Genetic Diversity of Cytochrome b of Crowned-pigeons (Goura sp.)
KERAGAMAN GENETIK CYTOCHROME B
PADA BURUNG MAMBRUK (Goura sp.)
Oleh:
Lasriama Siahaan
G04400032
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2006
ABSTRAK
LASRIAMA SIAHAAN. Keragaman Genetik Cytochrome b pada Burung Mambruk (Goura
sp.). Dibimbing oleh DEDY DURYADI SOLIHIN dan DJOKO WALUYO.
Burung Mambruk (Goura sp.) merupakan satwa endemik Indonesia dengan status
“Vulnerable” yang tersebar di daerah Pulau Irian Jaya dan beberapa daerah Papua New
Guinea. Usaha konservasi terhadap spesies ini akan berhasil jika karakteristik morfologi,
keragaman molekuler dan genetik dapat diketahui dengan pasti. Tujuan penelitian ini untuk
menganalisis keragaman genetik cytochrome b parsial dengan metode Polimerase Chain
Reaction. Hasil perunutan dari amplifikasi pasangan primer M101 dan M102 pada
cytochrome b parsial sepanjang 382 nukleotida (menyandikan 127 asam amino) disejajarkan
(multiple aligment) dengan bantuan perangkat lunak Genetyx-Win versi 3.0 dan Clustal-X,
selanjutnya dianalisis dengan program MEGA versi 3.0.
Hasil analisis dari 382 nukleotida yang dibandingkan terdapat 42 situs nukleotida
yang beragam dengan rata-rata kejadian substitusi transisi 0.05 dan rata-rata substitusi
transversi 0.01. Perubahan bersifat non-sinonimus 7.08% (10 situs asam amino) dan
perubahan bersifat sebesar 23.62% (30 situs asam amino). Jarak genetik nukleotida
cytochrome b (metode p-distance) didapat bahwa nilai paling kecil adalah 0.26% dan nilai
yang paling besar 7.07% dengan rata-rata sebesar 5.26%. Hasil rekonstruksi filogenetik
dengan metode Neighbor Joining menunjukkan bahwa G.cristata lebih berkerabat dekat
dengan G.scheepmakeri daripada G.victoria.
Kata kunci: Goura sp., Cytochrome b, substitusi, perubahan
ABSTRACT
LASRIAMA SIAHAAN. Genetic Diversity of Cytochrome b of Crowned-pigeons (Goura
sp.), Supervised by DEDY DURYADI SOLIHIN and DJOKO WALUYO.
Crowned-pigeon (Goura sp.) was one of endemic animal in Indonesia with
“vulnerable" status which spread at Papua New Guinea and Irian Jaya Island. Conservation
effort to this species will succeed if morphology characteristic and genetic diversity be known.
The main purpose of this research is to analyze nucleotide variability of cytochrome b partial
using Polymerase Chain Reaction method. The PCR product amplified by primer M101 and
M102, then multiple aligment using Genetyx-Win 3.0™ and Clustal-X™, furthermore
analyzed with MEGA 3.0™.
The result of analyse from 382 nucleotide of cytochrome b partial encoding 127
amino acid. Findings 42 sites of nucleotide variable with average of transitional substitutions
0.05 and average transversions substitutions is 0.01. Value non-synonymous mutations is
7.08% (10 amino acid sites) whereas synonymus mutations is 23.62% (30 amino acid
sites). Value of genetic distance of nucleotide cytochrome b (method p-distance) range from
0.26% - 7.07% with average 5.26%. Filogenetic reconstruction using Neighbor Joining
method indicate that G.cristata were closer to G.scheepmakeri compare with G.victoria.
Keyword: Goura sp., Cytochrome b, substitutions, mutations
7
mitokondria tidak hanya ditemukan pada
kelompok burung, hal sama yang terjadi pada
kelompok Rodensia dan Ikan (Kocher et al.
1989). Komposisi nukleotida-2 dari triplet kodon
paling tidak beragam karena komposisi A
(17.3%) sama, demikian pula dengan G (14.2%)
untuk Goura sp. dalam penelitian ini.
Basa dari triplet kodon yang paling banyak
mengalami perubahan substitusi adalah basa ke3 sebesar 22.04% (28 situs), hal ini sesuai
dengan pendapat Sorenson (2003) dimana
kejadian substitusi pada basa ke-3 dari triplet
kodon lebih banyak terjadi.
Perubahan penerjemahan asam amino
terjadi karena adanya substitusi nukleotida
transisi (perubahan antar basa purin atau antar
basa pirimidin)
dan substitusi transversi
(perubahan dari basa purin menjadi basa
pirimidin atau sebaliknya). Transisi pada basa
ke-3 tidak menyebabkan perubahan asam amino
dan transversi basa ke-3 tidak selalu
menyebabkan perubahan asam amino.
Perubahan basa triplet kodon
yang
menyebabkan terjadinya perubahan asam amino
non-sinonim adalah perubahan basa ke-1 sebesar
3.15% (4 situs asam amino), basa ke-2 sebesar
1.57% (2 situs asam amino), basa ke-3 sebesar
1.57% (2 situs asam amino), basa ke-1 dan 3
sebesar 1.57% (2 situs asam amino). Sedangkan
perubahan asam amino sinonim terdapat pada
perubahan basa ke-3 sebesar 20.47% (26 situs
asam amino), basa ke-1 sebesar 3.15% (4 situs
asam amino). Perubahan basa ke-1 umumnya
menyebabkan perubahan asam amino. Kecuali
pada asam amino Leu (leusin), walaupun transisi
dan transversi terjadi pada basa ke-1 dan ke-3
tidak akan menyebabkan perubahan translasi
asam aminonya.
Dari 127 asam amino yang diamati terdapat
68.50% (87 situs) merupakan asam amino kekal
(nukleotidanya tidak mengalami substitusi),
7.87% (10 situs) perubahan bersifat non-sinonim
(nukleotida mengalami substitusi dan asam
amino berubah) dan 23.62% (30 situs)
perubahan
bersifat
sinonim
(nukleotida
mengalami substitusi dan asam amino tetap).
Walaupun telah terjadi perubahan pada 42
situs nukleotida namun hanya 10 situs
nukleotida beragam yang dapat mengubah asam
amino (10 asam amino). Sepuluh situs asam
amino yang berubah terjadi secara transisi dan
transversi basa ke-1 (4 situs asam amino yaitu L
(leusina) menjadi F (fenilalanina), M
(metionina) menjadi L (leusina), T (treonina)
menjadi A (alanina) dan F (fenilalanina)
menjadi L (leusina); transisi basa ke-2 (2 situs
asam amino yaitu F (fenilalanina) menjadi S
(serina) dan M (metionina) menjadi T
(treonina); transversi basa ke-3 (2 situs asam
amino yaitu C (sisteina) menjadi W (triptofan);
serta perpaduan transisi basa ke-1 dan transversi
basa ke-3 (2 situs asam amino yaitu S (serina)
menjadi P (prolina) dan L (leusina) menjadi F
(fenilalanina). Sedangkan situs nukleotida yang
mengalami substitusi lebih banyak (30 situs
asam amino) terjadi secara sinonim bukan nonsinonim sehingga tidak mengubah asam
aminonya.
Kelompok burung (spesies, genera dan
famili) memiliki rata-rata jarak genetik yang
lebih kecil daripada jarak takson yang sama
antara mamalia, amphibi dan reptil. Secara
umum kelompok burung memiliki jarak genetik
intraspesies yang sangat kecil (Stanley &
Harrison 1999). Jarak genetik (p-distance)
berdasarkan jumlah nukleotida yang berbeda,
memperlihatkan jarak genetik intraspesies
Goura sp. yang paling rendah adalah 0.26% (G.
scheepmakeri dengan G. cristata) dan paling
tinggi sebesar 7.07% (G. victoria GenBank
dengan G. victoria hasil penelitian) dengan ratarata sebesar 5.26%. Rata-rata jarak genetik
antar spesies yang dibandingkan adalah 11.54%
dan jarak genetik rata-rata famili Columbidae
(data dari GenBank) sebesar 9.79%. Jarak
genetik ini mendukung hasil penelitian Johnson
& Clayton (2000) yaitu didapatkan bahwa
perbedaan nukleotida Cyt b antar spesies
Columbiformes sekitar 0.97-17.07%.
Hasil ini juga mengasumsikan kekerabatan
yang dekat di antara Goura sp. bahkan antar
spesies Columbidae. Kekerabatan genetik
antara G. cristata dengan G. scheepmakeri
(dengan nilai bootstrap 80%) lebih dekat
dengan morfologi yang lebih mirip jika
dibandingkan dengan G. victoria. Burung
Mambruk dari jenis G. scheepmakeri berada di
antara G. cristata dan G. victoria.
Dalam penelitian Stanley dan Harrison
(1999), pada kelompok burung terjadi
perbedaan mencolok dalam penggunaan kodon
C-U terutama pada kodon ketiga. Hal ini
menjelaskan
terjadinya
penurunan
perbandingan pertukaran substitusi diam (silent
substitution) yang berhubungan erat dengan
kodon bias yang terjadi pada saat penerjemahan
kodon.
KATA PENGANTAR
Persembahan syukur kepada Allah Bapa atas anugerahNya, sehingga penulis
dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Tema yang dipilih dalam penelitian yang
dilaksanakan sejak bulan September 2004 ini adalah ”Keragaman Genetik Cytochrome b
pada Burung Mambruk (Goura sp.).
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA
dan Bapak drh. Djoko Waluyo, M.S selaku pembimbing dan penyandang dana dalam
penelitian ini. Disamping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Taman Burung
Taman Mini Indonesia Indah (TMII) yang telah membantu dalam hal penyediaan contoh
darah burung Mambruk. Tak lupa penulis sampaikan kepada Bapak Heri yang telah
membantu dalam masalah tehnik laboratorium serta rekan-rekan kerja di Laboratorium
Biologi Molekuler Pusat Studi Ilmu Hayati IPB, Ibu Rini, K’ Chule, K’Evi, Virgo atas
saran, dukungan dan kerjasama yang terjalin selama bekerja di Laboratorium.
Terimakasih juga penulis ucapkan kepada saudara terkasih Ike, T’ Lucien, K’ Regina, K’
Anna, B’ Andrew, Pemuda GKI Pengadilan Bogor atas segala bentuk dorongan dan
perhatiannya, Lies dan Biologi angkatan 37’ atas kebersamaannya. Segala cinta dan
terima kasih penulis ungkapkan kepada Bapak, Oma, Nardus, Herman, Okki, Mindo atas
doa, dukungan moral, material, kesabaran dan kasih sayangnya.
Berharap karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Maret 2006
Lasriama Siahaan
KERAGAMAN GENETIK CYTOCHROME B
PADA BURUNG MAMBRUK (Goura sp.)
LASRIAMA SIAHAAN
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2006
Judul : Keragaman Genetik Cytochrome b pada Burung Mambruk (Goura sp.)
Nama : Lasriama Siahaan
NRP : G04400032
Menyetujui,
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA
NIP. 131415134
drh. Djoko Waluyo, M.S
NIP. 130350056
Mengetahui,
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, M.S
NIP. 131473999
Tanggal lulus:
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Pangururan, Sumatera Utara pada tanggal 02 Mei 1983 dari
ayah Tigor Siahaan dan Ibu Tiarasi Simbolon. Penulis merupakan anak pertama dari
lima bersaudara.
Pada tahun 2000 penulis lulus dari SMUN 1 Pangururan dan pada tahun yang
sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis
memilih Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis adalah anggota di Himpunan Mahasiswa
Biologi 2000/2001. Penulis melaksanakan praktik lapang selama dua bulan di PT.
Alpharma, Jakarta. Penulis pernah menjadi asisten mata kuliah Ekologi Dasar pada
tahun ajaran 2003/2004.
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL………………………..…….……………………..................................
Halaman
vi
DAFTAR GAMBAR……………………..…….……………………................................
vi
DAFTAR LAMPIRAN……………………………………………………………………….
vi
PENDAHULUAN…………………………………….………………………………………
1
BAHAN DAN METODE…………………………………………………………………….
2
Bahan………………………………………………….…………………………………
2
Metode……………………………………………….…………………………………..
2
Pengambilan sampel………………………….…………………………………….
2
Isolasi dan Purifikasi DNA…………………...……………………………………..
2
Uji kualitas DNA…………………………………….……………………………….
2
Amplifikasi Daerah Sitokrom b (Cyt b)……………….……................................
2
Perunutan Nukleotida dan Analisis Data…………….……................................
3
HASIL ……………………….…………………………………...………………………….
3
Amplifikasi Daerah Cytochrome b (Cyt b)…………..………..............................
3
Analisis Perunutan Nukleotida Gen Sitokrom b Parsial…................................
3
PEMBAHASAN …………………………………………………………………………….
6
SIMPULAN DAN SARAN………………………………………………………………….
8
DAFTAR PUSTAKA………………………………………………………………………..
8
LAMPIRAN…………………………………………………………………………………..
11
vi
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Rataan Komposisi Nukleotida Cyt b Parsial………………………………......
4
2 Situs Kodon Penyandi Beserta Asam Amino………………………………….
4
3 Jumlah dan Posisi Basa dari Triplet Kodon Beragam………………………..
5
4 Rataan Tansisi Basa ke-1,2,3 dan Rataan Transversi……………………….
5
5 Jarak Genetik Nukleotida Cyt b Parsial………………………………………..
6
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 DNA Mitokondria Avian (Gallus gallus)………………………………………...
2
2 Profil Fragmen Produk PCR Cyt b Burung Mambruk………………………...
3
3 Situs Pengenalan Primer dan Hasil Penjajaran Nukleotida……………........
3
4 Rekonstruksi Filogenetik Nukleotida Cyt b Parsial……………………………
6
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Peta Penyebaran Goura sp……………………………………………………...
11
2 Hasil Perunutan Nukleotida Cyt b (382 Nukleotida) Goura sp………………
13
3 Matriks Perbedaan Nukleotida dan Jarak Genetik Goura sp………….........
15
4 Penjajaran Berganda Nukleotida Cyt b Parsial Goura sp……………………
16
5 Penjajaran Berganda Asam Amino Cyt b Parsial Goura sp…………………
18
6 Jumlah Penggunaan Kodon pada Cyt b Parsial Goura sp………………….
19
7 Gambar Gallus gallus dan Spesies Famili Columbidae……………………..
20
PENDAHULUAN
Sekitar 17% populasi burung di dunia ada di
Indonesia, termasuk burung yang jenisnya
endemik. Salah satu burung endemik Indonesia
adalah burung Mambruk atau Dara mahkota
(Goura sp.).
Sibley dan Ahlquist (1991)
mengelompokkan Goura sp. dalam superordo:
Passerimorphae; ordo: Columbiformes; famili :
Columbidae (Pigeons dan Doves); sub-famili:
Gourinae; genus: Goura. Genus ini memiliki tiga
spesies antara lain: Goura victoria (Mambruk
raja/ Mambruk kembang) yang terbesar dalam
kelompok pigeon (Perrins & Middleton 1985),
G. cristata (Mambruk polos/Mambruk kelabu)
dan G. scheepmakeri (Mambruk besar/Mambruk
ungu). Secara umum G. cristata (Western
crowned-pigeon) hanya tersebar di daerah Kepala
Burung Irian Jaya (Lampiran 1a), G.
scheepmakeri
(Southern
crowned-pigeon)
tersebar di daerah selatan Irian Jaya dan Papua
New Guinea (Lampiran 1b). sedangkan G.
victoria (Victoria crowned-pigeon) tersebar di
bagian utara Irian Jaya dan Papua New Guinea
(Lampiran 1c).
Burung Mambruk merupakan satwa yang
dilindungi oleh pemerintah Indonesia yang
tercantum dalam undang-undang Peraturan
Perlindungan Binatang Liar 1931 (tertulis semua
jenis dari genus Goura) dan Peraturan pemerintah
No. 7 Tahun 1999 untuk semua jenis dari genus
Goura (Noerdjito & Maryamto 2001). Burung
Mambruk termasuk dalam status rawan
(“vulnerable”) artinya spesies ini akan menjadi
genting (“endangered”) dimasa mendatang
populasinya yang terus menurun sebagai akibat
dari daerah habitatnya yang semakin sempit,
diburu untuk dijadikan sebagai satwa peliharaan
karena nilai jualnya cukup tinggi dan untuk
dikonsumsi sebagai sumber protein bagi
penduduk setempat. Berat rata-rata burung
Mambruk dapat mencapai 1800-2400 gram
dengan tinggi 66-79 cm, sehingga memungkinkan
untuk dijadikan sebagai sumber protein hewani
(Kilmaskossu 2001).
Upaya mempertahankan dan melestarikan
suatu organisme memerlukan data informasi
lengkap seperti morfologi, sifat biologi, ekologi
persarangan, dan musim perkembangbiakan
(Kilmaskossu 2001), keragaman genetik dan
determinasi
jenis kelamin (Duryadi 2002).
Usaha-usaha penangkaran pada kondisi alami,
semi alami atau budidaya (pemeliharaan intensif)
perlu untuk menunjang konservasi burung ini
agar dapat mencegah kepunahan lebih lanjut.
Informasi genetik yang telah didapat
mengenai genom kelompok burung (avian)
telah berkembang dengan pesat. Berdasarkan
kandungan protein putih telur, Sibley dan
Ahlquist (1991) menyimpulkan bahwa genom
kelompok burung umumnya terdiri atas 6070% kopi linier, 13-20% ruas pengulangan
intermedian dan 16-20% ruas berulang yang
tinggi.
Data ini telah digunakan untuk
keperluan eksplorasi keragaman genetik dan
sejarah evolusi asal usul kelompok burung.
Penelitian Johnson dan Clayton (2000),
menguji keabsahan perbandingan filogenetik
famili
Columbiformes
dengan
membandingkan DNA inti, yaitu β-fibrinogen
intron-7 (FIB7) dan mitokondria (cytochrome
b/ Cyt b), hasilnya menunjukkan perbedaan
nukleotida antar spesies Columbiformes
sekitar 0.97-17.07% untuk Cyt b dan 0.277.03% untuk FIB7. Ini mengindikasikan
bahwa Cyt b berkembang 5.6 kali lebih cepat
dari FIB7. Uji pada daerah non-coding DNA
mitokondria yaitu D-loop didapatkan bahwa
substitusi transversi lebih sedikit, walaupun
demikian data ini masih dapat membantu
untuk determinasi kejadian mutasi untuk
mtDNA.
Daerah gen penyandi Cyt b pada
kelompok burung (Gallus gallus) berukuran
1143 nukleotida (nt) terletak diantara ND5 dan
tRNAThr (Desjardins & Morais 1990) (Gambar
1). Cytochrome b setiap tingkat spesies
memiliki variasi yang cukup tinggi, ini
menjadi alasan mengapa Cyt b sering dipakai
sebagai pembanding analisis filogenetik untuk
tingkat spesies, genus atau famili yang sama
(Randi 1996).
KERAGAMAN GENETIK CYTOCHROME B
PADA BURUNG MAMBRUK (Goura sp.)
Oleh:
Lasriama Siahaan
G04400032
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2006
ABSTRAK
LASRIAMA SIAHAAN. Keragaman Genetik Cytochrome b pada Burung Mambruk (Goura
sp.). Dibimbing oleh DEDY DURYADI SOLIHIN dan DJOKO WALUYO.
Burung Mambruk (Goura sp.) merupakan satwa endemik Indonesia dengan status
“Vulnerable” yang tersebar di daerah Pulau Irian Jaya dan beberapa daerah Papua New
Guinea. Usaha konservasi terhadap spesies ini akan berhasil jika karakteristik morfologi,
keragaman molekuler dan genetik dapat diketahui dengan pasti. Tujuan penelitian ini untuk
menganalisis keragaman genetik cytochrome b parsial dengan metode Polimerase Chain
Reaction. Hasil perunutan dari amplifikasi pasangan primer M101 dan M102 pada
cytochrome b parsial sepanjang 382 nukleotida (menyandikan 127 asam amino) disejajarkan
(multiple aligment) dengan bantuan perangkat lunak Genetyx-Win versi 3.0 dan Clustal-X,
selanjutnya dianalisis dengan program MEGA versi 3.0.
Hasil analisis dari 382 nukleotida yang dibandingkan terdapat 42 situs nukleotida
yang beragam dengan rata-rata kejadian substitusi transisi 0.05 dan rata-rata substitusi
transversi 0.01. Perubahan bersifat non-sinonimus 7.08% (10 situs asam amino) dan
perubahan bersifat sebesar 23.62% (30 situs asam amino). Jarak genetik nukleotida
cytochrome b (metode p-distance) didapat bahwa nilai paling kecil adalah 0.26% dan nilai
yang paling besar 7.07% dengan rata-rata sebesar 5.26%. Hasil rekonstruksi filogenetik
dengan metode Neighbor Joining menunjukkan bahwa G.cristata lebih berkerabat dekat
dengan G.scheepmakeri daripada G.victoria.
Kata kunci: Goura sp., Cytochrome b, substitusi, perubahan
ABSTRACT
LASRIAMA SIAHAAN. Genetic Diversity of Cytochrome b of Crowned-pigeons (Goura
sp.), Supervised by DEDY DURYADI SOLIHIN and DJOKO WALUYO.
Crowned-pigeon (Goura sp.) was one of endemic animal in Indonesia with
“vulnerable" status which spread at Papua New Guinea and Irian Jaya Island. Conservation
effort to this species will succeed if morphology characteristic and genetic diversity be known.
The main purpose of this research is to analyze nucleotide variability of cytochrome b partial
using Polymerase Chain Reaction method. The PCR product amplified by primer M101 and
M102, then multiple aligment using Genetyx-Win 3.0™ and Clustal-X™, furthermore
analyzed with MEGA 3.0™.
The result of analyse from 382 nucleotide of cytochrome b partial encoding 127
amino acid. Findings 42 sites of nucleotide variable with average of transitional substitutions
0.05 and average transversions substitutions is 0.01. Value non-synonymous mutations is
7.08% (10 amino acid sites) whereas synonymus mutations is 23.62% (30 amino acid
sites). Value of genetic distance of nucleotide cytochrome b (method p-distance) range from
0.26% - 7.07% with average 5.26%. Filogenetic reconstruction using Neighbor Joining
method indicate that G.cristata were closer to G.scheepmakeri compare with G.victoria.
Keyword: Goura sp., Cytochrome b, substitutions, mutations
7
mitokondria tidak hanya ditemukan pada
kelompok burung, hal sama yang terjadi pada
kelompok Rodensia dan Ikan (Kocher et al.
1989). Komposisi nukleotida-2 dari triplet kodon
paling tidak beragam karena komposisi A
(17.3%) sama, demikian pula dengan G (14.2%)
untuk Goura sp. dalam penelitian ini.
Basa dari triplet kodon yang paling banyak
mengalami perubahan substitusi adalah basa ke3 sebesar 22.04% (28 situs), hal ini sesuai
dengan pendapat Sorenson (2003) dimana
kejadian substitusi pada basa ke-3 dari triplet
kodon lebih banyak terjadi.
Perubahan penerjemahan asam amino
terjadi karena adanya substitusi nukleotida
transisi (perubahan antar basa purin atau antar
basa pirimidin)
dan substitusi transversi
(perubahan dari basa purin menjadi basa
pirimidin atau sebaliknya). Transisi pada basa
ke-3 tidak menyebabkan perubahan asam amino
dan transversi basa ke-3 tidak selalu
menyebabkan perubahan asam amino.
Perubahan basa triplet kodon
yang
menyebabkan terjadinya perubahan asam amino
non-sinonim adalah perubahan basa ke-1 sebesar
3.15% (4 situs asam amino), basa ke-2 sebesar
1.57% (2 situs asam amino), basa ke-3 sebesar
1.57% (2 situs asam amino), basa ke-1 dan 3
sebesar 1.57% (2 situs asam amino). Sedangkan
perubahan asam amino sinonim terdapat pada
perubahan basa ke-3 sebesar 20.47% (26 situs
asam amino), basa ke-1 sebesar 3.15% (4 situs
asam amino). Perubahan basa ke-1 umumnya
menyebabkan perubahan asam amino. Kecuali
pada asam amino Leu (leusin), walaupun transisi
dan transversi terjadi pada basa ke-1 dan ke-3
tidak akan menyebabkan perubahan translasi
asam aminonya.
Dari 127 asam amino yang diamati terdapat
68.50% (87 situs) merupakan asam amino kekal
(nukleotidanya tidak mengalami substitusi),
7.87% (10 situs) perubahan bersifat non-sinonim
(nukleotida mengalami substitusi dan asam
amino berubah) dan 23.62% (30 situs)
perubahan
bersifat
sinonim
(nukleotida
mengalami substitusi dan asam amino tetap).
Walaupun telah terjadi perubahan pada 42
situs nukleotida namun hanya 10 situs
nukleotida beragam yang dapat mengubah asam
amino (10 asam amino). Sepuluh situs asam
amino yang berubah terjadi secara transisi dan
transversi basa ke-1 (4 situs asam amino yaitu L
(leusina) menjadi F (fenilalanina), M
(metionina) menjadi L (leusina), T (treonina)
menjadi A (alanina) dan F (fenilalanina)
menjadi L (leusina); transisi basa ke-2 (2 situs
asam amino yaitu F (fenilalanina) menjadi S
(serina) dan M (metionina) menjadi T
(treonina); transversi basa ke-3 (2 situs asam
amino yaitu C (sisteina) menjadi W (triptofan);
serta perpaduan transisi basa ke-1 dan transversi
basa ke-3 (2 situs asam amino yaitu S (serina)
menjadi P (prolina) dan L (leusina) menjadi F
(fenilalanina). Sedangkan situs nukleotida yang
mengalami substitusi lebih banyak (30 situs
asam amino) terjadi secara sinonim bukan nonsinonim sehingga tidak mengubah asam
aminonya.
Kelompok burung (spesies, genera dan
famili) memiliki rata-rata jarak genetik yang
lebih kecil daripada jarak takson yang sama
antara mamalia, amphibi dan reptil. Secara
umum kelompok burung memiliki jarak genetik
intraspesies yang sangat kecil (Stanley &
Harrison 1999). Jarak genetik (p-distance)
berdasarkan jumlah nukleotida yang berbeda,
memperlihatkan jarak genetik intraspesies
Goura sp. yang paling rendah adalah 0.26% (G.
scheepmakeri dengan G. cristata) dan paling
tinggi sebesar 7.07% (G. victoria GenBank
dengan G. victoria hasil penelitian) dengan ratarata sebesar 5.26%. Rata-rata jarak genetik
antar spesies yang dibandingkan adalah 11.54%
dan jarak genetik rata-rata famili Columbidae
(data dari GenBank) sebesar 9.79%. Jarak
genetik ini mendukung hasil penelitian Johnson
& Clayton (2000) yaitu didapatkan bahwa
perbedaan nukleotida Cyt b antar spesies
Columbiformes sekitar 0.97-17.07%.
Hasil ini juga mengasumsikan kekerabatan
yang dekat di antara Goura sp. bahkan antar
spesies Columbidae. Kekerabatan genetik
antara G. cristata dengan G. scheepmakeri
(dengan nilai bootstrap 80%) lebih dekat
dengan morfologi yang lebih mirip jika
dibandingkan dengan G. victoria. Burung
Mambruk dari jenis G. scheepmakeri berada di
antara G. cristata dan G. victoria.
Dalam penelitian Stanley dan Harrison
(1999), pada kelompok burung terjadi
perbedaan mencolok dalam penggunaan kodon
C-U terutama pada kodon ketiga. Hal ini
menjelaskan
terjadinya
penurunan
perbandingan pertukaran substitusi diam (silent
substitution) yang berhubungan erat dengan
kodon bias yang terjadi pada saat penerjemahan
kodon.
KATA PENGANTAR
Persembahan syukur kepada Allah Bapa atas anugerahNya, sehingga penulis
dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Tema yang dipilih dalam penelitian yang
dilaksanakan sejak bulan September 2004 ini adalah ”Keragaman Genetik Cytochrome b
pada Burung Mambruk (Goura sp.).
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA
dan Bapak drh. Djoko Waluyo, M.S selaku pembimbing dan penyandang dana dalam
penelitian ini. Disamping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Taman Burung
Taman Mini Indonesia Indah (TMII) yang telah membantu dalam hal penyediaan contoh
darah burung Mambruk. Tak lupa penulis sampaikan kepada Bapak Heri yang telah
membantu dalam masalah tehnik laboratorium serta rekan-rekan kerja di Laboratorium
Biologi Molekuler Pusat Studi Ilmu Hayati IPB, Ibu Rini, K’ Chule, K’Evi, Virgo atas
saran, dukungan dan kerjasama yang terjalin selama bekerja di Laboratorium.
Terimakasih juga penulis ucapkan kepada saudara terkasih Ike, T’ Lucien, K’ Regina, K’
Anna, B’ Andrew, Pemuda GKI Pengadilan Bogor atas segala bentuk dorongan dan
perhatiannya, Lies dan Biologi angkatan 37’ atas kebersamaannya. Segala cinta dan
terima kasih penulis ungkapkan kepada Bapak, Oma, Nardus, Herman, Okki, Mindo atas
doa, dukungan moral, material, kesabaran dan kasih sayangnya.
Berharap karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Maret 2006
Lasriama Siahaan
KERAGAMAN GENETIK CYTOCHROME B
PADA BURUNG MAMBRUK (Goura sp.)
LASRIAMA SIAHAAN
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2006
Judul : Keragaman Genetik Cytochrome b pada Burung Mambruk (Goura sp.)
Nama : Lasriama Siahaan
NRP : G04400032
Menyetujui,
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA
NIP. 131415134
drh. Djoko Waluyo, M.S
NIP. 130350056
Mengetahui,
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, M.S
NIP. 131473999
Tanggal lulus:
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Pangururan, Sumatera Utara pada tanggal 02 Mei 1983 dari
ayah Tigor Siahaan dan Ibu Tiarasi Simbolon. Penulis merupakan anak pertama dari
lima bersaudara.
Pada tahun 2000 penulis lulus dari SMUN 1 Pangururan dan pada tahun yang
sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis
memilih Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis adalah anggota di Himpunan Mahasiswa
Biologi 2000/2001. Penulis melaksanakan praktik lapang selama dua bulan di PT.
Alpharma, Jakarta. Penulis pernah menjadi asisten mata kuliah Ekologi Dasar pada
tahun ajaran 2003/2004.
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL………………………..…….……………………..................................
Halaman
vi
DAFTAR GAMBAR……………………..…….……………………................................
vi
DAFTAR LAMPIRAN……………………………………………………………………….
vi
PENDAHULUAN…………………………………….………………………………………
1
BAHAN DAN METODE…………………………………………………………………….
2
Bahan………………………………………………….…………………………………
2
Metode……………………………………………….…………………………………..
2
Pengambilan sampel………………………….…………………………………….
2
Isolasi dan Purifikasi DNA…………………...……………………………………..
2
Uji kualitas DNA…………………………………….……………………………….
2
Amplifikasi Daerah Sitokrom b (Cyt b)……………….……................................
2
Perunutan Nukleotida dan Analisis Data…………….……................................
3
HASIL ……………………….…………………………………...………………………….
3
Amplifikasi Daerah Cytochrome b (Cyt b)…………..………..............................
3
Analisis Perunutan Nukleotida Gen Sitokrom b Parsial…................................
3
PEMBAHASAN …………………………………………………………………………….
6
SIMPULAN DAN SARAN………………………………………………………………….
8
DAFTAR PUSTAKA………………………………………………………………………..
8
LAMPIRAN…………………………………………………………………………………..
11
vi
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Rataan Komposisi Nukleotida Cyt b Parsial………………………………......
4
2 Situs Kodon Penyandi Beserta Asam Amino………………………………….
4
3 Jumlah dan Posisi Basa dari Triplet Kodon Beragam………………………..
5
4 Rataan Tansisi Basa ke-1,2,3 dan Rataan Transversi……………………….
5
5 Jarak Genetik Nukleotida Cyt b Parsial………………………………………..
6
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 DNA Mitokondria Avian (Gallus gallus)………………………………………...
2
2 Profil Fragmen Produk PCR Cyt b Burung Mambruk………………………...
3
3 Situs Pengenalan Primer dan Hasil Penjajaran Nukleotida……………........
3
4 Rekonstruksi Filogenetik Nukleotida Cyt b Parsial……………………………
6
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Peta Penyebaran Goura sp……………………………………………………...
11
2 Hasil Perunutan Nukleotida Cyt b (382 Nukleotida) Goura sp………………
13
3 Matriks Perbedaan Nukleotida dan Jarak Genetik Goura sp………….........
15
4 Penjajaran Berganda Nukleotida Cyt b Parsial Goura sp……………………
16
5 Penjajaran Berganda Asam Amino Cyt b Parsial Goura sp…………………
18
6 Jumlah Penggunaan Kodon pada Cyt b Parsial Goura sp………………….
19
7 Gambar Gallus gallus dan Spesies Famili Columbidae……………………..
20
PENDAHULUAN
Sekitar 17% populasi burung di dunia ada di
Indonesia, termasuk burung yang jenisnya
endemik. Salah satu burung endemik Indonesia
adalah burung Mambruk atau Dara mahkota
(Goura sp.).
Sibley dan Ahlquist (1991)
mengelompokkan Goura sp. dalam superordo:
Passerimorphae; ordo: Columbiformes; famili :
Columbidae (Pigeons dan Doves); sub-famili:
Gourinae; genus: Goura. Genus ini memiliki tiga
spesies antara lain: Goura victoria (Mambruk
raja/ Mambruk kembang) yang terbesar dalam
kelompok pigeon (Perrins & Middleton 1985),
G. cristata (Mambruk polos/Mambruk kelabu)
dan G. scheepmakeri (Mambruk besar/Mambruk
ungu). Secara umum G. cristata (Western
crowned-pigeon) hanya tersebar di daerah Kepala
Burung Irian Jaya (Lampiran 1a), G.
scheepmakeri
(Southern
crowned-pigeon)
tersebar di daerah selatan Irian Jaya dan Papua
New Guinea (Lampiran 1b). sedangkan G.
victoria (Victoria crowned-pigeon) tersebar di
bagian utara Irian Jaya dan Papua New Guinea
(Lampiran 1c).
Burung Mambruk merupakan satwa yang
dilindungi oleh pemerintah Indonesia yang
tercantum dalam undang-undang Peraturan
Perlindungan Binatang Liar 1931 (tertulis semua
jenis dari genus Goura) dan Peraturan pemerintah
No. 7 Tahun 1999 untuk semua jenis dari genus
Goura (Noerdjito & Maryamto 2001). Burung
Mambruk termasuk dalam status rawan
(“vulnerable”) artinya spesies ini akan menjadi
genting (“endangered”) dimasa mendatang
populasinya yang terus menurun sebagai akibat
dari daerah habitatnya yang semakin sempit,
diburu untuk dijadikan sebagai satwa peliharaan
karena nilai jualnya cukup tinggi dan untuk
dikonsumsi sebagai sumber protein bagi
penduduk setempat. Berat rata-rata burung
Mambruk dapat mencapai 1800-2400 gram
dengan tinggi 66-79 cm, sehingga memungkinkan
untuk dijadikan sebagai sumber protein hewani
(Kilmaskossu 2001).
Upaya mempertahankan dan melestarikan
suatu organisme memerlukan data informasi
lengkap seperti morfologi, sifat biologi, ekologi
persarangan, dan musim perkembangbiakan
(Kilmaskossu 2001), keragaman genetik dan
determinasi
jenis kelamin (Duryadi 2002).
Usaha-usaha penangkaran pada kondisi alami,
semi alami atau budidaya (pemeliharaan intensif)
perlu untuk menunjang konservasi burung ini
agar dapat mencegah kepunahan lebih lanjut.
Informasi genetik yang telah didapat
mengenai genom kelompok burung (avian)
telah berkembang dengan pesat. Berdasarkan
kandungan protein putih telur, Sibley dan
Ahlquist (1991) menyimpulkan bahwa genom
kelompok burung umumnya terdiri atas 6070% kopi linier, 13-20% ruas pengulangan
intermedian dan 16-20% ruas berulang yang
tinggi.
Data ini telah digunakan untuk
keperluan eksplorasi keragaman genetik dan
sejarah evolusi asal usul kelompok burung.
Penelitian Johnson dan Clayton (2000),
menguji keabsahan perbandingan filogenetik
famili
Columbiformes
dengan
membandingkan DNA inti, yaitu β-fibrinogen
intron-7 (FIB7) dan mitokondria (cytochrome
b/ Cyt b), hasilnya menunjukkan perbedaan
nukleotida antar spesies Columbiformes
sekitar 0.97-17.07% untuk Cyt b dan 0.277.03% untuk FIB7. Ini mengindikasikan
bahwa Cyt b berkembang 5.6 kali lebih cepat
dari FIB7. Uji pada daerah non-coding DNA
mitokondria yaitu D-loop didapatkan bahwa
substitusi transversi lebih sedikit, walaupun
demikian data ini masih dapat membantu
untuk determinasi kejadian mutasi untuk
mtDNA.
Daerah gen penyandi Cyt b pada
kelompok burung (Gallus gallus) berukuran
1143 nukleotida (nt) terletak diantara ND5 dan
tRNAThr (Desjardins & Morais 1990) (Gambar
1). Cytochrome b setiap tingkat spesies
memiliki variasi yang cukup tinggi, ini
menjadi alasan mengapa Cyt b sering dipakai
sebagai pembanding analisis filogenetik untuk
tingkat spesies, genus atau famili yang sama
(Randi 1996).
2
tRNA Thr
16.7 kb
Gambar 1 DNA mitokondria avian (Gallus
gallus).
Kurangnya informasi mengenai burung
Mambruk ini baik secara bioekologi, morfologi,
molekuler atau genetik, untuk keperluan data di
lapangan menjadi salah satu kesulitan bagi usahausaha konservasi dan peningkatan populasinya.
Data hasil penelitian ini diharapkan dapat
dijadikan acuan dalam penelusuran asal usul dan
perbedaan dari ketiga spesies burung Mambruk
yang ada.
Penelitian ini bertujuan menganalisis
keragaman genetik cytochrome b burung
Mambruk dengan merunut sebagian situs gen
penyandi Cyt b.
Penelitan ini dimulai pada bulan September
2004 hingga November 2005 di Laboratorium
Biologi Molekuler, Pusat Studi Ilmu Hayati
(PSIH), IPB, Bogor.
BAHAN DAN METODE
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini
adalah contoh darah burung Mambruk sebanyak 8
ekor yakni 7 ekor koleksi Taman Burung Taman
Mini Indonesia Indah (TMII) dan 1 ekor koleksi
Laboratorium Biologi Molekuler PSIH, IPB,
Bogor.
Metode
Pengambilan Sampel. Sampel darah diambil
dari sayap tepatnya di bagian vena vulgaris
menggunakan syringe 1cc/ml yang sebelumnya
telah diisi dengan ¾ volume 10% etylene tetra
acetic acid (EDTA) sebagai anti koagulan,
kemudian disimpan pada suhu -20oC.
Isolasi dan purifikasi DNA. DNA total
hasil isolasi dipurifikasi dengan metode
purifikasi fenol yang telah dimodifikasi.
Dalam tabung eppendorf 1.5 ml dimasukkan
sampel darah sebanyak 250-500 µl dan
ditambahkan dengan lysis buffer 1x volume
dikocok
sampai
homogen.
Campuran
disentrifugasi pada 6500 rpm selama 1 menit.
Pada endapan ditambahkan 200 µl rinse buffer,
dan divortex. Setelah itu 500 µl digestion
buffer ditambahkan pada tabung, dikocok
sampai homogen lalu diinkubasi pada suhu
55oC sampai semalam (± 16 jam). Setelah
inkubasi, 500 µl larutan fenol ditambahkan
pada supernatan, dikocok selama 20 menit,
lalu disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 3
menit. Supernatan dipindahkan ke dalam
tabung baru dan ditambah dengan Chloroform
isoamil alcohol (CIAA) sebanyak 500 µl
dikocok hingga homogen serta disentrifugasi
pada 13.000 rpm selama 3 menit. Supernatan
yang terbentuk dipindahkan ke dalam tabung
baru dan ditambahkan etanol absolut sebanyak
2x volume, disentrifugasi pada 13.000 rpm
selama 3 menit hingga terdapat endapan putih.
Endapan tersebut dicuci dengan menambahkan
alkohol 70% 1x volume dengan sentrifugasi
13.000 rpm selama 3 menit.
Endapan
kemudian dikeringkan pada suhu ruang.
Selanjutnya pada endapan ditambahkan Tris
EDTA (TE), disentrifugasi pelan dan
diinkubasi pada suhu 37oC selama 15 menit
lalu disimpan dalam freezer.
Uji kualitas DNA. DNA total yang telah
dipurifikasi kemudian dielektroforesis pada gel
agarose 1.2% menggunakan larutan buffer
1xTBE (89 mM Tris, 89 mM Asam Borat dan
2 mM EDTA, pH 8.0) dalam piranti submarine
electrophoresis
(Hoefer).
DNA
divisualisasikan
menggunakan
UV
Transluminator ( λ=260 nm).
Amplifikasi daerah Cytochrome b. Hasil
ekstraksi berupa DNA total digunakan sebagai
cetakan untuk mengamplifikasi daerah Cyt b.
Sepasang
primer
digunakan
untuk
mengamplifikasi daerah Cyt b yaitu M101 5’CAA ATC CTC ACA GGC CTA TTC CTA
GC -3’ (forwad), dan M102 5’-TAG GCG
AAT AGG AAA TAT CAT TCG GGT TGA
T-3’ (reverse). Pasangan primer ini
mengamplifikasi
dengan kondisi predenaturasi pada suhu 94oC selama 3 menit,
3
denaturasi pada suhu 94oC selama 30 detik,
anealing pada suhu 54oC selama 1 menit, elongasi
pada suhu 72oC selama 2 menit. Siklus ini
diulang sebanyak 35 kali, selanjutnya postelongasi pada suhu 72oC selama 5 menit. PCR
dilakukan
dengan
menggunakan
mesin
GeneAmp® PCR System 2400 (Perkin-Elmer).
Komposisi untuk tiap reaksi PCR terdiri dari
DNA total 2-5 µl (10-100 ng), 10x buffer PCR
mix 5 µl, 25 mM MgCl2 2 µl, 10 mM dNTP mix
1 µl, 25 pM primer M101 dan M102 masingmasing 2 µl, dan 5 unit/µl Tag DNA polymerase
0.2 µl dan air steril hingga volume total 50 µl.
Perunutan nukleotida dan analisis data.
DNA Cyt b produk PCR dirunut dengan
menggunakan mesin pengurut DNA otomatis ABI
Prism versi 3.4.1 (USA). Data perunutan yang
diperoleh disejajarkan (alignment) dengan
menggunakan perangkat lunak Genetix-Win versi
3.0 dan Clustal-W (Thompson et al. 1994).
Kemudian basa-basa asam amino gen penyandi
Cyt b diterjemahkan dengan menggunakan
Vertebrate mitochondrial translation code yang
terdapat dalam MEGA versi 3.0.
Sebagai pembanding dalam penelitian ini
digunakan nukleotida lengkap Gallus gallus
(Chicken) dari famili Phasianidae (nomor akses
NC007237, Desjardins & Morais 1990 ) dan
spesies famili Columbidae (Lampiran 6) yaitu:
Alectroenas madagascarensis dari famili
Columbidae
(Madagascar
blue-pigeon)
(AF483344, Shapiro et al. 2002), Didunculus
strigirostris dari famili Columbidae (tooth-billed
pigeon)
(AF483343, Shapiro et al. 2002),
Leptotila verreauxi fulviventri dari famili
Columbidae (white-tipped doves) (AF279704,
Clayton et al. 2003), Ptilinopus superbus dari
famili Columbidae (fruit-doves) (AF483329,
Shapiro et al. 2002), Columba livia dari famili
Columbidae (Rock Pigeon/common pigeon)
(AF182694, Johnson & Clayton 2000), Leptotila
megalura dari famili Columbidae (white-faced
dove) (AF182697, Johnson & Clayton 2000).
Analisis
rekonstruksi
filogenetik
menggunakan perangkat lunak MEGA versi 3.0
(Kumar et al. 2004) dengan menggunakan
bootstrapped Neighbor-Joining dengan 1000 kali
pengulangan.
cristata (m2, m3); 4 ekor G. scheepmakeri
(m4, m5, m6, m7) dan 1 ekor G. victoria (a1)
koleksi Laboratorium Biologi Molekuler.
Amplifikasi daerah Cyt b
Hasil amplifikasi Cyt b menggunakan
pasangan primer M101 dan M102 adalah
sepanjang 704 bp (Gambar 2) dari 1045
nukleotida (nt) Cyt b utuh G. cristata (nomor
akses AF182709) terletak pada situs ke-35
sampai dengan situs yang ke-738 (Johnson &
Clayton 2000).
* Marker 50 bp; cetak tebal produk PCR yang
dirunutkan yaitu m3 (G. cristata); m7 (G.
scheepmakeri); a1 (G. victoria).
Gambar 2 Hasil elektroforesis pada gel agarose
fragmen produk PCR (704 bp) dari
Cyt b burung Mambruk.
Analisis perunutan nukleotida Cyt b parsial
Delapan contoh darah yang diamplifikasi,
empat
di antaranya dirunut DNAnya
(sequencing) dan satu tidak digunakan sebagai
data karena banyak terdapat N. Fragmen
produk PCR sepanjang 704 bp yang dirunut
dengan mesin perunut otomatis ABI Prism
versi 3.4.1 didapat 382 nukleotida (nt) yang
jelas, tidak ambigius dan baik urutannya
(Lampiran 2). Setelah disejajarkan (alignment)
dengan nukleotida Cyt b Gallus gallus dari
GenBank dan spesies lain dari famili
Columbidae sebagai pembanding, didapat hasil
bahwa fragmen sepanjang 382 nt (Lampiran 4)
ini terletak pada situs ke-242 sampai dengan
situs ke-623 Cyt b utuh G. cristata GenBank
(Gambar 3).
tRNA-Thr
ND5
Sit b (1045 nt)
382 nt *
704 bp
HASIL
Hasil identifikasi pengamatan morfologi
setiap sampel dari Taman Burung/TMII (n=7)
didapatkan 1 ekor G. victoria (m1); 2 ekor G.
Primer M101
26 bp
Primer M102
31 bp
........ produk PCR situs ke 35-738
_ _ _ hasil perunutan situs ke 242-623
Gambar 3 Situs penempelan primer dan hasil
penjajaran nukleotida.
4
Hasil penjajaran sepanjang 382 nukleotida
paling banyak ditemukan fragmen tersebut adalah
nukleotida C (35.4%), diikuti dengan A (26.0%),
T (25.7%) dan yang paling sedikit adalah G
(12.9%). Komposisi pasangan nukleotida A+T
lebih tinggi pada G. cristata (52.8%), dan paling
rendah pada G. victoria 49.7% dengan rataan
51.7%, sedangkan untuk komposisi pasangan
nukleotida C+G lebih tinggi pada G. victoria
(50.3%) dan paling rendah pada G. cristata
(47.2%) dengan rataan 48.3% (Tabel 1).
Fragmen sepanjang 382 nukleotida ini
menyandikan 127 asam amino yaitu mulai dari
asam amino ke 81 sampai dengan asam amino ke
207 (situs acuan adalah asam amino hasil translasi
Cyt b utuh G. Cristata GenBank). Komposisi
basa ke-1 pada triplet kodon (nukleotida-1)
paling banyak ditemukan adalah nukleotida A
(28.1%) diikuti oleh nukleotida C (27.3%), T
(25.0%) dan G (22.7%). Komposisi basa ke-2
dari triplet kodon (nukleotida-2) paling banyak
(Tabel 1) adalah nukleotida T (42.5%) diikuti
oleh nukleotida C (26.0%), A (17.3%), G
(14.2%). Sedangkan untuk komposisi basa ke3 dari triplet kodon (nukleotida-3) yang paling
banyak (Tabel 1) adalah nukleotida C (53.7%)
diikuti dengan nukleotida A (32.8%), T
(11.0%), dan G (2.5%) (Tabel 1).
Tabel 1 Rataan komposisi nukleotida Cyt b parsial Goura sp. hasil penelitian, G. cristata GenBank,
dan G. victoria GenBank
1
2
3
4
5
R
T(U) C
A G
A+T
C+G
T-1 C-1 A-1 G-1
**
T-2 C-2 A-2 G-2
***
T-3 C-3 A-3 G-3
****
26.4
26.4
26.4
24.6
24.3
25.7
26.2
26.4
25.7
26.2
25.4
26.0
52.6
52.8
52.1
50.8
49.7
51.7
47.4
47.2
47.9
49.3
50.3
48.3
23.4 26.6 28.1 21.9
23.4 26.6 28.1 21.9
25.0 25.0 28.1 21.9
24.2 25.8 28.1 21.9
23.4 27.3 26.6 22.7
23.9 26.3 27.8 22.0
42.5 26.0 17.3 14.2
42.5 26.0 17.3 14.2
42.5 26.0 17.3 14.2
40.9 27.6 17.3 14.2
41.7 26.8 17.3 14.2
42.0 26.5 17.3 14.2
13.4 52.0
13.4 51.2
11.8 53.5
8.7 54.3
7.9 57.5
11.0 53.7
34.8
34.6
34.8
35.9
37.2
35.4
12.6
12.6
13.1
13.4
13.1
12.9
33.1
33.9
31.5
33.1
32.3
32.8
1.6
1.6
3.1
3.9
2.4
2.5
1. G. cristata*; 2. G. cristata._m3; 3. G. scheepmakeri._m7; 4. G. victoria_a1; 5. G. victoria*; R.Avg;
* GenBank; ** basa ke-1 dari triplet kodon; ** basa ke-2 dari triplet kodon *; **** basa ke-3 dari triplet kodon.
Hasil penjajaran (382 nt) nukleotida G.
victoria GenBank, G. cristata GenBank,
Goura sp. hasil penelitian terdapat 42 situs
nukleotida beragam yang terdapat dalam 40
situs asam amino (Tabel 2). Situs nukleotida
yang beragam merupakan hasil kejadian
substitusi basa ke-3 (paling banyak) diikuti
dengan substitusi basa ke-1, basa ke-2 dan
basa ke-1 dan 3 (Tabel 3).
Tabel 2 Situs kodon penyandi beserta asam amino yang mengalami perubahan pada Cyt b parsial dari
G. cristata GenBank, G. victoria GenBank, Goura sp. hasil penelitian
82
99
104
107
108
110
112
119
120
128
131
132
G.crist_GenB
G.crist_m3
G.scheep_m7
G.vict_a1
G.vict_GenB
AAC
...
...
..T
...
TAT
...
..C
..C
...
GGA
...
...
..G
...
TCA
...
..C
...
...
TTT
...
...
...
..C
GGT
...
..A
..A
..C
ACA
...
..G
...
...
TCC
...
...
C.A
...
GCC
...
..T
..T
..T
ATT
...
...
...
..C
TGA
...
...
...
..G
GCC
...
..T
...
...
Situs as.amino
82
99
104
107
108
110
112
119
120
128
131
132
134 139
G.crist_GenB
G.crist_m3
G.scheep_m7
G.vict_a1
G.vict_GenB
Situs ke (kodon)
G.crist_GenB
G.crist_m3
G.scheep_m7
G.vict_a1
G.vict_GenB
N
.
.
.
.
Y
.
.
.
.
G
.
.
.
.
S
.
.
.
.
F
.
.
.
.
G
.
.
.
.
T
.
.
.
.
S
.
.
P
.
A
.
.
.
.
I
.
.
.
.
W
.
.
.
.
A
.
.
.
.
G
.
.
.
.
Situs ke (kodon)
140 147
AAT
...
...
..C
..C
TTC
...
...
.C.
...
149
150
156
157
158
161
168
169
171
175
CTC
...
...
T..
...
CAC
...
...
..T
...
ATA
...
...
...
C..
ATT
...
...
..C
...
GCT
...
..C
...
..C
ACC
...
...
...
G..
TTA
...
...
C..
C..
CAT
...
..C
..C
..C
TCC
...
..T
...
...
AAT
...
..C
..C
..C
134 139
GGT
...
...
..C
...
GAT
...
...
..C
..C
D
.
.
.
.
177 178
CTA
...
...
T..
T..
GGC
...
...
...
..T
5
Situs as.amino
140 147
G.crist_GenB
G.crist_m3
G.scheep_m7
G.vict_a1
G.vict_GenB
N
.
.
.
.
F
.
.
S
.
149
150
156
157
158
161
168
169
171
175
177 178
L
.
.
F
.
H
.
.
.
.
M
.
.
.
L
I
.
.
.
.
A
.
.
.
.
T
.
.
.
A
L
.
.
.
.
H
.
.
.
.
S
.
.
.
.
N
.
.
.
.
L
.
.
.
.
180
183
184
G.crist_GenB
G.crist_m3
G.scheep_m7
G.vict_a1
G.vict_GenB
TCT
...
...
..C
...
TGC
...
...
..G
...
GAC
..A
..T
..T
..T
TTT
...
...
...
..C
CTA
...
...
T..
...
ATT
...
..C
..C
..C
Situs as.amino
180
183
184
192
194
197 198
G.crist_GenB
G.crist_m3
G.scheep_m7
G.vict_a1
G.vict_GenB
S
.
.
.
.
C
.
.
W
.
D
E
.
.
.
F
.
.
.
.
L
.
.
.
.
Situs ke (kodon)
192
194 197
I
.
.
.
.
198
200
201
202
205
207
CTT
...
T..
...
T.C
TTC
...
...
...
C..
ATA
...
...
.C.
.C.
CTA
...
..G
..G
...
CTC
...
...
...
..T
CTA
...
T..
...
...
200
201
202
205
207
F
.
.
.
L
M
.
.
T
T
L
.
.
.
.
L
.
.
.
.
L
.
.
.
.
L
.
F
.
F
G
.
.
.
.
Angka cetak tebal : situs as.amino yang berbeda pada Goura sp.
Huruf tebal, garis bawah : perubahn non-sinonimus (nukleotida berubah dan as.amino berubah).
Kodon ke-82 sama dengan asam amino ke-2 hasil penjajaran
Kodon ke-207 sama dengan asam amino ke-127 hasil penjajaran
Tabel 3 Jumlah dan posisi basa dari triplet kodon
Cyt b parsial (42 situs) G. cristata
GenBank, G. victoria GenBank dan
Goura sp. hasil penelitian
Basa
beragam
Ke-1
Ke-2
Ke-3
Ke-1 dan 3
Total
Jumlah
situs
nukleotida
Jumlah
Situs
asam amino
8
2
28
4
8 (6.29%)
2 (1.57%)
28 (22.04%)
2 (1.57%)
42 situs
40 situs
Kejadian substitusi transisi dan transversi
memberi kontribusi pada keragaman nukleotida
(Tabel 4). Kejadian substitusi transisi lebih besar
pada tingkat spesies daripada nilai transversi.
Sedangkan untuk tingkat genus umumnya nilai
transversi lebih besar (Kocher et al. 1989). Nilai
transisi terbesar 0.06 (G. victoria GenBank dan G.
victoria hasil penelitian tehadap G. cristata
GenBank; G. victoria GenBank terhadap G.
victoria hasil penelitian) dan nilai terkecil 0.00
antara G. cristata GenBank terhadap G. cristata
hasil penelitian dimana rata-rata kejadian
substitusi transisi sebesar 0.05. Sedangkan nilai
transversi terbesar 0.01 dan terkecil adalah 0.00
dengan rata-rata 0.01.
Tabel 4 Rataan transisi basa ke-1,2,3 (di
bawah diagonal) dan rataan transversi
basa ke- 1, 2, 3 (diatas diagonal) pada
Goura sp. hasil penelitian, G. cristata
GenBank dan G. victoria GenBank
1
1]G.crist_GenB
2]G.crist_m3
3]G.scheep_m
4]G.vict_a1
5]G.vict_GenB
0.00
0.03
0.06
0.06
2
3
0.00 0.01
0.01
0.03
0.05 0.05
0.05 0.05
4
5
0.01 0.00
0.01 0.01
0.01 0.01
0.01
0.06
Berdasarkan jumlah perbedaan nukleotida
didapatkan jarak genetik intraspesies Goura
sp. terhadap Gallus gallus paling kecil 0.26%
dan paling tinggi 21.99% dengan rata-rata
perbedaan nukleotida 10.73% (41 nt) (Tabel
5). Sedangkan untuk intraspesies Goura sp.
jarak genetik paling tinggi 7.07% dan paling
rendah 0.26% dengan rata-rata perbedaan
nukleotida sebesar 5.23% (20 nt).
6
Tabel 5 Jarak genetik nukleotida Cyt b parsial
(382 nt) G. cristata GenBank , G. victoria
GenBank, Goura sp. hasil penelitian dan
Gallus gallus sebagai pembanding
1
1]Gal.gallus*
2]G.crist*
3]G.crist-m3
4]G.sche-m7
5]G.vict-a1
6]G.vict*
0.2120
0.2147
0.2199
0.2068
0.2147
2
3
4
5
6
81
82
1
84
15
15
79
25
25
24
82
23
23
23
27
0.0026
0.0393 0.0393
0.0654 0.0654 0.0628
0.0602 0.0602 0.0602 0.0707
* data GenBank
Jarak genetik (dibawah diagonal) dengan
metode P-distance dan matriks perbedaan jumlah
nukleotida (diatas diagonal).
Filogram hasil rekonstruksi filogenetik
nukleotida Cyt b parsial (Gambar 4)
menunjukkan bahwa G. cristata GenBank, G.
victoria GenBank; Goura sp. hasil penelitian
mengelompok dalam satu percabangan yang
didukung dengan nilai bootstrap 99%. G.
cristata GenBank dan G. cristata hasil
penelitian berada dalam percabangan yang
sama yang didukung dengan nilai bootstrap
100%. Selanjutnya G. cristata berada dalam
cabang
yang bersebelahan dengan G.
scheepmakeri
diduk
PADA BURUNG MAMBRUK (Goura sp.)
Oleh:
Lasriama Siahaan
G04400032
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2006
ABSTRAK
LASRIAMA SIAHAAN. Keragaman Genetik Cytochrome b pada Burung Mambruk (Goura
sp.). Dibimbing oleh DEDY DURYADI SOLIHIN dan DJOKO WALUYO.
Burung Mambruk (Goura sp.) merupakan satwa endemik Indonesia dengan status
“Vulnerable” yang tersebar di daerah Pulau Irian Jaya dan beberapa daerah Papua New
Guinea. Usaha konservasi terhadap spesies ini akan berhasil jika karakteristik morfologi,
keragaman molekuler dan genetik dapat diketahui dengan pasti. Tujuan penelitian ini untuk
menganalisis keragaman genetik cytochrome b parsial dengan metode Polimerase Chain
Reaction. Hasil perunutan dari amplifikasi pasangan primer M101 dan M102 pada
cytochrome b parsial sepanjang 382 nukleotida (menyandikan 127 asam amino) disejajarkan
(multiple aligment) dengan bantuan perangkat lunak Genetyx-Win versi 3.0 dan Clustal-X,
selanjutnya dianalisis dengan program MEGA versi 3.0.
Hasil analisis dari 382 nukleotida yang dibandingkan terdapat 42 situs nukleotida
yang beragam dengan rata-rata kejadian substitusi transisi 0.05 dan rata-rata substitusi
transversi 0.01. Perubahan bersifat non-sinonimus 7.08% (10 situs asam amino) dan
perubahan bersifat sebesar 23.62% (30 situs asam amino). Jarak genetik nukleotida
cytochrome b (metode p-distance) didapat bahwa nilai paling kecil adalah 0.26% dan nilai
yang paling besar 7.07% dengan rata-rata sebesar 5.26%. Hasil rekonstruksi filogenetik
dengan metode Neighbor Joining menunjukkan bahwa G.cristata lebih berkerabat dekat
dengan G.scheepmakeri daripada G.victoria.
Kata kunci: Goura sp., Cytochrome b, substitusi, perubahan
ABSTRACT
LASRIAMA SIAHAAN. Genetic Diversity of Cytochrome b of Crowned-pigeons (Goura
sp.), Supervised by DEDY DURYADI SOLIHIN and DJOKO WALUYO.
Crowned-pigeon (Goura sp.) was one of endemic animal in Indonesia with
“vulnerable" status which spread at Papua New Guinea and Irian Jaya Island. Conservation
effort to this species will succeed if morphology characteristic and genetic diversity be known.
The main purpose of this research is to analyze nucleotide variability of cytochrome b partial
using Polymerase Chain Reaction method. The PCR product amplified by primer M101 and
M102, then multiple aligment using Genetyx-Win 3.0™ and Clustal-X™, furthermore
analyzed with MEGA 3.0™.
The result of analyse from 382 nucleotide of cytochrome b partial encoding 127
amino acid. Findings 42 sites of nucleotide variable with average of transitional substitutions
0.05 and average transversions substitutions is 0.01. Value non-synonymous mutations is
7.08% (10 amino acid sites) whereas synonymus mutations is 23.62% (30 amino acid
sites). Value of genetic distance of nucleotide cytochrome b (method p-distance) range from
0.26% - 7.07% with average 5.26%. Filogenetic reconstruction using Neighbor Joining
method indicate that G.cristata were closer to G.scheepmakeri compare with G.victoria.
Keyword: Goura sp., Cytochrome b, substitutions, mutations
7
mitokondria tidak hanya ditemukan pada
kelompok burung, hal sama yang terjadi pada
kelompok Rodensia dan Ikan (Kocher et al.
1989). Komposisi nukleotida-2 dari triplet kodon
paling tidak beragam karena komposisi A
(17.3%) sama, demikian pula dengan G (14.2%)
untuk Goura sp. dalam penelitian ini.
Basa dari triplet kodon yang paling banyak
mengalami perubahan substitusi adalah basa ke3 sebesar 22.04% (28 situs), hal ini sesuai
dengan pendapat Sorenson (2003) dimana
kejadian substitusi pada basa ke-3 dari triplet
kodon lebih banyak terjadi.
Perubahan penerjemahan asam amino
terjadi karena adanya substitusi nukleotida
transisi (perubahan antar basa purin atau antar
basa pirimidin)
dan substitusi transversi
(perubahan dari basa purin menjadi basa
pirimidin atau sebaliknya). Transisi pada basa
ke-3 tidak menyebabkan perubahan asam amino
dan transversi basa ke-3 tidak selalu
menyebabkan perubahan asam amino.
Perubahan basa triplet kodon
yang
menyebabkan terjadinya perubahan asam amino
non-sinonim adalah perubahan basa ke-1 sebesar
3.15% (4 situs asam amino), basa ke-2 sebesar
1.57% (2 situs asam amino), basa ke-3 sebesar
1.57% (2 situs asam amino), basa ke-1 dan 3
sebesar 1.57% (2 situs asam amino). Sedangkan
perubahan asam amino sinonim terdapat pada
perubahan basa ke-3 sebesar 20.47% (26 situs
asam amino), basa ke-1 sebesar 3.15% (4 situs
asam amino). Perubahan basa ke-1 umumnya
menyebabkan perubahan asam amino. Kecuali
pada asam amino Leu (leusin), walaupun transisi
dan transversi terjadi pada basa ke-1 dan ke-3
tidak akan menyebabkan perubahan translasi
asam aminonya.
Dari 127 asam amino yang diamati terdapat
68.50% (87 situs) merupakan asam amino kekal
(nukleotidanya tidak mengalami substitusi),
7.87% (10 situs) perubahan bersifat non-sinonim
(nukleotida mengalami substitusi dan asam
amino berubah) dan 23.62% (30 situs)
perubahan
bersifat
sinonim
(nukleotida
mengalami substitusi dan asam amino tetap).
Walaupun telah terjadi perubahan pada 42
situs nukleotida namun hanya 10 situs
nukleotida beragam yang dapat mengubah asam
amino (10 asam amino). Sepuluh situs asam
amino yang berubah terjadi secara transisi dan
transversi basa ke-1 (4 situs asam amino yaitu L
(leusina) menjadi F (fenilalanina), M
(metionina) menjadi L (leusina), T (treonina)
menjadi A (alanina) dan F (fenilalanina)
menjadi L (leusina); transisi basa ke-2 (2 situs
asam amino yaitu F (fenilalanina) menjadi S
(serina) dan M (metionina) menjadi T
(treonina); transversi basa ke-3 (2 situs asam
amino yaitu C (sisteina) menjadi W (triptofan);
serta perpaduan transisi basa ke-1 dan transversi
basa ke-3 (2 situs asam amino yaitu S (serina)
menjadi P (prolina) dan L (leusina) menjadi F
(fenilalanina). Sedangkan situs nukleotida yang
mengalami substitusi lebih banyak (30 situs
asam amino) terjadi secara sinonim bukan nonsinonim sehingga tidak mengubah asam
aminonya.
Kelompok burung (spesies, genera dan
famili) memiliki rata-rata jarak genetik yang
lebih kecil daripada jarak takson yang sama
antara mamalia, amphibi dan reptil. Secara
umum kelompok burung memiliki jarak genetik
intraspesies yang sangat kecil (Stanley &
Harrison 1999). Jarak genetik (p-distance)
berdasarkan jumlah nukleotida yang berbeda,
memperlihatkan jarak genetik intraspesies
Goura sp. yang paling rendah adalah 0.26% (G.
scheepmakeri dengan G. cristata) dan paling
tinggi sebesar 7.07% (G. victoria GenBank
dengan G. victoria hasil penelitian) dengan ratarata sebesar 5.26%. Rata-rata jarak genetik
antar spesies yang dibandingkan adalah 11.54%
dan jarak genetik rata-rata famili Columbidae
(data dari GenBank) sebesar 9.79%. Jarak
genetik ini mendukung hasil penelitian Johnson
& Clayton (2000) yaitu didapatkan bahwa
perbedaan nukleotida Cyt b antar spesies
Columbiformes sekitar 0.97-17.07%.
Hasil ini juga mengasumsikan kekerabatan
yang dekat di antara Goura sp. bahkan antar
spesies Columbidae. Kekerabatan genetik
antara G. cristata dengan G. scheepmakeri
(dengan nilai bootstrap 80%) lebih dekat
dengan morfologi yang lebih mirip jika
dibandingkan dengan G. victoria. Burung
Mambruk dari jenis G. scheepmakeri berada di
antara G. cristata dan G. victoria.
Dalam penelitian Stanley dan Harrison
(1999), pada kelompok burung terjadi
perbedaan mencolok dalam penggunaan kodon
C-U terutama pada kodon ketiga. Hal ini
menjelaskan
terjadinya
penurunan
perbandingan pertukaran substitusi diam (silent
substitution) yang berhubungan erat dengan
kodon bias yang terjadi pada saat penerjemahan
kodon.
KATA PENGANTAR
Persembahan syukur kepada Allah Bapa atas anugerahNya, sehingga penulis
dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Tema yang dipilih dalam penelitian yang
dilaksanakan sejak bulan September 2004 ini adalah ”Keragaman Genetik Cytochrome b
pada Burung Mambruk (Goura sp.).
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA
dan Bapak drh. Djoko Waluyo, M.S selaku pembimbing dan penyandang dana dalam
penelitian ini. Disamping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Taman Burung
Taman Mini Indonesia Indah (TMII) yang telah membantu dalam hal penyediaan contoh
darah burung Mambruk. Tak lupa penulis sampaikan kepada Bapak Heri yang telah
membantu dalam masalah tehnik laboratorium serta rekan-rekan kerja di Laboratorium
Biologi Molekuler Pusat Studi Ilmu Hayati IPB, Ibu Rini, K’ Chule, K’Evi, Virgo atas
saran, dukungan dan kerjasama yang terjalin selama bekerja di Laboratorium.
Terimakasih juga penulis ucapkan kepada saudara terkasih Ike, T’ Lucien, K’ Regina, K’
Anna, B’ Andrew, Pemuda GKI Pengadilan Bogor atas segala bentuk dorongan dan
perhatiannya, Lies dan Biologi angkatan 37’ atas kebersamaannya. Segala cinta dan
terima kasih penulis ungkapkan kepada Bapak, Oma, Nardus, Herman, Okki, Mindo atas
doa, dukungan moral, material, kesabaran dan kasih sayangnya.
Berharap karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Maret 2006
Lasriama Siahaan
KERAGAMAN GENETIK CYTOCHROME B
PADA BURUNG MAMBRUK (Goura sp.)
LASRIAMA SIAHAAN
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2006
Judul : Keragaman Genetik Cytochrome b pada Burung Mambruk (Goura sp.)
Nama : Lasriama Siahaan
NRP : G04400032
Menyetujui,
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA
NIP. 131415134
drh. Djoko Waluyo, M.S
NIP. 130350056
Mengetahui,
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, M.S
NIP. 131473999
Tanggal lulus:
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Pangururan, Sumatera Utara pada tanggal 02 Mei 1983 dari
ayah Tigor Siahaan dan Ibu Tiarasi Simbolon. Penulis merupakan anak pertama dari
lima bersaudara.
Pada tahun 2000 penulis lulus dari SMUN 1 Pangururan dan pada tahun yang
sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis
memilih Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis adalah anggota di Himpunan Mahasiswa
Biologi 2000/2001. Penulis melaksanakan praktik lapang selama dua bulan di PT.
Alpharma, Jakarta. Penulis pernah menjadi asisten mata kuliah Ekologi Dasar pada
tahun ajaran 2003/2004.
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL………………………..…….……………………..................................
Halaman
vi
DAFTAR GAMBAR……………………..…….……………………................................
vi
DAFTAR LAMPIRAN……………………………………………………………………….
vi
PENDAHULUAN…………………………………….………………………………………
1
BAHAN DAN METODE…………………………………………………………………….
2
Bahan………………………………………………….…………………………………
2
Metode……………………………………………….…………………………………..
2
Pengambilan sampel………………………….…………………………………….
2
Isolasi dan Purifikasi DNA…………………...……………………………………..
2
Uji kualitas DNA…………………………………….……………………………….
2
Amplifikasi Daerah Sitokrom b (Cyt b)……………….……................................
2
Perunutan Nukleotida dan Analisis Data…………….……................................
3
HASIL ……………………….…………………………………...………………………….
3
Amplifikasi Daerah Cytochrome b (Cyt b)…………..………..............................
3
Analisis Perunutan Nukleotida Gen Sitokrom b Parsial…................................
3
PEMBAHASAN …………………………………………………………………………….
6
SIMPULAN DAN SARAN………………………………………………………………….
8
DAFTAR PUSTAKA………………………………………………………………………..
8
LAMPIRAN…………………………………………………………………………………..
11
vi
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Rataan Komposisi Nukleotida Cyt b Parsial………………………………......
4
2 Situs Kodon Penyandi Beserta Asam Amino………………………………….
4
3 Jumlah dan Posisi Basa dari Triplet Kodon Beragam………………………..
5
4 Rataan Tansisi Basa ke-1,2,3 dan Rataan Transversi……………………….
5
5 Jarak Genetik Nukleotida Cyt b Parsial………………………………………..
6
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 DNA Mitokondria Avian (Gallus gallus)………………………………………...
2
2 Profil Fragmen Produk PCR Cyt b Burung Mambruk………………………...
3
3 Situs Pengenalan Primer dan Hasil Penjajaran Nukleotida……………........
3
4 Rekonstruksi Filogenetik Nukleotida Cyt b Parsial……………………………
6
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Peta Penyebaran Goura sp……………………………………………………...
11
2 Hasil Perunutan Nukleotida Cyt b (382 Nukleotida) Goura sp………………
13
3 Matriks Perbedaan Nukleotida dan Jarak Genetik Goura sp………….........
15
4 Penjajaran Berganda Nukleotida Cyt b Parsial Goura sp……………………
16
5 Penjajaran Berganda Asam Amino Cyt b Parsial Goura sp…………………
18
6 Jumlah Penggunaan Kodon pada Cyt b Parsial Goura sp………………….
19
7 Gambar Gallus gallus dan Spesies Famili Columbidae……………………..
20
PENDAHULUAN
Sekitar 17% populasi burung di dunia ada di
Indonesia, termasuk burung yang jenisnya
endemik. Salah satu burung endemik Indonesia
adalah burung Mambruk atau Dara mahkota
(Goura sp.).
Sibley dan Ahlquist (1991)
mengelompokkan Goura sp. dalam superordo:
Passerimorphae; ordo: Columbiformes; famili :
Columbidae (Pigeons dan Doves); sub-famili:
Gourinae; genus: Goura. Genus ini memiliki tiga
spesies antara lain: Goura victoria (Mambruk
raja/ Mambruk kembang) yang terbesar dalam
kelompok pigeon (Perrins & Middleton 1985),
G. cristata (Mambruk polos/Mambruk kelabu)
dan G. scheepmakeri (Mambruk besar/Mambruk
ungu). Secara umum G. cristata (Western
crowned-pigeon) hanya tersebar di daerah Kepala
Burung Irian Jaya (Lampiran 1a), G.
scheepmakeri
(Southern
crowned-pigeon)
tersebar di daerah selatan Irian Jaya dan Papua
New Guinea (Lampiran 1b). sedangkan G.
victoria (Victoria crowned-pigeon) tersebar di
bagian utara Irian Jaya dan Papua New Guinea
(Lampiran 1c).
Burung Mambruk merupakan satwa yang
dilindungi oleh pemerintah Indonesia yang
tercantum dalam undang-undang Peraturan
Perlindungan Binatang Liar 1931 (tertulis semua
jenis dari genus Goura) dan Peraturan pemerintah
No. 7 Tahun 1999 untuk semua jenis dari genus
Goura (Noerdjito & Maryamto 2001). Burung
Mambruk termasuk dalam status rawan
(“vulnerable”) artinya spesies ini akan menjadi
genting (“endangered”) dimasa mendatang
populasinya yang terus menurun sebagai akibat
dari daerah habitatnya yang semakin sempit,
diburu untuk dijadikan sebagai satwa peliharaan
karena nilai jualnya cukup tinggi dan untuk
dikonsumsi sebagai sumber protein bagi
penduduk setempat. Berat rata-rata burung
Mambruk dapat mencapai 1800-2400 gram
dengan tinggi 66-79 cm, sehingga memungkinkan
untuk dijadikan sebagai sumber protein hewani
(Kilmaskossu 2001).
Upaya mempertahankan dan melestarikan
suatu organisme memerlukan data informasi
lengkap seperti morfologi, sifat biologi, ekologi
persarangan, dan musim perkembangbiakan
(Kilmaskossu 2001), keragaman genetik dan
determinasi
jenis kelamin (Duryadi 2002).
Usaha-usaha penangkaran pada kondisi alami,
semi alami atau budidaya (pemeliharaan intensif)
perlu untuk menunjang konservasi burung ini
agar dapat mencegah kepunahan lebih lanjut.
Informasi genetik yang telah didapat
mengenai genom kelompok burung (avian)
telah berkembang dengan pesat. Berdasarkan
kandungan protein putih telur, Sibley dan
Ahlquist (1991) menyimpulkan bahwa genom
kelompok burung umumnya terdiri atas 6070% kopi linier, 13-20% ruas pengulangan
intermedian dan 16-20% ruas berulang yang
tinggi.
Data ini telah digunakan untuk
keperluan eksplorasi keragaman genetik dan
sejarah evolusi asal usul kelompok burung.
Penelitian Johnson dan Clayton (2000),
menguji keabsahan perbandingan filogenetik
famili
Columbiformes
dengan
membandingkan DNA inti, yaitu β-fibrinogen
intron-7 (FIB7) dan mitokondria (cytochrome
b/ Cyt b), hasilnya menunjukkan perbedaan
nukleotida antar spesies Columbiformes
sekitar 0.97-17.07% untuk Cyt b dan 0.277.03% untuk FIB7. Ini mengindikasikan
bahwa Cyt b berkembang 5.6 kali lebih cepat
dari FIB7. Uji pada daerah non-coding DNA
mitokondria yaitu D-loop didapatkan bahwa
substitusi transversi lebih sedikit, walaupun
demikian data ini masih dapat membantu
untuk determinasi kejadian mutasi untuk
mtDNA.
Daerah gen penyandi Cyt b pada
kelompok burung (Gallus gallus) berukuran
1143 nukleotida (nt) terletak diantara ND5 dan
tRNAThr (Desjardins & Morais 1990) (Gambar
1). Cytochrome b setiap tingkat spesies
memiliki variasi yang cukup tinggi, ini
menjadi alasan mengapa Cyt b sering dipakai
sebagai pembanding analisis filogenetik untuk
tingkat spesies, genus atau famili yang sama
(Randi 1996).
KERAGAMAN GENETIK CYTOCHROME B
PADA BURUNG MAMBRUK (Goura sp.)
Oleh:
Lasriama Siahaan
G04400032
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2006
ABSTRAK
LASRIAMA SIAHAAN. Keragaman Genetik Cytochrome b pada Burung Mambruk (Goura
sp.). Dibimbing oleh DEDY DURYADI SOLIHIN dan DJOKO WALUYO.
Burung Mambruk (Goura sp.) merupakan satwa endemik Indonesia dengan status
“Vulnerable” yang tersebar di daerah Pulau Irian Jaya dan beberapa daerah Papua New
Guinea. Usaha konservasi terhadap spesies ini akan berhasil jika karakteristik morfologi,
keragaman molekuler dan genetik dapat diketahui dengan pasti. Tujuan penelitian ini untuk
menganalisis keragaman genetik cytochrome b parsial dengan metode Polimerase Chain
Reaction. Hasil perunutan dari amplifikasi pasangan primer M101 dan M102 pada
cytochrome b parsial sepanjang 382 nukleotida (menyandikan 127 asam amino) disejajarkan
(multiple aligment) dengan bantuan perangkat lunak Genetyx-Win versi 3.0 dan Clustal-X,
selanjutnya dianalisis dengan program MEGA versi 3.0.
Hasil analisis dari 382 nukleotida yang dibandingkan terdapat 42 situs nukleotida
yang beragam dengan rata-rata kejadian substitusi transisi 0.05 dan rata-rata substitusi
transversi 0.01. Perubahan bersifat non-sinonimus 7.08% (10 situs asam amino) dan
perubahan bersifat sebesar 23.62% (30 situs asam amino). Jarak genetik nukleotida
cytochrome b (metode p-distance) didapat bahwa nilai paling kecil adalah 0.26% dan nilai
yang paling besar 7.07% dengan rata-rata sebesar 5.26%. Hasil rekonstruksi filogenetik
dengan metode Neighbor Joining menunjukkan bahwa G.cristata lebih berkerabat dekat
dengan G.scheepmakeri daripada G.victoria.
Kata kunci: Goura sp., Cytochrome b, substitusi, perubahan
ABSTRACT
LASRIAMA SIAHAAN. Genetic Diversity of Cytochrome b of Crowned-pigeons (Goura
sp.), Supervised by DEDY DURYADI SOLIHIN and DJOKO WALUYO.
Crowned-pigeon (Goura sp.) was one of endemic animal in Indonesia with
“vulnerable" status which spread at Papua New Guinea and Irian Jaya Island. Conservation
effort to this species will succeed if morphology characteristic and genetic diversity be known.
The main purpose of this research is to analyze nucleotide variability of cytochrome b partial
using Polymerase Chain Reaction method. The PCR product amplified by primer M101 and
M102, then multiple aligment using Genetyx-Win 3.0™ and Clustal-X™, furthermore
analyzed with MEGA 3.0™.
The result of analyse from 382 nucleotide of cytochrome b partial encoding 127
amino acid. Findings 42 sites of nucleotide variable with average of transitional substitutions
0.05 and average transversions substitutions is 0.01. Value non-synonymous mutations is
7.08% (10 amino acid sites) whereas synonymus mutations is 23.62% (30 amino acid
sites). Value of genetic distance of nucleotide cytochrome b (method p-distance) range from
0.26% - 7.07% with average 5.26%. Filogenetic reconstruction using Neighbor Joining
method indicate that G.cristata were closer to G.scheepmakeri compare with G.victoria.
Keyword: Goura sp., Cytochrome b, substitutions, mutations
7
mitokondria tidak hanya ditemukan pada
kelompok burung, hal sama yang terjadi pada
kelompok Rodensia dan Ikan (Kocher et al.
1989). Komposisi nukleotida-2 dari triplet kodon
paling tidak beragam karena komposisi A
(17.3%) sama, demikian pula dengan G (14.2%)
untuk Goura sp. dalam penelitian ini.
Basa dari triplet kodon yang paling banyak
mengalami perubahan substitusi adalah basa ke3 sebesar 22.04% (28 situs), hal ini sesuai
dengan pendapat Sorenson (2003) dimana
kejadian substitusi pada basa ke-3 dari triplet
kodon lebih banyak terjadi.
Perubahan penerjemahan asam amino
terjadi karena adanya substitusi nukleotida
transisi (perubahan antar basa purin atau antar
basa pirimidin)
dan substitusi transversi
(perubahan dari basa purin menjadi basa
pirimidin atau sebaliknya). Transisi pada basa
ke-3 tidak menyebabkan perubahan asam amino
dan transversi basa ke-3 tidak selalu
menyebabkan perubahan asam amino.
Perubahan basa triplet kodon
yang
menyebabkan terjadinya perubahan asam amino
non-sinonim adalah perubahan basa ke-1 sebesar
3.15% (4 situs asam amino), basa ke-2 sebesar
1.57% (2 situs asam amino), basa ke-3 sebesar
1.57% (2 situs asam amino), basa ke-1 dan 3
sebesar 1.57% (2 situs asam amino). Sedangkan
perubahan asam amino sinonim terdapat pada
perubahan basa ke-3 sebesar 20.47% (26 situs
asam amino), basa ke-1 sebesar 3.15% (4 situs
asam amino). Perubahan basa ke-1 umumnya
menyebabkan perubahan asam amino. Kecuali
pada asam amino Leu (leusin), walaupun transisi
dan transversi terjadi pada basa ke-1 dan ke-3
tidak akan menyebabkan perubahan translasi
asam aminonya.
Dari 127 asam amino yang diamati terdapat
68.50% (87 situs) merupakan asam amino kekal
(nukleotidanya tidak mengalami substitusi),
7.87% (10 situs) perubahan bersifat non-sinonim
(nukleotida mengalami substitusi dan asam
amino berubah) dan 23.62% (30 situs)
perubahan
bersifat
sinonim
(nukleotida
mengalami substitusi dan asam amino tetap).
Walaupun telah terjadi perubahan pada 42
situs nukleotida namun hanya 10 situs
nukleotida beragam yang dapat mengubah asam
amino (10 asam amino). Sepuluh situs asam
amino yang berubah terjadi secara transisi dan
transversi basa ke-1 (4 situs asam amino yaitu L
(leusina) menjadi F (fenilalanina), M
(metionina) menjadi L (leusina), T (treonina)
menjadi A (alanina) dan F (fenilalanina)
menjadi L (leusina); transisi basa ke-2 (2 situs
asam amino yaitu F (fenilalanina) menjadi S
(serina) dan M (metionina) menjadi T
(treonina); transversi basa ke-3 (2 situs asam
amino yaitu C (sisteina) menjadi W (triptofan);
serta perpaduan transisi basa ke-1 dan transversi
basa ke-3 (2 situs asam amino yaitu S (serina)
menjadi P (prolina) dan L (leusina) menjadi F
(fenilalanina). Sedangkan situs nukleotida yang
mengalami substitusi lebih banyak (30 situs
asam amino) terjadi secara sinonim bukan nonsinonim sehingga tidak mengubah asam
aminonya.
Kelompok burung (spesies, genera dan
famili) memiliki rata-rata jarak genetik yang
lebih kecil daripada jarak takson yang sama
antara mamalia, amphibi dan reptil. Secara
umum kelompok burung memiliki jarak genetik
intraspesies yang sangat kecil (Stanley &
Harrison 1999). Jarak genetik (p-distance)
berdasarkan jumlah nukleotida yang berbeda,
memperlihatkan jarak genetik intraspesies
Goura sp. yang paling rendah adalah 0.26% (G.
scheepmakeri dengan G. cristata) dan paling
tinggi sebesar 7.07% (G. victoria GenBank
dengan G. victoria hasil penelitian) dengan ratarata sebesar 5.26%. Rata-rata jarak genetik
antar spesies yang dibandingkan adalah 11.54%
dan jarak genetik rata-rata famili Columbidae
(data dari GenBank) sebesar 9.79%. Jarak
genetik ini mendukung hasil penelitian Johnson
& Clayton (2000) yaitu didapatkan bahwa
perbedaan nukleotida Cyt b antar spesies
Columbiformes sekitar 0.97-17.07%.
Hasil ini juga mengasumsikan kekerabatan
yang dekat di antara Goura sp. bahkan antar
spesies Columbidae. Kekerabatan genetik
antara G. cristata dengan G. scheepmakeri
(dengan nilai bootstrap 80%) lebih dekat
dengan morfologi yang lebih mirip jika
dibandingkan dengan G. victoria. Burung
Mambruk dari jenis G. scheepmakeri berada di
antara G. cristata dan G. victoria.
Dalam penelitian Stanley dan Harrison
(1999), pada kelompok burung terjadi
perbedaan mencolok dalam penggunaan kodon
C-U terutama pada kodon ketiga. Hal ini
menjelaskan
terjadinya
penurunan
perbandingan pertukaran substitusi diam (silent
substitution) yang berhubungan erat dengan
kodon bias yang terjadi pada saat penerjemahan
kodon.
KATA PENGANTAR
Persembahan syukur kepada Allah Bapa atas anugerahNya, sehingga penulis
dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Tema yang dipilih dalam penelitian yang
dilaksanakan sejak bulan September 2004 ini adalah ”Keragaman Genetik Cytochrome b
pada Burung Mambruk (Goura sp.).
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA
dan Bapak drh. Djoko Waluyo, M.S selaku pembimbing dan penyandang dana dalam
penelitian ini. Disamping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Taman Burung
Taman Mini Indonesia Indah (TMII) yang telah membantu dalam hal penyediaan contoh
darah burung Mambruk. Tak lupa penulis sampaikan kepada Bapak Heri yang telah
membantu dalam masalah tehnik laboratorium serta rekan-rekan kerja di Laboratorium
Biologi Molekuler Pusat Studi Ilmu Hayati IPB, Ibu Rini, K’ Chule, K’Evi, Virgo atas
saran, dukungan dan kerjasama yang terjalin selama bekerja di Laboratorium.
Terimakasih juga penulis ucapkan kepada saudara terkasih Ike, T’ Lucien, K’ Regina, K’
Anna, B’ Andrew, Pemuda GKI Pengadilan Bogor atas segala bentuk dorongan dan
perhatiannya, Lies dan Biologi angkatan 37’ atas kebersamaannya. Segala cinta dan
terima kasih penulis ungkapkan kepada Bapak, Oma, Nardus, Herman, Okki, Mindo atas
doa, dukungan moral, material, kesabaran dan kasih sayangnya.
Berharap karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Maret 2006
Lasriama Siahaan
KERAGAMAN GENETIK CYTOCHROME B
PADA BURUNG MAMBRUK (Goura sp.)
LASRIAMA SIAHAAN
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2006
Judul : Keragaman Genetik Cytochrome b pada Burung Mambruk (Goura sp.)
Nama : Lasriama Siahaan
NRP : G04400032
Menyetujui,
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA
NIP. 131415134
drh. Djoko Waluyo, M.S
NIP. 130350056
Mengetahui,
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, M.S
NIP. 131473999
Tanggal lulus:
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Pangururan, Sumatera Utara pada tanggal 02 Mei 1983 dari
ayah Tigor Siahaan dan Ibu Tiarasi Simbolon. Penulis merupakan anak pertama dari
lima bersaudara.
Pada tahun 2000 penulis lulus dari SMUN 1 Pangururan dan pada tahun yang
sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis
memilih Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis adalah anggota di Himpunan Mahasiswa
Biologi 2000/2001. Penulis melaksanakan praktik lapang selama dua bulan di PT.
Alpharma, Jakarta. Penulis pernah menjadi asisten mata kuliah Ekologi Dasar pada
tahun ajaran 2003/2004.
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL………………………..…….……………………..................................
Halaman
vi
DAFTAR GAMBAR……………………..…….……………………................................
vi
DAFTAR LAMPIRAN……………………………………………………………………….
vi
PENDAHULUAN…………………………………….………………………………………
1
BAHAN DAN METODE…………………………………………………………………….
2
Bahan………………………………………………….…………………………………
2
Metode……………………………………………….…………………………………..
2
Pengambilan sampel………………………….…………………………………….
2
Isolasi dan Purifikasi DNA…………………...……………………………………..
2
Uji kualitas DNA…………………………………….……………………………….
2
Amplifikasi Daerah Sitokrom b (Cyt b)……………….……................................
2
Perunutan Nukleotida dan Analisis Data…………….……................................
3
HASIL ……………………….…………………………………...………………………….
3
Amplifikasi Daerah Cytochrome b (Cyt b)…………..………..............................
3
Analisis Perunutan Nukleotida Gen Sitokrom b Parsial…................................
3
PEMBAHASAN …………………………………………………………………………….
6
SIMPULAN DAN SARAN………………………………………………………………….
8
DAFTAR PUSTAKA………………………………………………………………………..
8
LAMPIRAN…………………………………………………………………………………..
11
vi
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Rataan Komposisi Nukleotida Cyt b Parsial………………………………......
4
2 Situs Kodon Penyandi Beserta Asam Amino………………………………….
4
3 Jumlah dan Posisi Basa dari Triplet Kodon Beragam………………………..
5
4 Rataan Tansisi Basa ke-1,2,3 dan Rataan Transversi……………………….
5
5 Jarak Genetik Nukleotida Cyt b Parsial………………………………………..
6
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 DNA Mitokondria Avian (Gallus gallus)………………………………………...
2
2 Profil Fragmen Produk PCR Cyt b Burung Mambruk………………………...
3
3 Situs Pengenalan Primer dan Hasil Penjajaran Nukleotida……………........
3
4 Rekonstruksi Filogenetik Nukleotida Cyt b Parsial……………………………
6
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Peta Penyebaran Goura sp……………………………………………………...
11
2 Hasil Perunutan Nukleotida Cyt b (382 Nukleotida) Goura sp………………
13
3 Matriks Perbedaan Nukleotida dan Jarak Genetik Goura sp………….........
15
4 Penjajaran Berganda Nukleotida Cyt b Parsial Goura sp……………………
16
5 Penjajaran Berganda Asam Amino Cyt b Parsial Goura sp…………………
18
6 Jumlah Penggunaan Kodon pada Cyt b Parsial Goura sp………………….
19
7 Gambar Gallus gallus dan Spesies Famili Columbidae……………………..
20
PENDAHULUAN
Sekitar 17% populasi burung di dunia ada di
Indonesia, termasuk burung yang jenisnya
endemik. Salah satu burung endemik Indonesia
adalah burung Mambruk atau Dara mahkota
(Goura sp.).
Sibley dan Ahlquist (1991)
mengelompokkan Goura sp. dalam superordo:
Passerimorphae; ordo: Columbiformes; famili :
Columbidae (Pigeons dan Doves); sub-famili:
Gourinae; genus: Goura. Genus ini memiliki tiga
spesies antara lain: Goura victoria (Mambruk
raja/ Mambruk kembang) yang terbesar dalam
kelompok pigeon (Perrins & Middleton 1985),
G. cristata (Mambruk polos/Mambruk kelabu)
dan G. scheepmakeri (Mambruk besar/Mambruk
ungu). Secara umum G. cristata (Western
crowned-pigeon) hanya tersebar di daerah Kepala
Burung Irian Jaya (Lampiran 1a), G.
scheepmakeri
(Southern
crowned-pigeon)
tersebar di daerah selatan Irian Jaya dan Papua
New Guinea (Lampiran 1b). sedangkan G.
victoria (Victoria crowned-pigeon) tersebar di
bagian utara Irian Jaya dan Papua New Guinea
(Lampiran 1c).
Burung Mambruk merupakan satwa yang
dilindungi oleh pemerintah Indonesia yang
tercantum dalam undang-undang Peraturan
Perlindungan Binatang Liar 1931 (tertulis semua
jenis dari genus Goura) dan Peraturan pemerintah
No. 7 Tahun 1999 untuk semua jenis dari genus
Goura (Noerdjito & Maryamto 2001). Burung
Mambruk termasuk dalam status rawan
(“vulnerable”) artinya spesies ini akan menjadi
genting (“endangered”) dimasa mendatang
populasinya yang terus menurun sebagai akibat
dari daerah habitatnya yang semakin sempit,
diburu untuk dijadikan sebagai satwa peliharaan
karena nilai jualnya cukup tinggi dan untuk
dikonsumsi sebagai sumber protein bagi
penduduk setempat. Berat rata-rata burung
Mambruk dapat mencapai 1800-2400 gram
dengan tinggi 66-79 cm, sehingga memungkinkan
untuk dijadikan sebagai sumber protein hewani
(Kilmaskossu 2001).
Upaya mempertahankan dan melestarikan
suatu organisme memerlukan data informasi
lengkap seperti morfologi, sifat biologi, ekologi
persarangan, dan musim perkembangbiakan
(Kilmaskossu 2001), keragaman genetik dan
determinasi
jenis kelamin (Duryadi 2002).
Usaha-usaha penangkaran pada kondisi alami,
semi alami atau budidaya (pemeliharaan intensif)
perlu untuk menunjang konservasi burung ini
agar dapat mencegah kepunahan lebih lanjut.
Informasi genetik yang telah didapat
mengenai genom kelompok burung (avian)
telah berkembang dengan pesat. Berdasarkan
kandungan protein putih telur, Sibley dan
Ahlquist (1991) menyimpulkan bahwa genom
kelompok burung umumnya terdiri atas 6070% kopi linier, 13-20% ruas pengulangan
intermedian dan 16-20% ruas berulang yang
tinggi.
Data ini telah digunakan untuk
keperluan eksplorasi keragaman genetik dan
sejarah evolusi asal usul kelompok burung.
Penelitian Johnson dan Clayton (2000),
menguji keabsahan perbandingan filogenetik
famili
Columbiformes
dengan
membandingkan DNA inti, yaitu β-fibrinogen
intron-7 (FIB7) dan mitokondria (cytochrome
b/ Cyt b), hasilnya menunjukkan perbedaan
nukleotida antar spesies Columbiformes
sekitar 0.97-17.07% untuk Cyt b dan 0.277.03% untuk FIB7. Ini mengindikasikan
bahwa Cyt b berkembang 5.6 kali lebih cepat
dari FIB7. Uji pada daerah non-coding DNA
mitokondria yaitu D-loop didapatkan bahwa
substitusi transversi lebih sedikit, walaupun
demikian data ini masih dapat membantu
untuk determinasi kejadian mutasi untuk
mtDNA.
Daerah gen penyandi Cyt b pada
kelompok burung (Gallus gallus) berukuran
1143 nukleotida (nt) terletak diantara ND5 dan
tRNAThr (Desjardins & Morais 1990) (Gambar
1). Cytochrome b setiap tingkat spesies
memiliki variasi yang cukup tinggi, ini
menjadi alasan mengapa Cyt b sering dipakai
sebagai pembanding analisis filogenetik untuk
tingkat spesies, genus atau famili yang sama
(Randi 1996).
2
tRNA Thr
16.7 kb
Gambar 1 DNA mitokondria avian (Gallus
gallus).
Kurangnya informasi mengenai burung
Mambruk ini baik secara bioekologi, morfologi,
molekuler atau genetik, untuk keperluan data di
lapangan menjadi salah satu kesulitan bagi usahausaha konservasi dan peningkatan populasinya.
Data hasil penelitian ini diharapkan dapat
dijadikan acuan dalam penelusuran asal usul dan
perbedaan dari ketiga spesies burung Mambruk
yang ada.
Penelitian ini bertujuan menganalisis
keragaman genetik cytochrome b burung
Mambruk dengan merunut sebagian situs gen
penyandi Cyt b.
Penelitan ini dimulai pada bulan September
2004 hingga November 2005 di Laboratorium
Biologi Molekuler, Pusat Studi Ilmu Hayati
(PSIH), IPB, Bogor.
BAHAN DAN METODE
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini
adalah contoh darah burung Mambruk sebanyak 8
ekor yakni 7 ekor koleksi Taman Burung Taman
Mini Indonesia Indah (TMII) dan 1 ekor koleksi
Laboratorium Biologi Molekuler PSIH, IPB,
Bogor.
Metode
Pengambilan Sampel. Sampel darah diambil
dari sayap tepatnya di bagian vena vulgaris
menggunakan syringe 1cc/ml yang sebelumnya
telah diisi dengan ¾ volume 10% etylene tetra
acetic acid (EDTA) sebagai anti koagulan,
kemudian disimpan pada suhu -20oC.
Isolasi dan purifikasi DNA. DNA total
hasil isolasi dipurifikasi dengan metode
purifikasi fenol yang telah dimodifikasi.
Dalam tabung eppendorf 1.5 ml dimasukkan
sampel darah sebanyak 250-500 µl dan
ditambahkan dengan lysis buffer 1x volume
dikocok
sampai
homogen.
Campuran
disentrifugasi pada 6500 rpm selama 1 menit.
Pada endapan ditambahkan 200 µl rinse buffer,
dan divortex. Setelah itu 500 µl digestion
buffer ditambahkan pada tabung, dikocok
sampai homogen lalu diinkubasi pada suhu
55oC sampai semalam (± 16 jam). Setelah
inkubasi, 500 µl larutan fenol ditambahkan
pada supernatan, dikocok selama 20 menit,
lalu disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 3
menit. Supernatan dipindahkan ke dalam
tabung baru dan ditambah dengan Chloroform
isoamil alcohol (CIAA) sebanyak 500 µl
dikocok hingga homogen serta disentrifugasi
pada 13.000 rpm selama 3 menit. Supernatan
yang terbentuk dipindahkan ke dalam tabung
baru dan ditambahkan etanol absolut sebanyak
2x volume, disentrifugasi pada 13.000 rpm
selama 3 menit hingga terdapat endapan putih.
Endapan tersebut dicuci dengan menambahkan
alkohol 70% 1x volume dengan sentrifugasi
13.000 rpm selama 3 menit.
Endapan
kemudian dikeringkan pada suhu ruang.
Selanjutnya pada endapan ditambahkan Tris
EDTA (TE), disentrifugasi pelan dan
diinkubasi pada suhu 37oC selama 15 menit
lalu disimpan dalam freezer.
Uji kualitas DNA. DNA total yang telah
dipurifikasi kemudian dielektroforesis pada gel
agarose 1.2% menggunakan larutan buffer
1xTBE (89 mM Tris, 89 mM Asam Borat dan
2 mM EDTA, pH 8.0) dalam piranti submarine
electrophoresis
(Hoefer).
DNA
divisualisasikan
menggunakan
UV
Transluminator ( λ=260 nm).
Amplifikasi daerah Cytochrome b. Hasil
ekstraksi berupa DNA total digunakan sebagai
cetakan untuk mengamplifikasi daerah Cyt b.
Sepasang
primer
digunakan
untuk
mengamplifikasi daerah Cyt b yaitu M101 5’CAA ATC CTC ACA GGC CTA TTC CTA
GC -3’ (forwad), dan M102 5’-TAG GCG
AAT AGG AAA TAT CAT TCG GGT TGA
T-3’ (reverse). Pasangan primer ini
mengamplifikasi
dengan kondisi predenaturasi pada suhu 94oC selama 3 menit,
3
denaturasi pada suhu 94oC selama 30 detik,
anealing pada suhu 54oC selama 1 menit, elongasi
pada suhu 72oC selama 2 menit. Siklus ini
diulang sebanyak 35 kali, selanjutnya postelongasi pada suhu 72oC selama 5 menit. PCR
dilakukan
dengan
menggunakan
mesin
GeneAmp® PCR System 2400 (Perkin-Elmer).
Komposisi untuk tiap reaksi PCR terdiri dari
DNA total 2-5 µl (10-100 ng), 10x buffer PCR
mix 5 µl, 25 mM MgCl2 2 µl, 10 mM dNTP mix
1 µl, 25 pM primer M101 dan M102 masingmasing 2 µl, dan 5 unit/µl Tag DNA polymerase
0.2 µl dan air steril hingga volume total 50 µl.
Perunutan nukleotida dan analisis data.
DNA Cyt b produk PCR dirunut dengan
menggunakan mesin pengurut DNA otomatis ABI
Prism versi 3.4.1 (USA). Data perunutan yang
diperoleh disejajarkan (alignment) dengan
menggunakan perangkat lunak Genetix-Win versi
3.0 dan Clustal-W (Thompson et al. 1994).
Kemudian basa-basa asam amino gen penyandi
Cyt b diterjemahkan dengan menggunakan
Vertebrate mitochondrial translation code yang
terdapat dalam MEGA versi 3.0.
Sebagai pembanding dalam penelitian ini
digunakan nukleotida lengkap Gallus gallus
(Chicken) dari famili Phasianidae (nomor akses
NC007237, Desjardins & Morais 1990 ) dan
spesies famili Columbidae (Lampiran 6) yaitu:
Alectroenas madagascarensis dari famili
Columbidae
(Madagascar
blue-pigeon)
(AF483344, Shapiro et al. 2002), Didunculus
strigirostris dari famili Columbidae (tooth-billed
pigeon)
(AF483343, Shapiro et al. 2002),
Leptotila verreauxi fulviventri dari famili
Columbidae (white-tipped doves) (AF279704,
Clayton et al. 2003), Ptilinopus superbus dari
famili Columbidae (fruit-doves) (AF483329,
Shapiro et al. 2002), Columba livia dari famili
Columbidae (Rock Pigeon/common pigeon)
(AF182694, Johnson & Clayton 2000), Leptotila
megalura dari famili Columbidae (white-faced
dove) (AF182697, Johnson & Clayton 2000).
Analisis
rekonstruksi
filogenetik
menggunakan perangkat lunak MEGA versi 3.0
(Kumar et al. 2004) dengan menggunakan
bootstrapped Neighbor-Joining dengan 1000 kali
pengulangan.
cristata (m2, m3); 4 ekor G. scheepmakeri
(m4, m5, m6, m7) dan 1 ekor G. victoria (a1)
koleksi Laboratorium Biologi Molekuler.
Amplifikasi daerah Cyt b
Hasil amplifikasi Cyt b menggunakan
pasangan primer M101 dan M102 adalah
sepanjang 704 bp (Gambar 2) dari 1045
nukleotida (nt) Cyt b utuh G. cristata (nomor
akses AF182709) terletak pada situs ke-35
sampai dengan situs yang ke-738 (Johnson &
Clayton 2000).
* Marker 50 bp; cetak tebal produk PCR yang
dirunutkan yaitu m3 (G. cristata); m7 (G.
scheepmakeri); a1 (G. victoria).
Gambar 2 Hasil elektroforesis pada gel agarose
fragmen produk PCR (704 bp) dari
Cyt b burung Mambruk.
Analisis perunutan nukleotida Cyt b parsial
Delapan contoh darah yang diamplifikasi,
empat
di antaranya dirunut DNAnya
(sequencing) dan satu tidak digunakan sebagai
data karena banyak terdapat N. Fragmen
produk PCR sepanjang 704 bp yang dirunut
dengan mesin perunut otomatis ABI Prism
versi 3.4.1 didapat 382 nukleotida (nt) yang
jelas, tidak ambigius dan baik urutannya
(Lampiran 2). Setelah disejajarkan (alignment)
dengan nukleotida Cyt b Gallus gallus dari
GenBank dan spesies lain dari famili
Columbidae sebagai pembanding, didapat hasil
bahwa fragmen sepanjang 382 nt (Lampiran 4)
ini terletak pada situs ke-242 sampai dengan
situs ke-623 Cyt b utuh G. cristata GenBank
(Gambar 3).
tRNA-Thr
ND5
Sit b (1045 nt)
382 nt *
704 bp
HASIL
Hasil identifikasi pengamatan morfologi
setiap sampel dari Taman Burung/TMII (n=7)
didapatkan 1 ekor G. victoria (m1); 2 ekor G.
Primer M101
26 bp
Primer M102
31 bp
........ produk PCR situs ke 35-738
_ _ _ hasil perunutan situs ke 242-623
Gambar 3 Situs penempelan primer dan hasil
penjajaran nukleotida.
4
Hasil penjajaran sepanjang 382 nukleotida
paling banyak ditemukan fragmen tersebut adalah
nukleotida C (35.4%), diikuti dengan A (26.0%),
T (25.7%) dan yang paling sedikit adalah G
(12.9%). Komposisi pasangan nukleotida A+T
lebih tinggi pada G. cristata (52.8%), dan paling
rendah pada G. victoria 49.7% dengan rataan
51.7%, sedangkan untuk komposisi pasangan
nukleotida C+G lebih tinggi pada G. victoria
(50.3%) dan paling rendah pada G. cristata
(47.2%) dengan rataan 48.3% (Tabel 1).
Fragmen sepanjang 382 nukleotida ini
menyandikan 127 asam amino yaitu mulai dari
asam amino ke 81 sampai dengan asam amino ke
207 (situs acuan adalah asam amino hasil translasi
Cyt b utuh G. Cristata GenBank). Komposisi
basa ke-1 pada triplet kodon (nukleotida-1)
paling banyak ditemukan adalah nukleotida A
(28.1%) diikuti oleh nukleotida C (27.3%), T
(25.0%) dan G (22.7%). Komposisi basa ke-2
dari triplet kodon (nukleotida-2) paling banyak
(Tabel 1) adalah nukleotida T (42.5%) diikuti
oleh nukleotida C (26.0%), A (17.3%), G
(14.2%). Sedangkan untuk komposisi basa ke3 dari triplet kodon (nukleotida-3) yang paling
banyak (Tabel 1) adalah nukleotida C (53.7%)
diikuti dengan nukleotida A (32.8%), T
(11.0%), dan G (2.5%) (Tabel 1).
Tabel 1 Rataan komposisi nukleotida Cyt b parsial Goura sp. hasil penelitian, G. cristata GenBank,
dan G. victoria GenBank
1
2
3
4
5
R
T(U) C
A G
A+T
C+G
T-1 C-1 A-1 G-1
**
T-2 C-2 A-2 G-2
***
T-3 C-3 A-3 G-3
****
26.4
26.4
26.4
24.6
24.3
25.7
26.2
26.4
25.7
26.2
25.4
26.0
52.6
52.8
52.1
50.8
49.7
51.7
47.4
47.2
47.9
49.3
50.3
48.3
23.4 26.6 28.1 21.9
23.4 26.6 28.1 21.9
25.0 25.0 28.1 21.9
24.2 25.8 28.1 21.9
23.4 27.3 26.6 22.7
23.9 26.3 27.8 22.0
42.5 26.0 17.3 14.2
42.5 26.0 17.3 14.2
42.5 26.0 17.3 14.2
40.9 27.6 17.3 14.2
41.7 26.8 17.3 14.2
42.0 26.5 17.3 14.2
13.4 52.0
13.4 51.2
11.8 53.5
8.7 54.3
7.9 57.5
11.0 53.7
34.8
34.6
34.8
35.9
37.2
35.4
12.6
12.6
13.1
13.4
13.1
12.9
33.1
33.9
31.5
33.1
32.3
32.8
1.6
1.6
3.1
3.9
2.4
2.5
1. G. cristata*; 2. G. cristata._m3; 3. G. scheepmakeri._m7; 4. G. victoria_a1; 5. G. victoria*; R.Avg;
* GenBank; ** basa ke-1 dari triplet kodon; ** basa ke-2 dari triplet kodon *; **** basa ke-3 dari triplet kodon.
Hasil penjajaran (382 nt) nukleotida G.
victoria GenBank, G. cristata GenBank,
Goura sp. hasil penelitian terdapat 42 situs
nukleotida beragam yang terdapat dalam 40
situs asam amino (Tabel 2). Situs nukleotida
yang beragam merupakan hasil kejadian
substitusi basa ke-3 (paling banyak) diikuti
dengan substitusi basa ke-1, basa ke-2 dan
basa ke-1 dan 3 (Tabel 3).
Tabel 2 Situs kodon penyandi beserta asam amino yang mengalami perubahan pada Cyt b parsial dari
G. cristata GenBank, G. victoria GenBank, Goura sp. hasil penelitian
82
99
104
107
108
110
112
119
120
128
131
132
G.crist_GenB
G.crist_m3
G.scheep_m7
G.vict_a1
G.vict_GenB
AAC
...
...
..T
...
TAT
...
..C
..C
...
GGA
...
...
..G
...
TCA
...
..C
...
...
TTT
...
...
...
..C
GGT
...
..A
..A
..C
ACA
...
..G
...
...
TCC
...
...
C.A
...
GCC
...
..T
..T
..T
ATT
...
...
...
..C
TGA
...
...
...
..G
GCC
...
..T
...
...
Situs as.amino
82
99
104
107
108
110
112
119
120
128
131
132
134 139
G.crist_GenB
G.crist_m3
G.scheep_m7
G.vict_a1
G.vict_GenB
Situs ke (kodon)
G.crist_GenB
G.crist_m3
G.scheep_m7
G.vict_a1
G.vict_GenB
N
.
.
.
.
Y
.
.
.
.
G
.
.
.
.
S
.
.
.
.
F
.
.
.
.
G
.
.
.
.
T
.
.
.
.
S
.
.
P
.
A
.
.
.
.
I
.
.
.
.
W
.
.
.
.
A
.
.
.
.
G
.
.
.
.
Situs ke (kodon)
140 147
AAT
...
...
..C
..C
TTC
...
...
.C.
...
149
150
156
157
158
161
168
169
171
175
CTC
...
...
T..
...
CAC
...
...
..T
...
ATA
...
...
...
C..
ATT
...
...
..C
...
GCT
...
..C
...
..C
ACC
...
...
...
G..
TTA
...
...
C..
C..
CAT
...
..C
..C
..C
TCC
...
..T
...
...
AAT
...
..C
..C
..C
134 139
GGT
...
...
..C
...
GAT
...
...
..C
..C
D
.
.
.
.
177 178
CTA
...
...
T..
T..
GGC
...
...
...
..T
5
Situs as.amino
140 147
G.crist_GenB
G.crist_m3
G.scheep_m7
G.vict_a1
G.vict_GenB
N
.
.
.
.
F
.
.
S
.
149
150
156
157
158
161
168
169
171
175
177 178
L
.
.
F
.
H
.
.
.
.
M
.
.
.
L
I
.
.
.
.
A
.
.
.
.
T
.
.
.
A
L
.
.
.
.
H
.
.
.
.
S
.
.
.
.
N
.
.
.
.
L
.
.
.
.
180
183
184
G.crist_GenB
G.crist_m3
G.scheep_m7
G.vict_a1
G.vict_GenB
TCT
...
...
..C
...
TGC
...
...
..G
...
GAC
..A
..T
..T
..T
TTT
...
...
...
..C
CTA
...
...
T..
...
ATT
...
..C
..C
..C
Situs as.amino
180
183
184
192
194
197 198
G.crist_GenB
G.crist_m3
G.scheep_m7
G.vict_a1
G.vict_GenB
S
.
.
.
.
C
.
.
W
.
D
E
.
.
.
F
.
.
.
.
L
.
.
.
.
Situs ke (kodon)
192
194 197
I
.
.
.
.
198
200
201
202
205
207
CTT
...
T..
...
T.C
TTC
...
...
...
C..
ATA
...
...
.C.
.C.
CTA
...
..G
..G
...
CTC
...
...
...
..T
CTA
...
T..
...
...
200
201
202
205
207
F
.
.
.
L
M
.
.
T
T
L
.
.
.
.
L
.
.
.
.
L
.
.
.
.
L
.
F
.
F
G
.
.
.
.
Angka cetak tebal : situs as.amino yang berbeda pada Goura sp.
Huruf tebal, garis bawah : perubahn non-sinonimus (nukleotida berubah dan as.amino berubah).
Kodon ke-82 sama dengan asam amino ke-2 hasil penjajaran
Kodon ke-207 sama dengan asam amino ke-127 hasil penjajaran
Tabel 3 Jumlah dan posisi basa dari triplet kodon
Cyt b parsial (42 situs) G. cristata
GenBank, G. victoria GenBank dan
Goura sp. hasil penelitian
Basa
beragam
Ke-1
Ke-2
Ke-3
Ke-1 dan 3
Total
Jumlah
situs
nukleotida
Jumlah
Situs
asam amino
8
2
28
4
8 (6.29%)
2 (1.57%)
28 (22.04%)
2 (1.57%)
42 situs
40 situs
Kejadian substitusi transisi dan transversi
memberi kontribusi pada keragaman nukleotida
(Tabel 4). Kejadian substitusi transisi lebih besar
pada tingkat spesies daripada nilai transversi.
Sedangkan untuk tingkat genus umumnya nilai
transversi lebih besar (Kocher et al. 1989). Nilai
transisi terbesar 0.06 (G. victoria GenBank dan G.
victoria hasil penelitian tehadap G. cristata
GenBank; G. victoria GenBank terhadap G.
victoria hasil penelitian) dan nilai terkecil 0.00
antara G. cristata GenBank terhadap G. cristata
hasil penelitian dimana rata-rata kejadian
substitusi transisi sebesar 0.05. Sedangkan nilai
transversi terbesar 0.01 dan terkecil adalah 0.00
dengan rata-rata 0.01.
Tabel 4 Rataan transisi basa ke-1,2,3 (di
bawah diagonal) dan rataan transversi
basa ke- 1, 2, 3 (diatas diagonal) pada
Goura sp. hasil penelitian, G. cristata
GenBank dan G. victoria GenBank
1
1]G.crist_GenB
2]G.crist_m3
3]G.scheep_m
4]G.vict_a1
5]G.vict_GenB
0.00
0.03
0.06
0.06
2
3
0.00 0.01
0.01
0.03
0.05 0.05
0.05 0.05
4
5
0.01 0.00
0.01 0.01
0.01 0.01
0.01
0.06
Berdasarkan jumlah perbedaan nukleotida
didapatkan jarak genetik intraspesies Goura
sp. terhadap Gallus gallus paling kecil 0.26%
dan paling tinggi 21.99% dengan rata-rata
perbedaan nukleotida 10.73% (41 nt) (Tabel
5). Sedangkan untuk intraspesies Goura sp.
jarak genetik paling tinggi 7.07% dan paling
rendah 0.26% dengan rata-rata perbedaan
nukleotida sebesar 5.23% (20 nt).
6
Tabel 5 Jarak genetik nukleotida Cyt b parsial
(382 nt) G. cristata GenBank , G. victoria
GenBank, Goura sp. hasil penelitian dan
Gallus gallus sebagai pembanding
1
1]Gal.gallus*
2]G.crist*
3]G.crist-m3
4]G.sche-m7
5]G.vict-a1
6]G.vict*
0.2120
0.2147
0.2199
0.2068
0.2147
2
3
4
5
6
81
82
1
84
15
15
79
25
25
24
82
23
23
23
27
0.0026
0.0393 0.0393
0.0654 0.0654 0.0628
0.0602 0.0602 0.0602 0.0707
* data GenBank
Jarak genetik (dibawah diagonal) dengan
metode P-distance dan matriks perbedaan jumlah
nukleotida (diatas diagonal).
Filogram hasil rekonstruksi filogenetik
nukleotida Cyt b parsial (Gambar 4)
menunjukkan bahwa G. cristata GenBank, G.
victoria GenBank; Goura sp. hasil penelitian
mengelompok dalam satu percabangan yang
didukung dengan nilai bootstrap 99%. G.
cristata GenBank dan G. cristata hasil
penelitian berada dalam percabangan yang
sama yang didukung dengan nilai bootstrap
100%. Selanjutnya G. cristata berada dalam
cabang
yang bersebelahan dengan G.
scheepmakeri
diduk