Identification and extraction of Red Pigment of pathogenic bacteria to Stem Brown Planthopper (WBC)
IDENTIFIKASI BAKTERI ENTOMOPATOGENIK
TERHADAP WERENG BATANG COKELAT
YOHANA ARTDHI DAHLIANI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
ABSTRAK
YOHANA ARTDHI DAHLIANI. Identifikasi dan Ekstraksi Pigmen Bakteri Merah Patogenik
terhadap Wereng Batang Cokelat. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan TRI PUJI PRIYATNO.
Wereng Batang Cokelat merupakan salah satu hama tanaman padi yang berbahaya dan
sukar dikendalikan. Penemuan bakteri merah yang mampu menginfeksi wbc menjadi hal yang
sangat penting, karena wbc dengan tipe mulut pencucuk penghisap sangat jarang terinfeksi oleh
bakteri. Penelitian ini dilakukan untuk mengidentifikasi spesies bakteri merah yang patogenik
terhadap wbc, serta mengekstraksi pigmen bakteri merah untuk diuji aktivitasnya. Pertama
pengisolasian dan peremajaan bakteri, pengujian fenotipe dengan menggunakan kit GN
MicroPlateTM Biolog kit, analisis sekuen nukleotida 16S rDNA dengan software BlastN yang
terdapat dalam situs NCBI. Analisis filogenetika menggunakan program PHYLIP versi 3.6.Bakteri
merah yang diidentifikasi adalah Serratia marcescens. S. marcescens sensitif terhadap
streptomisin dengan konsentrasi 25 µg/ml hingga 50 µg/ml. Metabolit sekunder yang dihasilkan
bakteri merah adalah prodigiosin dengan konsentrasi 150 µg/ml mampu menekan perkembangan
penyakit kresek yang disebabkan oleh Xanthomonas oryzae pv. oryzae sebesar 30 %.
Kata kunci : Bakteri merah, Serratia marcescens, prodigiosin.
ABSTRACT
YOHANA ARTDHI DAHLIANI. Identification and extraction of Red Pigment of pathogenic
bacteria to Stem Brown planthopper (wbc). Superviced by IMAN RUSMANA and TRI PUJI
PRIYATNO.
Brown Planthopper Bar (BPH) is a dangerous and rebelliousness pests of rice. Discovery
of red bacteria that can infect bph becomes very important, because the bph, as the piercing and
sucking type insect mouth, was rarely infected by bacteria. This study was conducted to identify
the bph red pathogenic bacteria, and to determine production and inhibition activity of red
pigment. Bacterial phenotypes was perfomed using GN Microplate TM Biolog kit. Nukleotide
sequence aligment of 16S rDNA was analyed with BlastN of the NCBI website. Phylogenetic Tree
was contructed by PHYLIP version 3.6 program. The red bacterium was identified as Serratia
marcescens . S. marcescens was sensitive to streptomycin with concentration of 25µg/ml and 50
µg/ml. Red pigment produced by S. marcescens was determined as prodigiosin. Prodigiosin in
concentration of 150µg/ml able to suppress up to 30% the development a bacterial leaf blight
caused by Xanthomonas oryzae pv. oryzae.
Keyword : Red bacteria, Serratia marcescens, prodigiosin.
IDENTIFIKASI BAKTERI ENTOMOPATOGENIK
TERHADAP WERENG BATANG COKELAT
YOHANA ARTDHI DAHLIANI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
Judul
: Identifikasi Bakteri Entomopatogenik terhadap Wereng Batang
Cokelat
: Yohana Artdhi Dahliani
: G34070084
Nama
NIM
Menyetujui:
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si
NIP 1965072019911031002
Dr. Tri Puji Priyatno
NIP 196603211992031002
Mengetahui:
Ketua Departemen Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.S
NIP 196410021989031002
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji syukur penulis ucapkan kepada Tuhan Yang Maha Esa yang telah memberikan rahmat
dan karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Tema yang dipilih dalam
penelitian ini adalah mengenai pigmen bakteri merah yang dihasilkan oleh bakteri Serratia
marcescens dengan judul Identifikasi Bakteri Entomopatogenik terhadap Wereng Batang Cokelat
yang dilaksanakan mulai bulan Desember 2010 hingga April 2011 di Laboratorium Biokimia,
Balai Besar Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Bogor.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si. dan Bapak
Dr. Tri Puji Priyatno selaku pembimbing atas arahan dan bimbingan yang diberikan dalam
pelaksanaan penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Terima kasih yang sebesar-besarnya
kepada Keluarga tercinta ayah, ibu, adik, Leonard Simbolon dan Keluarga Besar atas do’a,
dukungan, dan kasih sayang yang diberikan. Terima kasih juga kepada Pak Made, Pak Yadi, Bu
Alina, Bu Ntin, Pak Wawan,Bu Uum Kak Pipit, Kak Delly, Novia, Resti, Keluarga Besar
Laboratorium Biokimia, Balai Besar Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian,
serta sahabat sahabat Rani, Ivan, Vita, Tira, Fitri, Nita, dan teman-teman seperjuangan di Biologi
44 atas semua kebersamaan dan motivasi yang telah diberikan.
Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat
Bogor, 4 Juli 2011
Yohana Artdhi Dahliani
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Pekalongan pada tanggal 25 Mei 1989 dari ayah Yohanes Petrus
Sarbani dan ibu Fransiska Elisabeth Murdiyanti. Penulis merupakan anak pertama dari dua
bersaudara. Tahun 2007 penulis lulus dari SMA Negeri 2 Pekalongan dan pada tahun yang sama
lulus seleksi masuk IPB melalui Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis memilih Program Studi
Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Penulis menjadi asisten praktikum mata kuliah Fisiologi Tumbuhan pada tahun ajaran
2010/2011.Pada tahun 2009, penulis melakukan studi lapang di Kawasan wana Wisata
Cangkuang Sukabumi, dengan judul makalah “Laju Dentrifikasi dan Nitrifikasi Mikroba Tanah
Hutan Cangkuang”. Pada tahun 2010, penulis melakukan praktik lapang di PT Perkebunan
Nusantara IX Divisi Tanaman Tahunan (Kebun Blimbing) dari bulan Juni sampai bulan Juli
dengan judul laporan “Budidaya Tanaman Karet dan Proses Pengolahan Karet di PT Perkebunan
Nusantara IX Kebun Blimbing Pekalongan Jawa Tengah”. Pada tahun 2010/2011, penulis
berkesempatan melakukan penelitian di Laboratorium Biokimia, Balai Besar Penelitian
Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Bogor.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ......................................................................................................................viii
DAFTAR GAMBAR ................................................................................................................. viii
DAFTAR LAMPIRAN ..............................................................................................................viii
PENDAHULUAN ......................................................................................................................... 1
Latar Belakang.......................................................................................................................... 1
Tujuan ...................................................................................................................................... 1
Waktu dan Tempat .................................................................................................................... 1
METODE ...................................................................................................................................... 1
Isolasi Bakteri dan Peremajaan ................................................................................................. 1
Uji Patogenisitas Bakteri Merah terhadap Wereng Batang Cokelat............................................ 1
Uji Fenotipe .............................................................................................................................. 2
Ekstraksi DNA Bakteri Merah .................................................................................................. 2
Sensitivitas Bakteri Merah terhadap Antibiotik ......................................................................... 2
Amplifikasi 16S DNA Ribosomal ............................................................................................. 2
Sekuensing Fragmen DNA ....................................................................................................... 2
Analisis Sekuen Nukelotida ...................................................................................................... 3
Analisis Filogenetika ................................................................................................................ 3
Produksi dan Ekstraksi Prodigiosin ........................................................................................... 3
Purifikasi Prodigiosin ............................................................................................................... 3
Uji Antibakteri Prodigiosin ....................................................................................................... 3
Uji Efikasi Prodigiosin terhadap Penyebab Penyakit Kresek pada Tanaman (Xanthomonas
Oryzae pv. oryzae) .................................................................................................................... 4
HASIL .......................................................................................................................................... 4
Peremajaan Isolat ...................................................................................................................... 4
Patogenisitas Bakteri Merah terhadap Wereng Batang Cokelat ................................................. 4
Karakteristik Fenotipe ............................................................................................................... 4
Amplifikasi 16S rDNA Ribosomal ............................................................................................ 5
Analisis Sekuen Nukelotida 16S rDNA ..................................................................................... 5
Analisis Filogenetika ................................................................................................................ 5
Ekstraksi dan Purifikasi Prodigiosin .......................................................................................... 6
Uji Antibakteri Prodigiosin ....................................................................................................... 6
PEMBAHASAN ........................................................................................................................... 8
SIMPULAN .................................................................................................................................. 9
SARAN ......................................................................................................................................... 9
DAFTAR PUSTAKA.................................................................................................................... 9
LAMPIRAN ................................................................................................................................ 11
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Efektifitas bakteri merah terhadap wbc setelah 10 hari aplikasi .............................................. 4
2 Sensitifitas bakteri merah terhadap antibiotik .......................................................................... 5
3 Hasil uji daya hambat prodigiosin dengan pengenceran ynag berbeda ..................................... 7
4 Hasil uji daya hambat prodigiosin Escherichia coli dan layu ubi jalar ..................................... 7
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Biakan Serratia marcnesces (a) pada media LB agar, (b) pada media LB agar miring .............4
2 Grafik efektivitas bakteri merah terhadap wbc .........................................................................4
3 Elektriforesis agarose gel hasil ekstraksi DNA genom (a) produk PCR 16S rDNA bakteri
merah (b) ..............................................................................................................................5
4 Pohon filogenetik bakteri merah ..............................................................................................6
5 Kultur bakteri merah yang berumur 5 hari (a), ekstraksi prodigiosin dalam pelarut etil
asetat (b) ..................................................................................................................................6
6 Hasil analisis prodigiosin dengan kromatografi lapis tipis silica gel (a), dan spektrofotometer 6
7 Daya hambat prodigiosin berdasarkan pengujian metode cawan petri (a), bioluminator pada
lapis tipis silica gel ..................................................................................................................7
8 Grafik efektivitas prodigiosin terhadap penyakit kresek ...........................................................7
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Lampiran 1. Karakteristik fenotipe bakteri merah berdasarkan pengujian dengan Biolog GN
MicroplateTM ..........................................................................................................................12
2 Perunutan sekuen nukleotida 16 S DNA hasil analisis software Blastn yang terdapat dalam
situs National Center for Biotechnology Information ...............................................................13
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Wereng
Batang
Cokelat
(wbc,
Nilaparvata lugens) merupakan salah satu
hama utama tanaman padi yang paling
berbahaya dan sukar dikendalikan. Wbc
merusak tanaman dengan cara menghisap
nutrisi dari tanaman sehingga pertumbuhan
dan perkembangan tanaman menjadi
terganggu, bahkan mati. Selain itu, wbc juga
menjadi vektor virus yang menyebabkan
penyakit kerdil rumput dan kerdil hampa
(Alamendah 2004). Berbagai musuh alami
wbc seperti predator, parasitoid dan patogen
telah
diidentifikasi
dan
banyak
dimanfaatkan
untuk
mengendalikan
populasi wbc. Salah satu patogen yang
dilaporkan menginfeksi wbc adalah bakteri
merah. Wereng batang cokelat yang mati
terinfeksi bakteri merah sering dijumpai di
tempat perbanyakan wbc di rumah kaca dan
di lapang saat populasinya tinggi. Gejalanya
ditunjukan oleh busuk basah dan warna
merah pada tubuhnya.
Bakteri yang berhasil diisolasi juga
menunjukkan pertumbuhan koloni berwarna
merah pada media Lurial Bertani (LB) agar.
Dalam uji postulat Koch, bakteri merah
terbukti bersifat patogenik terhadap wbc
(Baskoro et al. 2002). Bahkan bakteri
tersebut juga patogenik terhadap Spodoptera
exigua, Plutella xylotella, Crocidolomia
binotallis, kutu daun mangga (Rastrococcus
sp), dan belalang berkembar (Baskoro et al.
2002). Di New Zealand, dua bakteri
entomopatogen non-sporing forming dari
genus Serratia, yaitu S. entomophila dan S.
proteamaculans, telah berhasil dikembang
kan menjadi biopestisida yang efektif untuk
mengendalikan grass grub (Costelytra
zealandica). Hal ini menunjukkan bahwa
bakteri merah mempunyai potensi untuk
digunakan sebagai agensia pengendalian
biologi wbc dan serangga hama lainnya.
Serratia yang diisolasi dari wereng
coklat dicirikan oleh koloninya yang
cembung dan menghasilkan pigmen merah
pada media agar yang mengandung fosfat,
karbonat dan besi (Giri et al.2004). Pigmen
merah merupakan salah satu indikasi adanya
produksi prodigiosin pada genus Serratia.
Pigmen merah yang dihasilkan oleh Serratia
merupakan metabolit sekunder yang dikenal
sebagai prodigiosin yang merupakan famili
pigmen merah tripyrrole yang umumnya
mengandung 4-methoxy, ring 2-2 bipyrolle
(Giri et al. 2004). Prodigiosin adalah
metabolit sekunder multi aspek yang
mempunyai aktivitas sebagai antibakteri,
antifungi, antiprotozoal (Croft et al. 2002),
bersifat cytotoxic (Nakashima et al. 2005),
antitumor (Castro 1967, Perez-Tomás et al.
2003), antimalaria, antidiabetes ,obat-obatan
anti-inflammatory nonsteroidal, antioksidan
serta menjadi pewarna untuk sutera dan wol
(Khanafari et al. 2006). Pemanfaatan bakteri
merah untuk pengendalian wbc belum
banyak dilakukan, hal ini disebabkan karena
spesies bakteri tersebut belum diketahui.
Oleh karena itu perlu dilakukan identifikasi
bakteri patogenik terhadap wbc .
Tujuan
Penelitian
ini
bertujuan
untuk
mengidentifikasi bakteri yang patogenik
terhadap wbc dan mengkarakterisasi
pigmen yang dihasilkannya.
Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan pada bulan
Desember 2010 sampai April 2011 di
Laboratorium Biokimia, Balai Besar
Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya
Genetik Pertanian, Bogor.
METODE
Isolasi Bakteri dan Peremajaan
Bakteri entomopatogen merah diisolasi
dari wbc koloni Jatisari yang mati dengan
gejala warna merah pada tubuhnya.Wereng
yang telah mati dimasukkan dalam tabung
mikro yang telah diisi NaCl 0.85% 300 µl ,
divorteks
hingga
larutan
bewarna
kemerahan. Koloni bakteri tumbuh setelah
24-48 jam inkubasi pada suhu ruangan.
Koloni tunggal bakteri yang berwarna merah
diisolasi dan dipelihara pada media Lurial
Bertani Broth (triptose 1%, ekstrak khamir
0.5%, NaCl 1%, agar 1.5%). Koloni
dilakukan peremajaan 2 minggu sekali pada
agar miring di dalam tabung reaksi.
Uji Patogenisitas Bakteri Merah terhadap
Wereng Batang Cokelat
Bakteri merah diuji patogenisitasnya
terhadap nimfa wbc instar 2-3. Pengujian
dilakukan pada tanaman padi varietas
Cisadane yang berumur 35 hari setelah
tanam di rumah kaca. Sebanyak 5 ml
suspensi bakteri dengan konsentrasi antara
104-108 sel/ml disemprotkan secara merata
pada seluruh bagian tanaman terutama pada
bagian
batang
tanaman
dengan
menggunakan
hand
spring.
Sebagai
2
tanaman kontrol disemprot dengan akuades
steril.
Setelah
penyemprotan
dan
diselubungi dengan plastik milar, sebanyak
20 ekor nimfa wbc diinfestasikan kedalam
tanaman. Mortalitas wbc diamati setiap hari
selama 15 hari.
Uji Fenotipe
Fenotipe bakteri merah diuji dengan kit
GN MicroPlateTM Biolog. Bakteri dibiakan
dalam 5 ml media LB cair di dalam tabung
reaksi dan diinkubasikan dalam orbital
shaker selama 16 jam pada suhu ruangan.
Sel
bakteri
dipanen
dengan
cara
disentrifugasi dan dicuci dengan 0.85%
NaCl sebanyak tiga kali. Sel bakteri
disuspensikan dalam 0.85%
NaCl dan
dibuat pengenceran hingga nilai OD600
mencapai 0.5. Selanjutnya suspensi bakteri
diinokulasikan dalam kolom dari kit GN
MicroPlateTM Biolog sebanyak 150 µl per
kolom. Fenotipe bakteri diamati setelah 24
jam inkubasi pada suhu 28°C. Reaksi positif
ditunjukkan oleh perubahan warna biakan
menjadi ungu.
Ekstraksi DNA Bakteri Merah
Bakteri merah dikulturkan dalam media
LB selama 18 jam kemudian di shaker.
Biakan bakteri diambil sebanyak 2 ml,
kemudian disentrifuse 10000 rpm selama 5
menit, untuk didapatkan peletnya. Pelet
disuspensikan dengan larutan buffer solution
I sebanyak 50 µ l, buffer solution II 150µl ke
dalam suspensi bakteri, dicampur merata
dengan digoyang lambat dan diinkubasi
selama 5-20 menit pada suhu ruang (27°C).
Sebanyak 250 µ l solution III ditambahkan
dikocok kuat. Suspensi disentrifuse 10000
rpm selama 5 menit.Supernatan dipindahkan
ke tabung mikro baru dan ditambah fenol
dalam klorofom isoamil 100 µl,disentrifuse
10000 rpm selama 10 menit. Supernatan
diambil sebanyak 600 µ l, ditambahkan 600
µ l isopropanol. Disentrifuse kembali,
supernatan dibuang, peletnya diambil dan
ditambah aquades 20µ l.
Sensitivitas Bakteri Merah terhadap
Antibiotik
Bakteri merah diujui sensitivitasnya
terhadap beberapa antibiotik seperti
kloramfenikol, kasugamisin, rimfamisi
,streptomisin,
dan ampisilin
dengan
konsentrasi masing masing 25 µg/ml dan 50
µg/ml. Antibiotik ditambahkan ke dalam
media LB sebanyak 25 µg/ml dan 50 µg/ml.
Kemudian bakteri Serratia marcescens
ditumbuhkan dengan metode gores pada
media tersebut dan diinkubasi pada suhu
ruang selama 3 hari.
Amplifikasi 16S DNA Ribosomal
Identifikasi bakteri merah dilakukan
berdasarkan sekuen nukleotida 16S rDNA .
Amplifikasi fragmen DNA dilakukan
dengan sepasang primer 63F (C A G G C C
T A) dan 1387R (G G G C G G W G T G T
A C A A G G C) menggunakan mesin PCR.
Komposisi 20 µl reaksi PCR terdiri dari 2 µ l
10X bufer PCR, 1.5 µl 50 mM MgCl2, 0.5
µl 4 mM dNTP, 1 µl 20 mM primer
forward, 1 µl 20 mM primer reverse, 0.5 µl
5U Taq Polimerase, dan 13.5 µl air destilasi
steril. Reaksi PCR diletakan dalam tabung
PCR berukuran 0.2 ml. Templet DNA untuk
PCR menggunakan koloni tunggal bakteri
dari biakan yang berumur 18 jam pada
media LB agar di dalam cawan petri. Mesin
PCR dijalankan dengan program sebagai
berikut, yaitu denaturasi awal DNA pada
suhu 94°C selama 10 menit, denaturasi
kedua 94°C 1 menit, annealing 50°C 45
detik, dan extension 72 °C 1 menit 30 detik
dengan siklus sebanyak 35 kali. Produk PCR
dicek pada gel agarose yang dielektroforesis
dengan 90 volt selama 30 menit dalam bufer
TAE.
Sekuensing Fragmen DNA
Sekuensing DNA dilakukan dengan
ABI PRISM 3070 DNA Sequencer. Reaksi
sekuensing dibuat dengan ABI PRISM Big
DyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready
Reaction Kit (PE Biosystems, USA) sesuai
dengan petunjuk. Reaksi sekuensing
mengandung 200 ng DNA, 3.2 pmol primer,
1 µl Big Dye Terminator Ready Reaction
Mix dan air destilasi steril yang
ditambahkan hingga volume akhir menjadi
10 µl. Sekuensing dijalankan dalam mesin
PCR Thermal Cycler (Biometra, USA)
sebanyak 35 siklus dengan program 96°C
selama 30 detik, 50°C selama 5 detik and
60°C selama 1 menit. Selanjutnya, produk
PCR
dimurnikan
dengan
metode
pengendapan etanol. Reaksi sekuensing
ditambah 1 µl 125 mM EDTA, 1 µl 3 M
sodium asetat pH 4, dan 25 µl 100%
ethanol. Setelah diinkubasikan selama 15
menit pada suhu ruangan, campuran
disentrifugasi 12000 rpm selama 20 menit
pada suhu 4°C. Pelet dicuci dua kali dengan
70% etanol dan dikeringkan pada suhu 65°C
selama 10 menit.
3
Analisis Sekuen Nukelotida
Hasil perunutan sekuen nukleotida 16S
rDNA dianalisis dengan software BlastN
yang terdapat dalam situs National Center
for Biotechnology Information (NCBI,
www.ncbi.nlm.nih.gov) untuk mengetahui
tingkat kekerabatan terdekat dengan bakteri
yang ada di dalam Database GeneBank
(NCBI). Dalam menganalisis tingkat
kemiripan runutan DNA antara strain dalam
satu spesies dan antara spesies dalam satu
genus digunakan program interaktif dengan
mengirimkan urutan nukleotida DNA dalam
format Fasta melalui internet dengan cara
salin dan tempel pada kolom khusus yang
telah
disediakan
oleh
GeneBank.
Selanjutnya sekuen 16S rDNA dalam
GeneBank yang mempunyai kekerabatan
dengan sekuen 16S rDNA dari bakteri
merah diambil untuk analisis pohon
filogenetika.
Analisis Filogenetika
Analisis
filogenetika
dilakukan
menggunakan program PHYLIP versi 3.6
(University of Washington). Sebelum
analisis, runutan nukleotida semua isolat
yang terpilih dimodifikasi dengan software
ClustalX 1.83 untuk menyamakan format
runutannya. Matrik jarak genetika dihitung
dengan menggunakan matrik parameter
dalam program komputer DNAML. Analisis
boostrap dengan 100 ulangan dilakukan
menggunakan program SEQBOOT dan
konsensus pohon filogenetikanya dibuat
dengan program CONSENSE. Pohon
filogenetikanya
digambarkan
dengan
program MEGA4 dalam paket program
PHYLIP.
Produksi dan Ekstraksi Prodigiosin
Prodigiosin diproduksi dalam 250 ml
media LB cair ( triptose 1%, yeast ekstract
0.5%, NaCl 1% ). Media dimasukan dalam
erlenmeyer (1 liter) dan diautoklaf pada
suhu 121ºC dan tekanan 1 atm selama 20
menit. Setelah dingin, media diinokulasi
dengan 1 ml biakan Serratia yang berumur
16 jam yang sebelumnya telah dibiakan di
media LB cair dan diukur panjang
gelombang 600 dengan nilai OD 0.5. Biakan
diinkubasikan dalam orbital shaker (150
rpm) selama 5 hari pada suhu ruangan.
Biakan disentrifugasi kecepatan 5000 rpm, 4
°C selama 20 menit untuk memisahkan
supernatan dari pelet sel bakteri. Ekstraksi
prodigiosin dari supernatan dilakukan
dengan metanol-chloroform atau etil asetat
(Davaraj et al. 2009). Supernatan dimasukan
kedalam tabung fraksi dan ditambahkan 100
ml etil asetat, dikocok kuat hingga larutan
tercampur secara menyeluruh. Kemudian
didiamkan selama beberapa menit untuk
memisahkan fraksi air dari etil asetat yang
bercampur prodigiosin. Etil asetat yang
mengandung prodigiosin dievaporasi dengan
rotary evaporator pada suhu 35ºC selama
kurang lebih 20 menit. Selanjutnya
prodigiosin dilarutkan dalam DMSO.
Purifikasi Prodigiosin
Prodigiosin
dimurnikan
dengan
menggunakan kolom silica gel dan
kloroform
sebagai
pelarut.
Ekstrak
prodigiosin dalam pelarut metanol dialirkan
melalui kolom silika. Prodigiosin yang
terperangkap dalam kolom silika gel
dilepaskan dan dilarutkan dengan kloroform.
Tingkat kemurnian dianalisis dengan
spektrofotometer dan kromatografi lapis
tipis silika gel. Sebanyak 10 µl prodigiosin
diteteskan pada lapisan silika di atas
lempengan kaca dengan jarak 3cm dari
bagian bawah dan dijalankan dengan pelarut
amil asetat hingga pelarut mencapai batas 3
cm dari atas. Spot merah yang merupakan
prodigiosin dihitung nilai RF dengan rumus
jarak yang ditempuh sampel dibagi dengan
jarak yang ditempuh pelarut. Analisis
dengan spektrofotometer dilakukan dengan
pelarut air yang bersifat asam dan basa .
Sebanyak 20 µl prodigiosin dimasukan
dalam 200 µl pelarut dan dicampur dengan
merata. Prodigiosin dideteksi serapan
panjang gelombangnya pada kisaran antara
400-600 nm.
Uji Antibakteri Prodigiosin
Uji daya hambat prodigiosin terhadap
Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Eschericia
coli dan Pseudomonas solanacearum ini
dilakukan pada media LB agar ( triptose 1%,
yeast ekstract 0.5%, NaCl 1%, agar 1.5 % )
di dalam cawan petri. Sebanyak 200 µ l
biakan bakteri (OD600 0.5) dicampur
dengan 3 ml media LB agar overlay dan
dituangkan pada media LB dalam cawan.
Setelah beku, lima lubang sumur dibuat
pada media dengan menggunakan cork
borer (diameter 0.5 cm) untuk uji
prodigiosin. Sebanyak 20 µl prodigiosin
dengan pengenceran 10-1 - 10-3 diletakan
dalam lubang sumur tersebut. Sebagai
kontrol digunakan larutan DMSO atau air
destilasi steril. Pengamatan daya hambat
4
dilakukan 24 - 48 jam setelah inkubasi pada
suhu ruangan (27°C).
Uji
Efikasi
Prodigiosin
terhadap
Penyebab
Penyakit
Kresek
pada
Tanaman Padi (Xanthomonas Oryzae pv.
oryzae)
Tanaman padi varietas Ciherang (umur
40 hari setelah tanam) yang ditanam dalam
ember plastik (volume 1 liter) digunakan
untuk
uji
kemampuan
prodigiosin
mengendalikan serangan Xanthomonas
oryzae pv. oryzae. Daun padi dipotong pada
jarak
5 cm dari ujung atas daun dan
diinkokulasi dengan biakan bakteri dengan
cara disemprot. Setiap satu rumpun padi (5
batang per rumpun) disemprot dengan 1 ml
biakan bakteri yang berumur 48 jam setelah
inkubasi. Strain X. oryzae pv. oryzae yang
diinokulasikan, yaitu strain 1B yang
mempunyai tingkat virulensi yang lebih
tinggi. Prodigiosin dengan konsentrasi 100150µg disemprotkan sebanyak 1 ml setelah
suspensi bakteri kering pada tanaman.
Sebagai kontrol digunakan tanaman tanpa
semprot prodigiosin. Pengamatan intensitas
penyakit dilakukan setiap 3 hari sekali
selama 2 minggu.
Tingkat mortalitas wbc mencapai 65.678.2% pada aplikasi bakteri merah dengan
konsentrasi antara 106 dan 107 sel/ml (Tabel
1). Kematian wbc mulai terjadi pada 4 hari
setelah inokulasi (hsi), dan meningkat tajam
pada 7 hsi (Gambar 2). Serangga yang mati
ditujukkan oleh warna merah pada
tubuhnya. Hasil reisolasi memastikan bahwa
bakteri yang menginfeksi dan menyebabkan
kematian wbc adalah bakteri merah. Hal ini
menunjukkan bahwa bakteri merah bersifat
patogenik terhadap wbc.
Tabel 1 Efektivitas bakteri merah terhadap
wbc setelah 10 hari aplikasi
Konsentrasi
(sel/ml)
Mortalitas (%)
108
107
106
105
104
0
78.2
72.1
65.6
44.7
12.2
0
HASIL
Peremajaan Isolat
Bakteri merah ditumbuhkan pada media
Lurial Bertani Broth (LB) dan diinkubasi
pada suhu ruang selama 2-3 hari dengan
metode kuadran untuk mendapatkan koloni
tunggal (Gambar 1a). Koloni tunggal
disubkultur pada medium LB agar miring
dan diremajakan setiap 2 minggu sekali atau
sesuai dengan kebutuhan (Gambar 1b).
a
b
Gambar 1 Biakan bakteri merah (a) pada
media LB agar, (b) pada media LB agar
miring.
Patogenisitas Bakteri Merah terhadap
Wereng Batang Cokelat
Hasil uji efikasi membuktikan bahwa
bakteri merah efektif mengendalikan wbc.
Gambar 2 Grafik efektivitas bakteri merah
terhadap wbc.
Karakteristik Fenotipe
Bakteri merah adalah bakteri gram
negatif yang bersifat motil. Koloninya
berbentuk cembung dan berukuran 1-3 mm
pada biakan yang berumur 24 jam setelah
inkubasi. Ukuran koloni menjadi lebih besar
jika diinkubasikan lebih lama karena sifat
5
motilitasnya. Warna merah koloni sudah
mulai terlihat pada biakan yang berumur 24
jam,
dan
semakin
merah
setelah
diinkubasikan lebih 48 jam. Namun sering
juga dijumpai koloni bakteri warna putih,
terutama koloni tunggal yang terangsing
jauh dari koloni lain (quorum sensing).
Bakteri merah sensitif terhadap streptomisin
serta
tahan
dengan
kloramfenikol,
kasugamisin dan rimfamisin (Tabel 2).
Meskipun bakteri merah tahan terhadap
kloramfenikol
tetapi
pigmentasinya
terhambat, bahkan bakteri tidak mampu
menghasilkan
pigmen
merah
pada
konsentrasi kloramfenikol 1 g/ml.
(Qiagen) dan disekuensing dengan primer
yang sama secara dua arah.
Tabel 2 Sensitivitas bakteri merah terhadap
antibiotik
a
Antibiotik
Kloramfenikol
Kasugamisin
Rimfamisin
Streptomisin
Ampisilin
1800bp
Kosentrasi ( g/ml)
25
50
R
R
R
R
R
R
S
S
R
R
Karakteristik fenotipe bakteri merah
berdasarkan pengujian dengan Biolog GN
MicroplateTM disajikan dalam lampiran 1.
Bakteri merah menunjukkan 94 karakter
positif dari 95 pengujian yang dilakukan.
Karakter negatif hanya terdapat pada keto
butyric
acid.
Bakteri
dapat
memfermentasikan semua jenis karbohidrat
yang meliputi D-fructose, L-fucose, Dgalactose, Gentiobiose, m-inositol,
Maltose, Lactulose, D-lactose, D-mannitol,
D-Manose, D-melibiose dan -D-glucose,
serta semua jenis asam amino, termasuk Lornithin. Berdasarkan analisis dengan
Biolog GN database, bakteri merah
termasuk dalam genus Serratia.
Amplifikasi 16S rDNA Ribosomal
Kualitas
DNA
hasil
ekstraksi
ditampilkan pada gambar 3. Terdapat satu
band tunggal yang tidak terkontaminasi
dengan RNA. Pengukuran spektrofotometer
juga menunjukan tidak ada kontaminasi
protein. Hal ini ditunjukkan oleh nilai
perbandingan absorbansi OD260/280 sekitar
1.8. Amplifikasi sekuen 16S rDNA dengan
pasangan primer 63F dan 1387R
menghasilkan band tunggal berukuran
sekitar 1.4 kb yang sesuai dengan perkiraan
(Gambar 3). Proses sekuensing, produk
PCR dimurnikan dengan PCR purificatio kit
1500bp
1300bp
b
Gambar 3 Elektroforesis gel agarosel
ekstrak DNA genom (a), produk PCR 16S
rDNA bakteri merah (b).
Analisis Sekuen Nukelotida 16S rDNA
Urutan nukleotida 16S rDNA bakteri
merah disekuen dari dua arah sebanyak dua
kali. Hasil kedua sekuen dibandingkan
untuk memastikan tidak ada kesalahan
sekuensing. Kemudian kosensus sekuen
sebesar 1294 bp dibandingkan dengan
sekuen dari bakteri lain yang ada dalam
database Gene Bank melalui analsis
BLASTN.
Sekuen
bakteri
merah
mempunyai tingkat kesamaan 99% dengan
Serratia sp. endosimbion wbc (no. asesi
GU124498) dan S. marcescens (no. asesi
HQ154570) (lampiran 2). Hasil ini
berkorelasi dengan analisis fenotipe
menggunakan Biolog GN MicroplateTM
yang mengklasifikasikan bakteri merah ke
dalam genus Serratia.
Analisis Filogenetika
Berikut ini merupakan hasil dari analisi
filogenitika mengunakan program PHYLIP
6
versi 3.6. Terlihat pada hasil bahwa bakteri
merah yang diidentifikasi kekerabatannya,
dekat dengan Serratia marcescens dan
Serratia sp yang berendosimbion dengan
wbc.
0.24 untuk kontaminan (Gambar 6a).
Pengukuran
prodigiosin
dengan
spektrofotometer yang dilakukan dalam
pelarut yang bersifat asam juga mendeteksi
ada 2 titik puncak pada panjang gelombang
500 nm dan 540 nm (Gambar 6b). Serapan
tertinggi prodigiosin dalam pelarut asam
terjadi pada panjang gelombang 540 nm.
Tetapi pada pelarut basa, metabolit
kontaminan tidak terdeteksi. Titik puncak
absorbansi terjadi pada panjang gelombang
460 nm untuk prodigiosin.
Gambar 4 Pohon filogenetik bakteri merah.
Ekstraksi dan Purifikasi Prodigiosin
Prodigiosin diekstraksi dari kultur S.
marcescens 5 hari setelah inkubasi dan
menunjukkan warna merah (Gambar 5a).
Ekstraksi dengan etil asetat berhasil
memisahkan prodigiosin dari fraksi cair
media (Gambar 5b). Prodigiosin dalam etil
asetat dipekatkan dengan evaporator. Pada
suhu 35oC dan kondisi vakum, etil asetat
akan menguap tanpa membawa prodigiosin
sehingga prodigisin dapat dikoleksi.
Prodigiosin yang berhasil diekstrasi
dilarutkan dalam DMSO.
a
Pelarut asam
Pelarut basa
a
b
Gambar 5 Kultur bakteri merah yang
berumur 5 hari (a), ekstraksi prodigiosin
dalam pelarut etil asetat (b).
Hasil purifikasi dengan kromatografi
kolom menggunakan silika gel masih belum
mampu
menghilangkan
metabolit
kontaminan.
Hasil
analisis
dengan
kromatografi lapis tipis mendeteksi 2 spot
pada nilai Rf 0.82 untuk prodigiosin dan
b
Gambar 6 Profil hasil analisis prodigiosin
dengan kromatografi lapisi tipis silika gel
(a) dan spektrofotometer (b).
Uji Antibakteri Prodigiosin
Kemampuan prodigiosin menghambat
pertumbuhan bakteri telah diuji terhadap
7
Xanthomonas oryzae pv. oryzae penyebab
penyakit
kresek pada tanaman padi,
Escherichia
coli
dan
Pseudomonas
solanacearum penyebab penyakit layu pada
tanaman ubi jalar. Pada assay di cawan petri,
konsentrasi
prodigiosin
yang
efektif
menghambat pertumbuhan bakteri sekitar
100-150 g/ml. Pada konsentrasi yang lebih
rendah daya hambatnya berkurang. Jenis
bakteri yang berbeda akan menunjukkan
perbedaan sensitivitasnya. X. Oryzae pv.
oryzae dan P. Solanacearum prodigiosin
konsentrasi 10-15
g/ml masih sensitif
dibandingkan dengan Escherichia coli (Tabel
4). Dalam uji bioautografi, spot merah
prodigisoin juga efektif menghambat ketiga
bakteri tersebut. Pada titik yang ada
prodigiosin terbentuk zona bening yang
menunjukkan tidak tumbuhnya bakteri
(Gambar 7b). Hal ini menunjukkan bahwa
prodigiosin bersifat bakterisida.
Prodigiosin juga efektif menghambat
perkembangan penyakit kresek pada
tanaman padi. Efikasi prodigiosin 150
g/ml mampu menekan serangan penyakit
kresek hingga 30%. Pada tanaman tanpa
aplikasi prodigiosin, serangan penyakit
kresek mencapai 50%, tetapi bila diaplikasi
prodigiosin, serangannya hanya mencapai
20% setelah 4 minggu aplikasi (Gambar 8).
Gejala serangan kresek mulai terlihat pada 1
minggu setelah inokulasi (msi) dengan
gejala coklat kekuningan yang berkembang
dari ujung ke pangkal daun dan terus
meningkat dengan bertambahnya umur
tanaman. Perkembangan penyakit terlihat
sangat lambat pada tanaman yang diaplikasi
prodigiosin dibandingkan dengan tanaman
tanpa aplikasi prodigiosin.
b
Gambar 7 Daya hambat prodigiosin
terhadap berdasarkan pengujian metode
cawan petri (a) dan bioluminator pada lapis
tipis silika gel (b).
Tabel 3 Hasil uji daya hambat prodigiosin
dengan pengenceran yang berbeda (n=4)
Pengenceran
prodigiosin
10-1
Hasil
+
-2
10
10-3
+
-
Tabel 4 Hasil positif uji daya hambat
prodigiosin pada Escherichia coli, layu ubi
jalar dan X.oryzae pv.Oryzae
Pengenceran
prodigiosin
E. coli
P.
solanace
arum
10-1
10-2
10-3
+
-
+
+
-
p3
p1
p2
a
Gambar 8 Grafik efektivitas prodigiosin
terhadap penghambatan penyakit kresek.
X.
oryzae
pv.
Oryzae
+
+
-
8
PEMBAHASAN
Bakteri merah yang diidentifikasi
sebagai S. marcescens berdasarkan uji
fenotipe dengan Biolog GN Microplate TM
dan analisis sekuen 16S rDNA terbukti
bersifat
patogenik
terhadap
wbc.
Patogenisitas S. marcescens diduga terjadi
bukan melalui infeksi integumen, tetapi
melalui mulut dengan termakan ketika
serangga mencucuk dan menghisap cairan
tanaman. Mulut wbc bertipe pencucuk
penghisap dan rostumnya muncul dari
bagian posterior kepala digunakan sebagai
pintu masuk pintu masuk sel bakteri S.
marcescens yang berukuran 1 m. Pada uji
patogenisitas terhadap larva Tenebrio
molitor yang dilakukan melalui pakan, M.
marcescens juga bersifat patogenik, bahkan
protein yang diekstrak sel bakteri bersifat
toksik (Data tidak ditampilkan). Hal ini
menunjukkan bahwa patogenisitas S.
marcescens
bersifat
oral
dengan
menghasilkan protein yang toksik.
Menurut Hurst et al. (2000), faktor
virulensi
S.
entomophila
and
S.
proteamaculans terletak dalam plasmid
pADAP (amber disease-associated plasmid,
153 kb) yang membawa tiga gen penyandi
komplek toksin, yaitu sepABC (untuk S.
entomophila pathogenicity). Produk protein
dari sepABC mempunyai kesamaan sekuen
asam aminonya dengan toksin insektisidal
yang
dihasilkan oleh
Photorhabdus
luminescens (Bowen et al. 1998),
Xenorhabdus nematophilus (Morgan et al.
2001), Yersinia pestis C092 (Parkhill et al.
2001), Pseudomonas syringae pv. tomato
DC3000 (Buell et al. 2003), Serratia sp.
(Hurst et al. 2000; Dodd et al. 2006) dan
Chromobacterium violaceum ATCC 12472
(Vasconselos et al. 2003), yang dikenal
dengan nama komplek toksin (Tc). Tetapi
gen penyandi Tc berada dalam DNA
genomnya. Komplek toksin memiliki berat
molekul tinggi ( 1MDa) dan menunjukkan
aktvitas insektisidal terhadap serangga dari
ordo Coleoptera, Dictyoptera, Hymenoptera,
and Lepidoptera (Bowen et al. 1998).
Komplek toksin tersusun atas empat
komplek toksin (Tca, Tcb, Tcc dan Tcd)
yang masing-masing dikodekan oleh empat
lokus gen, yaitu Tca, Tcb, Tcc dan Tcd.
Komplek toksin Tca dan Tcd bersifat oral
terhadap Mandusa sexta (Waterfield et al.
2001) serta Leptinotarsa decemlineata dan
Bemisia tabaci (Blackburn et al. 2005).
Komplek toksin Tca dan Tcd potensial
untuk menjadi salah satu kandidat pengganti
toksin Bacillus thuringiensis (Bt) dalam
pengembangan tanaman transgenik tahan
serangga hama.
Bakteri patogen S. marcescens
yang menginfeksi wbc juga pernah
dilaporkan di Korea (Kim et al.1998).
Menurut Grimoet dan Grimoet (1978), strain
pigmen merah dari S. marcescens sering
dijumpai pada banyak ordo serangga baik
yang sehat, berpenyakit, maupun mati.
Umumnya, strain S. marcescens
yang
diisolasi dari manusia tidak berpigmen,
sedangkan strain berpigmen yang diisolasi
dari serangga dan lingkungan lainnya tidak
pernah dilaporkan menjadi penyebab infkesi
nosocomial pada manusia (Mohan et al.
2011). Dalam database GeneBank, sekuen
nukleotida 16S rDNA bakteri merah
memiliki tingkat kesamaan 99% dengan
sekuen nukleotida 16S rDNA Serratia sp.
endosimbion wbc (no. asesi GU124498) dan
S. marcescens (no. asesi HQ154570).
Menurut Janda dan Abbott (2007), apabila
terdapat persamaan sekuen nukleotida dari
gen antara satu bakteri dengan bakteri yang
lain dengan nilai lebih dari 90%, maka
bakteri-bakteri tersebut merupakan spesies
bakteri yang sama.
Serratia sp. endosimbion wbc tidak
pernah dilaporkan sebagai patogen yang
kuat. Pemanfaatnya untuk pengendalian wbc
juga jarang dilakukan. Hal ini diduga
disebabkan oleh beberapa faktor, yaitu
pertama endosimbion Serratia adalah
patogen lemah yang hanya akan bersifat
patogenik ketika serangga dalam keadaan
tertekan sehingga penggunaan untuk
pengendalian wbc tidak akan efektif. Kedua
S. marcescens telah dilaporkan sebagai
patogen oportunistik pada manusia sehingga
pemanfaatan dikhawatirkan membahayakan
organisme lain. Ketiga penelitian tentang
faktor-faktor virulen S. marcescens terhadap
wbc belum dilakukan.
Pigmen merah yang dihasilkan oleh S.
marcescens isolat wbc adalah metabolit
sekunder yang dikenal sebagai prodigiosin.
Prodigiosin
merupakan
antibiotik
multifungsi yang memiliki aktivitas sebagai
antibakteria, antifungi, antiprotozoa, dan
antikanker. Tetapi pengaruh prodigiosin
terhadap serangga belum pernah dilaporkan.
Asano et.al (1999) telah mencoba aplikasi
kombinasi prodigiosin dengan kristal toksin
Bacillus
thuringiensi
(Bt)
untuk
9
mengendalikan Spodoptera litura. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa aplikasi
toksin Bt yang dikombinasikan dengan
prodigiosin dapat menunda perkembangan
resistensi serangga terhadap toksin Bt
(Asano et al. 1999).
Aktivitas
antibakteri
prodigiosin
terbukti mampu menghambat perkembangan
E. Coli, Xanthomonas, dan Pseudomonas
secara in vitro, tetapi dosis efektifnya sangat
tinggi. Dalam pengujian secara in vivo,
prodigiosin
juga
mampu
menekan
perkembangan penyakit kresek yang
disebabkan oleh Xanthomonas hingga 30%
dibandingkan kontrol. Sebenarnya S.
marcescens sendiri tidak bersifat antagonis
terhadap Xanthomonas dalam pengujian
secara in vitro. Oleh karena itu, aplikasi
langsung sel bakteri S. marcescena tidak
mampu
mengendalikan
Xanthomonas.
Pengendalian Xanthomonas yang efektif
diperlukan prodigiosin pekat.
SIMPULAN
Berdasarkan uji fenotipe dengan Biolog
GN Microplate TM dan analisis sekuen 16S
rDNA, bakteri merah yang berendosimbion
dengan wbc serta bersifat patogenik adalah
S. marcescens. Database GeneBank, sekuen
nukleotida 16S rDNA bakteri merah
memiliki tingkat kesamaan 99% dengan
sekuen 16S rDNA Serratia sp endosimbion
wbc. Prodigiosin merupakan metabolit
sekunder dari S. marcescens yang mampu
menghambat perkembangan E. coli,
Xanthomonas, dan Pseudomonas secara in
vitro, dengan dosis efektif yang sangat
tinggi. Secara in vivo, prodigiosin mampu
menekan perkembangan penyakit kresek
yang disebabkan oleh X. oryzae pv. oryzae
sebesar 30%.
SARAN
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut
mengenai faktor-faktor virulensia S.
marcescens terhadap serangga, sehingga
dapat menjadi agen pengendali serangga
yang lebih baik. Penelitian lebih lanjut untuk
mendapatkan media yang baik untuk
produksi prodigiosin.
DAFTAR PUSTAKA
Alamaendah. 2006. Hama padi yang sulit
dibasmi. Natur Indonesia 6(2) : 84-86
Asano et al. 1999. Prodigiosin produced by
Serratia marcescens enhances the
insectisidal
activity of
Bacillus
thuringiensis delta endotoxin against
common cutworm, Spodoptera litura. J.
Pesticide Sci. 24:381-385.
Baskoro et al. 2002.Pengendalian serangga
hama dengan menggunakan bakteri
merah. Laporan hasil penelitian, Balai
pengamatan dan Peramalan Hama dan
Penyakit Tanaman.
Blackburn M, Golubeva E, Bowen D,
Effrench-Constant RH.1998. A novel
insectisidal toxin form Photarhabdus
luminescens, Toxin complex a (Tca)
and it histopatological effects on the
midgut of Manduca sexta. Environ
Microbiol 64(8):36-41.
Bowen et al. 1998. Insecticidal toxins from
the
bacterium
Photorhabdus
luminescens. Sci 280:2129-2132.
Buell CR. et al. 2003. The complete
genome sequence of the Arabidopsis
and tomato pathogen Pseudomonas
syringae pv tomato DC3000. Proc Natl
Acad Sci USA 100: 10181-10186.
Croft et al.2002. Antiprotozoal activities of
phospholipid analogues. Mol and
Biochem Parsitology. 126:165-172.
Davaraj Naveen Raj, Dharumaduari
Dhanasekaran, Nurdin Thajuadin and
Annamalai
Panneerselvam.2009.
Production of prodigiosin from Serratia
marcescens and its cytotoxicity activity.
J of Pharmacy Recearch. 2(4):590-593.
Giri et al.2004. A novel medium for the
enhanced cell growth and production of
prodigiosin from Serratia marcescens
isolated from soil. BMC Microbiol
4(11):1-10.
Grimont, P.A.D. and Grimont, F. 1978. The
genus Serratia. Annu Rev Microbiol.
32:221-248.
Hurst MR, Glare TR, Jackson A, Ronson
CW.2000.
Plasmid
located
pathogenicity determinants of Serratia
entomophila, the causal agent of amber
disease of grass grub, show simililarity
to the insectisidal to sans of
Photorhabdus
lumisnescens.
J
Bacteriol.182:5127-5138.
Janda J.M and Abbott S.L. 2007. 16S rRNA
gene
sequencing
for
backterial
identifications in the diagnostic
laboratories : pluses, perils, and pitfalls.
J Clinic Microbiol. 45(9) : 2761-2761.
Khanafari et al.2006.Review of prodigiosin,
Pigmentation in Serratia.Biological.
Sci. 6(1):1-3.
Kim C.H,and Kim S.W Hong S.I.1998.
Production of red pigment by Serratia
10
sp.KH-95 and its cultural properties.
Korea. J Biotechnol Bioeng.13:431-437.
Mohan, M, Selvakumar, G, Sushil
S.N,Bhatt,
J.C,Gupta,
H.S.2011.
Entomopathogen of endophytic Serratia
marcescens strain SRM against larvae
of Helicoverpa armigera (Noctuidae:
Lepidoptera). World J. Microbiol and
Biotechnol. Published online: 07 April
2011.
Morgan. J.A, M.Sergent, D.Ellis, M.
Ousley,and P. Jarret. 2001. Sequence
analysis of insektisidal genes from
Xenorhabdus nematophilus PMFI1296.
Appl Environ Microbiol 67:2062-2069.
Nakashima T, Tamura T, Kurachi M,
Yamaguchi K, Oda T. 2005. Apoptosis
like red pigment produced by ãProteobacterium and its multiple
bioactivities. Biol Pharmacol Bull.
28:2289-2295.
Parkhill. J et al.2001.Genome sequence of
Yersinia pestis, the causative agent of
plague. Nature 413:523-527.
Vasconcenlosn ATR et al. 2003. The
complete
genome
sequence
of
Chromabacterium violaceum reveals
remarkable and exploitable bacterial
adaptability. Proc Natl Acad Sci
USA.100:11660-11665.
Waterfield N, A. Dowling, S. Sharma, P.J
Dabom, U.Potter and R.H EffrenchConstant.2001. Oral toxicity of
Photorhabdus luminescens W14 toxin
complexes in Eschericia coli. Appl
Environ Microbiol. 67:5017-5024.
LAMPIRAN
12
Lampiran 1. Karakteristik fenotipe bakteri merah berdasarkan pengujian dengan Biolog GN
MicroplateTM
Uji
Reaksi
Uji
Cyclodextrin
+
Itaconic acid
Dextrin
+
-keto butyric acid
Glycogen
+
-keto glutaric acid
Tween 40
+
-keto valeric acid
Tween 80
+
D,L-latic acid
N-acetyl-D-galactosamine
+
Malonic acid
N-acetyl-D-glucosamine
+
Propionic acid
Adonitol
+
Quinic acid
L-arabinose
+
Saccharic acid
D-arabitol
+
Sebacic acid
Cellobiose
+
Succinic acid
i-erythritol
+
Bromo succinic acid
D-fructose
+
Succinamic acid
L-fucose
[+]
Glucuronamide
D-galactose
+
Alaninamide
Gentiobiose
[+]
D-alanine
+
L-alanine
-D-glucose
m-inositol
+
L-alanyl-glycine
+
L-asparagine
-D-lactose
Lactulose
+
L-aspartic acid
Maltose
+
L-glutamic acid
D-mannitol
+
Glycyl-L-aspartic acid
D-Manose
+
Glycyl-Lglutamic acid
D-melibiose
[+]
L-histidine
[+]
Hydroxy L-proline
-methyl-D-glucoside
D-psicose
+
L-leucine
D-raffinose
+
L-ornithine
L-rhamnose
+
L-phenylalanine
D-sorbitol
+
L-proline
Sucrose
+
L-pyroglutamic acid
D-trehalose
[+]
D-serine
Turanose
+
L-serine
Xylitol
+
Lthreonine
Methyl pyruvate
[+]
D,L-camitine
Mono-methyl succinate
+
-amino butyric acid
Acetic acid
[+]
Urocanic acid
Cis-aconitic acid
+
Inosine
Citric acid
+
Uridine
Formic acid
+
Thymidine
D-galactonic acid
+
Phenyl ethylamine
D-galacturonic acid
+
Putrescine
D-gluconic acid
+
2-amino ethanol
D-glucosaminic acid
+
2,3-butanediol
D-glucuronic acid
+
Glycerol
+
-hydroxybutyric acid
D,L- -glycerol phosphate
+
Glucose-1-phosphate
- hydroxybutyric acid
+
Glucose-6-phosphate
- hydroxybutyric acid
+
-hydroxy phenylacetic acid
Keterangan : + : reaksi positive; [+] : reaksi moderat; - : reaksi negative
Reaksi
[+]
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
[+]
[+]
13
Lampiran 2. Perunutan sekuen nukleotida 16 S DNA hasil analisis software Blastn yang terdapat
dalam situs National Center for Biotechnology Information.
Accesion
Description
GU124498.1
Serratia sp. Endosimbiont of Nilaparvata lugens clone M280 16S Ribosomal
HQ143657.1
Serratia marcescens strain YQH50 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
HQ538684.1
Serratia sp. bk_46 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
HQ154570.1
Serratia marcescens strain R9-8A 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
HM640277.1
EU876700.1
FJ853424.1
Serratia sp. YF-2 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
Serratia marcescens strain sls-1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
Serratia marcescens strain MH6 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
FJ495145.1
Serratia sp. BSFC16 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
FJ360761.3
FJ360759.1
Serratia sp. PSB9 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
Serratia marcescens strain PSB19 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
FJ009445.1
Bacterium enrichment culture clone JC1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
EU525929.1
Serratia marcescens strain SDLH-I 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
EF415649.1
HQ917058.1
JF206698.1
Serratia marcescens 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
Serratia sp. NB2 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
Uncultured bacterium clone ncd2365e07c2 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
JF138992.1
Uncultured bacterium clone ncd1613a08c1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
HM240853.1
Serratia entomophila strain M6 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
HM136578.1
Serratia sp. BL2 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
GQ465847.1
Serratia marcescens strain SB08 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
GQ417536.1
Uncultured Serratia sp. clone F3jan.3 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
GQ416504.1
Uncultured Serratia sp. clone F7may2.65 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
GQ165813.1
Serratia sp. XRK6 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
Total
score
Query
Covarage
∆E
Value
Max
Ident
2776
100 %
0.0
100%
2307
99 %
0.0
99 %
2307
99 %
0.0
99 %
2307
99 %
0.0
2307
2307
99 %
99 %
0.0
0.0
99 %
99 %
2307
99 %
0.0
99 %
2307
99 %
0.0
99 %
2307
99 %
0.0
99 %
2307
99 %
0.0
99 %
2307
99 %
0.0
99 %
2307
99 %
0.0
99 %
2307
2302
99 %
99 %
0.0
0.0
99 %
98 %
2302
99 %
0.0
98 %
2302
99 %
0.0
98 %
2302
99 %
0.0
98%
2302
99 %
0.0
98 %
2302
99 %
0.0
98 %
2302
99 %
0.0
98 %
2302
99 %
0.0
98 %
2302
99 %
0.0
98 %
99 %
ABSTRAK
YOHANA ARTDHI DAHLIANI. Identifikasi dan Ekstraksi Pigmen Bakteri Merah Patogenik
terhadap Wereng Batang Cokelat. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan TRI PUJI PRIYATNO.
Wereng Batang Cokelat merupakan salah satu hama tanaman padi yang berbahaya dan
sukar dikendalikan. Penemuan bakteri merah yang mampu menginfeksi wbc menjadi hal yang
sangat penting, karena wbc dengan tipe mulut pencucuk penghisap sangat jarang terinfeksi oleh
bakteri. Penelitian ini dilakukan untuk mengidentifikasi spesies bakteri merah yang patogenik
terhadap wbc, serta mengekstraksi pigmen bakteri merah untuk diuji aktivitasnya. Pertama
pengisolasian dan peremajaan bakteri, pengujian fenotipe dengan menggunakan kit GN
MicroPlateTM Biolog kit, analisis sekuen nukleotida 16S rDNA dengan software BlastN yang
terdapat dalam situs NCBI. Analisis filogenetika menggunakan program PHYLIP versi 3.6.Bakteri
merah yang diidentifikasi adalah Serratia marcescens. S. marcescens sensitif terhadap
streptomisin dengan konsentrasi 25 µg/ml hingga 50 µg/ml. Metabolit sekunder yang dihasilkan
bakteri merah adalah prodigiosin dengan konsentrasi 150 µg/ml mampu menekan perkembangan
penyakit kresek yang disebabkan oleh Xanthomonas oryzae pv. oryzae sebesar 30 %.
Kata kunci : Bakteri merah, Serratia marcescens, prodigiosin.
ABSTRACT
YOHANA ARTDHI DAHLIANI. Identification and extraction of Red Pigment of pathogenic
bacteria to Stem Brown planthopper (wbc). Superviced by IMAN RUSMANA and TRI PUJI
PRIYATNO.
Brown Planth
TERHADAP WERENG BATANG COKELAT
YOHANA ARTDHI DAHLIANI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
ABSTRAK
YOHANA ARTDHI DAHLIANI. Identifikasi dan Ekstraksi Pigmen Bakteri Merah Patogenik
terhadap Wereng Batang Cokelat. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan TRI PUJI PRIYATNO.
Wereng Batang Cokelat merupakan salah satu hama tanaman padi yang berbahaya dan
sukar dikendalikan. Penemuan bakteri merah yang mampu menginfeksi wbc menjadi hal yang
sangat penting, karena wbc dengan tipe mulut pencucuk penghisap sangat jarang terinfeksi oleh
bakteri. Penelitian ini dilakukan untuk mengidentifikasi spesies bakteri merah yang patogenik
terhadap wbc, serta mengekstraksi pigmen bakteri merah untuk diuji aktivitasnya. Pertama
pengisolasian dan peremajaan bakteri, pengujian fenotipe dengan menggunakan kit GN
MicroPlateTM Biolog kit, analisis sekuen nukleotida 16S rDNA dengan software BlastN yang
terdapat dalam situs NCBI. Analisis filogenetika menggunakan program PHYLIP versi 3.6.Bakteri
merah yang diidentifikasi adalah Serratia marcescens. S. marcescens sensitif terhadap
streptomisin dengan konsentrasi 25 µg/ml hingga 50 µg/ml. Metabolit sekunder yang dihasilkan
bakteri merah adalah prodigiosin dengan konsentrasi 150 µg/ml mampu menekan perkembangan
penyakit kresek yang disebabkan oleh Xanthomonas oryzae pv. oryzae sebesar 30 %.
Kata kunci : Bakteri merah, Serratia marcescens, prodigiosin.
ABSTRACT
YOHANA ARTDHI DAHLIANI. Identification and extraction of Red Pigment of pathogenic
bacteria to Stem Brown planthopper (wbc). Superviced by IMAN RUSMANA and TRI PUJI
PRIYATNO.
Brown Planthopper Bar (BPH) is a dangerous and rebelliousness pests of rice. Discovery
of red bacteria that can infect bph becomes very important, because the bph, as the piercing and
sucking type insect mouth, was rarely infected by bacteria. This study was conducted to identify
the bph red pathogenic bacteria, and to determine production and inhibition activity of red
pigment. Bacterial phenotypes was perfomed using GN Microplate TM Biolog kit. Nukleotide
sequence aligment of 16S rDNA was analyed with BlastN of the NCBI website. Phylogenetic Tree
was contructed by PHYLIP version 3.6 program. The red bacterium was identified as Serratia
marcescens . S. marcescens was sensitive to streptomycin with concentration of 25µg/ml and 50
µg/ml. Red pigment produced by S. marcescens was determined as prodigiosin. Prodigiosin in
concentration of 150µg/ml able to suppress up to 30% the development a bacterial leaf blight
caused by Xanthomonas oryzae pv. oryzae.
Keyword : Red bacteria, Serratia marcescens, prodigiosin.
IDENTIFIKASI BAKTERI ENTOMOPATOGENIK
TERHADAP WERENG BATANG COKELAT
YOHANA ARTDHI DAHLIANI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
Judul
: Identifikasi Bakteri Entomopatogenik terhadap Wereng Batang
Cokelat
: Yohana Artdhi Dahliani
: G34070084
Nama
NIM
Menyetujui:
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si
NIP 1965072019911031002
Dr. Tri Puji Priyatno
NIP 196603211992031002
Mengetahui:
Ketua Departemen Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.S
NIP 196410021989031002
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji syukur penulis ucapkan kepada Tuhan Yang Maha Esa yang telah memberikan rahmat
dan karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Tema yang dipilih dalam
penelitian ini adalah mengenai pigmen bakteri merah yang dihasilkan oleh bakteri Serratia
marcescens dengan judul Identifikasi Bakteri Entomopatogenik terhadap Wereng Batang Cokelat
yang dilaksanakan mulai bulan Desember 2010 hingga April 2011 di Laboratorium Biokimia,
Balai Besar Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Bogor.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si. dan Bapak
Dr. Tri Puji Priyatno selaku pembimbing atas arahan dan bimbingan yang diberikan dalam
pelaksanaan penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Terima kasih yang sebesar-besarnya
kepada Keluarga tercinta ayah, ibu, adik, Leonard Simbolon dan Keluarga Besar atas do’a,
dukungan, dan kasih sayang yang diberikan. Terima kasih juga kepada Pak Made, Pak Yadi, Bu
Alina, Bu Ntin, Pak Wawan,Bu Uum Kak Pipit, Kak Delly, Novia, Resti, Keluarga Besar
Laboratorium Biokimia, Balai Besar Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian,
serta sahabat sahabat Rani, Ivan, Vita, Tira, Fitri, Nita, dan teman-teman seperjuangan di Biologi
44 atas semua kebersamaan dan motivasi yang telah diberikan.
Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat
Bogor, 4 Juli 2011
Yohana Artdhi Dahliani
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Pekalongan pada tanggal 25 Mei 1989 dari ayah Yohanes Petrus
Sarbani dan ibu Fransiska Elisabeth Murdiyanti. Penulis merupakan anak pertama dari dua
bersaudara. Tahun 2007 penulis lulus dari SMA Negeri 2 Pekalongan dan pada tahun yang sama
lulus seleksi masuk IPB melalui Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis memilih Program Studi
Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Penulis menjadi asisten praktikum mata kuliah Fisiologi Tumbuhan pada tahun ajaran
2010/2011.Pada tahun 2009, penulis melakukan studi lapang di Kawasan wana Wisata
Cangkuang Sukabumi, dengan judul makalah “Laju Dentrifikasi dan Nitrifikasi Mikroba Tanah
Hutan Cangkuang”. Pada tahun 2010, penulis melakukan praktik lapang di PT Perkebunan
Nusantara IX Divisi Tanaman Tahunan (Kebun Blimbing) dari bulan Juni sampai bulan Juli
dengan judul laporan “Budidaya Tanaman Karet dan Proses Pengolahan Karet di PT Perkebunan
Nusantara IX Kebun Blimbing Pekalongan Jawa Tengah”. Pada tahun 2010/2011, penulis
berkesempatan melakukan penelitian di Laboratorium Biokimia, Balai Besar Penelitian
Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Bogor.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ......................................................................................................................viii
DAFTAR GAMBAR ................................................................................................................. viii
DAFTAR LAMPIRAN ..............................................................................................................viii
PENDAHULUAN ......................................................................................................................... 1
Latar Belakang.......................................................................................................................... 1
Tujuan ...................................................................................................................................... 1
Waktu dan Tempat .................................................................................................................... 1
METODE ...................................................................................................................................... 1
Isolasi Bakteri dan Peremajaan ................................................................................................. 1
Uji Patogenisitas Bakteri Merah terhadap Wereng Batang Cokelat............................................ 1
Uji Fenotipe .............................................................................................................................. 2
Ekstraksi DNA Bakteri Merah .................................................................................................. 2
Sensitivitas Bakteri Merah terhadap Antibiotik ......................................................................... 2
Amplifikasi 16S DNA Ribosomal ............................................................................................. 2
Sekuensing Fragmen DNA ....................................................................................................... 2
Analisis Sekuen Nukelotida ...................................................................................................... 3
Analisis Filogenetika ................................................................................................................ 3
Produksi dan Ekstraksi Prodigiosin ........................................................................................... 3
Purifikasi Prodigiosin ............................................................................................................... 3
Uji Antibakteri Prodigiosin ....................................................................................................... 3
Uji Efikasi Prodigiosin terhadap Penyebab Penyakit Kresek pada Tanaman (Xanthomonas
Oryzae pv. oryzae) .................................................................................................................... 4
HASIL .......................................................................................................................................... 4
Peremajaan Isolat ...................................................................................................................... 4
Patogenisitas Bakteri Merah terhadap Wereng Batang Cokelat ................................................. 4
Karakteristik Fenotipe ............................................................................................................... 4
Amplifikasi 16S rDNA Ribosomal ............................................................................................ 5
Analisis Sekuen Nukelotida 16S rDNA ..................................................................................... 5
Analisis Filogenetika ................................................................................................................ 5
Ekstraksi dan Purifikasi Prodigiosin .......................................................................................... 6
Uji Antibakteri Prodigiosin ....................................................................................................... 6
PEMBAHASAN ........................................................................................................................... 8
SIMPULAN .................................................................................................................................. 9
SARAN ......................................................................................................................................... 9
DAFTAR PUSTAKA.................................................................................................................... 9
LAMPIRAN ................................................................................................................................ 11
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Efektifitas bakteri merah terhadap wbc setelah 10 hari aplikasi .............................................. 4
2 Sensitifitas bakteri merah terhadap antibiotik .......................................................................... 5
3 Hasil uji daya hambat prodigiosin dengan pengenceran ynag berbeda ..................................... 7
4 Hasil uji daya hambat prodigiosin Escherichia coli dan layu ubi jalar ..................................... 7
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Biakan Serratia marcnesces (a) pada media LB agar, (b) pada media LB agar miring .............4
2 Grafik efektivitas bakteri merah terhadap wbc .........................................................................4
3 Elektriforesis agarose gel hasil ekstraksi DNA genom (a) produk PCR 16S rDNA bakteri
merah (b) ..............................................................................................................................5
4 Pohon filogenetik bakteri merah ..............................................................................................6
5 Kultur bakteri merah yang berumur 5 hari (a), ekstraksi prodigiosin dalam pelarut etil
asetat (b) ..................................................................................................................................6
6 Hasil analisis prodigiosin dengan kromatografi lapis tipis silica gel (a), dan spektrofotometer 6
7 Daya hambat prodigiosin berdasarkan pengujian metode cawan petri (a), bioluminator pada
lapis tipis silica gel ..................................................................................................................7
8 Grafik efektivitas prodigiosin terhadap penyakit kresek ...........................................................7
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Lampiran 1. Karakteristik fenotipe bakteri merah berdasarkan pengujian dengan Biolog GN
MicroplateTM ..........................................................................................................................12
2 Perunutan sekuen nukleotida 16 S DNA hasil analisis software Blastn yang terdapat dalam
situs National Center for Biotechnology Information ...............................................................13
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Wereng
Batang
Cokelat
(wbc,
Nilaparvata lugens) merupakan salah satu
hama utama tanaman padi yang paling
berbahaya dan sukar dikendalikan. Wbc
merusak tanaman dengan cara menghisap
nutrisi dari tanaman sehingga pertumbuhan
dan perkembangan tanaman menjadi
terganggu, bahkan mati. Selain itu, wbc juga
menjadi vektor virus yang menyebabkan
penyakit kerdil rumput dan kerdil hampa
(Alamendah 2004). Berbagai musuh alami
wbc seperti predator, parasitoid dan patogen
telah
diidentifikasi
dan
banyak
dimanfaatkan
untuk
mengendalikan
populasi wbc. Salah satu patogen yang
dilaporkan menginfeksi wbc adalah bakteri
merah. Wereng batang cokelat yang mati
terinfeksi bakteri merah sering dijumpai di
tempat perbanyakan wbc di rumah kaca dan
di lapang saat populasinya tinggi. Gejalanya
ditunjukan oleh busuk basah dan warna
merah pada tubuhnya.
Bakteri yang berhasil diisolasi juga
menunjukkan pertumbuhan koloni berwarna
merah pada media Lurial Bertani (LB) agar.
Dalam uji postulat Koch, bakteri merah
terbukti bersifat patogenik terhadap wbc
(Baskoro et al. 2002). Bahkan bakteri
tersebut juga patogenik terhadap Spodoptera
exigua, Plutella xylotella, Crocidolomia
binotallis, kutu daun mangga (Rastrococcus
sp), dan belalang berkembar (Baskoro et al.
2002). Di New Zealand, dua bakteri
entomopatogen non-sporing forming dari
genus Serratia, yaitu S. entomophila dan S.
proteamaculans, telah berhasil dikembang
kan menjadi biopestisida yang efektif untuk
mengendalikan grass grub (Costelytra
zealandica). Hal ini menunjukkan bahwa
bakteri merah mempunyai potensi untuk
digunakan sebagai agensia pengendalian
biologi wbc dan serangga hama lainnya.
Serratia yang diisolasi dari wereng
coklat dicirikan oleh koloninya yang
cembung dan menghasilkan pigmen merah
pada media agar yang mengandung fosfat,
karbonat dan besi (Giri et al.2004). Pigmen
merah merupakan salah satu indikasi adanya
produksi prodigiosin pada genus Serratia.
Pigmen merah yang dihasilkan oleh Serratia
merupakan metabolit sekunder yang dikenal
sebagai prodigiosin yang merupakan famili
pigmen merah tripyrrole yang umumnya
mengandung 4-methoxy, ring 2-2 bipyrolle
(Giri et al. 2004). Prodigiosin adalah
metabolit sekunder multi aspek yang
mempunyai aktivitas sebagai antibakteri,
antifungi, antiprotozoal (Croft et al. 2002),
bersifat cytotoxic (Nakashima et al. 2005),
antitumor (Castro 1967, Perez-Tomás et al.
2003), antimalaria, antidiabetes ,obat-obatan
anti-inflammatory nonsteroidal, antioksidan
serta menjadi pewarna untuk sutera dan wol
(Khanafari et al. 2006). Pemanfaatan bakteri
merah untuk pengendalian wbc belum
banyak dilakukan, hal ini disebabkan karena
spesies bakteri tersebut belum diketahui.
Oleh karena itu perlu dilakukan identifikasi
bakteri patogenik terhadap wbc .
Tujuan
Penelitian
ini
bertujuan
untuk
mengidentifikasi bakteri yang patogenik
terhadap wbc dan mengkarakterisasi
pigmen yang dihasilkannya.
Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan pada bulan
Desember 2010 sampai April 2011 di
Laboratorium Biokimia, Balai Besar
Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya
Genetik Pertanian, Bogor.
METODE
Isolasi Bakteri dan Peremajaan
Bakteri entomopatogen merah diisolasi
dari wbc koloni Jatisari yang mati dengan
gejala warna merah pada tubuhnya.Wereng
yang telah mati dimasukkan dalam tabung
mikro yang telah diisi NaCl 0.85% 300 µl ,
divorteks
hingga
larutan
bewarna
kemerahan. Koloni bakteri tumbuh setelah
24-48 jam inkubasi pada suhu ruangan.
Koloni tunggal bakteri yang berwarna merah
diisolasi dan dipelihara pada media Lurial
Bertani Broth (triptose 1%, ekstrak khamir
0.5%, NaCl 1%, agar 1.5%). Koloni
dilakukan peremajaan 2 minggu sekali pada
agar miring di dalam tabung reaksi.
Uji Patogenisitas Bakteri Merah terhadap
Wereng Batang Cokelat
Bakteri merah diuji patogenisitasnya
terhadap nimfa wbc instar 2-3. Pengujian
dilakukan pada tanaman padi varietas
Cisadane yang berumur 35 hari setelah
tanam di rumah kaca. Sebanyak 5 ml
suspensi bakteri dengan konsentrasi antara
104-108 sel/ml disemprotkan secara merata
pada seluruh bagian tanaman terutama pada
bagian
batang
tanaman
dengan
menggunakan
hand
spring.
Sebagai
2
tanaman kontrol disemprot dengan akuades
steril.
Setelah
penyemprotan
dan
diselubungi dengan plastik milar, sebanyak
20 ekor nimfa wbc diinfestasikan kedalam
tanaman. Mortalitas wbc diamati setiap hari
selama 15 hari.
Uji Fenotipe
Fenotipe bakteri merah diuji dengan kit
GN MicroPlateTM Biolog. Bakteri dibiakan
dalam 5 ml media LB cair di dalam tabung
reaksi dan diinkubasikan dalam orbital
shaker selama 16 jam pada suhu ruangan.
Sel
bakteri
dipanen
dengan
cara
disentrifugasi dan dicuci dengan 0.85%
NaCl sebanyak tiga kali. Sel bakteri
disuspensikan dalam 0.85%
NaCl dan
dibuat pengenceran hingga nilai OD600
mencapai 0.5. Selanjutnya suspensi bakteri
diinokulasikan dalam kolom dari kit GN
MicroPlateTM Biolog sebanyak 150 µl per
kolom. Fenotipe bakteri diamati setelah 24
jam inkubasi pada suhu 28°C. Reaksi positif
ditunjukkan oleh perubahan warna biakan
menjadi ungu.
Ekstraksi DNA Bakteri Merah
Bakteri merah dikulturkan dalam media
LB selama 18 jam kemudian di shaker.
Biakan bakteri diambil sebanyak 2 ml,
kemudian disentrifuse 10000 rpm selama 5
menit, untuk didapatkan peletnya. Pelet
disuspensikan dengan larutan buffer solution
I sebanyak 50 µ l, buffer solution II 150µl ke
dalam suspensi bakteri, dicampur merata
dengan digoyang lambat dan diinkubasi
selama 5-20 menit pada suhu ruang (27°C).
Sebanyak 250 µ l solution III ditambahkan
dikocok kuat. Suspensi disentrifuse 10000
rpm selama 5 menit.Supernatan dipindahkan
ke tabung mikro baru dan ditambah fenol
dalam klorofom isoamil 100 µl,disentrifuse
10000 rpm selama 10 menit. Supernatan
diambil sebanyak 600 µ l, ditambahkan 600
µ l isopropanol. Disentrifuse kembali,
supernatan dibuang, peletnya diambil dan
ditambah aquades 20µ l.
Sensitivitas Bakteri Merah terhadap
Antibiotik
Bakteri merah diujui sensitivitasnya
terhadap beberapa antibiotik seperti
kloramfenikol, kasugamisin, rimfamisi
,streptomisin,
dan ampisilin
dengan
konsentrasi masing masing 25 µg/ml dan 50
µg/ml. Antibiotik ditambahkan ke dalam
media LB sebanyak 25 µg/ml dan 50 µg/ml.
Kemudian bakteri Serratia marcescens
ditumbuhkan dengan metode gores pada
media tersebut dan diinkubasi pada suhu
ruang selama 3 hari.
Amplifikasi 16S DNA Ribosomal
Identifikasi bakteri merah dilakukan
berdasarkan sekuen nukleotida 16S rDNA .
Amplifikasi fragmen DNA dilakukan
dengan sepasang primer 63F (C A G G C C
T A) dan 1387R (G G G C G G W G T G T
A C A A G G C) menggunakan mesin PCR.
Komposisi 20 µl reaksi PCR terdiri dari 2 µ l
10X bufer PCR, 1.5 µl 50 mM MgCl2, 0.5
µl 4 mM dNTP, 1 µl 20 mM primer
forward, 1 µl 20 mM primer reverse, 0.5 µl
5U Taq Polimerase, dan 13.5 µl air destilasi
steril. Reaksi PCR diletakan dalam tabung
PCR berukuran 0.2 ml. Templet DNA untuk
PCR menggunakan koloni tunggal bakteri
dari biakan yang berumur 18 jam pada
media LB agar di dalam cawan petri. Mesin
PCR dijalankan dengan program sebagai
berikut, yaitu denaturasi awal DNA pada
suhu 94°C selama 10 menit, denaturasi
kedua 94°C 1 menit, annealing 50°C 45
detik, dan extension 72 °C 1 menit 30 detik
dengan siklus sebanyak 35 kali. Produk PCR
dicek pada gel agarose yang dielektroforesis
dengan 90 volt selama 30 menit dalam bufer
TAE.
Sekuensing Fragmen DNA
Sekuensing DNA dilakukan dengan
ABI PRISM 3070 DNA Sequencer. Reaksi
sekuensing dibuat dengan ABI PRISM Big
DyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready
Reaction Kit (PE Biosystems, USA) sesuai
dengan petunjuk. Reaksi sekuensing
mengandung 200 ng DNA, 3.2 pmol primer,
1 µl Big Dye Terminator Ready Reaction
Mix dan air destilasi steril yang
ditambahkan hingga volume akhir menjadi
10 µl. Sekuensing dijalankan dalam mesin
PCR Thermal Cycler (Biometra, USA)
sebanyak 35 siklus dengan program 96°C
selama 30 detik, 50°C selama 5 detik and
60°C selama 1 menit. Selanjutnya, produk
PCR
dimurnikan
dengan
metode
pengendapan etanol. Reaksi sekuensing
ditambah 1 µl 125 mM EDTA, 1 µl 3 M
sodium asetat pH 4, dan 25 µl 100%
ethanol. Setelah diinkubasikan selama 15
menit pada suhu ruangan, campuran
disentrifugasi 12000 rpm selama 20 menit
pada suhu 4°C. Pelet dicuci dua kali dengan
70% etanol dan dikeringkan pada suhu 65°C
selama 10 menit.
3
Analisis Sekuen Nukelotida
Hasil perunutan sekuen nukleotida 16S
rDNA dianalisis dengan software BlastN
yang terdapat dalam situs National Center
for Biotechnology Information (NCBI,
www.ncbi.nlm.nih.gov) untuk mengetahui
tingkat kekerabatan terdekat dengan bakteri
yang ada di dalam Database GeneBank
(NCBI). Dalam menganalisis tingkat
kemiripan runutan DNA antara strain dalam
satu spesies dan antara spesies dalam satu
genus digunakan program interaktif dengan
mengirimkan urutan nukleotida DNA dalam
format Fasta melalui internet dengan cara
salin dan tempel pada kolom khusus yang
telah
disediakan
oleh
GeneBank.
Selanjutnya sekuen 16S rDNA dalam
GeneBank yang mempunyai kekerabatan
dengan sekuen 16S rDNA dari bakteri
merah diambil untuk analisis pohon
filogenetika.
Analisis Filogenetika
Analisis
filogenetika
dilakukan
menggunakan program PHYLIP versi 3.6
(University of Washington). Sebelum
analisis, runutan nukleotida semua isolat
yang terpilih dimodifikasi dengan software
ClustalX 1.83 untuk menyamakan format
runutannya. Matrik jarak genetika dihitung
dengan menggunakan matrik parameter
dalam program komputer DNAML. Analisis
boostrap dengan 100 ulangan dilakukan
menggunakan program SEQBOOT dan
konsensus pohon filogenetikanya dibuat
dengan program CONSENSE. Pohon
filogenetikanya
digambarkan
dengan
program MEGA4 dalam paket program
PHYLIP.
Produksi dan Ekstraksi Prodigiosin
Prodigiosin diproduksi dalam 250 ml
media LB cair ( triptose 1%, yeast ekstract
0.5%, NaCl 1% ). Media dimasukan dalam
erlenmeyer (1 liter) dan diautoklaf pada
suhu 121ºC dan tekanan 1 atm selama 20
menit. Setelah dingin, media diinokulasi
dengan 1 ml biakan Serratia yang berumur
16 jam yang sebelumnya telah dibiakan di
media LB cair dan diukur panjang
gelombang 600 dengan nilai OD 0.5. Biakan
diinkubasikan dalam orbital shaker (150
rpm) selama 5 hari pada suhu ruangan.
Biakan disentrifugasi kecepatan 5000 rpm, 4
°C selama 20 menit untuk memisahkan
supernatan dari pelet sel bakteri. Ekstraksi
prodigiosin dari supernatan dilakukan
dengan metanol-chloroform atau etil asetat
(Davaraj et al. 2009). Supernatan dimasukan
kedalam tabung fraksi dan ditambahkan 100
ml etil asetat, dikocok kuat hingga larutan
tercampur secara menyeluruh. Kemudian
didiamkan selama beberapa menit untuk
memisahkan fraksi air dari etil asetat yang
bercampur prodigiosin. Etil asetat yang
mengandung prodigiosin dievaporasi dengan
rotary evaporator pada suhu 35ºC selama
kurang lebih 20 menit. Selanjutnya
prodigiosin dilarutkan dalam DMSO.
Purifikasi Prodigiosin
Prodigiosin
dimurnikan
dengan
menggunakan kolom silica gel dan
kloroform
sebagai
pelarut.
Ekstrak
prodigiosin dalam pelarut metanol dialirkan
melalui kolom silika. Prodigiosin yang
terperangkap dalam kolom silika gel
dilepaskan dan dilarutkan dengan kloroform.
Tingkat kemurnian dianalisis dengan
spektrofotometer dan kromatografi lapis
tipis silika gel. Sebanyak 10 µl prodigiosin
diteteskan pada lapisan silika di atas
lempengan kaca dengan jarak 3cm dari
bagian bawah dan dijalankan dengan pelarut
amil asetat hingga pelarut mencapai batas 3
cm dari atas. Spot merah yang merupakan
prodigiosin dihitung nilai RF dengan rumus
jarak yang ditempuh sampel dibagi dengan
jarak yang ditempuh pelarut. Analisis
dengan spektrofotometer dilakukan dengan
pelarut air yang bersifat asam dan basa .
Sebanyak 20 µl prodigiosin dimasukan
dalam 200 µl pelarut dan dicampur dengan
merata. Prodigiosin dideteksi serapan
panjang gelombangnya pada kisaran antara
400-600 nm.
Uji Antibakteri Prodigiosin
Uji daya hambat prodigiosin terhadap
Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Eschericia
coli dan Pseudomonas solanacearum ini
dilakukan pada media LB agar ( triptose 1%,
yeast ekstract 0.5%, NaCl 1%, agar 1.5 % )
di dalam cawan petri. Sebanyak 200 µ l
biakan bakteri (OD600 0.5) dicampur
dengan 3 ml media LB agar overlay dan
dituangkan pada media LB dalam cawan.
Setelah beku, lima lubang sumur dibuat
pada media dengan menggunakan cork
borer (diameter 0.5 cm) untuk uji
prodigiosin. Sebanyak 20 µl prodigiosin
dengan pengenceran 10-1 - 10-3 diletakan
dalam lubang sumur tersebut. Sebagai
kontrol digunakan larutan DMSO atau air
destilasi steril. Pengamatan daya hambat
4
dilakukan 24 - 48 jam setelah inkubasi pada
suhu ruangan (27°C).
Uji
Efikasi
Prodigiosin
terhadap
Penyebab
Penyakit
Kresek
pada
Tanaman Padi (Xanthomonas Oryzae pv.
oryzae)
Tanaman padi varietas Ciherang (umur
40 hari setelah tanam) yang ditanam dalam
ember plastik (volume 1 liter) digunakan
untuk
uji
kemampuan
prodigiosin
mengendalikan serangan Xanthomonas
oryzae pv. oryzae. Daun padi dipotong pada
jarak
5 cm dari ujung atas daun dan
diinkokulasi dengan biakan bakteri dengan
cara disemprot. Setiap satu rumpun padi (5
batang per rumpun) disemprot dengan 1 ml
biakan bakteri yang berumur 48 jam setelah
inkubasi. Strain X. oryzae pv. oryzae yang
diinokulasikan, yaitu strain 1B yang
mempunyai tingkat virulensi yang lebih
tinggi. Prodigiosin dengan konsentrasi 100150µg disemprotkan sebanyak 1 ml setelah
suspensi bakteri kering pada tanaman.
Sebagai kontrol digunakan tanaman tanpa
semprot prodigiosin. Pengamatan intensitas
penyakit dilakukan setiap 3 hari sekali
selama 2 minggu.
Tingkat mortalitas wbc mencapai 65.678.2% pada aplikasi bakteri merah dengan
konsentrasi antara 106 dan 107 sel/ml (Tabel
1). Kematian wbc mulai terjadi pada 4 hari
setelah inokulasi (hsi), dan meningkat tajam
pada 7 hsi (Gambar 2). Serangga yang mati
ditujukkan oleh warna merah pada
tubuhnya. Hasil reisolasi memastikan bahwa
bakteri yang menginfeksi dan menyebabkan
kematian wbc adalah bakteri merah. Hal ini
menunjukkan bahwa bakteri merah bersifat
patogenik terhadap wbc.
Tabel 1 Efektivitas bakteri merah terhadap
wbc setelah 10 hari aplikasi
Konsentrasi
(sel/ml)
Mortalitas (%)
108
107
106
105
104
0
78.2
72.1
65.6
44.7
12.2
0
HASIL
Peremajaan Isolat
Bakteri merah ditumbuhkan pada media
Lurial Bertani Broth (LB) dan diinkubasi
pada suhu ruang selama 2-3 hari dengan
metode kuadran untuk mendapatkan koloni
tunggal (Gambar 1a). Koloni tunggal
disubkultur pada medium LB agar miring
dan diremajakan setiap 2 minggu sekali atau
sesuai dengan kebutuhan (Gambar 1b).
a
b
Gambar 1 Biakan bakteri merah (a) pada
media LB agar, (b) pada media LB agar
miring.
Patogenisitas Bakteri Merah terhadap
Wereng Batang Cokelat
Hasil uji efikasi membuktikan bahwa
bakteri merah efektif mengendalikan wbc.
Gambar 2 Grafik efektivitas bakteri merah
terhadap wbc.
Karakteristik Fenotipe
Bakteri merah adalah bakteri gram
negatif yang bersifat motil. Koloninya
berbentuk cembung dan berukuran 1-3 mm
pada biakan yang berumur 24 jam setelah
inkubasi. Ukuran koloni menjadi lebih besar
jika diinkubasikan lebih lama karena sifat
5
motilitasnya. Warna merah koloni sudah
mulai terlihat pada biakan yang berumur 24
jam,
dan
semakin
merah
setelah
diinkubasikan lebih 48 jam. Namun sering
juga dijumpai koloni bakteri warna putih,
terutama koloni tunggal yang terangsing
jauh dari koloni lain (quorum sensing).
Bakteri merah sensitif terhadap streptomisin
serta
tahan
dengan
kloramfenikol,
kasugamisin dan rimfamisin (Tabel 2).
Meskipun bakteri merah tahan terhadap
kloramfenikol
tetapi
pigmentasinya
terhambat, bahkan bakteri tidak mampu
menghasilkan
pigmen
merah
pada
konsentrasi kloramfenikol 1 g/ml.
(Qiagen) dan disekuensing dengan primer
yang sama secara dua arah.
Tabel 2 Sensitivitas bakteri merah terhadap
antibiotik
a
Antibiotik
Kloramfenikol
Kasugamisin
Rimfamisin
Streptomisin
Ampisilin
1800bp
Kosentrasi ( g/ml)
25
50
R
R
R
R
R
R
S
S
R
R
Karakteristik fenotipe bakteri merah
berdasarkan pengujian dengan Biolog GN
MicroplateTM disajikan dalam lampiran 1.
Bakteri merah menunjukkan 94 karakter
positif dari 95 pengujian yang dilakukan.
Karakter negatif hanya terdapat pada keto
butyric
acid.
Bakteri
dapat
memfermentasikan semua jenis karbohidrat
yang meliputi D-fructose, L-fucose, Dgalactose, Gentiobiose, m-inositol,
Maltose, Lactulose, D-lactose, D-mannitol,
D-Manose, D-melibiose dan -D-glucose,
serta semua jenis asam amino, termasuk Lornithin. Berdasarkan analisis dengan
Biolog GN database, bakteri merah
termasuk dalam genus Serratia.
Amplifikasi 16S rDNA Ribosomal
Kualitas
DNA
hasil
ekstraksi
ditampilkan pada gambar 3. Terdapat satu
band tunggal yang tidak terkontaminasi
dengan RNA. Pengukuran spektrofotometer
juga menunjukan tidak ada kontaminasi
protein. Hal ini ditunjukkan oleh nilai
perbandingan absorbansi OD260/280 sekitar
1.8. Amplifikasi sekuen 16S rDNA dengan
pasangan primer 63F dan 1387R
menghasilkan band tunggal berukuran
sekitar 1.4 kb yang sesuai dengan perkiraan
(Gambar 3). Proses sekuensing, produk
PCR dimurnikan dengan PCR purificatio kit
1500bp
1300bp
b
Gambar 3 Elektroforesis gel agarosel
ekstrak DNA genom (a), produk PCR 16S
rDNA bakteri merah (b).
Analisis Sekuen Nukelotida 16S rDNA
Urutan nukleotida 16S rDNA bakteri
merah disekuen dari dua arah sebanyak dua
kali. Hasil kedua sekuen dibandingkan
untuk memastikan tidak ada kesalahan
sekuensing. Kemudian kosensus sekuen
sebesar 1294 bp dibandingkan dengan
sekuen dari bakteri lain yang ada dalam
database Gene Bank melalui analsis
BLASTN.
Sekuen
bakteri
merah
mempunyai tingkat kesamaan 99% dengan
Serratia sp. endosimbion wbc (no. asesi
GU124498) dan S. marcescens (no. asesi
HQ154570) (lampiran 2). Hasil ini
berkorelasi dengan analisis fenotipe
menggunakan Biolog GN MicroplateTM
yang mengklasifikasikan bakteri merah ke
dalam genus Serratia.
Analisis Filogenetika
Berikut ini merupakan hasil dari analisi
filogenitika mengunakan program PHYLIP
6
versi 3.6. Terlihat pada hasil bahwa bakteri
merah yang diidentifikasi kekerabatannya,
dekat dengan Serratia marcescens dan
Serratia sp yang berendosimbion dengan
wbc.
0.24 untuk kontaminan (Gambar 6a).
Pengukuran
prodigiosin
dengan
spektrofotometer yang dilakukan dalam
pelarut yang bersifat asam juga mendeteksi
ada 2 titik puncak pada panjang gelombang
500 nm dan 540 nm (Gambar 6b). Serapan
tertinggi prodigiosin dalam pelarut asam
terjadi pada panjang gelombang 540 nm.
Tetapi pada pelarut basa, metabolit
kontaminan tidak terdeteksi. Titik puncak
absorbansi terjadi pada panjang gelombang
460 nm untuk prodigiosin.
Gambar 4 Pohon filogenetik bakteri merah.
Ekstraksi dan Purifikasi Prodigiosin
Prodigiosin diekstraksi dari kultur S.
marcescens 5 hari setelah inkubasi dan
menunjukkan warna merah (Gambar 5a).
Ekstraksi dengan etil asetat berhasil
memisahkan prodigiosin dari fraksi cair
media (Gambar 5b). Prodigiosin dalam etil
asetat dipekatkan dengan evaporator. Pada
suhu 35oC dan kondisi vakum, etil asetat
akan menguap tanpa membawa prodigiosin
sehingga prodigisin dapat dikoleksi.
Prodigiosin yang berhasil diekstrasi
dilarutkan dalam DMSO.
a
Pelarut asam
Pelarut basa
a
b
Gambar 5 Kultur bakteri merah yang
berumur 5 hari (a), ekstraksi prodigiosin
dalam pelarut etil asetat (b).
Hasil purifikasi dengan kromatografi
kolom menggunakan silika gel masih belum
mampu
menghilangkan
metabolit
kontaminan.
Hasil
analisis
dengan
kromatografi lapis tipis mendeteksi 2 spot
pada nilai Rf 0.82 untuk prodigiosin dan
b
Gambar 6 Profil hasil analisis prodigiosin
dengan kromatografi lapisi tipis silika gel
(a) dan spektrofotometer (b).
Uji Antibakteri Prodigiosin
Kemampuan prodigiosin menghambat
pertumbuhan bakteri telah diuji terhadap
7
Xanthomonas oryzae pv. oryzae penyebab
penyakit
kresek pada tanaman padi,
Escherichia
coli
dan
Pseudomonas
solanacearum penyebab penyakit layu pada
tanaman ubi jalar. Pada assay di cawan petri,
konsentrasi
prodigiosin
yang
efektif
menghambat pertumbuhan bakteri sekitar
100-150 g/ml. Pada konsentrasi yang lebih
rendah daya hambatnya berkurang. Jenis
bakteri yang berbeda akan menunjukkan
perbedaan sensitivitasnya. X. Oryzae pv.
oryzae dan P. Solanacearum prodigiosin
konsentrasi 10-15
g/ml masih sensitif
dibandingkan dengan Escherichia coli (Tabel
4). Dalam uji bioautografi, spot merah
prodigisoin juga efektif menghambat ketiga
bakteri tersebut. Pada titik yang ada
prodigiosin terbentuk zona bening yang
menunjukkan tidak tumbuhnya bakteri
(Gambar 7b). Hal ini menunjukkan bahwa
prodigiosin bersifat bakterisida.
Prodigiosin juga efektif menghambat
perkembangan penyakit kresek pada
tanaman padi. Efikasi prodigiosin 150
g/ml mampu menekan serangan penyakit
kresek hingga 30%. Pada tanaman tanpa
aplikasi prodigiosin, serangan penyakit
kresek mencapai 50%, tetapi bila diaplikasi
prodigiosin, serangannya hanya mencapai
20% setelah 4 minggu aplikasi (Gambar 8).
Gejala serangan kresek mulai terlihat pada 1
minggu setelah inokulasi (msi) dengan
gejala coklat kekuningan yang berkembang
dari ujung ke pangkal daun dan terus
meningkat dengan bertambahnya umur
tanaman. Perkembangan penyakit terlihat
sangat lambat pada tanaman yang diaplikasi
prodigiosin dibandingkan dengan tanaman
tanpa aplikasi prodigiosin.
b
Gambar 7 Daya hambat prodigiosin
terhadap berdasarkan pengujian metode
cawan petri (a) dan bioluminator pada lapis
tipis silika gel (b).
Tabel 3 Hasil uji daya hambat prodigiosin
dengan pengenceran yang berbeda (n=4)
Pengenceran
prodigiosin
10-1
Hasil
+
-2
10
10-3
+
-
Tabel 4 Hasil positif uji daya hambat
prodigiosin pada Escherichia coli, layu ubi
jalar dan X.oryzae pv.Oryzae
Pengenceran
prodigiosin
E. coli
P.
solanace
arum
10-1
10-2
10-3
+
-
+
+
-
p3
p1
p2
a
Gambar 8 Grafik efektivitas prodigiosin
terhadap penghambatan penyakit kresek.
X.
oryzae
pv.
Oryzae
+
+
-
8
PEMBAHASAN
Bakteri merah yang diidentifikasi
sebagai S. marcescens berdasarkan uji
fenotipe dengan Biolog GN Microplate TM
dan analisis sekuen 16S rDNA terbukti
bersifat
patogenik
terhadap
wbc.
Patogenisitas S. marcescens diduga terjadi
bukan melalui infeksi integumen, tetapi
melalui mulut dengan termakan ketika
serangga mencucuk dan menghisap cairan
tanaman. Mulut wbc bertipe pencucuk
penghisap dan rostumnya muncul dari
bagian posterior kepala digunakan sebagai
pintu masuk pintu masuk sel bakteri S.
marcescens yang berukuran 1 m. Pada uji
patogenisitas terhadap larva Tenebrio
molitor yang dilakukan melalui pakan, M.
marcescens juga bersifat patogenik, bahkan
protein yang diekstrak sel bakteri bersifat
toksik (Data tidak ditampilkan). Hal ini
menunjukkan bahwa patogenisitas S.
marcescens
bersifat
oral
dengan
menghasilkan protein yang toksik.
Menurut Hurst et al. (2000), faktor
virulensi
S.
entomophila
and
S.
proteamaculans terletak dalam plasmid
pADAP (amber disease-associated plasmid,
153 kb) yang membawa tiga gen penyandi
komplek toksin, yaitu sepABC (untuk S.
entomophila pathogenicity). Produk protein
dari sepABC mempunyai kesamaan sekuen
asam aminonya dengan toksin insektisidal
yang
dihasilkan oleh
Photorhabdus
luminescens (Bowen et al. 1998),
Xenorhabdus nematophilus (Morgan et al.
2001), Yersinia pestis C092 (Parkhill et al.
2001), Pseudomonas syringae pv. tomato
DC3000 (Buell et al. 2003), Serratia sp.
(Hurst et al. 2000; Dodd et al. 2006) dan
Chromobacterium violaceum ATCC 12472
(Vasconselos et al. 2003), yang dikenal
dengan nama komplek toksin (Tc). Tetapi
gen penyandi Tc berada dalam DNA
genomnya. Komplek toksin memiliki berat
molekul tinggi ( 1MDa) dan menunjukkan
aktvitas insektisidal terhadap serangga dari
ordo Coleoptera, Dictyoptera, Hymenoptera,
and Lepidoptera (Bowen et al. 1998).
Komplek toksin tersusun atas empat
komplek toksin (Tca, Tcb, Tcc dan Tcd)
yang masing-masing dikodekan oleh empat
lokus gen, yaitu Tca, Tcb, Tcc dan Tcd.
Komplek toksin Tca dan Tcd bersifat oral
terhadap Mandusa sexta (Waterfield et al.
2001) serta Leptinotarsa decemlineata dan
Bemisia tabaci (Blackburn et al. 2005).
Komplek toksin Tca dan Tcd potensial
untuk menjadi salah satu kandidat pengganti
toksin Bacillus thuringiensis (Bt) dalam
pengembangan tanaman transgenik tahan
serangga hama.
Bakteri patogen S. marcescens
yang menginfeksi wbc juga pernah
dilaporkan di Korea (Kim et al.1998).
Menurut Grimoet dan Grimoet (1978), strain
pigmen merah dari S. marcescens sering
dijumpai pada banyak ordo serangga baik
yang sehat, berpenyakit, maupun mati.
Umumnya, strain S. marcescens
yang
diisolasi dari manusia tidak berpigmen,
sedangkan strain berpigmen yang diisolasi
dari serangga dan lingkungan lainnya tidak
pernah dilaporkan menjadi penyebab infkesi
nosocomial pada manusia (Mohan et al.
2011). Dalam database GeneBank, sekuen
nukleotida 16S rDNA bakteri merah
memiliki tingkat kesamaan 99% dengan
sekuen nukleotida 16S rDNA Serratia sp.
endosimbion wbc (no. asesi GU124498) dan
S. marcescens (no. asesi HQ154570).
Menurut Janda dan Abbott (2007), apabila
terdapat persamaan sekuen nukleotida dari
gen antara satu bakteri dengan bakteri yang
lain dengan nilai lebih dari 90%, maka
bakteri-bakteri tersebut merupakan spesies
bakteri yang sama.
Serratia sp. endosimbion wbc tidak
pernah dilaporkan sebagai patogen yang
kuat. Pemanfaatnya untuk pengendalian wbc
juga jarang dilakukan. Hal ini diduga
disebabkan oleh beberapa faktor, yaitu
pertama endosimbion Serratia adalah
patogen lemah yang hanya akan bersifat
patogenik ketika serangga dalam keadaan
tertekan sehingga penggunaan untuk
pengendalian wbc tidak akan efektif. Kedua
S. marcescens telah dilaporkan sebagai
patogen oportunistik pada manusia sehingga
pemanfaatan dikhawatirkan membahayakan
organisme lain. Ketiga penelitian tentang
faktor-faktor virulen S. marcescens terhadap
wbc belum dilakukan.
Pigmen merah yang dihasilkan oleh S.
marcescens isolat wbc adalah metabolit
sekunder yang dikenal sebagai prodigiosin.
Prodigiosin
merupakan
antibiotik
multifungsi yang memiliki aktivitas sebagai
antibakteria, antifungi, antiprotozoa, dan
antikanker. Tetapi pengaruh prodigiosin
terhadap serangga belum pernah dilaporkan.
Asano et.al (1999) telah mencoba aplikasi
kombinasi prodigiosin dengan kristal toksin
Bacillus
thuringiensi
(Bt)
untuk
9
mengendalikan Spodoptera litura. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa aplikasi
toksin Bt yang dikombinasikan dengan
prodigiosin dapat menunda perkembangan
resistensi serangga terhadap toksin Bt
(Asano et al. 1999).
Aktivitas
antibakteri
prodigiosin
terbukti mampu menghambat perkembangan
E. Coli, Xanthomonas, dan Pseudomonas
secara in vitro, tetapi dosis efektifnya sangat
tinggi. Dalam pengujian secara in vivo,
prodigiosin
juga
mampu
menekan
perkembangan penyakit kresek yang
disebabkan oleh Xanthomonas hingga 30%
dibandingkan kontrol. Sebenarnya S.
marcescens sendiri tidak bersifat antagonis
terhadap Xanthomonas dalam pengujian
secara in vitro. Oleh karena itu, aplikasi
langsung sel bakteri S. marcescena tidak
mampu
mengendalikan
Xanthomonas.
Pengendalian Xanthomonas yang efektif
diperlukan prodigiosin pekat.
SIMPULAN
Berdasarkan uji fenotipe dengan Biolog
GN Microplate TM dan analisis sekuen 16S
rDNA, bakteri merah yang berendosimbion
dengan wbc serta bersifat patogenik adalah
S. marcescens. Database GeneBank, sekuen
nukleotida 16S rDNA bakteri merah
memiliki tingkat kesamaan 99% dengan
sekuen 16S rDNA Serratia sp endosimbion
wbc. Prodigiosin merupakan metabolit
sekunder dari S. marcescens yang mampu
menghambat perkembangan E. coli,
Xanthomonas, dan Pseudomonas secara in
vitro, dengan dosis efektif yang sangat
tinggi. Secara in vivo, prodigiosin mampu
menekan perkembangan penyakit kresek
yang disebabkan oleh X. oryzae pv. oryzae
sebesar 30%.
SARAN
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut
mengenai faktor-faktor virulensia S.
marcescens terhadap serangga, sehingga
dapat menjadi agen pengendali serangga
yang lebih baik. Penelitian lebih lanjut untuk
mendapatkan media yang baik untuk
produksi prodigiosin.
DAFTAR PUSTAKA
Alamaendah. 2006. Hama padi yang sulit
dibasmi. Natur Indonesia 6(2) : 84-86
Asano et al. 1999. Prodigiosin produced by
Serratia marcescens enhances the
insectisidal
activity of
Bacillus
thuringiensis delta endotoxin against
common cutworm, Spodoptera litura. J.
Pesticide Sci. 24:381-385.
Baskoro et al. 2002.Pengendalian serangga
hama dengan menggunakan bakteri
merah. Laporan hasil penelitian, Balai
pengamatan dan Peramalan Hama dan
Penyakit Tanaman.
Blackburn M, Golubeva E, Bowen D,
Effrench-Constant RH.1998. A novel
insectisidal toxin form Photarhabdus
luminescens, Toxin complex a (Tca)
and it histopatological effects on the
midgut of Manduca sexta. Environ
Microbiol 64(8):36-41.
Bowen et al. 1998. Insecticidal toxins from
the
bacterium
Photorhabdus
luminescens. Sci 280:2129-2132.
Buell CR. et al. 2003. The complete
genome sequence of the Arabidopsis
and tomato pathogen Pseudomonas
syringae pv tomato DC3000. Proc Natl
Acad Sci USA 100: 10181-10186.
Croft et al.2002. Antiprotozoal activities of
phospholipid analogues. Mol and
Biochem Parsitology. 126:165-172.
Davaraj Naveen Raj, Dharumaduari
Dhanasekaran, Nurdin Thajuadin and
Annamalai
Panneerselvam.2009.
Production of prodigiosin from Serratia
marcescens and its cytotoxicity activity.
J of Pharmacy Recearch. 2(4):590-593.
Giri et al.2004. A novel medium for the
enhanced cell growth and production of
prodigiosin from Serratia marcescens
isolated from soil. BMC Microbiol
4(11):1-10.
Grimont, P.A.D. and Grimont, F. 1978. The
genus Serratia. Annu Rev Microbiol.
32:221-248.
Hurst MR, Glare TR, Jackson A, Ronson
CW.2000.
Plasmid
located
pathogenicity determinants of Serratia
entomophila, the causal agent of amber
disease of grass grub, show simililarity
to the insectisidal to sans of
Photorhabdus
lumisnescens.
J
Bacteriol.182:5127-5138.
Janda J.M and Abbott S.L. 2007. 16S rRNA
gene
sequencing
for
backterial
identifications in the diagnostic
laboratories : pluses, perils, and pitfalls.
J Clinic Microbiol. 45(9) : 2761-2761.
Khanafari et al.2006.Review of prodigiosin,
Pigmentation in Serratia.Biological.
Sci. 6(1):1-3.
Kim C.H,and Kim S.W Hong S.I.1998.
Production of red pigment by Serratia
10
sp.KH-95 and its cultural properties.
Korea. J Biotechnol Bioeng.13:431-437.
Mohan, M, Selvakumar, G, Sushil
S.N,Bhatt,
J.C,Gupta,
H.S.2011.
Entomopathogen of endophytic Serratia
marcescens strain SRM against larvae
of Helicoverpa armigera (Noctuidae:
Lepidoptera). World J. Microbiol and
Biotechnol. Published online: 07 April
2011.
Morgan. J.A, M.Sergent, D.Ellis, M.
Ousley,and P. Jarret. 2001. Sequence
analysis of insektisidal genes from
Xenorhabdus nematophilus PMFI1296.
Appl Environ Microbiol 67:2062-2069.
Nakashima T, Tamura T, Kurachi M,
Yamaguchi K, Oda T. 2005. Apoptosis
like red pigment produced by ãProteobacterium and its multiple
bioactivities. Biol Pharmacol Bull.
28:2289-2295.
Parkhill. J et al.2001.Genome sequence of
Yersinia pestis, the causative agent of
plague. Nature 413:523-527.
Vasconcenlosn ATR et al. 2003. The
complete
genome
sequence
of
Chromabacterium violaceum reveals
remarkable and exploitable bacterial
adaptability. Proc Natl Acad Sci
USA.100:11660-11665.
Waterfield N, A. Dowling, S. Sharma, P.J
Dabom, U.Potter and R.H EffrenchConstant.2001. Oral toxicity of
Photorhabdus luminescens W14 toxin
complexes in Eschericia coli. Appl
Environ Microbiol. 67:5017-5024.
LAMPIRAN
12
Lampiran 1. Karakteristik fenotipe bakteri merah berdasarkan pengujian dengan Biolog GN
MicroplateTM
Uji
Reaksi
Uji
Cyclodextrin
+
Itaconic acid
Dextrin
+
-keto butyric acid
Glycogen
+
-keto glutaric acid
Tween 40
+
-keto valeric acid
Tween 80
+
D,L-latic acid
N-acetyl-D-galactosamine
+
Malonic acid
N-acetyl-D-glucosamine
+
Propionic acid
Adonitol
+
Quinic acid
L-arabinose
+
Saccharic acid
D-arabitol
+
Sebacic acid
Cellobiose
+
Succinic acid
i-erythritol
+
Bromo succinic acid
D-fructose
+
Succinamic acid
L-fucose
[+]
Glucuronamide
D-galactose
+
Alaninamide
Gentiobiose
[+]
D-alanine
+
L-alanine
-D-glucose
m-inositol
+
L-alanyl-glycine
+
L-asparagine
-D-lactose
Lactulose
+
L-aspartic acid
Maltose
+
L-glutamic acid
D-mannitol
+
Glycyl-L-aspartic acid
D-Manose
+
Glycyl-Lglutamic acid
D-melibiose
[+]
L-histidine
[+]
Hydroxy L-proline
-methyl-D-glucoside
D-psicose
+
L-leucine
D-raffinose
+
L-ornithine
L-rhamnose
+
L-phenylalanine
D-sorbitol
+
L-proline
Sucrose
+
L-pyroglutamic acid
D-trehalose
[+]
D-serine
Turanose
+
L-serine
Xylitol
+
Lthreonine
Methyl pyruvate
[+]
D,L-camitine
Mono-methyl succinate
+
-amino butyric acid
Acetic acid
[+]
Urocanic acid
Cis-aconitic acid
+
Inosine
Citric acid
+
Uridine
Formic acid
+
Thymidine
D-galactonic acid
+
Phenyl ethylamine
D-galacturonic acid
+
Putrescine
D-gluconic acid
+
2-amino ethanol
D-glucosaminic acid
+
2,3-butanediol
D-glucuronic acid
+
Glycerol
+
-hydroxybutyric acid
D,L- -glycerol phosphate
+
Glucose-1-phosphate
- hydroxybutyric acid
+
Glucose-6-phosphate
- hydroxybutyric acid
+
-hydroxy phenylacetic acid
Keterangan : + : reaksi positive; [+] : reaksi moderat; - : reaksi negative
Reaksi
[+]
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
[+]
[+]
13
Lampiran 2. Perunutan sekuen nukleotida 16 S DNA hasil analisis software Blastn yang terdapat
dalam situs National Center for Biotechnology Information.
Accesion
Description
GU124498.1
Serratia sp. Endosimbiont of Nilaparvata lugens clone M280 16S Ribosomal
HQ143657.1
Serratia marcescens strain YQH50 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
HQ538684.1
Serratia sp. bk_46 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
HQ154570.1
Serratia marcescens strain R9-8A 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
HM640277.1
EU876700.1
FJ853424.1
Serratia sp. YF-2 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
Serratia marcescens strain sls-1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
Serratia marcescens strain MH6 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
FJ495145.1
Serratia sp. BSFC16 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
FJ360761.3
FJ360759.1
Serratia sp. PSB9 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
Serratia marcescens strain PSB19 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
FJ009445.1
Bacterium enrichment culture clone JC1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
EU525929.1
Serratia marcescens strain SDLH-I 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
EF415649.1
HQ917058.1
JF206698.1
Serratia marcescens 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
Serratia sp. NB2 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
Uncultured bacterium clone ncd2365e07c2 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
JF138992.1
Uncultured bacterium clone ncd1613a08c1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
HM240853.1
Serratia entomophila strain M6 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
HM136578.1
Serratia sp. BL2 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
GQ465847.1
Serratia marcescens strain SB08 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
GQ417536.1
Uncultured Serratia sp. clone F3jan.3 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
GQ416504.1
Uncultured Serratia sp. clone F7may2.65 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
GQ165813.1
Serratia sp. XRK6 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
Total
score
Query
Covarage
∆E
Value
Max
Ident
2776
100 %
0.0
100%
2307
99 %
0.0
99 %
2307
99 %
0.0
99 %
2307
99 %
0.0
2307
2307
99 %
99 %
0.0
0.0
99 %
99 %
2307
99 %
0.0
99 %
2307
99 %
0.0
99 %
2307
99 %
0.0
99 %
2307
99 %
0.0
99 %
2307
99 %
0.0
99 %
2307
99 %
0.0
99 %
2307
2302
99 %
99 %
0.0
0.0
99 %
98 %
2302
99 %
0.0
98 %
2302
99 %
0.0
98 %
2302
99 %
0.0
98%
2302
99 %
0.0
98 %
2302
99 %
0.0
98 %
2302
99 %
0.0
98 %
2302
99 %
0.0
98 %
2302
99 %
0.0
98 %
99 %
ABSTRAK
YOHANA ARTDHI DAHLIANI. Identifikasi dan Ekstraksi Pigmen Bakteri Merah Patogenik
terhadap Wereng Batang Cokelat. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan TRI PUJI PRIYATNO.
Wereng Batang Cokelat merupakan salah satu hama tanaman padi yang berbahaya dan
sukar dikendalikan. Penemuan bakteri merah yang mampu menginfeksi wbc menjadi hal yang
sangat penting, karena wbc dengan tipe mulut pencucuk penghisap sangat jarang terinfeksi oleh
bakteri. Penelitian ini dilakukan untuk mengidentifikasi spesies bakteri merah yang patogenik
terhadap wbc, serta mengekstraksi pigmen bakteri merah untuk diuji aktivitasnya. Pertama
pengisolasian dan peremajaan bakteri, pengujian fenotipe dengan menggunakan kit GN
MicroPlateTM Biolog kit, analisis sekuen nukleotida 16S rDNA dengan software BlastN yang
terdapat dalam situs NCBI. Analisis filogenetika menggunakan program PHYLIP versi 3.6.Bakteri
merah yang diidentifikasi adalah Serratia marcescens. S. marcescens sensitif terhadap
streptomisin dengan konsentrasi 25 µg/ml hingga 50 µg/ml. Metabolit sekunder yang dihasilkan
bakteri merah adalah prodigiosin dengan konsentrasi 150 µg/ml mampu menekan perkembangan
penyakit kresek yang disebabkan oleh Xanthomonas oryzae pv. oryzae sebesar 30 %.
Kata kunci : Bakteri merah, Serratia marcescens, prodigiosin.
ABSTRACT
YOHANA ARTDHI DAHLIANI. Identification and extraction of Red Pigment of pathogenic
bacteria to Stem Brown planthopper (wbc). Superviced by IMAN RUSMANA and TRI PUJI
PRIYATNO.
Brown Planth