebesar
20,76 %.
Lipase yang biasa digunakan dalam proses industri merupakan lipase imobil.
Beberapa keuntungan dari lipase imobil adalah peningkatan aktivitas dan stabilitas
enzim, dan kemudahan perolehan enzim imobil di akhir reaksi (Kharrat et al. 2011).
Metode adsorpsi merupakan metode penjeratan enzim berdasarkan interaksi ikatan
ionik, interaksi ikatan hidrogen, ikatan hidrofobik antara enzim atau sel mikrob
dengan bahan penyangga. Metode ini merupakan menyebabkan konformasi enzim
atau destruksi pada pusat aktif enzim (Wang et al. 2009).. Untuk melakukan
immobilisasi enzim, perlu dilakukan pengamatan tentang bahan pendukung yang
akan dipakai. Terdapat beberapa macam bahan pendukung yang dapat dipakai
untuk metode adsorpsi, yaitu bahan pendukung organik seperti tulang sapi dan
bahan pendukung anorganik seperti silica gel, CaCO3, dan zeolit.

Perumusan Masalah
Potensi dari lipase pada Rhizopus oryzae yang berasal dari Indonesia belum
banyak diungkap. Screening awal mengenai aktivitas lipase pada isolat Rhizopus
oryzae koleksi laboratorium Bioproses Pusat Penelitian Boteknologi dan
Bioindustri Indonesia (PPBBI) merupakan salah satunya. Lipase dari Rhizopus
oryzae telah dimurnikan secara parsial dan diungkap karakternya oleh Putranto et
al. (2006). Namun, imobilisasi lipase dari Rhizopus oryzae menggunakan zeolit,
CaCO3, silica gel, atau tulang sapi belum dilakukan. Salah satu aplikasi lipase
dalam produk pangan adalah gliserolisis triasilgliserol yang terkandung dalam CPO
menjadi diasilgliserol. Karakter lipase imobil dan penyimpanannya juga belum
diketahui.

3
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengimobilisasi lipase dari Rhizopus oryzae.
Lipase imobil yang diperoleh digunakan untuk gliserolisis triasilgliserol yang
terkandung dalam CPO menjadi diasilgliserol.

Manfaat Penelitian
Penelitian ini dapat memberikan informasi ilmiah mengenai karakter lipase
dari Rhizopus oryzae dan teknik imobilisasinya. Lipase imobil yang telah diketahui
karakternya digunakan untuk gliserolisis triasilgliserol yang terkandung dalam
CPO menjadi diasilgliserol oleh lipase.
Ruang Lingkup Penelitian
Lingkup kegiatan penelitian meliputi prduksi enzim kasar lipase,
dilanjutkan dengan pengendapan dan isolasi lipase menggunakan aseton. Enzim
yang diperoleh diimobilisasi menggunakan zeolit, CaCO3, silika gel dan tulang sapi
dan setiap lipase imobilisasi dilakukan pengujian pengaruh terhadap pH, temperatur,
waktu penyimpanan, Km, Vmaks, penggunaan kembali. Persen adsorb lipase
terbesar dan aktivitas spesifik tertinggi digunakan untuk produksi diasilgliserol dari
CPO.

2 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Bioproses, Pusat Penelitian
Bioteknologi dan Bioindustri Indonesia. Penelitian ini diselesaikan selama enam
bulan dari September 2014 hingga Maret 2015.

Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rhizopus oryzae dari Pusat
Penelitian Bioteknologi dan Bioindustri Indonesia, CPO, enzim lipase yang
diproduksi dari isolat Rhizopus oryzae, akuades, PDA, MgSO4, KH2PO4, pepton,
gliserol, heksana, buffer Tris-HCl, aseton, polivinil alkohol, buffer fosfat-sitrat,
etanol, NaOH, fenolftalein, petroleum benzena, dietil eter, asam asetat glasial,
CaCO3, silica gel, zeolit, tulang sapi, kertas HVS 80 g, lempeng KLT silika gel G60, kertas saring Whatman No. 40,alkohol 70%, aluminium foil dan bahan-bahan
lainnya.

4
Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah labu Erlenmeyer, shaker,
chamber KLT (Kromatografi Lapis Tipis), autoklaf, kertas pH, gelas piala, gelas
ukur, corong Buchner, pompa vakum, pompa peristaltik, sentrifus Beckman Coulter
Allegra X-22R, oven, batang pengaduk, cawan petri, pipet tetes, labu ukur, neraca
analitik, inkubator, magnetic stirrer, freezer, pipet mikro, jarum ose, bunsen,
laminar air flow, buret, Spektrofotometer UV-Vis Shimadzu, TLC Scanner Camag
3, dan peralatan lainnya.

Prosedur Penelitian
Produksi Enzim Kasar Lipase (Palilingan 2013)
Isolat kapang yang tumbuh dalam media agar-agar kentang (PDA)
diremajakan kembali dengan diinokulasikan ke dalam media PDA baru, kemudian
diinkubasi pada suhu ruang (27-30°C) selama 3-4 hari. Spora yang tumbuh dalam
media PDA diambil sebanyak 1 ose lalu diinokulasikan dalam masing-masing 100
mL medium fermentasi steril yang mengandung Crude Palm Oil (CPO) 3% dengan
total volume sebanyak 500 mL dan diinkubasi pada suhu ruang (27-30°C) selama
5 hari sambil digoyang dengan kecepatan agitasi 75 rpm. Setelah dilakukan proses
fermentasi, enzim yang dihasilkan dipanen. Untuk memisahkan biomassa (spora)
dengan filtrat dilakukan penyaringan vakum dengan menggunakan kertas saring
yang telah diketahui bobot massanya. Biomassa sel dikeringkan dalam oven dengan
suhu 60°C hingga bobotnya konstan dan dihitung biomassa sel keringnya
sedangkan filtrat diambil untuk dilakukan proses pengendapan dan isolasi enzim.
Pengendapan dan Isolasi Enzim Lipase (Palilingan 2013)
Pengendapan dan isolasi enzim lipase dari kapang R. oryzae dilakukan
menurut metode pengendapan enzim menggunakan aseton. Semua tahap dikerjakan
pada suhu 4 °C. Filtrat enzim kasar lipase yang diperoleh dari tahap pemanenan
enzim diendapkan proteinnya menggunakan aseton dingin dengan nisbah filtrat dan
aseton 1:2 (v/v). Setelah itu campuran disentrifugasi dengan kecepatan 8.400g
selama 15 menit pada suhu 4 °C. Setiap endapan yang diperoleh dilarutkan ke
dalam 1 ml bufer Tris HCl 0,05 M pH 7. Larutan enzim yang didapat, diambil 1-2
mL untuk diuji aktivitasnya.
Imobilisasi Enzim Lipase
Imobilisasi Enzim Lipase dengan Zeolit (Apriyanti 2012)
Butiran zeolit berukuran 3-10 mm sebelum digunakan sebagai padatan
pendukung dicuci dengan air sampai air cucian tersebut jernih dan tidak keruh,
kemudian zeolit direndam dalam larutan NaCl 1 M selama 12 jam dengan dua kali
penggantian larutan perendam sambil digoyang perlahan. Butiran zeolit kemudian
diaktivasi dengan memanaskan di dalam oven pada suhu 200°C selama 15 menit.
Imobilisasi lipase dilakukan dengan cara merendam 70 gram zeolit teraktivasi ke
dalam 210 mL larutan enzim larutan enzim hasil pengendapan dengan aseton dan
dikocok pada kecepatan agitasi 180 rpm selama satu jam pada suhu ruang (2530°C), kemudian cairan yang tersisa dipisahkan. Penentuan jumlah enzim imobil

5
dilakukan berdasarkan pengurangan kadar protein cairan enzim sebelum dan
setelah imobilisasi menggunakan metode Bradford dengan standar protein BSA
(Bovine Serum Albumin), serta pengurangan lipasenya.
Imobilisasi Enzim Lipase dengan CaCO3 (Ghamgui et al. 2004)
Sebanyak 70 gram ditambahkan CaCO3 ke dalam 210 mL larutan enzim
hasil pengendapan dengan aseton. Campuran diinkubasi selama 1 jam pada suhu
4°C. Setelah itu ditambahkan 100 mL aseton, lalu suspensi disaring menggunakan
corong Buchner, kemudian dicuci dua kali dengan 100 mL aseton dingin, dan
dikeringkan menggunakan vakum desikator pada suhu kamar (25-30°C) selama 6
jam dan disimpan pada suhu 4°C sampai digunakan. Penentuan jumlah enzim
imobil dilakukan berdasarkan pengurangan kadar protein cairan enzim sebelum dan
setelah imobilisasi menggunakan metode Bradford dengan standar protein BSA
(Bovine Serum Albumin), serta pengurangan lipasenya.
Imobilisasi Enzim Lipase dengan Silika gel (Lee et al. 2006)
Sebanyak 70 mg silika gel dicampur dengan 210 mL larutan lipase dan
diinkubasi pada 20°C. Lipase imobil yang diperoleh dicuci dengan akuades dan
kemudian dikeringkan pada suhu kamar (25-30°C) semalaman. Penentuan jumlah
enzim imobil dilakukan berdasarkan pengurangan kadar protein cairan enzim
sebelum dan setelah imobilisasi menggunakan metode Bradford dengan standar
protein BSA (Bovine Serum Albumin), serta pengurangan lipasenya.
Imobilisasi Enzim Lipase dengan Butiran Tulang Sapi (Panji et al. 2010)
Tulang paha sapi dikeringkan menggunakan oven, dihancurkan dengan
grinder hingga berdiameter 0,3-1,0 cm. Butiran tulang dicuci dengan heksana
hingga terbebas dari lemak, dicuci dengan detergen (surfaktan) dan dikeringkan
kembali dengan oven pada suhu 105°C sampai beratnya tetap. Imobilisasi lipase
dilakukan dengan cara menambahkan masing-masing 70 gram butiran tulang ke
dalam 210 mL larutan lipase hasil pengendapan dengan aseton, digoyang
menggunakan shaker pada 180 rpm selama satu jam, kemudian cairan dipisahkan.
Penentuan jumlah enzim imobil dilakukan berdasarkan pengurangan kadar protein
cairan enzim sebelum dan setelah imobilisasi menggunakan metode Bradford
dengan standar protein BSA (Bovine Serum Albumin), serta pengurangan lipasenya.
Analisis Aktivitas Enzim Lipase (Ibegbulam-njoku et al. 2014)
Penentuan aktivitas enzim lipase dilakukan dengan melarutkan 3 gram CPO
dan 1 gram polivinil alkohol dalam 40 mL bufer fosfat-kalium pH 7. Sebanyak
1mL enzim lipase ditambahkan dalam larutan lalu diinkubasi selama 30 menit pada
suhu 37°C. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 20 mL campuran aseton :
etanol (1:1 v/v). Kemudian sampel dititrasi menggunakan NaOH 1 N menggunakan
indikator fenolftalein hingga titik akhir berwarna merah muda. Untuk blanko
dilakukan prosedur yang sama tanpa perlakuan penambahan enzim. Penentuan
kadar asam lemak bebas dapat dihitung menggunakan persamaan sebagai berikut:
Vol NaOH mL x [NaOH] M
Aktivitas enzim lipase =
Vol lipase mL x Waktu reaksi menit
Satu unit aktivitas lipase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang digunakan
untuk membebaskan 1 mol asam lemak bebas per menit (1 U = 1 mol FFA/menit).

6
Karakterisasi lipase
Pengaruh pH pada stabilitas lipase imobil (Yesiloglu dan Sit, 2011)
Optimasi pH dilakukan dengan menggunakan bufer tris-HCl pada pH 5, 6,
7, 8, dan 9. Aktivitas ditentukan pada suhu 37°C selama 5 menit. Aktivitas tertinggi
berdasarkan uji aktivitas lipase imobil menunjukkan pH optimum lipase. Stabilitas
enzim imobil terhadap pH diuji dengan menginkubasikan larutan enzim pada
larutan bufer pada berbagai pH (5-10 dengan selang 1) selama 1 jam. Setelah
inkubasi selesai larutan enzim dengan cepat didinginkan dalam wadah berisi es
dengan suhu 0 °C selama 10 menit. Aktivitas enzim yang tersisa diuji dengan reaksi
enzimatis lipase pada pH optimum. Nilai aktivitas enzim imobil tersisa dinyatakan
dalam persentase dari aktivitas setelah perlakuan dibandingkan dengan kontrol
(enzim imobil tanpa perlakuan).
Pengaruh suhu pada stabilitas lipase imobil (Yesiloglu dan Sit, 2011)
Uji aktivitas enzim imobil dengan variasi suhu antara 25°C hingga 40°C
dilakukan untuk penentuan suhu optimum. Pengujian aktivitas dilakukan
berdasarkan pH optimum selama 5 menit. Aktivitas tertinggi berdasarkan uji
aktivitas lipase menunjukkan suhu optimum lipase. Stabilitas enzim terhadap suhu
diuji dengan menginkubasikan larutan enzim pada berbagai suhu (25-40 °C dengan
selang 5°C) selama 1 jam dalam bufer dengan pH hasil stabilitas. Setelah inkubasi
selesai larutan enzim dengan cepat didinginkan dalam penangas es. Aktivitas enzim
imobil yang tersisa diuji dengan reaksi enzimatis lipase pada pH dan suhu optimum.
Nilai aktivitas enzim imobil tersisa dinyatakan dalam persentase dari aktivitas
setelah perlakuan dibandingkan dengan kontrol (enzim tanpa perlakuan).
Stabilitas penyimpanan lipase imobil (Yesiloglu dan Sit, 2011)
Enzim bebas dan imobil disimpan dalam suhu 4°C dalam 50 mM bufer trisHCl berdasarkan pH optimum. Stabilitas penyimpanan dinyatakan dalam persen
dari aktivitas sampel yang diperoleh dari pengambilan pada minggu pertama hingga
minggu keenam dibandingkan dengan kontrol (enzim tanpa perlakuan).
Penggunaan kembali lipase imobil (Suharyanto et al. 2011)
Medium gliserolisis mengandung 0,8 gram gliserol, 40 mL heksana, 50 mL
buffer tris HCl 50 mMol pH 7, dan 3 gram CPO. Sebanyak 1g enzim imobil
ditambahkan dalam medium tersebut. Sampel diinkubasi pada suhu 37°C selama
24 jam. Setiap 3 jam sekali dilakukan pengambilan sampel untuk dilakukan analisis
produk hasil gliserolisis. Seluruh prosedur dilakukan pengulangan hingga tiga kali.
Aplikasi Lipase pada Produksi Diasilgliserol (Suharyanto et al., 2011)
Medium gliserolisis mengandung 0,8 gram gliserol, 40 mL heksana, 50 mL
buffer tris HCl 50 mMol pH 7, dan 3 gram CPO. Sebanyak 20 µL enzim lipase
bebas atau enzim imobil ditambahkan dalam medium tersebut. Sampel diinkubasi
pada suhu 37°C selama 27 jam. Setiap 3 jam sekali dilakukan pengambilan sampel
untuk dilakukan analisis produk hasil gliserolisis.
Analisis Produk Hasil Gliserolisis (TAG, DAG, MAG dan ALB) (Suharyanto
et al. 2011)
Fraksi massa komponen TAG, DAG, MAG dan ALB dari reaksi gliserolisis
dianalisis dengan metode kromatografi lapis tipis (KLT). Lempeng yang digunakan
adalah lempeng silika gel G 60. Sebanyak 10 µL sampel ditotolkan sedikit demi
sedikit ke dalam lempeng tersebut dan dielusikan dengan campuran petroleum
benzena : dietil eter : asam asetat glasial (90:10:1 v/v).

7
Lempeng KLT yang sudah dielusikan dibiarkan mengering terlebih dahulu,
kemudian visualisasi noda dilakukan dengan menggunakan uap iodine. Kristal
iodine dituangkan ke dalam cawan petri hingga rata. Lempeng KLT yang sudah
kering diletakkan di atas cawan petri selama dua menit (hingga terlihat noda
cokelat). Noda yang terlihat langsung dilihat menggunakan TLC scanner
Perbesaran Skala Gliserolisis
Reaksi gliserolisis CPO dan teknik pemisahan komponen hasil gliserolisis
digunakan untuk reaksi gliserolisis dalam skala yang lebih besar. Perhitungan kadar
TAG dihitung menggunakan metode KLT. Skala gliserolisis diperbesar menjadi 25
kali lipat dari skala sebelumnya. Besarnya medium yang digunakan menjadi 1000
mL heksana, 1250 mL buffer tris HCl 50 mM pH 7, 20 g gliserol, dan 75 g CPO.
Suhu reaksi gliserolisis pada suhu kamar (25-30 °C) dan diinkubasi selama 27 jam.
Kemudian ALB, MAG, DAG,dan TAG dianalisis menggunakan TLC Scanner.

3 HASIL
Produksi, Pengendapan, dan Analisis Aktivitas Lipase
Isolat Rhizopus orzyae diremajakan dalam media PDA, kemudian
difermentasikan. Isolasi enzim dilakukan menggunakan metode pengendapan
dengan aseton dingin dengan perbandingan 1:2 (v/v). Sebanyak 1 mL enzim
diperoleh dari isolasi dengan aseton dingin diperoleh dari 10 mL filtrat enzim kasar.
Enzim diambil sebanyak 1% dari jumlah ekstrak yang didapat untuk diuji aktivitas
lipasenya, diperoleh hasil sebesar 4,244 mol/menit.
Imobilisasi Lipase Rhizopus oryzae
Empat bahan pendukung yang diuji untuk imobilisasi lipase Rhizopus
oryzae ialah zeolit, CaCO3, silika gel, dan tulang sapi. Persentase penyerapan setiap
bahan pendukung dihitung dengan menganggap jumlah protein yang terkandung
dalam larutan enzim bebas adalah 100%. Konsentrasi protein imobil diperoleh dari
selisih konsentrasi larutan enzim sebelum dan setelah imobilisasi. Secara lengkap
konsentrasi protein yang imobil pada masing-masing bahan pendukung dapat
dilihat pada tabel 1.
Tabel 1 Konsentrasi protein imobil
Bahan
Pendukung
Zeolit
CaCO3
Silika gel
Tulang sapi

% Enzim dalam larutan
yang imobil
90.69
99.46
59.63
91.56

8
Pengaruh pH pada Kestabilan Lipase Imobil
Lingkungan dimana enzim akan mengkatalis reaksi harus berada pada kondisi
optimum enzim untuk bereaksi. Zona ini diberikan oleh parameter derajat keasaman
(pH). Setiap enzim memiliki karakter yang berbeda dimana kondisi optimum pH
lingkungan akan spesifik untuk tiap enzim. Kondisi pH yang jauh dari kondisi
spesifik ini akan menyebabkan inaktivasi enzim karena enzim mengalami
kerusakan struktur. Secara lengkap pengaruh pH terhadap stabilitas enzim imobil
pada masing-masing bahan pendukung dapat dilihat pada gambar 2.

Gambar 1 Kurva pengaruh pH pada lipase imobil
Pengaruh Suhu terhadap Kestabilan Lipase Imobil
Seperti halnya perubahan kondisi pH, enzim memiliki kondisi optimal dengan
adanya perubahan suhu. Laju reaksi akan meningkat sejalan dengan kenaikan suhu
sampai pada batas optimalnya, kemudian aktivitas akan menurun setelah melewati
kondisi tersebut karena enzim akan mengalami denaturasi. Suhu yang terlalu rendah
akan menyebabkan aktivitas enzim kurang baik. Secara lengkap pengaruh suhu
terhadap stabilitas enzim imobil pada masing-masing bahan pendukung dapat
dilihat pada gambar 3.

Gambar 2 Kurva pengaruh suhu pada lipase imobil

9
Kestabilan Lipase Rhizopus oryzae Imobil
Penyimpanan lipase imobil pada jangka waktu pada suhu tertentu adalah
salah satu faktor kunci yang cukup dipertimbangkan. Enzim umumnya tetap aktif
saat disimpan pada suhu rendah, dikarenakan lipase cenderung untuk menjaga
struktur aslinya. Atas dasar tersebut lipase disimpan pada suhu 4°C. Secara lengkap
pengaruh waktu penyimpanan terhadap stabilitas enzim imobil pada masingmasing bahan pendukung dapat dilihat pada gambar 4.

Gambar 3 Pengaruh waktu penyimpanan pada lipase imobil
Penggunaan Kembali Lipase Rhizopus oryzae Imobil
Penentuan kemampuan penggunaan kembali lipase imobil, dilakukan
proses pergantian substrat sebanyak tiga kali dalam proses gliserolisis yang
berlangsung selama 81 jam, dimana setiap 27 jam dilakukan pergantian substrat,
tetapi lipase imobil yang digunakan tetap dipertahankan (tidak diganti). Prosedur
tersebut dimaksudkan untuk menguji stabilitas lipase imobil ketika dilakukan
pengamatan berulang dalam proses gliserolisis setiap tiga jam.
Prosedur penentuan kemampuan penggunaan kembali lipase imobil ini
dilakukan setelah proses optimasi waktu gliserolisis. Hal ini berarti bahwa prosedur
penentuan kemampuan penggunaan kembali telah menggunakan lipase imobil
bekas proses optimasi waktu gliserolisis, sehingga terhitung telah digunakan untuk
yang kedua kalinya. Fraksi massa DAG pada penggunaan kembali lipase imobil
CaCO3 terlihat pada gambar dibawah ini.

10

Gambar 4 Fraksi massa DAG pada penggunaan kembali lipase imobil CaCO3
Produksi Diasilgliserol, Analisis Produk, dan Perbesaran Gliserolisis
Reaksi gliserolisis dilakukan dengan variasi waktu yaitu 0, 3, 6, 9, 12, 15,
18, 21, 24, dan 27. Data pada gambar menunjukkan bahwa produk DAG menurun
pada waktu 12 jam, lalu mencapai nilai tertinggi pada waktu 15 jam, kemudian
mengalami penurunan pada waktu 21 jam, kemudian naik kembali pada waktu 24
jam, dan mengalami penurunan pada waktu 27 jam.

Gambar 5 Fraksi massa ALB, MAG, DAG, dan TAG menggunakan lipase bebas
Pada penelitian ini juga dilakukan reaksi gliserolisis menggunakan lipase
imobil CaCO3. Lipase bebas menghasilkan fraksi massa DAG tertinggi pada waktu
15 jam sebesar 18,41%, sedangkan lipase imobil CaCO3 menghasilkan fraksi massa
DAG tertinggi pada waktu 9 jam sebesar 15,02%. Dari data tersebut terliha bahwa
lipase bebas menghasilkan menghasilkan fraksi massa DAG yang lebih tinggi
dibandingkan lipase imobil CaCO3.

11

Gambar 6 Fraksi massa DAG pada lipase bebas dan lipase imobil
Pada penelitian ini juga dilakukan perbesaran skala gliserolisis hingga 25
kali lipat dari skala sebelumnya. Data pada gambar menunjukkan produk DAG
menurun pada waktu 3 jam, kemudian meningkat hingga mencapai nilai tertinggi
pada waktu 21 jam, lalu mengalami penurunan pada waktu 24 jam.

Gambar 7 Fraksi massa ALB, MAG, DAG, dan TAG pada perbesaran skala
gliserolisis

12

4 PEMBAHASAN
Produksi, Pengendapan, dan Analisis Aktivitas Lipase
Rhizopus orzyae merupakan fungi yang termasuk dalam jenis kapang yang
banyak digunakan dalam proses pembuatan tempe kedelai. Rhizopus orzyae dipilih
karena kapang lokal jenis ini bersifat tidak toksik, mudah diperoleh, pertumbuhan
relatif cepat. Isolat Rhizopus orzyae diremajakan dalam media agar kentang (PDA)
lalu diinkubasi selama tiga hari, dan inkubasi fermentasi dilakukan selama lima
hari, dikarenakan berdasarkan penelitian Perwitasari (2008) yang menunjukkan
tingginya aktivitas lipase isolat Rhizopus orzyae pada saat tersebut. Selanjutnya
dilakukan isolasi enzim lipase untuk memekatkan lipase dari cairan hasil fermentasi
(Murni et al. 2015). Isolasi enzim yang diperoleh menggunakan teknik
pengendapan dengan pelarut organik aseton. Penambahan pelarut organik dalam
cairan fermentasi mengurangi kelarutan protein dengan mengurangi konstanta
dielektrik larutan. Pengendapan terjadi lebih mudah ketika pH dekat dengan pI
protein (Panesar et al. 2010). Selanjutnya, aktivitas lipase ditentukan dengan
penentuan kadar asam lemak bebas yang terbentuk melalui proses pemecahan
ikatan ester oleh lipase (Ibegbulam-njoku et al. 2014). Diperoleh hasil sebesar
4,244 mol/menit (4,244 U), yang berarti terjadi pembebasan 4,244 mol asam lemak
bebas dalam setiap satu menit oleh enzim lipase.
Imobilisasi Lipase Rhizopus oryzae
Seperti dapat dilihat pada tabel 1, bahan pendukung CaCO3 menunjukkan
konsentrasi protein teringgi sebesar 99.46%, dibandingkan tulang sapi yang sebesar
91.56% dan zeolit yang hanya sebesar 90.69%. Hal ini dikarenakan luas permukaan
struktur bubuk CaCO3 yang lebih besar dibandingkan butiran tulang sapi dan
butiran zeolit. Semakin besar luas permukaan bahan pendukung maka semakin
besar konsentrasi protein yang dapat terabsorpsi (Zou et al. 2014). Dari sisi struktur
bahan, CaCO3 merupakan garam yang memiliki gaya antarmolekul dengan larutan
lipase cukup baik (Wulan et al. 2007).
Tulang sapi merupakan adsorben organik yang sudah dideproteinasi dan demineralisasi, meninggalkan pori yang dapat diisi oleh zat lain. Dengan pori yang
besar dan luas permukaan yang besar, tulang sapi dapat menyerap lipase dengan
baik dibandingkan zeolit. (Wulan et al. 2007). Zeolit merupakan padatan kristal
yang telah digunakan secara luas dalam adsorpsi molekul. Zeolit memiliki gugus
hidroksil yang dapat membentuk ikatan hidrogen yang kuat dengan enzim. Selain
itu, zeolit memiliki permukaan heterogen yang cocok dengan beberapa sisi adsorpsi
enzim (Datta et al. 2013)
Namun pada bahan pendukung silika gel menunjukkan aktivitas terendah
yaitu sebesar 59.63%. Silika adalah material yang porous dan amorphous. Silika
gel merupakan partikel adsorben alamiah, dimana zat ini akan menyerap air dengan
batas tertentu. Kemampuan adsorpsi permukaan dan intra molekul silika gel sudah
terbukti luas. Namun yang membuat kemampuan adsorpsi silika gel rendah adalah
karena silika gel yang berbentuk padat memiliki kekuatan tarik antar partikel yang
rendah dibandingkan CaCO3 (Wulan et al. 2007). Selain itu, hal tersebut
dikarenakan permukaan silika gel tidak bersifat inert secara fisik dengan lipase

13
(Ghamgui et al. 2004). Hal ini yang diperkirakan menyebabkan lipase tidak terikat
kuat dengan silika gel.
Pengaruh pH pada Kestabilan Lipase Imobil
pH optimum lipase bebas sama seperti lipase imobil tulang sapi yaitu pada
pH 7. Namun pH optimum diperoleh pada pH 8 untuk lipase yang imobil zeolit,
CaCO3, dan silika gel. Hal ini menunjukkan matriks bersifat polianion.
Pendistribusian ion hidroksida yang berbeda antara dekat dengan permukaan di
dalam matriks, dimana muatan positif dekat dengan sisi pengikatan enzim,
mengakibatkan enzim imobil zeolit, CaCO3, dan silika gel memiliki pH optimum
yang lebih tinggi dibandingkan pH optimum pada lipase bebas (Pereira et al. 2001)
Pengaruh Suhu terhadap Kestabilan Lipase Imobil
Suhu optimum pada lipase bebas sama seperti suhu optimum pada lipase
imobil zeolit, silika gel, dan tulang sapi yaitu sebesar 30°C. Namun terjadi
peningkatan suhu optimum pada lipase imobil CaCO3 yaitu sebesar 35°C.
Imobilisasi lipase Rhizopus oryzae pada CaCO3 dapat mengakibatkan
meningkatnya termostabilitas enzim dan memperluas potensi bioteknologi, karena
bioproses berjalan pada suhu yang lebih tinggi dapat meningkatkan tingkat difusi,
menurunkan viskositas substrat, dan meningkatkan kelarutan reaktan (Kilinc et al.
2006). Hal ini merupakan hal yang diinginkan, karena suhu operasional yang lebih
tinggi akan menyebabkan resiko yang lebih rendah dari kontaminasi mikroba
(Pereira et al. 2001).
Kestabilan Lipase Rhizopus oryzae Imobil
Pada gambar 4 terlihat bahwa aktivitas lipase bebas lebih tinggi lipase imobil
pada minggu pertama. Namun aktivitas lipase imobil lebih tinggi daripada lipase
bebas sejak minggu kedua hingga minggu keenam. Lipase imobil lebih stabil
dibandingkan enzim bebas dikarenakan dukungan matriks mencegah proses
antarmolekul seperti proteolisis dan agregasi, oleh karena itu menciptakan molekul
enzim yang lebih kaku (Yesiloglu & Sit 2011).
Penggunaan Kembali Lipase Rhizopus oryzae Imobil
Pada gambar 4 terlihat bahwa lipase imobil memiliki kemampuan untuk
mengkatalisis proses gliserolisis berulang-ulang. Dari hasil pada gambar terlihat
fraksi massa DAG dari tiap siklus dan tiap perlakuan pergantian substrat CPO relatif
sama atau tidak berbeda jauh. Hal ini mengindikasikan bahwa aktivitas lipase tetap
stabil dan tidak menurun drastis seiring dengan bertambahnya waktu gliserolisis
dan banyaknya penggunaan substrat baru.
Pada penggunaan substrat pertama, didapatkan fraksi massa DAG tertinggi
sebesar 15,02%, pada penggunaan substrat kedua sebesar 30,32%, dan pada
penggunaan substrat ketiga sebesar 22,61%. Fraksi massa DAG pada penggunaan
substrat kedua lebih tinggi dibandingkan pada penggunaan substrat pertama. Hal
ini dikarenakan suplai (donor) asil baru yang tersedia kembali untuk membentuk
tambahan fraksi massa DAG, sehingga nilai konversinya menjadi lebih tinggi.
Penurunan fraksi massa DAG pada penggunaan substrat ketiga dikarenakan kondisi
tersebut sudah mencapai kondisi optimum, sehingga tidak dapat lagi meningkatkan
fraksi massa produk.

14

Produksi Diasilgliserol, Analisis Produk, dan Perbesaran skala Gliserolisis
Gliserolisis merupakan suatu reaksi antara gliserol dengan minyak/lemak
untuk menghasilkan produk MAG dan DAG (Kimmel 2004). Salah satu faktor
penting pada proses gliserolisis adalah kelarutan atau kontak antara TAG dan
gliserol (Cheirshilp et al. 2007; Susi 2010), karena alasan tersebut maka dalam
penelitian ini digunakan heksana sebagai pelarut organik. Dipilihnya heksana
sebagai pelarut organik karena heksana merupakan pelarut yang dapat melarutkan
substrat CPO; membantu dalam meningkatkan rendemen produk DAG serta dapat
meningkatkan kelarutan minyak dan gliserol dalam proses gliserolisis, sehingga
proses gliserolisis dapat berlangsung lebih optimal (Nuraeni 2008). Selain itu,
penggunaan pelarut heksana memiliki bau yang tidak tajam sehingga tidak
mengganggu nilai organoleptik produk akhir yang dihasilkan (Susi 2010). Adanya
penambahan heksana dapat membuat kandungan TAG pada CPO berkurang. Hal
ini dikarenakan heksana adalah pelarut non polar dan TAG dalam CPO dapat
terlarut di dalamnya, karena TAG lebih bersifat non polar daripada DAG dan MAG,
membuat TAG dapat terpisah dari DAG dan MAG.
Enzim merupakan katalisator sejati. Molekul ini dapat meningkatkan
kecepatan reaksi kimia. Katalis yang digunakan dalam rekasi gliserolisis ini adalah
enzim lipase. Rhizopus orzyae dapat menghasilkan enzim lipase yang bersifat
spesifik 1,3 gliserida. Spesifitas lipase dari R. oryzae yang bersifat spesifik 1,3 telah
dilaporkan melalui penelitian yang dilakukan antara lain Arini (2005); Putranto et
al. (2006); Perwitasari (2008), serta Suharyanto et al. (2011). Enzim lipase dari R.
oryzae yang bersifat spesifik dalam menghidrolisis TAG pada posisi 1,3 dapat pula
dibuktikan dengan rumusan yang dikemukakan oleh Arini (2005) dan Panji et al.
(2008). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa nilai perbandingan DAG/TAG
lebih besar dari ALB/TAG, yaitu 0,23 > 0,04, sehingga dapat disimpulkan bahwa
lipase yang digunakan bersifat 1,3-gliserida. Kerja lipase yang spesifik 1,3 ini
sangat penting dalam penggunaannya untuk produksi DAG karena reaksi
gliserolisis enzim dapat dikendalikan dan tidak menghasilkan pemecahan total
gliserida menjadi ALB seperti yang biasa terjadi pada pemecahan secara nonenziatis (kimiawi) (Panji et al. 2008)
Ketika suatu lipase digolongkan berdasarkan sifat spesifitasnya dalam
menghidrolisis substrat, maka lipase tersebut dapat dibagi atas dua jenis, yaitu
lipase non spesifik dan lipase spesifik. Lipase non spesifik akan menghidrolisis
TAG pada ketiga posisi ikatan ester sehingga yang dihasilkan adalah asam-asam
lemak dan gliserol, sedangkan lipase spesifik akan menghidrolisis ikatan ester pada
posisi 1,3 sehingga produk yang terbentuk adalah asam-asam lemak, MAG dan
DAG (Suharyanto et al. 2011).

15

Gambar 8 Reaksi hidrolisis trigliserida menjadi diasilgliserol (Paques dan
Macedo 2006)
Pada gambar 5 dan 7 terlihat adanya ketidakstabilan enzim dalam presentase
perubahan fraksi massa DAG, dapat disebabkan karena kerja lipase yang
mengkatalisis reaksi hidrolisis TAG menjadi DAG, juga reaksi esterifikasi MAG
dengan ALB ataupun ALB dengan gliserol untuk membentuk DAG. Adanya
penurunan fraksi massa produk DAG seperti terlihat pada waktu ke 12, 21, dan 21
jam disebabkan karena DAG yang terbentuk dapat mengalami hidrolisis kembali
menjadi MAG dan ALB. Hal ini menunjukkan bahwa lipase merupakan enzim yang
dapat mengkatalisis reaksi dua arah, yaitu hidrolisis dan esterifikasi (Turner et al.
2008).

Gambar 9 Reaksi hidrolisis TAG oleh lipase (Palilingan 2013)

16

Gambar 10 Reaksi esterifikasi asam lemak dan gliserolisis oleh lipase
(Hermansyah et al. 2010)
Pada gambar 6 terlihat adanya ketidakstabilan enzim dalam presentase
perubahan fraksi massa DAG saat menggunakan lipase imobil. Hal ini dikarenakan
teknik imobilisasi CaCO3 menggunakan metode imobilisasi adsorpsi. Menurut
Kneevic et al. (2004), metode adsorpsi merupakan teknik yang paling mudah dan
murah dilakukan. Akan tetapi teknik imobilisasi dengan adsorpsi membentuk
ikatan antara enzim dengan bahan pendukung yang sangat lemah (terutama ikatan
Van der Waals, ikatan hidrogen, dan interaksi hidrofobik), sehingga
memungkinkan lipase untuk terdesorpsi dari materi pendukung, dan dapat berakibat
pada menurunnya aktivitas lipase.
Selain itu, menurut Su et al. (2007) adanya pelarut heksana yang digunakan
dalam proses gliserolisis, diduga dapat menyebabkan perubahan konformasi dari
lipase, sehingga dapat menyebabkan lipase terdenaturasi, sehingga aktivitas
menurun. Kondisi tersebut berbeda dengan gliserolisis menggunakan lipase bebas,
dimana lipase bebas terlidung/terlarut dalam larutan buffer dalam jumlah yang
banyak sehingga kemungkinan lipase untuk terdenaturasi oleh heksana menjadi
lebih kecil dibandingkan lipase imobil.

5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Imobilisasi enzim lipase Rhizopus oryzae dengan teknik adsorpsi dapat
dilakukan menggunakan zeolit, CaCO3, silika gel, dan tulang sapi. Adsorpsi enzim
tertinggi pada CaCO3 yaitu sebesar 99,46%, lalu tulang sapi (91,56%), zeolit
(90,69%), dan silika gel (59,63%). Kondisi optimum lipase bebas ialah pH 7 dan
temperatur 30°C sedangkan pada lipase imobil CaCO3 ialah pH 8 dan temperatur

17
35°C. Seluruh lipase imobil lebih stabil dibandingkan enzim bebas sejak
penyimpanan pada minggu pertama. Lipase imobil CaCO3 dapat digunakan
kembali hingga tiga kali penggunaan. Konversi gliserolisis lipase imobil CaCO3
mencapai 15,02% selama 9 jam lebih rendah dibandingkan menggunakan lipase
bebas sebesar 18,41% selama 15 jam.

Saran
Sebaiknya dilakukan tahap pemurnian lipase lebih lanjut dengan dialisis dan
kolom filtrasi gel. Pemurnian lebih lanjut meningkatkan ketelitian dan identifikasi
karakteristik lipase. Selain itu, memodifikasi teknik imobilisasi pada setiap bahan
pendukung untuk memperoleh adsorpsi enzim yang lebih baik.

DAFTAR PUSTAKA
Anggirasti, Hariyadi P, Andarwulan N, Haryati T. 2008. Gliserolisis RBDPO
(Refined Bleached Deodorized Palm Oil) dengan Lipase untuk Sintesis
MDAG (Monodiasilgliserol). Prosiding Seminar PATPI, Palembang.
Apriyanti S. 2012. Optimasi Produksi Diasilgliserol dari CPO dengan Biokonversi
Enzim Lipase Spesifik 1,3 Amobil [Skripsi]. Bogor (ID) : Universitas Pakuan.
Arini N. 2005. Isolasi dan penapisan mikroba penghasil lipase spesifik 1,3-gliserida
serta penentuan kondisi optimum produksi diasilgliserol menggunakan
minyak sawit mentah [tesis]. Depok (ID): Universitas Indonesia.
Cheirsilp B, Kaewtong W, Kittikun AH. 2007. Kinetic study of glycerolysis of palm
olein for monoacylglycerol production by immobilied lipases. Biochl
Engineering Journal. 35:71-80
Cheong LZ, Lai MO. 2009. Diacylglycerol oil: Healthful or Hype? Inform.
20(6)391-393.
Datta S, Christena LR, Rajaram YRS. 2013. Enzyme immobiliation: an overview
on techniques and support materials. Journal Biotech. 3:1-9.
DOI:10.1007/s13205-012-0071-7
Ghamgui H, Chaabouni MK, Gargouri Y. 2004. 1-butyl oleate synthesis by
immobilzed lipase from Rhizopus oryzae: a comparative study between nhexane and solvent free system. Enzyme and Microbial Technology. 35:355363. DOI: 10.1016/j.enzmictec.2004.06.002
Hasanuddin A, Mappiratu, Hutomo GS. 2003. Pola perubahan mono dan
diasilgliserol dalam reaksi etanolisis minyak sawit mentah. J Tekn & Indust
Pangan. 14(3):241-247.
Hermansyah H, Utami TS, Arbianti R, Achmadi F. 2010. Simulasi reaksi
esterifikasi asam lemak bebas dan gliserol untuk menghasilkan minyak
diasilgliserol. Reaktor. 13(2):95-120.
Ibegbulam-njoku PN, Achi OK, Chijioke-Osuji CC. 2014. Use of palm oil mill
effluent as fermentative medium by lipase producing bacteria. International

18
Journal of Sciencetific & Engineering Research. 5(2):1631-1640. DOI:
10.1590/S1516-89132011000100015
Keenevic D, Siler-Marinkovic SS, Mojovic LV. 204. Immobilied lipase as practical
catalysts. APTEFF. 35:1-280
Kharrat N, Yassine BA, Sana M, Youssef-Talel G, Maha K. 2011. Immobilization
of Rhizopus oryzae lipase on silica aerogels by adsorption: Comparison with
the
free
enzyme.
Process
Biochemistry.
46:1083-1089.
DOI:10.1016/j.procbio.2011.01.029
Kilinc A, Mustafa T, Azmi T. 2006. Immobilization of pancreatic lipase on chitin
and chitosan. Prep Biochem Biotechnol. 36:153-163. DOI:
10.1080/10826060500533976
Kimel T. 2004 Kinetic investigation of the base-catalyed glycerolysis of fatty acid
methyl esther. Genehmigte Dissertation, Technischen Universtat Berlin.
Berlin. Germany.
Kirk, O. Vedel T. Crone C. 2002. Industrial Enzyme Application. Current opinion
on biotechnology. 13:345-351. DOI: 10.1016/S0958-1669(02)00328-2
Kong GT. 2010. Peran Biomassa Bagi Energi Terbarukan. Jakarta: Elex Media
Komputindo.
Kusumo DP. 2008. Sintesis dan Karakterisasi Minyak Kaya DAG (MKDAG)
Berbahan Baku RBDPO (Refined Bleached Deodorized Palm Oil) dengan
Metode Gliserolisis Enzimatis [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Lee DH, Kim JM, Kang SW, Lee JW, Kim SW. 2006. Pretreatment of lipase with
soybean oil before immobilization to prevent loss of activity. Biotechnol Lett.
28:1965-1969. DOI: 10.1007/s10529-006-9181-9
Murni SW, Kholisoh SD, Tanti DL, Petrissia EM. 2015. Produksi, karakterisasi,
dan isolasi lipase dari Aspergillus niger menggunakan minyak goreng sawit
sebagai induser. Eksergi. 12(1):1-4.
Nuraeni F. 2008. Sintesis mono-diasilgliserol (M-DAG) dari destilat asam lemak
minyak saw