Pengujian aktivitas transglikosilasi biakan Xanthomonas Campestris pada berbagai sumber karbohidrat
ABSTRAK
DEDY SANJI PRASTIKO. Pengujian Aktivitas Transglikosilasi Biakan Xanthomonas campestris
pada Berbagai Sumber Karbohidrat. Dibimbing oleh NISA RACHMANIA MUBARIK dan
JOKO SULISTYO.
Bakteri fitopatogenik Xanthomonas campestris adalah anggota bakteri aerobik penyebab
kebusukan tanaman cruciferous, seperti cabai, brokoli, dan kubis. Bakteri ini menghasilkan
enzim-enzim dan polisakarida ekstraseluler berupa biopolimer yang dapat digunakan dalam olahan
bahan pangan. Aplikasi gum xanthan dalam industri sebagai viscosifying, bahan pengental,
penstabil, dan agen suspensi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan biakan X.
campestris dalam mensistesis produk transfer secara reaksi transglikosilasi menggunakan enzim
CGTase pada berbagai sumber karbohidrat. Aktivitas transfer diuji menggunakan kromatografi
lapis tipis (KLT) dan kromatografi cair kinerja tinggi dengan indeks refraksi (KCKT IR). Proses
sintesis gum xanthan dapat dibentuk melalui reaksi transglikolisasi. Substrat jagung menjadi
substrat terbaik dalam pembentukan produk transfer dibandingkan substrat yang lainnya. Hasil
analisis menunjukkan substrat jagung dengan akseptor xilosa memiliki kadar kandungan gum
xanthan sebesar 0,47% dibandingkan kadar standar gum xanthan (Sigma® ) sebesar 0,6%.
Kata kunci : Gum xanthan, reaksi transglikosilasi, X. campestris, CGTase
ABSTRACT
DEDY SANJI PRASTIKO. Tested of Xanthomonas campestris Cultures transglycosylation
Activity on Different Sources of Carbohydrates. Supervised by NISA RACHMANIA and JOKO
SULISTYO.
Phytopathogenic bacterium, Xanthomonas campestris is an aerobic bacterium that caused
rot disease on cruciferous plants, such as peppers, broccoli, and cabbage. This bacterium produced
enzymes and extracellular polysaccharide biopolymers that can be used in food processing. The
applications of xanthan gum as one of the extracellular polysaccharides of X. campestris in
industry used as viscosifying and thickening agents, stabilizing, and suspension agents. Xanthan
gum can be synthesized by transglycosylation reaction. The objective of this research was to
know the capability of X. campestris in synthesizing transfer product on transglycosyzation
reaction by using CGTase from various carbohydrate sources. Transfer activity was tested using
thin layer chromatography (TLC) and high performance liquid chromatography refraction index
(HPLC RI). Corn showed as the best substrate in the formation of transfer product compared than
the other substrates. Using xylose acceptor was obtained that the level content of xanthan gum was
0.47% of 0.6% xanthan gum standard (Sigma®).
Keywords: Xanthan Gum, transglycosylation reaction, X. campestris, CGTase
11
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Bakteri
fitopatogenik
Xanthomonas
campestris ialah suatu anggota bakteri aerobik
famili
Xanthomonadaceae,
penyebab
kebusukan tanaman cruciferous, seperti cabai,
brokoli, dan kubis (Gambar 1, Onsando 1992).
Ciri dan karakterisasi X. campestris ialah
jumlah flagella satu, tidak dapat mereduksi
NO3- menjadi NO2-, tidak mendekarbosilasi
lisin, membutuhkan metionin atau sistein
dalam pertumbuhannya, bentuk mukoid pada
media tumbuh agar-agar nutrien yang
mengandung 5% glukosa, menghidrolisis
gelatin dan pati, menghidrolisis eskulin dan
protein, menghasilkan H2S dari pepton,
terdapat aktivitas pektinase dalam kultur, suhu
maksimal pertumbuhan 35-39oC, toleran
terhadap salinitas 2,0 – 5,0 promil,
memproduksi asam serta patogen pada
tumbuhan
terutama
pada
kelompok
cruciferous (John et al. 1994). Bakteri X.
campestris menghasilkan berbagai enzim
ekstraseluler seperti amilase, endoglukanase,
poligalakturonate liase dan protease (Dow &
Daniels 1994) .
Gambar 1 Serangan X. campestris pada
bagian permukaan atas daun
kubis
(Sumber:
http://www.apsnet.org/publication
s/apsnetfeatures/Pages/PDDiagno
sis.aspx).
Bakteri ini pun dapat menghasilkan
polisakarida ekstraseluler yang dikenal
dengan gum xanthan, suatu biopolimer yang
dapat digunakan dalam pengolahan makanan.
Aplikasi gum xanthan
dalam industri
digunakan sebagai viscosifying, bahan
pengental, penstabil, dan agen suspensi
(Kennedy & Bradshaw 1984, Rosalam &
England 2006).
Gum xanthan ialah heteropolisakarida
larut air yang dihasilkan oleh bakteri Gram
negatif X. campestris (Borges et al. 2009).
Gum xanthan merupakan jenis biopolimer
yang memiliki prospek cerah baik di dalam
negeri maupun luar negeri karena memiliki
nilai komersial yang tinggi. Gum xanthan
digunakan sebagai suspending agent untuk
menghilangkan pulp, dan bahan-bahan yang
dapat membuat keruh dalam beberapa
minuman. Gum xanthan juga dipakai sebagai
penstabil untuk emulsi minyak dalam
beberapa minuman tertentu, makanan beku
dan digunakan dalam industri nonpangan
sebagai oil welldrilling
fluid additive
terutama
pada
industri
tekstil
dan
pertambangan. Harga komersial gum xanthan
sangat mahal karena diproduksi dengan bahan
dasar glukosa dan sukrosa (Yoo & Harcum
1999). Produksi tahunan gum xanthan dunia
diperkirakan 25000 ton (Galindo 1994).
Gum xanthan berwujud butiran saat
kering dan mampu meningkatkan viskositas
air dengan konsentrasi hanya 0,01%. Gum
xanthan memiliki berat molekul bervariasi
antara 2000 – 62000 kDa. Lebarnya selang
ini disebabkan oleh pengaruh ikatan hidrogen
yang menstabilkan agregat-agregat polimer
dalam air. Satu monomer gum xanthan
mengandung 5 satuan yang terdiri atas 2
satuan glukosa, 2 satuan manosa, dan 1
satuan asam glukoronat (Kennedy &
Bradshaw 1984).
Proses pembentukan gum xanthan sangat
rumit dan belum banyak diketahui.
Mekanisme
pembentukannya
secara
sederhana
melalui
reaksi
enzimatik
transglikosida.
Enzim siklodekstrin glukanotransferase
(1,4-α-D-1,4-glukano-transferase,
EC
2.4.1.19) disingkat menjadi CGTase ialah
enzim yang mengkatalisis sintesis pati
menjadi reaksi siklisasi. Enzim ini tergolong
enzim transferase yang berperan dalam
pemindahan gugus glikosidik pada reaksi
siklisasi dekstrin menjadi siklodekstrin
(Kometani et al. 1994, Mori et al. 1994).
CGTase merupakan enzim multifungsi
yang berperan dalam proses siklisasi, yaitu
mengubah pati dan α-1,4 glukan menjadi
siklodekstrin melalui reaksi transglikosilasi
intramolekuler. Enzim ini juga mampu
mengkatalisis reaksi penggabungan yaitu
membuka
cincin
siklodekstrin
dan
mentransfer maltooligosakarida linear melalui
reaksi transglikosilasi intermolekuler pada
akseptor. CGTase tidak hanya mengkatalisis
secara intramolekuler yang mengubah pati
menjadi siklodekstrin dan intermolekuler yang
mentransfer gugus glukosil ke akseptor yang
sesuai, tetapi dapat juga menghidrolisis pati
dan siklodekstrin menjadi senyawa yang lebih
sederhana
(Kometani
et
al.
1996).
Siklodekstrin glukanotransferase (CGTase)
dihasilkan oleh berbagai macam bakteri
seperti Bacillus macerans, B. megaterium, B.
2
circulans,
B. cereus (Tankova 1998), dan
diduga juga terdapat pada X. campestris. Oleh
karena itu, dalam penelitian awal, biakan X.
campestris ditumbuhkan pada media dan
dilakukan pengujian untuk mengetahui
kemampuan biakan X. campestris dalam
menghasilkan enzim CGTase.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
kemampuan biakan X. campestris dalam
mensintesis produk transfer secara reaksi
transglikosilasi menggunakan enzim CGTase
pada berbagai sumber karbohidrat.
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan mulai
bulan April 2010 sampai bulan November
2010
di
Laboratorium
Bioprospeksi,
Mikrobiologi LIPI Cibinong.
BAHAN DAN METODE
Bahan
Bahan yang digunakan
yaitu X.
campestris FNCC 0089 yang merupakan
koleksi Mikrobiologi Cibinong Science
Center (CSC) LIPI-Bogor.
kemudian disentrifugasi pada kecepatan 8030
g
selama 15 menit pada suhu 4 oC.
Selanjutnya supernatannya digunakan sebagai
sumber enzim CGTase kasar (Sulistyo et al.
2002).
Uji Aktivitas Hidrolitik, Optimasi pH dan
suhu CGTase
Penentuan kondisi optimum aktivitas
enzim CGTase dilakukan pada berbagai pH
dan suhu. Campuran reaksi terdiri atas 100 µl
larutan enzim CGTase kasar dan 450 µl bufer
Na-fosfat 50mM yang mengandung 0,5 % pati
dapat larut (soluble starch) diinkubasi pada
suhu 45oC selama 10 menit. Reaksi dihentikan
dengan penambahan HCl 0,5N sebanyak 1 ml.
Campuran reaksi kemudian direaksikan
dengan pewarna iodin 2,5 ml (KI 0,05% yang
mengandung I2 0,005%). Serapan warna
diukur dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang 660 nm. Satu unit aktivitas enzim
dinyatakan sebagai jumlah enzim yang dapat
menurunkan unit serapan sebanyak 0,5 pada
panjang gelombang (λ) 660 nm (Sulistyo et al.
2002). Selanjutnya dilakukan pengukuran
berseri selama lima hari tiap 24 jam.
Media Kultur X. campestris. Bahanbahan media standar (NH)2SO4 3 g, MgSO4
0,5 g, CaSO4 0,1 g, MnSO4 0,01 g, FeSO4 0,1
g, malt ekstrak 3 g, pepton 0,5 g dilarutkan
dalam takaran 1 L bufer Na-fosfat 0,05 mM
pH 7 dan glukosa 1 % sebagai substrat.
Media standar yang sudah dilarutkan
kemudian dituang
ke dalam 5 tabung
erlenmeyer ukuran 500 ml masing-masing
100 ml dan ditambah masing-masing satu
jenis substrat pati dari mulai singkong,
kentang, ubi, jagung dan beras masing-masing
2 %, kemudian disterilisasi menggunakan
autoklaf suhu 121oC tekanan 1 atm.
Uji Kepekatan Karbohidrat
Uji karbohidrat ditentukan dengan
menggunakan kaidah asam sulfat-fenol
(Dubois et al. 1956). Sebanyak 0,5 ml fenol
5% ditambah 2,5 ml H2SO4 pekat, kemudian
ditambahkan 0,5 ml sampel yang telah
diencerkan 10 kali dengan akuades. Campuran
reaksi dibiarkan selama 20 menit pada suhu
ruang.
Selanjutnya
ditentukan
nilai
absorbansinya pada panjang gelombang 490
nm. Kepekatan karbohidrat ditentukan melalui
kurva standar pati dapat larut (Lampiran 1).
Kurva standar karbohidrat dibuat dengan cara
mengukur absorbansi kandungan karbohidrat
yang diketahui konsentrasinya. Konsentrasi
standar dibuat dengan melarutkan pati dapat
larut dengan konsentrasi 0, 10, 20, 30, 40, 50
µg dilarutkan masing-masing ke dalam
akuades hingga volume larutan mencapai 5
ml. Larutan kemudian direaksikan dengan 0,5
ml fenol dan 2,5 ml H2SO4 pekat. Kemudian
campuran reaksinya diukur absorbansinya
pada panjang gelombang 490 nm mulai dari
konsentrasi terkecil hingga konsentrasi
terbesar.
Produksi Enzim CGTase
Media produksi enzim CGTase yang telah
ditambah kultur X. campestris diinkubasi
selama 72-120 jam di dalam inkubator goyang
dengan kecepatan 240 rpm, suhu 37 oC
Uji Aktivitas Transglikosilasi
Campuran reaksi sebanyak 2 ml, yang
terdiri atas 1,5 ml bufer Na-fosfat 0,05 M pH
7 yang mengandung 5% pati dapat larut dan
resorsinol 2% serta 0,5 ml enzim CGTase
Metode
Pembuatan Media
Media Lauria Broth agar (LA). Bahanbahan seperti ekstrak khamir 5 g, tripton 10 g,
NaCl 5 g, dan agar-agar 15 g dilarutkan dalam
takaran 1 L akuades kemudian disterilisasi
pada suhu 121 oC tekanan 1 atm.
2
circulans,
B. cereus (Tankova 1998), dan
diduga juga terdapat pada X. campestris. Oleh
karena itu, dalam penelitian awal, biakan X.
campestris ditumbuhkan pada media dan
dilakukan pengujian untuk mengetahui
kemampuan biakan X. campestris dalam
menghasilkan enzim CGTase.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
kemampuan biakan X. campestris dalam
mensintesis produk transfer secara reaksi
transglikosilasi menggunakan enzim CGTase
pada berbagai sumber karbohidrat.
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan mulai
bulan April 2010 sampai bulan November
2010
di
Laboratorium
Bioprospeksi,
Mikrobiologi LIPI Cibinong.
BAHAN DAN METODE
Bahan
Bahan yang digunakan
yaitu X.
campestris FNCC 0089 yang merupakan
koleksi Mikrobiologi Cibinong Science
Center (CSC) LIPI-Bogor.
kemudian disentrifugasi pada kecepatan 8030
g
selama 15 menit pada suhu 4 oC.
Selanjutnya supernatannya digunakan sebagai
sumber enzim CGTase kasar (Sulistyo et al.
2002).
Uji Aktivitas Hidrolitik, Optimasi pH dan
suhu CGTase
Penentuan kondisi optimum aktivitas
enzim CGTase dilakukan pada berbagai pH
dan suhu. Campuran reaksi terdiri atas 100 µl
larutan enzim CGTase kasar dan 450 µl bufer
Na-fosfat 50mM yang mengandung 0,5 % pati
dapat larut (soluble starch) diinkubasi pada
suhu 45oC selama 10 menit. Reaksi dihentikan
dengan penambahan HCl 0,5N sebanyak 1 ml.
Campuran reaksi kemudian direaksikan
dengan pewarna iodin 2,5 ml (KI 0,05% yang
mengandung I2 0,005%). Serapan warna
diukur dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang 660 nm. Satu unit aktivitas enzim
dinyatakan sebagai jumlah enzim yang dapat
menurunkan unit serapan sebanyak 0,5 pada
panjang gelombang (λ) 660 nm (Sulistyo et al.
2002). Selanjutnya dilakukan pengukuran
berseri selama lima hari tiap 24 jam.
Media Kultur X. campestris. Bahanbahan media standar (NH)2SO4 3 g, MgSO4
0,5 g, CaSO4 0,1 g, MnSO4 0,01 g, FeSO4 0,1
g, malt ekstrak 3 g, pepton 0,5 g dilarutkan
dalam takaran 1 L bufer Na-fosfat 0,05 mM
pH 7 dan glukosa 1 % sebagai substrat.
Media standar yang sudah dilarutkan
kemudian dituang
ke dalam 5 tabung
erlenmeyer ukuran 500 ml masing-masing
100 ml dan ditambah masing-masing satu
jenis substrat pati dari mulai singkong,
kentang, ubi, jagung dan beras masing-masing
2 %, kemudian disterilisasi menggunakan
autoklaf suhu 121oC tekanan 1 atm.
Uji Kepekatan Karbohidrat
Uji karbohidrat ditentukan dengan
menggunakan kaidah asam sulfat-fenol
(Dubois et al. 1956). Sebanyak 0,5 ml fenol
5% ditambah 2,5 ml H2SO4 pekat, kemudian
ditambahkan 0,5 ml sampel yang telah
diencerkan 10 kali dengan akuades. Campuran
reaksi dibiarkan selama 20 menit pada suhu
ruang.
Selanjutnya
ditentukan
nilai
absorbansinya pada panjang gelombang 490
nm. Kepekatan karbohidrat ditentukan melalui
kurva standar pati dapat larut (Lampiran 1).
Kurva standar karbohidrat dibuat dengan cara
mengukur absorbansi kandungan karbohidrat
yang diketahui konsentrasinya. Konsentrasi
standar dibuat dengan melarutkan pati dapat
larut dengan konsentrasi 0, 10, 20, 30, 40, 50
µg dilarutkan masing-masing ke dalam
akuades hingga volume larutan mencapai 5
ml. Larutan kemudian direaksikan dengan 0,5
ml fenol dan 2,5 ml H2SO4 pekat. Kemudian
campuran reaksinya diukur absorbansinya
pada panjang gelombang 490 nm mulai dari
konsentrasi terkecil hingga konsentrasi
terbesar.
Produksi Enzim CGTase
Media produksi enzim CGTase yang telah
ditambah kultur X. campestris diinkubasi
selama 72-120 jam di dalam inkubator goyang
dengan kecepatan 240 rpm, suhu 37 oC
Uji Aktivitas Transglikosilasi
Campuran reaksi sebanyak 2 ml, yang
terdiri atas 1,5 ml bufer Na-fosfat 0,05 M pH
7 yang mengandung 5% pati dapat larut dan
resorsinol 2% serta 0,5 ml enzim CGTase
Metode
Pembuatan Media
Media Lauria Broth agar (LA). Bahanbahan seperti ekstrak khamir 5 g, tripton 10 g,
NaCl 5 g, dan agar-agar 15 g dilarutkan dalam
takaran 1 L akuades kemudian disterilisasi
pada suhu 121 oC tekanan 1 atm.
3
Analisis Gum Xanthan
Campuran reaksi enzim substrat
jagung dengan akseptor xilosa kemudian
dianalisis pada HPLC RI menggunakan
kolom karbohidrat PLH 2 pelarut asetonitril :
air perbandingan (80:20) dengan suhu 40 oC.
Standar yang digunakan adalah gum xanthan
Sigma® yang dilarutkan dengan konsentrasi
0,6%.
HASIL
Aktivitas CGTase
(U/mL)
Optimasi pH dan Suhu Aktivitas CGTase
Penentuan pH optimum aktivitas enzim
CGTase yang dihasilkan dari biakan X.
campestris dilakukan pada suhu 45oC dalam
larutan bufer fosfat 0,5 mM pada kisaran
antara pH 6,0-8,0. Hasil pengujian
menunjukkan bahwa CGTase memiliki
aktivitas tertinggi pada pada pH 7 yaitu
sebesar 0,4522 unit/ml (Gambar 2, Lampiran
0,5
2)
0,4
0,3
Aktivitas CGTase (U/mL)
Aktivitas tertinggi setelah inkubasi pada
suhu 45oC yaitu sebesar 0,3472 unit/ml.
Setelah itu mengalami penurunan aktivitas
pada suhu 50 dan 55oC. Aktivtas CGTase
mengalami peningkatan pada suhu 65oC
yaitu sebesar 0,2658 unit/ml (Gambar 3,
Lampiran 2).
0,4
0,3
0,2
0,1
0
35 40 45 50 55 60 65 70
Suhu (0C)
Gambar 3 Aktivitas hidrolitik enzim CGTase
dari X. campestris FNCC 0089
pada berbagai suhu.
Pengukuran Aktivitas CGTase pada
Berbagai Substrat Selama 120 Jam
Inkubasi
Pengukuran aktivitas CGTase dari mulai 0
jam hingga 120 jam inkubasi, menunjukan
hasil dengan peningkatan aktivitas yang
bervariasi. Enzim dengan substrat kentang,
jagung, dan singkong meningkat aktivitasnya
pada 24 jam pertama dan cenderung stabil
hingga 120 jam. Enzim dengan substrat beras
dan ubi meningkat bertahap tiap 24 jam
hingga jam ke-120 (Gambar 4, Lampiran 2).
Aktivitas CGTase (U/mL)
kasar diinkubasi pada suhu 45oC selama 24
jam. Aktivitas enzim CGTase dihentikan
pada suhu 100 oC selama 10 menit, setelah
dingin
ditambahkan
enzim
αamiloglukosidase produksi Sigma® sebanyak
0,005% dan diinkubasi selama 45 menit.
Produk
transfer
yang
dihasilkan
diidentifikasi dengan kromatografi lapis tipis
(KLT), menggunakan larutan etil asetat-asam
asetat-akuades (3:1:1, v/v). Plat KLT
dikeringkan pada suhu 100 oC selama 1 jam,
kemudian
disemprot
dengan
larutan
pembangkit yang mengandung H2SO4 20%
dalam metanol, selanjutnya plat KLT dibakar
dalam oven pada suhu 150oC selama 5-10
menit.
Setelah didapatkan substrat dengan
aktivitas transfer tertinggi, lalu dilakukan uji
aktivitas transfer dengan mengganti akseptor
resolsinol dengan gula sederhana yang terdiri
atas glukosa, galaktosa, xilosa, dan fruktosa
sehingga didapatkan akseptor dengan produk
transfer terbaik.
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0,2
0
48
72
96 120
Waktu (Jam)
singkong
kentang
0,1
0
6
6,5
7
pH
7,5
8
Gambar 2 Aktivitas hidrolitik enzim CGTase
dari X. campestris FNCC 0089
pada berbagai pH.
ubi
24
jagung
Gambar 4 Aktivitas CGTase selama 120 jam
inkubasi. Pengukuran dilakukan
pada suhu 45oC dan pH 7.
3
Analisis Gum Xanthan
Campuran reaksi enzim substrat
jagung dengan akseptor xilosa kemudian
dianalisis pada HPLC RI menggunakan
kolom karbohidrat PLH 2 pelarut asetonitril :
air perbandingan (80:20) dengan suhu 40 oC.
Standar yang digunakan adalah gum xanthan
Sigma® yang dilarutkan dengan konsentrasi
0,6%.
HASIL
Aktivitas CGTase
(U/mL)
Optimasi pH dan Suhu Aktivitas CGTase
Penentuan pH optimum aktivitas enzim
CGTase yang dihasilkan dari biakan X.
campestris dilakukan pada suhu 45oC dalam
larutan bufer fosfat 0,5 mM pada kisaran
antara pH 6,0-8,0. Hasil pengujian
menunjukkan bahwa CGTase memiliki
aktivitas tertinggi pada pada pH 7 yaitu
sebesar 0,4522 unit/ml (Gambar 2, Lampiran
0,5
2)
0,4
0,3
Aktivitas CGTase (U/mL)
Aktivitas tertinggi setelah inkubasi pada
suhu 45oC yaitu sebesar 0,3472 unit/ml.
Setelah itu mengalami penurunan aktivitas
pada suhu 50 dan 55oC. Aktivtas CGTase
mengalami peningkatan pada suhu 65oC
yaitu sebesar 0,2658 unit/ml (Gambar 3,
Lampiran 2).
0,4
0,3
0,2
0,1
0
35 40 45 50 55 60 65 70
Suhu (0C)
Gambar 3 Aktivitas hidrolitik enzim CGTase
dari X. campestris FNCC 0089
pada berbagai suhu.
Pengukuran Aktivitas CGTase pada
Berbagai Substrat Selama 120 Jam
Inkubasi
Pengukuran aktivitas CGTase dari mulai 0
jam hingga 120 jam inkubasi, menunjukan
hasil dengan peningkatan aktivitas yang
bervariasi. Enzim dengan substrat kentang,
jagung, dan singkong meningkat aktivitasnya
pada 24 jam pertama dan cenderung stabil
hingga 120 jam. Enzim dengan substrat beras
dan ubi meningkat bertahap tiap 24 jam
hingga jam ke-120 (Gambar 4, Lampiran 2).
Aktivitas CGTase (U/mL)
kasar diinkubasi pada suhu 45oC selama 24
jam. Aktivitas enzim CGTase dihentikan
pada suhu 100 oC selama 10 menit, setelah
dingin
ditambahkan
enzim
αamiloglukosidase produksi Sigma® sebanyak
0,005% dan diinkubasi selama 45 menit.
Produk
transfer
yang
dihasilkan
diidentifikasi dengan kromatografi lapis tipis
(KLT), menggunakan larutan etil asetat-asam
asetat-akuades (3:1:1, v/v). Plat KLT
dikeringkan pada suhu 100 oC selama 1 jam,
kemudian
disemprot
dengan
larutan
pembangkit yang mengandung H2SO4 20%
dalam metanol, selanjutnya plat KLT dibakar
dalam oven pada suhu 150oC selama 5-10
menit.
Setelah didapatkan substrat dengan
aktivitas transfer tertinggi, lalu dilakukan uji
aktivitas transfer dengan mengganti akseptor
resolsinol dengan gula sederhana yang terdiri
atas glukosa, galaktosa, xilosa, dan fruktosa
sehingga didapatkan akseptor dengan produk
transfer terbaik.
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0,2
0
48
72
96 120
Waktu (Jam)
singkong
kentang
0,1
0
6
6,5
7
pH
7,5
8
Gambar 2 Aktivitas hidrolitik enzim CGTase
dari X. campestris FNCC 0089
pada berbagai pH.
ubi
24
jagung
Gambar 4 Aktivitas CGTase selama 120 jam
inkubasi. Pengukuran dilakukan
pada suhu 45oC dan pH 7.
4
Uji Kepekatan Karbohidrat Kultur X.
campestris Selama 120 Jam Inkubasi
Uji kepekatan karbohidrat diuji pada setiap
media mengandung substrat yaitu singkong,
kentang, ubi, jagung, dan beras selama lima
hari yang diukur setiap 24 jam. Hasil
pengukuran
masing-masing
substrat
mengalami penurunan kadar karbohidrat.
Masing-masing penurunannya hingga hari ke
lima sebagai berikut: media substrat singkong
turun sebesar 168,78 µg/ml, media substrat
kentang turun sebesar 174,04 µg /ml, media
substrat ubi sebesar 153,20 µg /ml, media
substrat jagung turun sebesar 100,05 µg /ml,
dan media substrat beras turun sebesar 236,65
µg /ml (Gambar 5, Lampiran 3).
400
300
Gambar 6 Kromatogram hasil uji aktivitas
transfer dari berbagai macam
substrat pada akseptor resorsinol.
Keterangan : S : standar, SKG :
singkong, KTG: kentang, UB:
ubi, JAG : jagung, BRS : beras.
200
100
0
0
1
singkong
Gambar 5
2
3
4
5
kentang
Kadar kepekatan karbohidrat
media produksi gum xanthan
dengan
penambahan
X.
campestris diukur hingga 120 jam
inkubasi.
Uji Aktivitas Transfer
Pengujian aktivitas transfer dilakukan
terhadap enzim CGTase yang dihasilkan dari
berbagai jenis substrat yang dapat mentransfer
gugus glikosil ke akseptor resorsinol.
Aktivitas transfer dari tiap substrat, ditandai
dengan adanya titik (spot) sejajar standar
arbutin. Enzim CGTase menggunakan substrat
jagung menunjukkan spot yang paling tebal
dibanding substrat lainnya (Gambar 6).
Pengujian aktivitas transfer CGTase
dilakukan kembali dengan menggunakan
substrat jagung dan akseptor glukosa,
fruktosa, xilosa, dan galaktosa. Dari keempat
akseptor diperoleh akseptor xilosa yang
memiliki titik paling mendekati standar
arbutin yaitu di sekitar area standar metil-αglikosida (Gambar 7 ).
Gambar 7 Kromatogram hasil uji aktivitas
transfer menggunakan akseptor
gula
sederhana,
diantaranya
glukosa, fruktosa, xilosa, dan
galaktosa. Keterangan : S :
standar, GLU : glukosa, FRUK:
fruktosa, XIL: xilosa, GAL :
galaktosa.
5
Analasis Gum Xanthan
Analisis gum xanthan dilakukan pada
enzim CGTase media substrat jagung akseptor
xilosa. Standar analisis menggunakan gum
xanthan merek dagang Sigma® dengan
konsentrasi 0,6 %. Hasil analisis standar gum
xanthan diperoleh puncak dengan waktu
Gambar 8
retensi (Rt) 1,012 menit dengan luas area
17990 dan waktu retensi sampel diambil yang
paling mendekati dengan 1,012 menit yaitu
0,998 menit. Luas puncak area sampel 14372
(Gambar 8 dan 9, Lampiran 4). Kadar gum
xanthan yang terkandung dalam sampel dapat
dihitung melalui membandingkan luas area
Kromatogram HPLC RI analisis struktur organik standar gum xanthan Sigma ®
dengan Rt (retention time) 1,012 dan luas area 17990.
Gambar 9 Kromatogram HPLC RI analisis struktur organik gum xanthan sampel substrat
jagung dengan Rt 0,998 dan luas area 14372.
6
puncak standar gum xanthan dengan luas area
puncak standar sampel dikalikan konsentrasi
standar gum xanthan. Hasil perhitungan
bahwa di dalam sampel terkandung 0,47%
gum xanthan dibanding konsentrasi standar
gum xanthan Sigma® 0,6% .
PEMBAHASAN
Enzim CGTase diproduksi menggunakan
media produksi gum xanthan dengan
tambahan 2% substrat pati. Jenis pati yang
digunakan ialah beras,
kentang, jagung,
singkong, dan ubi jalar. Fungsi dari
penggunaan berbagai macam substrat pati
sebagai penginduksi untuk mengetahui
kemampuan enzim yang dihasilkan apakah
memiliki
aktivitas
hidrolitik
dan
transglikosilasi. Dalam kondisi tersebut
diharapkan enzim CGTase dapat diproduksi.
Larutan buffer yang digunakan dalam
produksi enzim CGTase ialah bufer fosfat.
Fosfat merupakan komponen anorganik yang
mempunyai sifat bufer pada kisaran pH
normal, yaitu kisaran pH yang dapat
mempertahankan keseimbangan fisiologi dari
mikrob, selain itu fosfat, merupakan sumber
fosfor dan tidak bersifat racun terhadap
mikrob.
Enzim yang diharapkan ialah ekstrak
kasar CGTase, meskipun diduga ada enzim
lain yang dihasilkan dengan menggunakan
penginduksi pati ini, salah satu contohnya αamilase. Kedua enzim ini yaitu CGTase dan
α-amilase dapat dibedakan dengan melakukan
uji aktivitas transfer (transglikosilasi) dari
ekstrak kasar enzim yang dihasilkan, αamilase hanya memiliki aktivitas hidrolitik,
sedangkan CGTase selain memiliki aktivitas
hidrolitik
juga
mempunyai
aktivitas
transglikosilasi (Kometani et al. 1996).
CGTase memiliki kemampuan tidak hanya
mengkatalisis secara intramolekuler yaitu
mengubah pati menjadi siklodekstrin tetapi
juga intermolekuler yaitu mentransfer gugus
glukosil ke akseptor yang sesuai. Selain itu
dapat juga
menghidrolisis pati dan
siklodekstrin menjadi senyawa yang lebih
sederhana.
Pengujian dilakukan dengan menggunakan
pati sebagai substrat. Kemampuan enzim
dalam menghidrolisis pati diuji dengan cara
menambahkan KI 0,05% yang mengandung
I2 0,005% sehingga ketika bereaksi dengan
pati akan membentuk warna biru. Intensitas
warna biru yang terbentuk sebanding dengan
dengan
banyaknya
pati
yang
tidak
terhidrolisis, sehingga semakin banyak pati
yang terhidrolisis intensitas warna biru akan
semakin memudar.
Penentuan kondisi optimum aktivitas
hidrolitik enzim CGTase meliputi penentuan
kondisi optimum pH dan suhu. Suhu dan pH
yang menunjukkan aktivitas hidrolitik
tertinggi merupakan kondisi optimum enzim
tersebut.
Enzim CGTase X. campestris FNCC 0089
diinkubasi pada berbagai suhu mulai dari suhu
35oC hingga suhu
70oC dan diperoleh
aktivitas tertinggi pada suhu 45oC yaitu
sebesar 0,3472 unit/ml. Adapun pada
penentuan pH optimum diperoleh hasil bahwa
aktivitas CGTase tertinggi berada di pH 7
sebesar 0,4522 unit/ml. Hasil ini sesuai
dengan pernyataan Mori et al. (1994) bahwa
aktivitas CGTase stabil pada suhu 50oC atau
kurang dan pH 6-10.
Analisis
penentuan
karbohidrat
menghasilkan reaksi antara
karbohidrat
dengan fenol dan asam sulfat pekat sehingga
akan terbentuk warna hitam pekat apabila
kandungan karbohidrat tinggi. Semakin
rendah kandungan karbohidrat maka warna
campuran reaksi akan semakin pudar.
Pengujian dilakukan selama lima hari tiap 24
jam. Dari kelima macam kultur masingmasing
mengalami
penurunan
kadar
karbohidrat. Penurunan kadar karbohidrat
kultur karena sifat X. campestris yang
kemoorganotropik
yaitu
mampu
menggunakan berbagai macam karbohidrat
dan garam asam organik sebagai sumber
karbonnya (John et al. 1994).
Pengujian aktivitas transfer dilakukan
terhadap enzim CGTase yang dihasilkan dari
berbagai jenis substrat yang dapat mentransfer
gugus glikosil ke akseptor resorsinol. Hasil
produk resorsinol-glikosida diidentifikasi
menggunakan KLT, ditandai dengan adanya
spot yang memiliki nilai Retention factor (Rf)
yang mendekati nilai Rf standar arbutin.
(Gambar 1).
Standar yang digunakan dalam identifikasi
produk transfer
ialah arbutin. Arbutin
merupakan senyawa polifenol yang sudah
dalam bentuk glikosida, dengan nama
sistematik: 4-hidroksifenil-D-glukanopirosida
dan telah diketahui memiliki aktivitas
senyawa antimikrob, antiflamantori, dan anti
oksidan (Hapsah 2004).
Fase diam yang digunakan pada KLT,
yaitu silika yang bersifat polar, adapun fase
geraknya ialah larutan pengembang yang
terdiri atas etil asetat-asam asetat-akuades
(3:1:1, v/v). Senyawa dengan tingkat
kepolaran rendah akan terbawa dengan fase
7
gerak sehingga memiliki nilai Rf yang tinggi,
sedangkan senyawa dengan tingkat kepolaran
yang tinggi akan tertahan sehingga cenderung
lebih kecil nilai Rf.
Hasil
reaksi
transglikosida
selain
dihasilkan senyawa dalam bentuk monosida,
terdapat juga produk samping seperti
polifenol-glukobiosida
atau
polifenol
glukotriasida (Hapsah 2004). Kedua polifenol
ini dapat dijadikan bentuk monosida dengan
menambahkan α-1,6-glikosidik dari ujung
nonpreduksi
secara
berurutan
dengan
membebaskan unit-unit glukosa.
Biakan X. campestris FNCC 0899
memiliki aktivitas transfer. Hal ini ditunjukan
oleh spot pada KLT yang memiliki nilai Rf
mendekati nilai Rf arbutin 0, 78. Dari kelima
substrat, substrat jagung memiliki spot paling
tebal. Selanjutnya terhadap produk transfer
dari substrat jagung tersebut dilakukan uji
transfer
dengan
mengganti
akseptor
menggunakan gula sederhana, di antaranya
glukosa, fruktosa, xilosa, dan galaktosa
(Gambar 7).
Dari keempat akseptor gula sederhana
yang digunakan (Gambar 7) hanya xilosa
yang mampu membentuk dua spot yaitu satu
spot mendekati standar glukosa dengan nilai
Rf 0,45 dan satu spot berikutnya berada
mendekati spot standar metil-α-glukosida
dengan nilai Rf 0,58. Hal ini menandakan
terdapat gugus glikosil yang diduga mampu
menerima akseptor xilosa untuk membentuk
produk transfer berupa glikosida. Namun
belum diketahui
produk yang terbentuk
berupa gum xanthan atau produk transfer
lainnya. Sedangkan pada akseptor yang
lainnya hanya mampu membentuk masingmasing satu spot dengan nilai Rf glukosa
0,43; fruktosa 0,45; dan galaktosa 0,45.
Pengujian menggunakan HPLC RI
terhadap sampel substrat jagung dengan
akseptor xilosa perlu dilakukan karena
pengujian menggunakan KLT belum dapat
menjelaskan keberadaan kandungan gum
xanthan di dalam sampel. Prinsip pada HPLC
semakin dekat sifat suatu molekul akan
mempunyai retention time yang saling
berdekatan.
Hasil uji kandungan gum xanthan
menggunakan HPLC RI diperoleh sebesar
0,47%. Hasil penelitian Kerdsup et al. (2007)
gum xanthan mampu diproduksi sebesar 4,31
g/L menggunakan tepung singkong dan
mampu ditingkatkan produksinya sebesar 5,97
g/L menggunakan biakan X. campestris
varietas liar.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Xanthomonas campestris FNCC 0089
menghasilkan
enzim
siklodekstrin
glukanotransferase (CGTase). CGTase X.
campestris memiliki aktivitas tertinggi pada
pH 7 sebesar 0,4522 unit/ml dan suhu 45oC
sebesar 0,3472 unit/ml. Substrat jagung
merupakan substrat terbaik dan xilosa menjadi
akseptor terbaik dalam pembentukan produk
transfer. Pengukuran dengan HPLC RI
menunjukkan nilai Rt sampel enzim CGTase
X. campestris dengan menggunakan substrat
jagung dan akseptor xilosa sebesar 0,998
mendekati nilai Rt standar gum xanthan
Sigma® sebesar 1,012 dan
menghasilkan
gum xanthan 0,47% dibanding kadar standar
gum xanthan Sigma® sebesar 0,6%.
SARAN
Perlu dilakukan pengujian terhadap
substrat singkong dan kentang yang memiliki
spot tebal yang sejajar standar metil-αglikosida
pada
kromatogram
yang
menggunakan akseptor resorsinol (Gambar 6).
Campuran reaksi pada spot ini perlu
ditambahkan lebih banyak enzim αamiloglukosidase produksi Sigma® untuk
menggeser spot sejajar standar arbutin dan
selanjutnya dilakukan uji dengan mengganti
akseptor resorsinol dengan akseptor gula
sederhana. Perlu ditambahkan standar gum
xanthan
pada
kromatogram
yang
menggunakan akseptor gula sederhana
(Gambar 7) agar dapat dibandingkan dengan
sampel yang diuji.
DAFTAR PUSTAKA
Borges CD, Paula RCM, Feitosa JPA,
Vendruscolo, CT. 2009. The influence
of thermal treatment and operational
conditions on xanthan produced by X.
arboricola pv pruni strain 106. Carbo
Pol 75: 262–268.
Dow JM, Daniels MJ. 1994. Pathogenicity
determinants and global regulation of
pathogenicity
in
Xanthomonas
campestris pv. campestris. Di dalam:
Dangl JL, editor. Molecular and
Cellular Mechanisms in Bacterial
Pathogenesis of Plants and Animals.
Berlin: Springer. hlm 29–41.
Dubois M, Gilles LA, Hamilton JK, Robers
PA, Smith F. 1956. Colormetric
7
gerak sehingga memiliki nilai Rf yang tinggi,
sedangkan senyawa dengan tingkat kepolaran
yang tinggi akan tertahan sehingga cenderung
lebih kecil nilai Rf.
Hasil
reaksi
transglikosida
selain
dihasilkan senyawa dalam bentuk monosida,
terdapat juga produk samping seperti
polifenol-glukobiosida
atau
polifenol
glukotriasida (Hapsah 2004). Kedua polifenol
ini dapat dijadikan bentuk monosida dengan
menambahkan α-1,6-glikosidik dari ujung
nonpreduksi
secara
berurutan
dengan
membebaskan unit-unit glukosa.
Biakan X. campestris FNCC 0899
memiliki aktivitas transfer. Hal ini ditunjukan
oleh spot pada KLT yang memiliki nilai Rf
mendekati nilai Rf arbutin 0, 78. Dari kelima
substrat, substrat jagung memiliki spot paling
tebal. Selanjutnya terhadap produk transfer
dari substrat jagung tersebut dilakukan uji
transfer
dengan
mengganti
akseptor
menggunakan gula sederhana, di antaranya
glukosa, fruktosa, xilosa, dan galaktosa
(Gambar 7).
Dari keempat akseptor gula sederhana
yang digunakan (Gambar 7) hanya xilosa
yang mampu membentuk dua spot yaitu satu
spot mendekati standar glukosa dengan nilai
Rf 0,45 dan satu spot berikutnya berada
mendekati spot standar metil-α-glukosida
dengan nilai Rf 0,58. Hal ini menandakan
terdapat gugus glikosil yang diduga mampu
menerima akseptor xilosa untuk membentuk
produk transfer berupa glikosida. Namun
belum diketahui
produk yang terbentuk
berupa gum xanthan atau produk transfer
lainnya. Sedangkan pada akseptor yang
lainnya hanya mampu membentuk masingmasing satu spot dengan nilai Rf glukosa
0,43; fruktosa 0,45; dan galaktosa 0,45.
Pengujian menggunakan HPLC RI
terhadap sampel substrat jagung dengan
akseptor xilosa perlu dilakukan karena
pengujian menggunakan KLT belum dapat
menjelaskan keberadaan kandungan gum
xanthan di dalam sampel. Prinsip pada HPLC
semakin dekat sifat suatu molekul akan
mempunyai retention time yang saling
berdekatan.
Hasil uji kandungan gum xanthan
menggunakan HPLC RI diperoleh sebesar
0,47%. Hasil penelitian Kerdsup et al. (2007)
gum xanthan mampu diproduksi sebesar 4,31
g/L menggunakan tepung singkong dan
mampu ditingkatkan produksinya sebesar 5,97
g/L menggunakan biakan X. campestris
varietas liar.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Xanthomonas campestris FNCC 0089
menghasilkan
enzim
siklodekstrin
glukanotransferase (CGTase). CGTase X.
campestris memiliki aktivitas tertinggi pada
pH 7 sebesar 0,4522 unit/ml dan suhu 45oC
sebesar 0,3472 unit/ml. Substrat jagung
merupakan substrat terbaik dan xilosa menjadi
akseptor terbaik dalam pembentukan produk
transfer. Pengukuran dengan HPLC RI
menunjukkan nilai Rt sampel enzim CGTase
X. campestris dengan menggunakan substrat
jagung dan akseptor xilosa sebesar 0,998
mendekati nilai Rt standar gum xanthan
Sigma® sebesar 1,012 dan
menghasilkan
gum xanthan 0,47% dibanding kadar standar
gum xanthan Sigma® sebesar 0,6%.
SARAN
Perlu dilakukan pengujian terhadap
substrat singkong dan kentang yang memiliki
spot tebal yang sejajar standar metil-αglikosida
pada
kromatogram
yang
menggunakan akseptor resorsinol (Gambar 6).
Campuran reaksi pada spot ini perlu
ditambahkan lebih banyak enzim αamiloglukosidase produksi Sigma® untuk
menggeser spot sejajar standar arbutin dan
selanjutnya dilakukan uji dengan mengganti
akseptor resorsinol dengan akseptor gula
sederhana. Perlu ditambahkan standar gum
xanthan
pada
kromatogram
yang
menggunakan akseptor gula sederhana
(Gambar 7) agar dapat dibandingkan dengan
sampel yang diuji.
DAFTAR PUSTAKA
Borges CD, Paula RCM, Feitosa JPA,
Vendruscolo, CT. 2009. The influence
of thermal treatment and operational
conditions on xanthan produced by X.
arboricola pv pruni strain 106. Carbo
Pol 75: 262–268.
Dow JM, Daniels MJ. 1994. Pathogenicity
determinants and global regulation of
pathogenicity
in
Xanthomonas
campestris pv. campestris. Di dalam:
Dangl JL, editor. Molecular and
Cellular Mechanisms in Bacterial
Pathogenesis of Plants and Animals.
Berlin: Springer. hlm 29–41.
Dubois M, Gilles LA, Hamilton JK, Robers
PA, Smith F. 1956. Colormetric
PENGUJIAN AKTIVITAS TRANSGLIKOSILASI BIAKAN
Xanthomonas campestris PADA BERBAGAI SUMBER
KARBOHIDRAT
DEDY SANJI PRASTIKO
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2011
8
method for determination of sugar
and related substances. Anal Chem 28:
350-356.
Galindo E. 1994. Xanthan gum World Market
Report (Telefax letters). Mexico City:
Institute
de
Biotechnology,
Universided Nacional Autonomo De
Mexico.
Hapsah H. 2004. Sintesis flavonoid-glikosida
hasil reaksi transglikosilasi enzimatik
dan aktivitasnya sebagai antimikrob
[skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut
Pertanian Bogor.
John GH, Noel RK, Peter HAS, James TS,
Williams TS. 1994. Determinative
Bacteriology. Ed ke-9. Baltimore:
Williams and Wilkins.
Kennedy JF, Bradshaw JI. 1984. Production,
properties and applications of xanthan.
Proc Indust Microb 19: 319-371.
Kerdsup P, Tantratian S, Sanguandeekul R,
Imjongjirak
C.
2009.
Xanthan
production
by mutant strain of
Xanthomonas campestris TISTR 840
in raw cassava starch medium. Food
Bioprocess Technol. 250: 007-009.
Kometani T, Terada Y, Nishimura T, Nakae
T, Takii H, Okada S. 1994.
Transglycosylation to hesperidin by
cyclodextrin glucanotransferase from
an alcalophilic Bacillus species in
alcaline pH and propeties of hesperidin
glycosides. J Biosci Biotech Biochem
58: 1990-1994.
Kometani T, Terada Y, Nishimura T, Nakae
T, Takii H, Okada S. 1996. Acceptor
specificity
of
cyclodextrin
glucanotransferase from an alcalophilic
Bacillus species and synthesis of
glucosyl rhamnose. J Biosci Biotech
Biochem 60: 1176-1178.
Mori S, Hirose S, Oya T, Kitahana S. 1994.
Purification
and
properties
of
cyclodextrin glucanotransferase from
Brevibacterium sp. No. 9605. J Biosci
Biotech Biochem 58: 1968-1972.
Onsando JM. 1992. Black rot of crucifers. Di
dalam: Chaube H S, Kumar J,
Mukhopadhyay AN, Singh US, and
Cliffs E, editor. Plant Diseases of
International Importance II: Diseases
of Vegetable and Oil Seed Crops. New
York: Prentice Hall. hlm 243–252.
Rosalam S, England R. 2006. Review of
xanthan
gum
production
from
unmodified starches by Xanthomonas
campestris sp. J Enzyme Microb
Technol 39: 197-207.
Sulistyo J, Handayani R, Hawab M. 2002.
Aktivitas
antioksidasi
polifenol
glikosida hasil reaksi transglikosilasi
enzim CGTase dari Bacillus macerans.
BioSMART 4: 18-22.
Tankova A. 1998. Bacterial cyclodextrin
glucanotransferase. J Enzyme Microb
Technol 22: 678-686.
Yoo SD, Harcum SW. 1999. Xanthan gum
production from waste sugar beet
pulp. Biores Technol 70: 105–109.
PENGUJIAN AKTIVITAS TRANSGLIKOSILASI BIAKAN
Xanthomonas campestris PADA BERBAGAI SUMBER
KARBOHIDRAT
DEDY SANJI PRASTIKO
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2011
ABSTRAK
DEDY SANJI PRASTIKO. Pengujian Aktivitas Transglikosilasi Biakan Xanthomonas campestris
pada Berbagai Sumber Karbohidrat. Dibimbing oleh NISA RACHMANIA MUBARIK dan
JOKO SULISTYO.
Bakteri fitopatogenik Xanthomonas campestris adalah anggota bakteri aerobik penyebab
kebusukan tanaman cruciferous, seperti cabai, brokoli, dan kubis. Bakteri ini menghasilkan
enzim-enzim dan polisakarida ekstraseluler berupa biopolimer yang dapat digunakan dalam olahan
bahan pangan. Aplikasi gum xanthan dalam industri sebagai viscosifying, bahan pengental,
penstabil, dan agen suspensi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan biakan X.
campestris dalam mensistesis produk transfer secara reaksi transglikosilasi menggunakan enzim
CGTase pada berbagai sumber karbohidrat. Aktivitas transfer diuji menggunakan kromatografi
lapis tipis (KLT) dan kromatografi cair kinerja tinggi dengan indeks refraksi (KCKT IR). Proses
sintesis gum xanthan dapat dibentuk melalui reaksi transglikolisasi. Substrat jagung menjadi
substrat terbaik dalam pembentukan produk transfer dibandingkan substrat yang lainnya. Hasil
analisis menunjukkan substrat jagung dengan akseptor xilosa memiliki kadar kandungan gum
xanthan sebesar 0,47% dibandingkan kadar standar gum xanthan (Sigma® ) sebesar 0,6%.
Kata kunci : Gum xanthan, reaksi transglikosilasi, X. campestris, CGTase
ABSTRACT
DEDY SANJI PRASTIKO. Tested of Xanthomonas campestris Cultures transglycosylation
Activity on Different Sources of Carbohydrates. Supervised by NISA RACHMANIA and JOKO
SULISTYO.
Phytopathogenic bacterium, Xanthomonas campestris is an aerobic bacterium that caused
rot disease on cruciferous plants, such as peppers, broccoli, and cabbage. This bacterium produced
enzymes and extracellular polysaccharide biopolymers that can be used in food processing. The
applications of xanthan gum as one of the extracellular polysaccharides of X. campestris in
industry used as viscosifying and thickening agents, stabilizing, and suspension agents. Xanthan
gum can be synthesized by transglycosylation reaction. The objective of this research was to
know the capability of X. campestris in synthesizing transfer product on transglycosyzation
reaction by using CGTase from various carbohydrate sources. Transfer activity was tested using
thin layer chromatography (TLC) and high performance liquid chromatography refraction index
(HPLC RI). Corn showed as the best substrate in the formation of transfer product compared than
the other substrates. Using xylose acceptor was obtained that the level content of xanthan gum was
0.47% of 0.6% xanthan gum standard (Sigma®).
Keywords: Xanthan Gum, transglycosylation reaction, X. campestris, CGTase
PENGUJIAN AKTIVITAS TRANSGLIKOSILASI BIAKAN
Xanthomonas campestris PADA BERBAGAI SUMBER
KARBOHIDRAT
DEDY SANJI PRASTIKO
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2011
Judul
Nama
NIM
: Pengujian Aktivitas Transglikosilasi Biakan Xanthomonas
campestris pada Beberapa Macam Sumber Karbohidrat
: Dedy Sanji Prastiko
: G34062750
Disetujui oleh,
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si.
NIP. 196711271993022001
Dr. Joko Sulistyo, M. Agr., APU
NIP. 195803171983121001
Diketahui oleh,
Ketua Departemen Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si.
NIP. 19641002 198903 1 002
Tanggal lulus :
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Pati pada tanggal 14 November 1987 sebagai anak kedua dari tiga
bersaudara, anak dari pasangan Almarhum H. Santoso dan Muji Lestari.
Penulis lulus dari SMUN 1 Pati tahun 2006 pada tahun yang sama lulus seleksi masuk
IPB melalui jalur undangan seleksi masuk IPB (USMI) pada Mayor Biologi, Departemen Biologi,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama menjalani perkuliahan di IPB, penulis aktif berorganisasi, di antaranya yaitu
BEM FMIPA IPB sebagai staf Departemen Kajian Strategis, Advokasi dan Kaderisasi pada tahun
2008 dan menjadi Ketua Himpunan Mahasiswa Biologi FMIPA IPB pada tahun 2009. Selain itu
penulis juga pernah mengikuti praktik lapangan selama satu bulan di Laboratorium Bioprospeksi
LIPI-Cibinong Bogor dengan pembimbing Bapak Dr. Joko Sulistyo, M. Agr., APU yang
selanjutnya menjadi pembimbing II penulisan karya ilmiah ini. Tahun 2009 penulis menjadi
asisten praktikum Biologi Dasar TPB selama satu semester.
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT, Tuhan Yang Maha Penolong yang
telah melimpahkan rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulisan karya ilmiah ini dapat
diselesaikan. Shalawat dan salam semoga tercurah kepada manusia paling mulia,
Nabi
Muhammad SAW.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si selaku
pembimbing I yang telah memberi bimbingan dan masukan selama penyusunan karya ilmiah ini,
Dr. Joko Sulistyo, M. Agr., APU selaku pembimbing II yang dengan setia selalu meluangkan
waktunya untuk memberi arahan, dan bimbingan kepada penulis. Terima kasih disampaikan pula
kepada Dr. Aris Tjahjoleksono, DEA selaku penguji dan wakil komisi pendidikan atas saran dan
diskusi yang diberikan. Terima kasih kepada Gatot, Bahar, Ucup, dan Cory teman-teman
seperjuangan riset yang selalu memberikan bantuan dan senyuman. Ibu Rita, teh Alida dan kak
Ugi yang tak segan memberikan nasehat dan semangat. Pa’e (Alm), Bu’e, mas Huring, dan Megi
yang selalu memberi dukungan moral dan doa, serta teman-teman Biologi 43 atas segala bantuan,
semangat, kekompakan, dan kebersamaan yang diberikan.
Semoga karya ilmiah ini dapat memberikan manfaat dan menambah pengetahuan bagi
para pembacanya.
Bogor, 12 Januari 2011
Dedy Sanji Prastiko
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR ..................................................................................................................... vi
DAFTAR LAMPIRAN.............................................................................................................. ...... vii
PENDAHULUAN
Latar belakang ....................................................................................................................... 1
Tujuan .................................................................................................................................... 2
Waktu dan Tempat Penelitian ................................................................................................ 2
BAHAN DAN METODE
Bahan .....................................................................................................................................
Metode ...................................................................................................................................
Pembuatan Media ............................................................................................................
Produksi Enzim CGTase ..................................................................................................
Uji Aktivitas Hidrolitik, Optimasi pH dan Suhu CGTase ...............................................
Uji Kepekatan Karbohidrat .............................................................................................
Uji Aktivitas Transglikosilasi .........................................................................................
Analisis Gum Xanthan .....................................................................................................
2
2
2
2
2
2
2
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil ........................................................................................................................................
Optimasi pH dan Suhu Aktivitas CGTase........................................................................
Pengukuran Aktivitas CGTase pada Berbagai Substrat Selama 120 Jam Inkubasi .........
Uji Kepekatan Karbohidrat Kultur X. campestris Selama 120 Jam Inkubasi...................
Uji Aktivitas Transfer ......................................................................................................
Analisis Gum Xanthan ....................................................................................................
Pembahasan ............................................................................................................................
3
3
3
4
4
5
6
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan ................................................................................................................................. 7
Saran ....................................................................................................................................... 7
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................................... 7
LAMPIRAN ................................................................................................................................... 9
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Serangan X. campestris pada bagian permukaan atas daun kubis.…....….........................
1
2
Optimasi pH aktivitas hidrolitik enzim CGTase dari X. campestris FNCC 0089...............
3
3
Aktivitas hidrolitik enzim CGTase dari X. campestris FNCC 0089 pada
berbagai pH.........................................................................................................................
3
4
Aktivitas CGTase selama 120 jam inkubasi .......................................................................
3
5
Kadar kepekatan karbohidrat media produksi gum xanthan dengan penambahan
X. campestris diukur hingga 120 jam inkubasi ..................................................................
6
Kromatogram hasil uji aktivitas transfer dari berbagai macam substrat pada
akseptor resorsinol ..............................................................................................................
7
Kromatogram HPLC RI analisis struktur organik standar gum xanthan Sigma
4
®
dengan Rt 1,012 dan luas area 17990..................................................................................
9
4
Kromatogram hasil uji aktivitas transfer menggunakan akseptor gula sederhana,
diantaranya glukosa, fruktosa, xilosa, dan galaktosa ..........................................................
8
4
5
Kromatogram HPLC RI analisis struktur organik gum xanthan sampel substrat
jagung dengan Rt 0,998 dan luas area 14372......................................................................
5
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
Kurva standar karbohidrat..................................................................................................
2
Absorbansi pengukuran enzim CGTase meliputi optimasi pH, suhu, dan
10
pengukuran berseri selama lima hari dari masing-masing substrat....................................
10
3
Absorbansi uji kepekatan karbohidrat …...........................................................................
11
4
Perhitungan kadar gum xanthan sampel.............................................................................
12
11
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Bakteri
fitopatogenik
Xanthomonas
campestris ialah suatu anggota bakteri aerobik
famili
Xanthomonadaceae,
penyebab
kebusukan tanaman cruciferous, seperti cabai,
brokoli, dan kubis (Gambar 1, Onsando 1992).
Ciri dan karakterisasi X. campestris ialah
jumlah flagella satu, tidak dapat mereduksi
NO3- menjadi NO2-, tidak mendekarbosilasi
lisin, membutuhkan metionin atau sistein
dalam pertumbuhannya, bentuk mukoid pada
media tumbuh agar-agar nutrien yang
mengandung 5% glukosa, menghidrolisis
gelatin dan pati, menghidrolisis eskulin dan
protein, menghasilkan H2S dari pepton,
terdapat aktivitas pektinase da
DEDY SANJI PRASTIKO. Pengujian Aktivitas Transglikosilasi Biakan Xanthomonas campestris
pada Berbagai Sumber Karbohidrat. Dibimbing oleh NISA RACHMANIA MUBARIK dan
JOKO SULISTYO.
Bakteri fitopatogenik Xanthomonas campestris adalah anggota bakteri aerobik penyebab
kebusukan tanaman cruciferous, seperti cabai, brokoli, dan kubis. Bakteri ini menghasilkan
enzim-enzim dan polisakarida ekstraseluler berupa biopolimer yang dapat digunakan dalam olahan
bahan pangan. Aplikasi gum xanthan dalam industri sebagai viscosifying, bahan pengental,
penstabil, dan agen suspensi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan biakan X.
campestris dalam mensistesis produk transfer secara reaksi transglikosilasi menggunakan enzim
CGTase pada berbagai sumber karbohidrat. Aktivitas transfer diuji menggunakan kromatografi
lapis tipis (KLT) dan kromatografi cair kinerja tinggi dengan indeks refraksi (KCKT IR). Proses
sintesis gum xanthan dapat dibentuk melalui reaksi transglikolisasi. Substrat jagung menjadi
substrat terbaik dalam pembentukan produk transfer dibandingkan substrat yang lainnya. Hasil
analisis menunjukkan substrat jagung dengan akseptor xilosa memiliki kadar kandungan gum
xanthan sebesar 0,47% dibandingkan kadar standar gum xanthan (Sigma® ) sebesar 0,6%.
Kata kunci : Gum xanthan, reaksi transglikosilasi, X. campestris, CGTase
ABSTRACT
DEDY SANJI PRASTIKO. Tested of Xanthomonas campestris Cultures transglycosylation
Activity on Different Sources of Carbohydrates. Supervised by NISA RACHMANIA and JOKO
SULISTYO.
Phytopathogenic bacterium, Xanthomonas campestris is an aerobic bacterium that caused
rot disease on cruciferous plants, such as peppers, broccoli, and cabbage. This bacterium produced
enzymes and extracellular polysaccharide biopolymers that can be used in food processing. The
applications of xanthan gum as one of the extracellular polysaccharides of X. campestris in
industry used as viscosifying and thickening agents, stabilizing, and suspension agents. Xanthan
gum can be synthesized by transglycosylation reaction. The objective of this research was to
know the capability of X. campestris in synthesizing transfer product on transglycosyzation
reaction by using CGTase from various carbohydrate sources. Transfer activity was tested using
thin layer chromatography (TLC) and high performance liquid chromatography refraction index
(HPLC RI). Corn showed as the best substrate in the formation of transfer product compared than
the other substrates. Using xylose acceptor was obtained that the level content of xanthan gum was
0.47% of 0.6% xanthan gum standard (Sigma®).
Keywords: Xanthan Gum, transglycosylation reaction, X. campestris, CGTase
11
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Bakteri
fitopatogenik
Xanthomonas
campestris ialah suatu anggota bakteri aerobik
famili
Xanthomonadaceae,
penyebab
kebusukan tanaman cruciferous, seperti cabai,
brokoli, dan kubis (Gambar 1, Onsando 1992).
Ciri dan karakterisasi X. campestris ialah
jumlah flagella satu, tidak dapat mereduksi
NO3- menjadi NO2-, tidak mendekarbosilasi
lisin, membutuhkan metionin atau sistein
dalam pertumbuhannya, bentuk mukoid pada
media tumbuh agar-agar nutrien yang
mengandung 5% glukosa, menghidrolisis
gelatin dan pati, menghidrolisis eskulin dan
protein, menghasilkan H2S dari pepton,
terdapat aktivitas pektinase dalam kultur, suhu
maksimal pertumbuhan 35-39oC, toleran
terhadap salinitas 2,0 – 5,0 promil,
memproduksi asam serta patogen pada
tumbuhan
terutama
pada
kelompok
cruciferous (John et al. 1994). Bakteri X.
campestris menghasilkan berbagai enzim
ekstraseluler seperti amilase, endoglukanase,
poligalakturonate liase dan protease (Dow &
Daniels 1994) .
Gambar 1 Serangan X. campestris pada
bagian permukaan atas daun
kubis
(Sumber:
http://www.apsnet.org/publication
s/apsnetfeatures/Pages/PDDiagno
sis.aspx).
Bakteri ini pun dapat menghasilkan
polisakarida ekstraseluler yang dikenal
dengan gum xanthan, suatu biopolimer yang
dapat digunakan dalam pengolahan makanan.
Aplikasi gum xanthan
dalam industri
digunakan sebagai viscosifying, bahan
pengental, penstabil, dan agen suspensi
(Kennedy & Bradshaw 1984, Rosalam &
England 2006).
Gum xanthan ialah heteropolisakarida
larut air yang dihasilkan oleh bakteri Gram
negatif X. campestris (Borges et al. 2009).
Gum xanthan merupakan jenis biopolimer
yang memiliki prospek cerah baik di dalam
negeri maupun luar negeri karena memiliki
nilai komersial yang tinggi. Gum xanthan
digunakan sebagai suspending agent untuk
menghilangkan pulp, dan bahan-bahan yang
dapat membuat keruh dalam beberapa
minuman. Gum xanthan juga dipakai sebagai
penstabil untuk emulsi minyak dalam
beberapa minuman tertentu, makanan beku
dan digunakan dalam industri nonpangan
sebagai oil welldrilling
fluid additive
terutama
pada
industri
tekstil
dan
pertambangan. Harga komersial gum xanthan
sangat mahal karena diproduksi dengan bahan
dasar glukosa dan sukrosa (Yoo & Harcum
1999). Produksi tahunan gum xanthan dunia
diperkirakan 25000 ton (Galindo 1994).
Gum xanthan berwujud butiran saat
kering dan mampu meningkatkan viskositas
air dengan konsentrasi hanya 0,01%. Gum
xanthan memiliki berat molekul bervariasi
antara 2000 – 62000 kDa. Lebarnya selang
ini disebabkan oleh pengaruh ikatan hidrogen
yang menstabilkan agregat-agregat polimer
dalam air. Satu monomer gum xanthan
mengandung 5 satuan yang terdiri atas 2
satuan glukosa, 2 satuan manosa, dan 1
satuan asam glukoronat (Kennedy &
Bradshaw 1984).
Proses pembentukan gum xanthan sangat
rumit dan belum banyak diketahui.
Mekanisme
pembentukannya
secara
sederhana
melalui
reaksi
enzimatik
transglikosida.
Enzim siklodekstrin glukanotransferase
(1,4-α-D-1,4-glukano-transferase,
EC
2.4.1.19) disingkat menjadi CGTase ialah
enzim yang mengkatalisis sintesis pati
menjadi reaksi siklisasi. Enzim ini tergolong
enzim transferase yang berperan dalam
pemindahan gugus glikosidik pada reaksi
siklisasi dekstrin menjadi siklodekstrin
(Kometani et al. 1994, Mori et al. 1994).
CGTase merupakan enzim multifungsi
yang berperan dalam proses siklisasi, yaitu
mengubah pati dan α-1,4 glukan menjadi
siklodekstrin melalui reaksi transglikosilasi
intramolekuler. Enzim ini juga mampu
mengkatalisis reaksi penggabungan yaitu
membuka
cincin
siklodekstrin
dan
mentransfer maltooligosakarida linear melalui
reaksi transglikosilasi intermolekuler pada
akseptor. CGTase tidak hanya mengkatalisis
secara intramolekuler yang mengubah pati
menjadi siklodekstrin dan intermolekuler yang
mentransfer gugus glukosil ke akseptor yang
sesuai, tetapi dapat juga menghidrolisis pati
dan siklodekstrin menjadi senyawa yang lebih
sederhana
(Kometani
et
al.
1996).
Siklodekstrin glukanotransferase (CGTase)
dihasilkan oleh berbagai macam bakteri
seperti Bacillus macerans, B. megaterium, B.
2
circulans,
B. cereus (Tankova 1998), dan
diduga juga terdapat pada X. campestris. Oleh
karena itu, dalam penelitian awal, biakan X.
campestris ditumbuhkan pada media dan
dilakukan pengujian untuk mengetahui
kemampuan biakan X. campestris dalam
menghasilkan enzim CGTase.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
kemampuan biakan X. campestris dalam
mensintesis produk transfer secara reaksi
transglikosilasi menggunakan enzim CGTase
pada berbagai sumber karbohidrat.
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan mulai
bulan April 2010 sampai bulan November
2010
di
Laboratorium
Bioprospeksi,
Mikrobiologi LIPI Cibinong.
BAHAN DAN METODE
Bahan
Bahan yang digunakan
yaitu X.
campestris FNCC 0089 yang merupakan
koleksi Mikrobiologi Cibinong Science
Center (CSC) LIPI-Bogor.
kemudian disentrifugasi pada kecepatan 8030
g
selama 15 menit pada suhu 4 oC.
Selanjutnya supernatannya digunakan sebagai
sumber enzim CGTase kasar (Sulistyo et al.
2002).
Uji Aktivitas Hidrolitik, Optimasi pH dan
suhu CGTase
Penentuan kondisi optimum aktivitas
enzim CGTase dilakukan pada berbagai pH
dan suhu. Campuran reaksi terdiri atas 100 µl
larutan enzim CGTase kasar dan 450 µl bufer
Na-fosfat 50mM yang mengandung 0,5 % pati
dapat larut (soluble starch) diinkubasi pada
suhu 45oC selama 10 menit. Reaksi dihentikan
dengan penambahan HCl 0,5N sebanyak 1 ml.
Campuran reaksi kemudian direaksikan
dengan pewarna iodin 2,5 ml (KI 0,05% yang
mengandung I2 0,005%). Serapan warna
diukur dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang 660 nm. Satu unit aktivitas enzim
dinyatakan sebagai jumlah enzim yang dapat
menurunkan unit serapan sebanyak 0,5 pada
panjang gelombang (λ) 660 nm (Sulistyo et al.
2002). Selanjutnya dilakukan pengukuran
berseri selama lima hari tiap 24 jam.
Media Kultur X. campestris. Bahanbahan media standar (NH)2SO4 3 g, MgSO4
0,5 g, CaSO4 0,1 g, MnSO4 0,01 g, FeSO4 0,1
g, malt ekstrak 3 g, pepton 0,5 g dilarutkan
dalam takaran 1 L bufer Na-fosfat 0,05 mM
pH 7 dan glukosa 1 % sebagai substrat.
Media standar yang sudah dilarutkan
kemudian dituang
ke dalam 5 tabung
erlenmeyer ukuran 500 ml masing-masing
100 ml dan ditambah masing-masing satu
jenis substrat pati dari mulai singkong,
kentang, ubi, jagung dan beras masing-masing
2 %, kemudian disterilisasi menggunakan
autoklaf suhu 121oC tekanan 1 atm.
Uji Kepekatan Karbohidrat
Uji karbohidrat ditentukan dengan
menggunakan kaidah asam sulfat-fenol
(Dubois et al. 1956). Sebanyak 0,5 ml fenol
5% ditambah 2,5 ml H2SO4 pekat, kemudian
ditambahkan 0,5 ml sampel yang telah
diencerkan 10 kali dengan akuades. Campuran
reaksi dibiarkan selama 20 menit pada suhu
ruang.
Selanjutnya
ditentukan
nilai
absorbansinya pada panjang gelombang 490
nm. Kepekatan karbohidrat ditentukan melalui
kurva standar pati dapat larut (Lampiran 1).
Kurva standar karbohidrat dibuat dengan cara
mengukur absorbansi kandungan karbohidrat
yang diketahui konsentrasinya. Konsentrasi
standar dibuat dengan melarutkan pati dapat
larut dengan konsentrasi 0, 10, 20, 30, 40, 50
µg dilarutkan masing-masing ke dalam
akuades hingga volume larutan mencapai 5
ml. Larutan kemudian direaksikan dengan 0,5
ml fenol dan 2,5 ml H2SO4 pekat. Kemudian
campuran reaksinya diukur absorbansinya
pada panjang gelombang 490 nm mulai dari
konsentrasi terkecil hingga konsentrasi
terbesar.
Produksi Enzim CGTase
Media produksi enzim CGTase yang telah
ditambah kultur X. campestris diinkubasi
selama 72-120 jam di dalam inkubator goyang
dengan kecepatan 240 rpm, suhu 37 oC
Uji Aktivitas Transglikosilasi
Campuran reaksi sebanyak 2 ml, yang
terdiri atas 1,5 ml bufer Na-fosfat 0,05 M pH
7 yang mengandung 5% pati dapat larut dan
resorsinol 2% serta 0,5 ml enzim CGTase
Metode
Pembuatan Media
Media Lauria Broth agar (LA). Bahanbahan seperti ekstrak khamir 5 g, tripton 10 g,
NaCl 5 g, dan agar-agar 15 g dilarutkan dalam
takaran 1 L akuades kemudian disterilisasi
pada suhu 121 oC tekanan 1 atm.
2
circulans,
B. cereus (Tankova 1998), dan
diduga juga terdapat pada X. campestris. Oleh
karena itu, dalam penelitian awal, biakan X.
campestris ditumbuhkan pada media dan
dilakukan pengujian untuk mengetahui
kemampuan biakan X. campestris dalam
menghasilkan enzim CGTase.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
kemampuan biakan X. campestris dalam
mensintesis produk transfer secara reaksi
transglikosilasi menggunakan enzim CGTase
pada berbagai sumber karbohidrat.
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan mulai
bulan April 2010 sampai bulan November
2010
di
Laboratorium
Bioprospeksi,
Mikrobiologi LIPI Cibinong.
BAHAN DAN METODE
Bahan
Bahan yang digunakan
yaitu X.
campestris FNCC 0089 yang merupakan
koleksi Mikrobiologi Cibinong Science
Center (CSC) LIPI-Bogor.
kemudian disentrifugasi pada kecepatan 8030
g
selama 15 menit pada suhu 4 oC.
Selanjutnya supernatannya digunakan sebagai
sumber enzim CGTase kasar (Sulistyo et al.
2002).
Uji Aktivitas Hidrolitik, Optimasi pH dan
suhu CGTase
Penentuan kondisi optimum aktivitas
enzim CGTase dilakukan pada berbagai pH
dan suhu. Campuran reaksi terdiri atas 100 µl
larutan enzim CGTase kasar dan 450 µl bufer
Na-fosfat 50mM yang mengandung 0,5 % pati
dapat larut (soluble starch) diinkubasi pada
suhu 45oC selama 10 menit. Reaksi dihentikan
dengan penambahan HCl 0,5N sebanyak 1 ml.
Campuran reaksi kemudian direaksikan
dengan pewarna iodin 2,5 ml (KI 0,05% yang
mengandung I2 0,005%). Serapan warna
diukur dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang 660 nm. Satu unit aktivitas enzim
dinyatakan sebagai jumlah enzim yang dapat
menurunkan unit serapan sebanyak 0,5 pada
panjang gelombang (λ) 660 nm (Sulistyo et al.
2002). Selanjutnya dilakukan pengukuran
berseri selama lima hari tiap 24 jam.
Media Kultur X. campestris. Bahanbahan media standar (NH)2SO4 3 g, MgSO4
0,5 g, CaSO4 0,1 g, MnSO4 0,01 g, FeSO4 0,1
g, malt ekstrak 3 g, pepton 0,5 g dilarutkan
dalam takaran 1 L bufer Na-fosfat 0,05 mM
pH 7 dan glukosa 1 % sebagai substrat.
Media standar yang sudah dilarutkan
kemudian dituang
ke dalam 5 tabung
erlenmeyer ukuran 500 ml masing-masing
100 ml dan ditambah masing-masing satu
jenis substrat pati dari mulai singkong,
kentang, ubi, jagung dan beras masing-masing
2 %, kemudian disterilisasi menggunakan
autoklaf suhu 121oC tekanan 1 atm.
Uji Kepekatan Karbohidrat
Uji karbohidrat ditentukan dengan
menggunakan kaidah asam sulfat-fenol
(Dubois et al. 1956). Sebanyak 0,5 ml fenol
5% ditambah 2,5 ml H2SO4 pekat, kemudian
ditambahkan 0,5 ml sampel yang telah
diencerkan 10 kali dengan akuades. Campuran
reaksi dibiarkan selama 20 menit pada suhu
ruang.
Selanjutnya
ditentukan
nilai
absorbansinya pada panjang gelombang 490
nm. Kepekatan karbohidrat ditentukan melalui
kurva standar pati dapat larut (Lampiran 1).
Kurva standar karbohidrat dibuat dengan cara
mengukur absorbansi kandungan karbohidrat
yang diketahui konsentrasinya. Konsentrasi
standar dibuat dengan melarutkan pati dapat
larut dengan konsentrasi 0, 10, 20, 30, 40, 50
µg dilarutkan masing-masing ke dalam
akuades hingga volume larutan mencapai 5
ml. Larutan kemudian direaksikan dengan 0,5
ml fenol dan 2,5 ml H2SO4 pekat. Kemudian
campuran reaksinya diukur absorbansinya
pada panjang gelombang 490 nm mulai dari
konsentrasi terkecil hingga konsentrasi
terbesar.
Produksi Enzim CGTase
Media produksi enzim CGTase yang telah
ditambah kultur X. campestris diinkubasi
selama 72-120 jam di dalam inkubator goyang
dengan kecepatan 240 rpm, suhu 37 oC
Uji Aktivitas Transglikosilasi
Campuran reaksi sebanyak 2 ml, yang
terdiri atas 1,5 ml bufer Na-fosfat 0,05 M pH
7 yang mengandung 5% pati dapat larut dan
resorsinol 2% serta 0,5 ml enzim CGTase
Metode
Pembuatan Media
Media Lauria Broth agar (LA). Bahanbahan seperti ekstrak khamir 5 g, tripton 10 g,
NaCl 5 g, dan agar-agar 15 g dilarutkan dalam
takaran 1 L akuades kemudian disterilisasi
pada suhu 121 oC tekanan 1 atm.
3
Analisis Gum Xanthan
Campuran reaksi enzim substrat
jagung dengan akseptor xilosa kemudian
dianalisis pada HPLC RI menggunakan
kolom karbohidrat PLH 2 pelarut asetonitril :
air perbandingan (80:20) dengan suhu 40 oC.
Standar yang digunakan adalah gum xanthan
Sigma® yang dilarutkan dengan konsentrasi
0,6%.
HASIL
Aktivitas CGTase
(U/mL)
Optimasi pH dan Suhu Aktivitas CGTase
Penentuan pH optimum aktivitas enzim
CGTase yang dihasilkan dari biakan X.
campestris dilakukan pada suhu 45oC dalam
larutan bufer fosfat 0,5 mM pada kisaran
antara pH 6,0-8,0. Hasil pengujian
menunjukkan bahwa CGTase memiliki
aktivitas tertinggi pada pada pH 7 yaitu
sebesar 0,4522 unit/ml (Gambar 2, Lampiran
0,5
2)
0,4
0,3
Aktivitas CGTase (U/mL)
Aktivitas tertinggi setelah inkubasi pada
suhu 45oC yaitu sebesar 0,3472 unit/ml.
Setelah itu mengalami penurunan aktivitas
pada suhu 50 dan 55oC. Aktivtas CGTase
mengalami peningkatan pada suhu 65oC
yaitu sebesar 0,2658 unit/ml (Gambar 3,
Lampiran 2).
0,4
0,3
0,2
0,1
0
35 40 45 50 55 60 65 70
Suhu (0C)
Gambar 3 Aktivitas hidrolitik enzim CGTase
dari X. campestris FNCC 0089
pada berbagai suhu.
Pengukuran Aktivitas CGTase pada
Berbagai Substrat Selama 120 Jam
Inkubasi
Pengukuran aktivitas CGTase dari mulai 0
jam hingga 120 jam inkubasi, menunjukan
hasil dengan peningkatan aktivitas yang
bervariasi. Enzim dengan substrat kentang,
jagung, dan singkong meningkat aktivitasnya
pada 24 jam pertama dan cenderung stabil
hingga 120 jam. Enzim dengan substrat beras
dan ubi meningkat bertahap tiap 24 jam
hingga jam ke-120 (Gambar 4, Lampiran 2).
Aktivitas CGTase (U/mL)
kasar diinkubasi pada suhu 45oC selama 24
jam. Aktivitas enzim CGTase dihentikan
pada suhu 100 oC selama 10 menit, setelah
dingin
ditambahkan
enzim
αamiloglukosidase produksi Sigma® sebanyak
0,005% dan diinkubasi selama 45 menit.
Produk
transfer
yang
dihasilkan
diidentifikasi dengan kromatografi lapis tipis
(KLT), menggunakan larutan etil asetat-asam
asetat-akuades (3:1:1, v/v). Plat KLT
dikeringkan pada suhu 100 oC selama 1 jam,
kemudian
disemprot
dengan
larutan
pembangkit yang mengandung H2SO4 20%
dalam metanol, selanjutnya plat KLT dibakar
dalam oven pada suhu 150oC selama 5-10
menit.
Setelah didapatkan substrat dengan
aktivitas transfer tertinggi, lalu dilakukan uji
aktivitas transfer dengan mengganti akseptor
resolsinol dengan gula sederhana yang terdiri
atas glukosa, galaktosa, xilosa, dan fruktosa
sehingga didapatkan akseptor dengan produk
transfer terbaik.
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0,2
0
48
72
96 120
Waktu (Jam)
singkong
kentang
0,1
0
6
6,5
7
pH
7,5
8
Gambar 2 Aktivitas hidrolitik enzim CGTase
dari X. campestris FNCC 0089
pada berbagai pH.
ubi
24
jagung
Gambar 4 Aktivitas CGTase selama 120 jam
inkubasi. Pengukuran dilakukan
pada suhu 45oC dan pH 7.
3
Analisis Gum Xanthan
Campuran reaksi enzim substrat
jagung dengan akseptor xilosa kemudian
dianalisis pada HPLC RI menggunakan
kolom karbohidrat PLH 2 pelarut asetonitril :
air perbandingan (80:20) dengan suhu 40 oC.
Standar yang digunakan adalah gum xanthan
Sigma® yang dilarutkan dengan konsentrasi
0,6%.
HASIL
Aktivitas CGTase
(U/mL)
Optimasi pH dan Suhu Aktivitas CGTase
Penentuan pH optimum aktivitas enzim
CGTase yang dihasilkan dari biakan X.
campestris dilakukan pada suhu 45oC dalam
larutan bufer fosfat 0,5 mM pada kisaran
antara pH 6,0-8,0. Hasil pengujian
menunjukkan bahwa CGTase memiliki
aktivitas tertinggi pada pada pH 7 yaitu
sebesar 0,4522 unit/ml (Gambar 2, Lampiran
0,5
2)
0,4
0,3
Aktivitas CGTase (U/mL)
Aktivitas tertinggi setelah inkubasi pada
suhu 45oC yaitu sebesar 0,3472 unit/ml.
Setelah itu mengalami penurunan aktivitas
pada suhu 50 dan 55oC. Aktivtas CGTase
mengalami peningkatan pada suhu 65oC
yaitu sebesar 0,2658 unit/ml (Gambar 3,
Lampiran 2).
0,4
0,3
0,2
0,1
0
35 40 45 50 55 60 65 70
Suhu (0C)
Gambar 3 Aktivitas hidrolitik enzim CGTase
dari X. campestris FNCC 0089
pada berbagai suhu.
Pengukuran Aktivitas CGTase pada
Berbagai Substrat Selama 120 Jam
Inkubasi
Pengukuran aktivitas CGTase dari mulai 0
jam hingga 120 jam inkubasi, menunjukan
hasil dengan peningkatan aktivitas yang
bervariasi. Enzim dengan substrat kentang,
jagung, dan singkong meningkat aktivitasnya
pada 24 jam pertama dan cenderung stabil
hingga 120 jam. Enzim dengan substrat beras
dan ubi meningkat bertahap tiap 24 jam
hingga jam ke-120 (Gambar 4, Lampiran 2).
Aktivitas CGTase (U/mL)
kasar diinkubasi pada suhu 45oC selama 24
jam. Aktivitas enzim CGTase dihentikan
pada suhu 100 oC selama 10 menit, setelah
dingin
ditambahkan
enzim
αamiloglukosidase produksi Sigma® sebanyak
0,005% dan diinkubasi selama 45 menit.
Produk
transfer
yang
dihasilkan
diidentifikasi dengan kromatografi lapis tipis
(KLT), menggunakan larutan etil asetat-asam
asetat-akuades (3:1:1, v/v). Plat KLT
dikeringkan pada suhu 100 oC selama 1 jam,
kemudian
disemprot
dengan
larutan
pembangkit yang mengandung H2SO4 20%
dalam metanol, selanjutnya plat KLT dibakar
dalam oven pada suhu 150oC selama 5-10
menit.
Setelah didapatkan substrat dengan
aktivitas transfer tertinggi, lalu dilakukan uji
aktivitas transfer dengan mengganti akseptor
resolsinol dengan gula sederhana yang terdiri
atas glukosa, galaktosa, xilosa, dan fruktosa
sehingga didapatkan akseptor dengan produk
transfer terbaik.
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0,2
0
48
72
96 120
Waktu (Jam)
singkong
kentang
0,1
0
6
6,5
7
pH
7,5
8
Gambar 2 Aktivitas hidrolitik enzim CGTase
dari X. campestris FNCC 0089
pada berbagai pH.
ubi
24
jagung
Gambar 4 Aktivitas CGTase selama 120 jam
inkubasi. Pengukuran dilakukan
pada suhu 45oC dan pH 7.
4
Uji Kepekatan Karbohidrat Kultur X.
campestris Selama 120 Jam Inkubasi
Uji kepekatan karbohidrat diuji pada setiap
media mengandung substrat yaitu singkong,
kentang, ubi, jagung, dan beras selama lima
hari yang diukur setiap 24 jam. Hasil
pengukuran
masing-masing
substrat
mengalami penurunan kadar karbohidrat.
Masing-masing penurunannya hingga hari ke
lima sebagai berikut: media substrat singkong
turun sebesar 168,78 µg/ml, media substrat
kentang turun sebesar 174,04 µg /ml, media
substrat ubi sebesar 153,20 µg /ml, media
substrat jagung turun sebesar 100,05 µg /ml,
dan media substrat beras turun sebesar 236,65
µg /ml (Gambar 5, Lampiran 3).
400
300
Gambar 6 Kromatogram hasil uji aktivitas
transfer dari berbagai macam
substrat pada akseptor resorsinol.
Keterangan : S : standar, SKG :
singkong, KTG: kentang, UB:
ubi, JAG : jagung, BRS : beras.
200
100
0
0
1
singkong
Gambar 5
2
3
4
5
kentang
Kadar kepekatan karbohidrat
media produksi gum xanthan
dengan
penambahan
X.
campestris diukur hingga 120 jam
inkubasi.
Uji Aktivitas Transfer
Pengujian aktivitas transfer dilakukan
terhadap enzim CGTase yang dihasilkan dari
berbagai jenis substrat yang dapat mentransfer
gugus glikosil ke akseptor resorsinol.
Aktivitas transfer dari tiap substrat, ditandai
dengan adanya titik (spot) sejajar standar
arbutin. Enzim CGTase menggunakan substrat
jagung menunjukkan spot yang paling tebal
dibanding substrat lainnya (Gambar 6).
Pengujian aktivitas transfer CGTase
dilakukan kembali dengan menggunakan
substrat jagung dan akseptor glukosa,
fruktosa, xilosa, dan galaktosa. Dari keempat
akseptor diperoleh akseptor xilosa yang
memiliki titik paling mendekati standar
arbutin yaitu di sekitar area standar metil-αglikosida (Gambar 7 ).
Gambar 7 Kromatogram hasil uji aktivitas
transfer menggunakan akseptor
gula
sederhana,
diantaranya
glukosa, fruktosa, xilosa, dan
galaktosa. Keterangan : S :
standar, GLU : glukosa, FRUK:
fruktosa, XIL: xilosa, GAL :
galaktosa.
5
Analasis Gum Xanthan
Analisis gum xanthan dilakukan pada
enzim CGTase media substrat jagung akseptor
xilosa. Standar analisis menggunakan gum
xanthan merek dagang Sigma® dengan
konsentrasi 0,6 %. Hasil analisis standar gum
xanthan diperoleh puncak dengan waktu
Gambar 8
retensi (Rt) 1,012 menit dengan luas area
17990 dan waktu retensi sampel diambil yang
paling mendekati dengan 1,012 menit yaitu
0,998 menit. Luas puncak area sampel 14372
(Gambar 8 dan 9, Lampiran 4). Kadar gum
xanthan yang terkandung dalam sampel dapat
dihitung melalui membandingkan luas area
Kromatogram HPLC RI analisis struktur organik standar gum xanthan Sigma ®
dengan Rt (retention time) 1,012 dan luas area 17990.
Gambar 9 Kromatogram HPLC RI analisis struktur organik gum xanthan sampel substrat
jagung dengan Rt 0,998 dan luas area 14372.
6
puncak standar gum xanthan dengan luas area
puncak standar sampel dikalikan konsentrasi
standar gum xanthan. Hasil perhitungan
bahwa di dalam sampel terkandung 0,47%
gum xanthan dibanding konsentrasi standar
gum xanthan Sigma® 0,6% .
PEMBAHASAN
Enzim CGTase diproduksi menggunakan
media produksi gum xanthan dengan
tambahan 2% substrat pati. Jenis pati yang
digunakan ialah beras,
kentang, jagung,
singkong, dan ubi jalar. Fungsi dari
penggunaan berbagai macam substrat pati
sebagai penginduksi untuk mengetahui
kemampuan enzim yang dihasilkan apakah
memiliki
aktivitas
hidrolitik
dan
transglikosilasi. Dalam kondisi tersebut
diharapkan enzim CGTase dapat diproduksi.
Larutan buffer yang digunakan dalam
produksi enzim CGTase ialah bufer fosfat.
Fosfat merupakan komponen anorganik yang
mempunyai sifat bufer pada kisaran pH
normal, yaitu kisaran pH yang dapat
mempertahankan keseimbangan fisiologi dari
mikrob, selain itu fosfat, merupakan sumber
fosfor dan tidak bersifat racun terhadap
mikrob.
Enzim yang diharapkan ialah ekstrak
kasar CGTase, meskipun diduga ada enzim
lain yang dihasilkan dengan menggunakan
penginduksi pati ini, salah satu contohnya αamilase. Kedua enzim ini yaitu CGTase dan
α-amilase dapat dibedakan dengan melakukan
uji aktivitas transfer (transglikosilasi) dari
ekstrak kasar enzim yang dihasilkan, αamilase hanya memiliki aktivitas hidrolitik,
sedangkan CGTase selain memiliki aktivitas
hidrolitik
juga
mempunyai
aktivitas
transglikosilasi (Kometani et al. 1996).
CGTase memiliki kemampuan tidak hanya
mengkatalisis secara intramolekuler yaitu
mengubah pati menjadi siklodekstrin tetapi
juga intermolekuler yaitu mentransfer gugus
glukosil ke akseptor yang sesuai. Selain itu
dapat juga
menghidrolisis pati dan
siklodekstrin menjadi senyawa yang lebih
sederhana.
Pengujian dilakukan dengan menggunakan
pati sebagai substrat. Kemampuan enzim
dalam menghidrolisis pati diuji dengan cara
menambahkan KI 0,05% yang mengandung
I2 0,005% sehingga ketika bereaksi dengan
pati akan membentuk warna biru. Intensitas
warna biru yang terbentuk sebanding dengan
dengan
banyaknya
pati
yang
tidak
terhidrolisis, sehingga semakin banyak pati
yang terhidrolisis intensitas warna biru akan
semakin memudar.
Penentuan kondisi optimum aktivitas
hidrolitik enzim CGTase meliputi penentuan
kondisi optimum pH dan suhu. Suhu dan pH
yang menunjukkan aktivitas hidrolitik
tertinggi merupakan kondisi optimum enzim
tersebut.
Enzim CGTase X. campestris FNCC 0089
diinkubasi pada berbagai suhu mulai dari suhu
35oC hingga suhu
70oC dan diperoleh
aktivitas tertinggi pada suhu 45oC yaitu
sebesar 0,3472 unit/ml. Adapun pada
penentuan pH optimum diperoleh hasil bahwa
aktivitas CGTase tertinggi berada di pH 7
sebesar 0,4522 unit/ml. Hasil ini sesuai
dengan pernyataan Mori et al. (1994) bahwa
aktivitas CGTase stabil pada suhu 50oC atau
kurang dan pH 6-10.
Analisis
penentuan
karbohidrat
menghasilkan reaksi antara
karbohidrat
dengan fenol dan asam sulfat pekat sehingga
akan terbentuk warna hitam pekat apabila
kandungan karbohidrat tinggi. Semakin
rendah kandungan karbohidrat maka warna
campuran reaksi akan semakin pudar.
Pengujian dilakukan selama lima hari tiap 24
jam. Dari kelima macam kultur masingmasing
mengalami
penurunan
kadar
karbohidrat. Penurunan kadar karbohidrat
kultur karena sifat X. campestris yang
kemoorganotropik
yaitu
mampu
menggunakan berbagai macam karbohidrat
dan garam asam organik sebagai sumber
karbonnya (John et al. 1994).
Pengujian aktivitas transfer dilakukan
terhadap enzim CGTase yang dihasilkan dari
berbagai jenis substrat yang dapat mentransfer
gugus glikosil ke akseptor resorsinol. Hasil
produk resorsinol-glikosida diidentifikasi
menggunakan KLT, ditandai dengan adanya
spot yang memiliki nilai Retention factor (Rf)
yang mendekati nilai Rf standar arbutin.
(Gambar 1).
Standar yang digunakan dalam identifikasi
produk transfer
ialah arbutin. Arbutin
merupakan senyawa polifenol yang sudah
dalam bentuk glikosida, dengan nama
sistematik: 4-hidroksifenil-D-glukanopirosida
dan telah diketahui memiliki aktivitas
senyawa antimikrob, antiflamantori, dan anti
oksidan (Hapsah 2004).
Fase diam yang digunakan pada KLT,
yaitu silika yang bersifat polar, adapun fase
geraknya ialah larutan pengembang yang
terdiri atas etil asetat-asam asetat-akuades
(3:1:1, v/v). Senyawa dengan tingkat
kepolaran rendah akan terbawa dengan fase
7
gerak sehingga memiliki nilai Rf yang tinggi,
sedangkan senyawa dengan tingkat kepolaran
yang tinggi akan tertahan sehingga cenderung
lebih kecil nilai Rf.
Hasil
reaksi
transglikosida
selain
dihasilkan senyawa dalam bentuk monosida,
terdapat juga produk samping seperti
polifenol-glukobiosida
atau
polifenol
glukotriasida (Hapsah 2004). Kedua polifenol
ini dapat dijadikan bentuk monosida dengan
menambahkan α-1,6-glikosidik dari ujung
nonpreduksi
secara
berurutan
dengan
membebaskan unit-unit glukosa.
Biakan X. campestris FNCC 0899
memiliki aktivitas transfer. Hal ini ditunjukan
oleh spot pada KLT yang memiliki nilai Rf
mendekati nilai Rf arbutin 0, 78. Dari kelima
substrat, substrat jagung memiliki spot paling
tebal. Selanjutnya terhadap produk transfer
dari substrat jagung tersebut dilakukan uji
transfer
dengan
mengganti
akseptor
menggunakan gula sederhana, di antaranya
glukosa, fruktosa, xilosa, dan galaktosa
(Gambar 7).
Dari keempat akseptor gula sederhana
yang digunakan (Gambar 7) hanya xilosa
yang mampu membentuk dua spot yaitu satu
spot mendekati standar glukosa dengan nilai
Rf 0,45 dan satu spot berikutnya berada
mendekati spot standar metil-α-glukosida
dengan nilai Rf 0,58. Hal ini menandakan
terdapat gugus glikosil yang diduga mampu
menerima akseptor xilosa untuk membentuk
produk transfer berupa glikosida. Namun
belum diketahui
produk yang terbentuk
berupa gum xanthan atau produk transfer
lainnya. Sedangkan pada akseptor yang
lainnya hanya mampu membentuk masingmasing satu spot dengan nilai Rf glukosa
0,43; fruktosa 0,45; dan galaktosa 0,45.
Pengujian menggunakan HPLC RI
terhadap sampel substrat jagung dengan
akseptor xilosa perlu dilakukan karena
pengujian menggunakan KLT belum dapat
menjelaskan keberadaan kandungan gum
xanthan di dalam sampel. Prinsip pada HPLC
semakin dekat sifat suatu molekul akan
mempunyai retention time yang saling
berdekatan.
Hasil uji kandungan gum xanthan
menggunakan HPLC RI diperoleh sebesar
0,47%. Hasil penelitian Kerdsup et al. (2007)
gum xanthan mampu diproduksi sebesar 4,31
g/L menggunakan tepung singkong dan
mampu ditingkatkan produksinya sebesar 5,97
g/L menggunakan biakan X. campestris
varietas liar.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Xanthomonas campestris FNCC 0089
menghasilkan
enzim
siklodekstrin
glukanotransferase (CGTase). CGTase X.
campestris memiliki aktivitas tertinggi pada
pH 7 sebesar 0,4522 unit/ml dan suhu 45oC
sebesar 0,3472 unit/ml. Substrat jagung
merupakan substrat terbaik dan xilosa menjadi
akseptor terbaik dalam pembentukan produk
transfer. Pengukuran dengan HPLC RI
menunjukkan nilai Rt sampel enzim CGTase
X. campestris dengan menggunakan substrat
jagung dan akseptor xilosa sebesar 0,998
mendekati nilai Rt standar gum xanthan
Sigma® sebesar 1,012 dan
menghasilkan
gum xanthan 0,47% dibanding kadar standar
gum xanthan Sigma® sebesar 0,6%.
SARAN
Perlu dilakukan pengujian terhadap
substrat singkong dan kentang yang memiliki
spot tebal yang sejajar standar metil-αglikosida
pada
kromatogram
yang
menggunakan akseptor resorsinol (Gambar 6).
Campuran reaksi pada spot ini perlu
ditambahkan lebih banyak enzim αamiloglukosidase produksi Sigma® untuk
menggeser spot sejajar standar arbutin dan
selanjutnya dilakukan uji dengan mengganti
akseptor resorsinol dengan akseptor gula
sederhana. Perlu ditambahkan standar gum
xanthan
pada
kromatogram
yang
menggunakan akseptor gula sederhana
(Gambar 7) agar dapat dibandingkan dengan
sampel yang diuji.
DAFTAR PUSTAKA
Borges CD, Paula RCM, Feitosa JPA,
Vendruscolo, CT. 2009. The influence
of thermal treatment and operational
conditions on xanthan produced by X.
arboricola pv pruni strain 106. Carbo
Pol 75: 262–268.
Dow JM, Daniels MJ. 1994. Pathogenicity
determinants and global regulation of
pathogenicity
in
Xanthomonas
campestris pv. campestris. Di dalam:
Dangl JL, editor. Molecular and
Cellular Mechanisms in Bacterial
Pathogenesis of Plants and Animals.
Berlin: Springer. hlm 29–41.
Dubois M, Gilles LA, Hamilton JK, Robers
PA, Smith F. 1956. Colormetric
7
gerak sehingga memiliki nilai Rf yang tinggi,
sedangkan senyawa dengan tingkat kepolaran
yang tinggi akan tertahan sehingga cenderung
lebih kecil nilai Rf.
Hasil
reaksi
transglikosida
selain
dihasilkan senyawa dalam bentuk monosida,
terdapat juga produk samping seperti
polifenol-glukobiosida
atau
polifenol
glukotriasida (Hapsah 2004). Kedua polifenol
ini dapat dijadikan bentuk monosida dengan
menambahkan α-1,6-glikosidik dari ujung
nonpreduksi
secara
berurutan
dengan
membebaskan unit-unit glukosa.
Biakan X. campestris FNCC 0899
memiliki aktivitas transfer. Hal ini ditunjukan
oleh spot pada KLT yang memiliki nilai Rf
mendekati nilai Rf arbutin 0, 78. Dari kelima
substrat, substrat jagung memiliki spot paling
tebal. Selanjutnya terhadap produk transfer
dari substrat jagung tersebut dilakukan uji
transfer
dengan
mengganti
akseptor
menggunakan gula sederhana, di antaranya
glukosa, fruktosa, xilosa, dan galaktosa
(Gambar 7).
Dari keempat akseptor gula sederhana
yang digunakan (Gambar 7) hanya xilosa
yang mampu membentuk dua spot yaitu satu
spot mendekati standar glukosa dengan nilai
Rf 0,45 dan satu spot berikutnya berada
mendekati spot standar metil-α-glukosida
dengan nilai Rf 0,58. Hal ini menandakan
terdapat gugus glikosil yang diduga mampu
menerima akseptor xilosa untuk membentuk
produk transfer berupa glikosida. Namun
belum diketahui
produk yang terbentuk
berupa gum xanthan atau produk transfer
lainnya. Sedangkan pada akseptor yang
lainnya hanya mampu membentuk masingmasing satu spot dengan nilai Rf glukosa
0,43; fruktosa 0,45; dan galaktosa 0,45.
Pengujian menggunakan HPLC RI
terhadap sampel substrat jagung dengan
akseptor xilosa perlu dilakukan karena
pengujian menggunakan KLT belum dapat
menjelaskan keberadaan kandungan gum
xanthan di dalam sampel. Prinsip pada HPLC
semakin dekat sifat suatu molekul akan
mempunyai retention time yang saling
berdekatan.
Hasil uji kandungan gum xanthan
menggunakan HPLC RI diperoleh sebesar
0,47%. Hasil penelitian Kerdsup et al. (2007)
gum xanthan mampu diproduksi sebesar 4,31
g/L menggunakan tepung singkong dan
mampu ditingkatkan produksinya sebesar 5,97
g/L menggunakan biakan X. campestris
varietas liar.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Xanthomonas campestris FNCC 0089
menghasilkan
enzim
siklodekstrin
glukanotransferase (CGTase). CGTase X.
campestris memiliki aktivitas tertinggi pada
pH 7 sebesar 0,4522 unit/ml dan suhu 45oC
sebesar 0,3472 unit/ml. Substrat jagung
merupakan substrat terbaik dan xilosa menjadi
akseptor terbaik dalam pembentukan produk
transfer. Pengukuran dengan HPLC RI
menunjukkan nilai Rt sampel enzim CGTase
X. campestris dengan menggunakan substrat
jagung dan akseptor xilosa sebesar 0,998
mendekati nilai Rt standar gum xanthan
Sigma® sebesar 1,012 dan
menghasilkan
gum xanthan 0,47% dibanding kadar standar
gum xanthan Sigma® sebesar 0,6%.
SARAN
Perlu dilakukan pengujian terhadap
substrat singkong dan kentang yang memiliki
spot tebal yang sejajar standar metil-αglikosida
pada
kromatogram
yang
menggunakan akseptor resorsinol (Gambar 6).
Campuran reaksi pada spot ini perlu
ditambahkan lebih banyak enzim αamiloglukosidase produksi Sigma® untuk
menggeser spot sejajar standar arbutin dan
selanjutnya dilakukan uji dengan mengganti
akseptor resorsinol dengan akseptor gula
sederhana. Perlu ditambahkan standar gum
xanthan
pada
kromatogram
yang
menggunakan akseptor gula sederhana
(Gambar 7) agar dapat dibandingkan dengan
sampel yang diuji.
DAFTAR PUSTAKA
Borges CD, Paula RCM, Feitosa JPA,
Vendruscolo, CT. 2009. The influence
of thermal treatment and operational
conditions on xanthan produced by X.
arboricola pv pruni strain 106. Carbo
Pol 75: 262–268.
Dow JM, Daniels MJ. 1994. Pathogenicity
determinants and global regulation of
pathogenicity
in
Xanthomonas
campestris pv. campestris. Di dalam:
Dangl JL, editor. Molecular and
Cellular Mechanisms in Bacterial
Pathogenesis of Plants and Animals.
Berlin: Springer. hlm 29–41.
Dubois M, Gilles LA, Hamilton JK, Robers
PA, Smith F. 1956. Colormetric
PENGUJIAN AKTIVITAS TRANSGLIKOSILASI BIAKAN
Xanthomonas campestris PADA BERBAGAI SUMBER
KARBOHIDRAT
DEDY SANJI PRASTIKO
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2011
8
method for determination of sugar
and related substances. Anal Chem 28:
350-356.
Galindo E. 1994. Xanthan gum World Market
Report (Telefax letters). Mexico City:
Institute
de
Biotechnology,
Universided Nacional Autonomo De
Mexico.
Hapsah H. 2004. Sintesis flavonoid-glikosida
hasil reaksi transglikosilasi enzimatik
dan aktivitasnya sebagai antimikrob
[skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut
Pertanian Bogor.
John GH, Noel RK, Peter HAS, James TS,
Williams TS. 1994. Determinative
Bacteriology. Ed ke-9. Baltimore:
Williams and Wilkins.
Kennedy JF, Bradshaw JI. 1984. Production,
properties and applications of xanthan.
Proc Indust Microb 19: 319-371.
Kerdsup P, Tantratian S, Sanguandeekul R,
Imjongjirak
C.
2009.
Xanthan
production
by mutant strain of
Xanthomonas campestris TISTR 840
in raw cassava starch medium. Food
Bioprocess Technol. 250: 007-009.
Kometani T, Terada Y, Nishimura T, Nakae
T, Takii H, Okada S. 1994.
Transglycosylation to hesperidin by
cyclodextrin glucanotransferase from
an alcalophilic Bacillus species in
alcaline pH and propeties of hesperidin
glycosides. J Biosci Biotech Biochem
58: 1990-1994.
Kometani T, Terada Y, Nishimura T, Nakae
T, Takii H, Okada S. 1996. Acceptor
specificity
of
cyclodextrin
glucanotransferase from an alcalophilic
Bacillus species and synthesis of
glucosyl rhamnose. J Biosci Biotech
Biochem 60: 1176-1178.
Mori S, Hirose S, Oya T, Kitahana S. 1994.
Purification
and
properties
of
cyclodextrin glucanotransferase from
Brevibacterium sp. No. 9605. J Biosci
Biotech Biochem 58: 1968-1972.
Onsando JM. 1992. Black rot of crucifers. Di
dalam: Chaube H S, Kumar J,
Mukhopadhyay AN, Singh US, and
Cliffs E, editor. Plant Diseases of
International Importance II: Diseases
of Vegetable and Oil Seed Crops. New
York: Prentice Hall. hlm 243–252.
Rosalam S, England R. 2006. Review of
xanthan
gum
production
from
unmodified starches by Xanthomonas
campestris sp. J Enzyme Microb
Technol 39: 197-207.
Sulistyo J, Handayani R, Hawab M. 2002.
Aktivitas
antioksidasi
polifenol
glikosida hasil reaksi transglikosilasi
enzim CGTase dari Bacillus macerans.
BioSMART 4: 18-22.
Tankova A. 1998. Bacterial cyclodextrin
glucanotransferase. J Enzyme Microb
Technol 22: 678-686.
Yoo SD, Harcum SW. 1999. Xanthan gum
production from waste sugar beet
pulp. Biores Technol 70: 105–109.
PENGUJIAN AKTIVITAS TRANSGLIKOSILASI BIAKAN
Xanthomonas campestris PADA BERBAGAI SUMBER
KARBOHIDRAT
DEDY SANJI PRASTIKO
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2011
ABSTRAK
DEDY SANJI PRASTIKO. Pengujian Aktivitas Transglikosilasi Biakan Xanthomonas campestris
pada Berbagai Sumber Karbohidrat. Dibimbing oleh NISA RACHMANIA MUBARIK dan
JOKO SULISTYO.
Bakteri fitopatogenik Xanthomonas campestris adalah anggota bakteri aerobik penyebab
kebusukan tanaman cruciferous, seperti cabai, brokoli, dan kubis. Bakteri ini menghasilkan
enzim-enzim dan polisakarida ekstraseluler berupa biopolimer yang dapat digunakan dalam olahan
bahan pangan. Aplikasi gum xanthan dalam industri sebagai viscosifying, bahan pengental,
penstabil, dan agen suspensi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan biakan X.
campestris dalam mensistesis produk transfer secara reaksi transglikosilasi menggunakan enzim
CGTase pada berbagai sumber karbohidrat. Aktivitas transfer diuji menggunakan kromatografi
lapis tipis (KLT) dan kromatografi cair kinerja tinggi dengan indeks refraksi (KCKT IR). Proses
sintesis gum xanthan dapat dibentuk melalui reaksi transglikolisasi. Substrat jagung menjadi
substrat terbaik dalam pembentukan produk transfer dibandingkan substrat yang lainnya. Hasil
analisis menunjukkan substrat jagung dengan akseptor xilosa memiliki kadar kandungan gum
xanthan sebesar 0,47% dibandingkan kadar standar gum xanthan (Sigma® ) sebesar 0,6%.
Kata kunci : Gum xanthan, reaksi transglikosilasi, X. campestris, CGTase
ABSTRACT
DEDY SANJI PRASTIKO. Tested of Xanthomonas campestris Cultures transglycosylation
Activity on Different Sources of Carbohydrates. Supervised by NISA RACHMANIA and JOKO
SULISTYO.
Phytopathogenic bacterium, Xanthomonas campestris is an aerobic bacterium that caused
rot disease on cruciferous plants, such as peppers, broccoli, and cabbage. This bacterium produced
enzymes and extracellular polysaccharide biopolymers that can be used in food processing. The
applications of xanthan gum as one of the extracellular polysaccharides of X. campestris in
industry used as viscosifying and thickening agents, stabilizing, and suspension agents. Xanthan
gum can be synthesized by transglycosylation reaction. The objective of this research was to
know the capability of X. campestris in synthesizing transfer product on transglycosyzation
reaction by using CGTase from various carbohydrate sources. Transfer activity was tested using
thin layer chromatography (TLC) and high performance liquid chromatography refraction index
(HPLC RI). Corn showed as the best substrate in the formation of transfer product compared than
the other substrates. Using xylose acceptor was obtained that the level content of xanthan gum was
0.47% of 0.6% xanthan gum standard (Sigma®).
Keywords: Xanthan Gum, transglycosylation reaction, X. campestris, CGTase
PENGUJIAN AKTIVITAS TRANSGLIKOSILASI BIAKAN
Xanthomonas campestris PADA BERBAGAI SUMBER
KARBOHIDRAT
DEDY SANJI PRASTIKO
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2011
Judul
Nama
NIM
: Pengujian Aktivitas Transglikosilasi Biakan Xanthomonas
campestris pada Beberapa Macam Sumber Karbohidrat
: Dedy Sanji Prastiko
: G34062750
Disetujui oleh,
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si.
NIP. 196711271993022001
Dr. Joko Sulistyo, M. Agr., APU
NIP. 195803171983121001
Diketahui oleh,
Ketua Departemen Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si.
NIP. 19641002 198903 1 002
Tanggal lulus :
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Pati pada tanggal 14 November 1987 sebagai anak kedua dari tiga
bersaudara, anak dari pasangan Almarhum H. Santoso dan Muji Lestari.
Penulis lulus dari SMUN 1 Pati tahun 2006 pada tahun yang sama lulus seleksi masuk
IPB melalui jalur undangan seleksi masuk IPB (USMI) pada Mayor Biologi, Departemen Biologi,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama menjalani perkuliahan di IPB, penulis aktif berorganisasi, di antaranya yaitu
BEM FMIPA IPB sebagai staf Departemen Kajian Strategis, Advokasi dan Kaderisasi pada tahun
2008 dan menjadi Ketua Himpunan Mahasiswa Biologi FMIPA IPB pada tahun 2009. Selain itu
penulis juga pernah mengikuti praktik lapangan selama satu bulan di Laboratorium Bioprospeksi
LIPI-Cibinong Bogor dengan pembimbing Bapak Dr. Joko Sulistyo, M. Agr., APU yang
selanjutnya menjadi pembimbing II penulisan karya ilmiah ini. Tahun 2009 penulis menjadi
asisten praktikum Biologi Dasar TPB selama satu semester.
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT, Tuhan Yang Maha Penolong yang
telah melimpahkan rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulisan karya ilmiah ini dapat
diselesaikan. Shalawat dan salam semoga tercurah kepada manusia paling mulia,
Nabi
Muhammad SAW.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si selaku
pembimbing I yang telah memberi bimbingan dan masukan selama penyusunan karya ilmiah ini,
Dr. Joko Sulistyo, M. Agr., APU selaku pembimbing II yang dengan setia selalu meluangkan
waktunya untuk memberi arahan, dan bimbingan kepada penulis. Terima kasih disampaikan pula
kepada Dr. Aris Tjahjoleksono, DEA selaku penguji dan wakil komisi pendidikan atas saran dan
diskusi yang diberikan. Terima kasih kepada Gatot, Bahar, Ucup, dan Cory teman-teman
seperjuangan riset yang selalu memberikan bantuan dan senyuman. Ibu Rita, teh Alida dan kak
Ugi yang tak segan memberikan nasehat dan semangat. Pa’e (Alm), Bu’e, mas Huring, dan Megi
yang selalu memberi dukungan moral dan doa, serta teman-teman Biologi 43 atas segala bantuan,
semangat, kekompakan, dan kebersamaan yang diberikan.
Semoga karya ilmiah ini dapat memberikan manfaat dan menambah pengetahuan bagi
para pembacanya.
Bogor, 12 Januari 2011
Dedy Sanji Prastiko
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR ..................................................................................................................... vi
DAFTAR LAMPIRAN.............................................................................................................. ...... vii
PENDAHULUAN
Latar belakang ....................................................................................................................... 1
Tujuan .................................................................................................................................... 2
Waktu dan Tempat Penelitian ................................................................................................ 2
BAHAN DAN METODE
Bahan .....................................................................................................................................
Metode ...................................................................................................................................
Pembuatan Media ............................................................................................................
Produksi Enzim CGTase ..................................................................................................
Uji Aktivitas Hidrolitik, Optimasi pH dan Suhu CGTase ...............................................
Uji Kepekatan Karbohidrat .............................................................................................
Uji Aktivitas Transglikosilasi .........................................................................................
Analisis Gum Xanthan .....................................................................................................
2
2
2
2
2
2
2
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil ........................................................................................................................................
Optimasi pH dan Suhu Aktivitas CGTase........................................................................
Pengukuran Aktivitas CGTase pada Berbagai Substrat Selama 120 Jam Inkubasi .........
Uji Kepekatan Karbohidrat Kultur X. campestris Selama 120 Jam Inkubasi...................
Uji Aktivitas Transfer ......................................................................................................
Analisis Gum Xanthan ....................................................................................................
Pembahasan ............................................................................................................................
3
3
3
4
4
5
6
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan ................................................................................................................................. 7
Saran ....................................................................................................................................... 7
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................................... 7
LAMPIRAN ................................................................................................................................... 9
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Serangan X. campestris pada bagian permukaan atas daun kubis.…....….........................
1
2
Optimasi pH aktivitas hidrolitik enzim CGTase dari X. campestris FNCC 0089...............
3
3
Aktivitas hidrolitik enzim CGTase dari X. campestris FNCC 0089 pada
berbagai pH.........................................................................................................................
3
4
Aktivitas CGTase selama 120 jam inkubasi .......................................................................
3
5
Kadar kepekatan karbohidrat media produksi gum xanthan dengan penambahan
X. campestris diukur hingga 120 jam inkubasi ..................................................................
6
Kromatogram hasil uji aktivitas transfer dari berbagai macam substrat pada
akseptor resorsinol ..............................................................................................................
7
Kromatogram HPLC RI analisis struktur organik standar gum xanthan Sigma
4
®
dengan Rt 1,012 dan luas area 17990..................................................................................
9
4
Kromatogram hasil uji aktivitas transfer menggunakan akseptor gula sederhana,
diantaranya glukosa, fruktosa, xilosa, dan galaktosa ..........................................................
8
4
5
Kromatogram HPLC RI analisis struktur organik gum xanthan sampel substrat
jagung dengan Rt 0,998 dan luas area 14372......................................................................
5
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
Kurva standar karbohidrat..................................................................................................
2
Absorbansi pengukuran enzim CGTase meliputi optimasi pH, suhu, dan
10
pengukuran berseri selama lima hari dari masing-masing substrat....................................
10
3
Absorbansi uji kepekatan karbohidrat …...........................................................................
11
4
Perhitungan kadar gum xanthan sampel.............................................................................
12
11
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Bakteri
fitopatogenik
Xanthomonas
campestris ialah suatu anggota bakteri aerobik
famili
Xanthomonadaceae,
penyebab
kebusukan tanaman cruciferous, seperti cabai,
brokoli, dan kubis (Gambar 1, Onsando 1992).
Ciri dan karakterisasi X. campestris ialah
jumlah flagella satu, tidak dapat mereduksi
NO3- menjadi NO2-, tidak mendekarbosilasi
lisin, membutuhkan metionin atau sistein
dalam pertumbuhannya, bentuk mukoid pada
media tumbuh agar-agar nutrien yang
mengandung 5% glukosa, menghidrolisis
gelatin dan pati, menghidrolisis eskulin dan
protein, menghasilkan H2S dari pepton,
terdapat aktivitas pektinase da