The In Vitro Tetraploid Induction of Tangerine (Citrus nobilis Lour.) Using Colchicines.

INDUKSI TETRAPLOID JERUK SIAM SIMADU (Citrus nobilis
Lour.) MENGGUNAKAN KOLKISIN SECARA IN VITRO

FITRI YULIANTI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Induksi Tetraploid
Jeruk Siam Simadu (Citrus nobilis Lour.) Menggunakan Kolkisin secara In
Vitro adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir Tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.

Bogor, Januari 2014
Fitri Yulianti
NIM A253110131

RINGKASAN
FITRI YULIANTI. Induksi Tetraploid Jeruk Siam Simadu (Citrus nobilis Lour.)
Menggunakan Kolkisin secara In Vitro. Dibimbing oleh AGUS PURWITO,
DINY DINARTI dan ALI HUSNI.
Buah tanpa biji merupakan salah satu kriteria yang diperlukan untuk dapat
meningkatkan kualitas jeruk Siam Simadu. Metode yang paling efektif untuk
mendapatkan jeruk Siam Simadu tanpa biji adalah dengan cara menyilangkan
antara tetua tetraploid dan diploid. Tujuan penelitian ini adalah untuk
mendapatkan planlet jeruk Siam Simadu tetraploid yang akan dijadikan sebagai
tetua untuk menghasilkan jeruk Siam Simadu tanpa biji. Penelitian dilaksanakan
di Laboratorium Biologi Sel dan Jaringan BB-Biogen dan Laboratorium Micro
Technique Departemen Agronomi dan Hortikultura IPB, Bogor pada Bulan
Januari-Agustus 2013. Tunas pucuk tanpa daun, tunas samping tanpa daun dan
embrio somatik fase globular jeruk Siam Simadu diberikan perlakuan empat
konsentrasi kolkisin yang berbeda (0%, 0.1%, 0.2%, dan 0.3%) selama 3 jam
(tunas pucuk), 6 jam (tunas samping) dan 1 jam (globular).

Hasil penelitian induksi tetraploid tunas pucuk jeruk Siam Simadu secara in
vitro menunjukkan bahwa perlakuan kolkisin menurunkan pertumbuhan tunas
pucuk jeruk Siam Simadu. Daun tunas pucuk yang diberikan perlakuan kolkisin
lebih tebal dibandingkan dengan daun tunas pucuk kontrol. Jumlah kloroplas dari
daun tunas yang dihasilkan dari kontrol (kolkisin 0%) dan perendaman kolkisin
0.1% adalah 8.67 dan 18.25 kloroplas per pasang sel penjaga. Daun dari tunas
perlakuan kolkisin 0.1% memiliki ukuran stomata yang lebih besar dibandingkan
dengan tunas kontrol. Daun dari tunas perlakuan kolkisin 0.1% memiliki
kerapatan stomata yang lebih rendah dibandingkan dengan tunas kontrol. Tunas
jeruk Siam Simadu tetraploid dihasilkan pada perlakuan kolkisin 0.1%.
Hasil penelitian induksi tetraploid tunas samping jeruk Siam Simadu secara
in vitro menunjukkan bahwa tunas yang diberikan perlakuan kolkisin lebih tinggi
tanamannya dari pada tunas kontrol. Tunas yang diberikan perlakuan kolkisin
memiliki daun yang lebih lebar dari pada tunas kontrol. Daun tunas yang
diberikan perlakuan kolkisin lebih tebal dibandingkan dengan daun tunas kontrol.
Perlakuan kolkisin meningkatkan jumlah kloroplas per pasang sel penjaga. Daun
dari tunas yang diberikan perlakuan kolkisin memiliki ukuran stomata yang lebih
besar dibandingkan dengan tunas kontrol. Daun dari tunas yang diberikan
perlakuan kolkisin memiliki kerapatan stomata yang lebih rendah dibandingkan
dengan tunas kontrol.

Hasil penelitian induksi tetraploid embrio somatik jeruk Siam Simadu secara
in vitro menunjukkan bahwa perlakuan kolkisin dengan konsentrasi tinggi dapat
meningkatkan persentase planlet abnormal. Planlet tetraploid Jeruk Siam Simadu
dihasilkan pada perlakuan kolkisin 0.2% dan 0.3%.
Kata kunci: kloroplas, penggandaan kromosom, mutasi, stomata

SUMMARY
FITRI YULIANTI. The In Vitro Tetraploid Induction of Tangerine (Citrus nobilis
Lour.) Using Colchicines. Supervised by AGUS PURWITO, DINY DINARTI
and ALI HUSNI.
Seedless fruit is one of the criteria necessary to improve the quality of
Simadu tangerine. The most effective method to obtain seedless triploid cultivars
is hybridisation between tetraploid and diploid parents. The aim of this research
was to obtain tetraploid Simadu tangerine planlet which would serve as parent to
produced seedless Simadu tangerine. The experiment was conducted at Biology
Cell and Tissue Laboratory of BB-Biogen and Micro Technique Laboratory of
Agronomy and Horticulture Department, IPB, Bogor from January to August
2013. In vitro Simadu tangerine shoot-tips without leaves, lateral shoots without
leaves and somatic embryos globular phase were treated with colchicines at four
different concentrations (0%, 0.1%, 0.2%, and 0.3) for 3 hours (Shoot-tips), 6

hours (lateral shoots) and 1 hour (globular).
The result of in vitro tetraploid induction of tangerine shoot-tip showed that
colchicine treatments reduced growth of shoot-tip of Simadu Tangerine. The
leaves of colchicines treated shoots were thicker than control. Leaves from control
(0% colchicine) and 0.1% colchicine treated shoots had 8.67 and 18.25
chloroplasts per pair of guard cells. Leaves from 0.1% colchicine treated shoots
had stomata sizes were larger than control shoots. Leaves from 0.1% colchicine
treated shoots had stomata density was lower than control shoots. The tetraploid
Simadu tangerine shoots were produced by the treatment of 0.1% colchicine.
The result of in vitro tetraploid induction of tangerine shoot-tip showed that
the shoots of colchicines treated were taller than control. The shoots of colchicines
treated had leaves were wider than control. The colchicines treatments increased
numbers of chloroplasts per stomata guard cell. Leaves from colchicine treated
shoots had stomata sizes were larger than control shoots. Leaves from colchicine
treated shoots had stomata density was lower than control shoots.
The result of in vitro tetraploid induction of tangerine somatic embryos
showed that colchicine treatments with high concentration increased abnormal
planlet percentage. The tetraploid Simadu tangerine planlets were produced using
0.2% colchicine and 0.3% colchicine.
Keywords: chloroplasts, doubling chromosome, mutation, stomata

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

INDUKSI TETRAPLOID JERUK SIAM SIMADU (Citrus nobilis
Lour.) MENGGUNAKAN KOLKISIN SECARA IN VITRO

FITRI YULIANTI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada

Program Studi Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis :

Dr Ir Ni Made Armini Wiendi, MS

Judul Tesis : Induksi Tetraploid Jeruk Siam Simadu (Citrus nobilis Lour.)
Menggunakan Kolkisin secara In Vitro
Nama
: Fitri Yulianti
NIM
: A253110131
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

Dr Ir Agus Purwito, MScAgr
Ketua

Dr Ir Diny Dinarti, MS
Anggota

Dr Drs Ali Husni, MSi
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Pemuliaan dan
Bioteknologi Tanaman

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr Ir Yudiwanti Wahyu EK, MS

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian:
24 Desember 2013

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah Subhanahu Wa Ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari 2013 ini ialah
penggandaan kromosom, dengan judul Induksi Tetraploid Jeruk Siam Simadu
(Citrus nobilis Lour.) Menggunakan Kolkisin secara In Vitro. Bagian dari tesis ini
diajukan untuk diterbitkan di Jurnal Agronomi Indonesia dengan judul Induksi
Tetraploid Tunas Pucuk Jeruk Siam Simadu (Citrus nobilis Lour.) Menggunakan
Kolkisin secara In Vitro.
Ungkapan terima kasih penulis sampaikan kepada :
1. Ibu Sopiah, Ayah Mudro, Ka Faizah, Ka Fauzih, Adik Fajri, Ka Muslim, Ka
Lina, De Rifat serta seluruh keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya.
2. Dr Ir Agus Purwito, MScAgr, Dr Ir Diny Dinarti, MSi dan Dr Drs Ali Husni,
MSi selaku pembimbing.

3. Dr Ir Trikoesoemaningtyas, MSc selaku ketua program studi Pemuliaan dan
Bioteknologi Tanaman yang lama dan Dr Ir Yudiwanti Wahyu EK, MS selaku
ketua program studi Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman yang baru.
4. Dr Ir Ni Made Armini Wiendi, MS selaku penguji luar komisi pada ujian
Tesis.
5. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (DIKTI) yang memberikan beasiswa
unggulan calon dosen.
6. Lembaga Penelitian dan Pengembangan Masyarakat Institut Pertanian Bogor
atas sebagian biaya penelitian melalui Hibah Pascasarjana atas nama Dr Ir
Agus Purwito, MScAgr.
7. Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya
Genetik Pertanian (BB BIOGEN) yang memberikan fasilitas penelitian.
8. Dr Titien Ng. Praptosuwiryo dari LIPI Kebun Raya, Joko Mulyono teknisi
Laboratorium Micro Technique Departemen AGH IPB, serta Joko Tamami,
Dr Mia Kosmiatin, dan Prof Dr Ika Mariska, APU dari BB BIOGEN yang
telah memberi masukan pada penelitian tesis saya.
9. Tim Dosen Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, IPB
yang telah memberikan ilmu yang sangat bermanfaat.
10. Sahabatku Ony, Hoti, Nahrin, Arti, Nita, dan Nyun, teman-teman kosn,
teman-teman kerja dan bermain di AGH, serta teman-teman seperjuangan

Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman mbak winda, mbak eka, dan lain-lain.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Januari 2014
Fitri Yulianti

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vii

DAFTAR GAMBAR

vii

DAFTAR LAMPIRAN

ix

1 PENDAHULUAN

Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian

1
1
1
2
2
2

2 TINJAUAN PUSTAKA
Tanaman Jeruk

3
3

Jeruk Siam Simadu

4

Buah Jeruk Tanpa Biji

5

Perkembangan Penelitian Tanaman Jeruk Tetraploid

5

Induksi Mutasi Kromosom dengan Mutagen Kimia

6

Mitosis Sel Somatik

7

3 METODE
Bahan
Alat
Prosedur Analisis Data
Pelaksanaan Percobaan
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Kondisi Umum

8
8
9
9
9
12
12

Percobaan I. Induksi Tetraploid Tunas Pucuk Jeruk Siam Simadu
(Citrus nobilis Lour.) Menggunakan Kolkisin secara In Vitro

14

Percobaan II. Induksi Tetraploid Tunas Samping Jeruk Siam Simadu
Menggunakan Kolkisin secara In Vitro

21

Percobaan III. Induksi Tetraploid Embrio Somatik Jeruk Siam Simadu
Menggunakan Kolkisin secara In Vitro

27

Perbandingan antara Induksi Tetraploid Tunas Pucuk, Tunas Samping,
dan Embrio Somatik Jeruk Siam Simadu Menggunakan Kolkisin secara
In Vitro

30

Pembahasan Umum

30

5 SIMPULAN
Simpulan

33
33

DAFTAR PUSTAKA

33

LAMPIRAN

38

RIWAYAT HIDUP

42

DAFTAR TABEL
1

Jumlah dan panjang akar tunas pucuk jeruk Siam Simadu yang
diberikan perlakuan kolkisin pada media MS + vitamin MS + IBA 3
ppm selama satu bulan
2 Jumlah dan panjang akar tunas pucuk jeruk Siam Simadu yang
diberikan perlakuan kolkisin pada media MS + vitamin MS + NAA 3
ppm selama satu bulan
3 Pengaruh perlakuan konsentrasi kolkisin terhadap tebal daun dan
jumlah kloroplas per pasang sel penjaga
4 Pengaruh perlakuan konsentrasi kolkisin terhadap ukuran panjang
dan lebar stomata serta kerapatan stomata
5 Jumlah kloroplas daun pertama, ketiga, dan kelima tunas perlakuan
kolkisin 0.1%
6 Jumlah dan panjang akar tunas pucuk jeruk Siam Simadu yang
diberikan perlakuan kolkisin pada media MS + vitamin MS + IBA 3
ppm selama satu bulan
7 Jumlah dan panjang akar tunas pucuk jeruk Siam Simadu yang
diberikan perlakuan kolkisin pada media MS + vitamin MS + NAA 3
ppm selama satu bulan
8 Pengaruh perlakuan konsentrasi kolkisin terhadap tebal daun dan
jumlah kloroplas per pasang sel penjaga
9 Pengaruh perlakuan konsentrasi kolkisin terhadap ukuran panjang
dan lebar stomata serta kerapatan stomata
10 Persentase planlet normal dan abnormal yang dihasilkan setelah
perlakuan kolkisin
11 Persentase planlet diploid dan tetraploid yang dihasilkan setelah
perlakuan kolkisin
12 Jumlah kromosom planlet diploid dan tetraploid

18

18
19
20
21

26
26
26
27
28
29
29

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7

Bagan Alir kegiatan penelitian induksi tetraploid jeruk Siam Simadu
menggunakan kolkisin secara in vitro
Jeruk Siam Simadu (Balitjestro 2013)
Struktur kimia kolkisin (Matthew 1998)
(1) Tunas pucuk, (2) tunas samping, dan (3) embrio somatik fase
globular (kanan) in vitro jeruk Siam Simadu
Kondisi ruang kultur dan ruang tanam
(A) Daun kecil tunas pucuk, (B) buku (node) jeruk Siam Simadu
yang pendek, (C) globular yang memiliki ukuran beragam
(A) Tunas samping yang membentuk kalus hijau bertekstur kompak,
(B) tunas samping yang hanya membesar, (C) tunas samping yang
membentuk kalus putih bertekstur remah

3
4
7
9
12
13

13

8
9
10
11
12
13
14
15
16

17
18
19
20
21
22
23
24
25
26

27

28
29

(A) Embrio somatik yang membentuk kalus, (B) embrio somatik
yang membentuk akar
Kurva LD50 tunas pucuk jeruk Siam Simadu satu bulan setelah
perlakuan kolkisin
Tunas pucuk jeruk Siam Simadu yang mati akibat perlakuan kolkisin
Pertambahan tinggi tunas pucuk jeruk Siam Simadu pada umur
delapan minggu setelah perlakuan kolkisin
Jumlah daun tunas pucuk jeruk Siam Simadu pada umur delapan
minggu setelah perlakuan kolkisin
Jumlah buku tunas pucuk jeruk Siam Simadu pada umur delapan
minggu setelah perlakuan kolkisin
Panjang daun tunas pucuk jeruk Siam Simadu pada umur delapan
minggu setelah perlakuan kolkisin
Lebar daun tunas pucuk jeruk Siam Simadu pada umur delapan
minggu setelah perlakuan kolkisin
Tunas dengan perlakuan kolkisin (A) 0%, (B) 0.1%, (C) 0.2%, (D)
0.3%, tebal daun dengan perlakuan kolkisin (E) 0%, (F) 0.1%, (G)
0.2%, (H) 0.3%, stomata dengan perlakuan kolkisin (I) 0%, (J) 0.1%,
(K) 0.2%, (L) 0.3%
Daun pertama, daun ketiga, dan daun kelima tunas jeruk Siam
Simadu perlakuan kolkisin 0.1% yang dianalisis jumlah kloroplas
Struktur tunas pucuk (sel-sel meristematik, bakal daun yang lebih
muda, dan bakal daun yang lebih tua)
Kurva LD50 tunas samping jeruk Siam Simadu satu bulan setelah
perlakuan kolkisin
Tunas samping jeruk Siam Simadu yang mati akibat perlakuan
kolkisin
Rata-rata jumlah tunas baru yang muncul tunas samping jeruk Siam
Simadu pada umur delapan minggu setelah perlakuan kolkisin
Tinggi tunas yang baru muncul dari tunas samping jeruk Siam
Simadu pada umur delapan minggu setelah perlakuan kolkisin
Jumlah daun tunas yang baru muncul dari tunas samping jeruk Siam
Simadu pada umur delapan minggu setelah perlakuan kolkisin
Panjang daun tunas yang baru muncul dari tunas samping jeruk Siam
Simadu pada umur delapan minggu setelah perlakuan kolkisin
Lebar daun tunas yang baru muncul dari tunas samping jeruk Siam
Simadu pada umur delapan minggu setelah perlakuan kolkisin
Tunas baru yang muncul dari tunas samping jeruk Siam Simadu yang
berumur delapan minggu setelah perlakuan kolkisin (A) 0%, (B)
0.1%, (C) 0.2%, dan (D) 0.3%
Tebal daun tunas yang baru muncul dari tunas samping jeruk Siam
Simadu yang berumur delapan minggu setelah perlakuan kolkisin (A)
0%), (B) 0.1%, (C) 0.2%, dan (D) 0.3%
Stomata daun tunas yang baru muncul dari tunas samping jeruk Siam
Simadu yang berumur delapan minggu setelah perlakuan kolkisin (A)
0%), (B) 0.1%, (C) 0.2%, dan (D) 0.3%
Kurva LD50 embrio somatik jeruk Siam Simadu satu bulan setelah
perlakuan kolkisin

14
14
15
15
16
16
16
17

19
20
21
22
22
23
23
24
24
24

25

25

27
28

30 Planlet normal dari perlakuan kolkisin (A) 0%, (B) 0.1%, (C) 0.2%,
(D) 0.3% dan plenlet abnormal dari perlakuan kolkisin (E) 0.1%, (F)
0.2%, (G) 0.3%
31 Sel diploid 2n=2x=18 (atas) dan sel tetraploid 2n=4x=36 (bawah)
planlet jeruk Siam Simadu

29
29

DAFTAR LAMPIRAN
1.
2.
3.
4.

Komposisi media media dasar Murashige-Skoog (MS)
Komposisi vitamin Murashige-Skoog (MS)
Komposisi vitamin Morel and Wetmore (MW)
Hasil analisis sidik ragam peubah pertambahan tinggi tunas pucuk
jeruk Siam Simadu pada umur delapan minggu setelah perlakuan
kolkisin
5. Hasil analisis sidik ragam peubah jumlah buku tunas pucuk jeruk
Siam Simadu pada umur delapan minggu setelah perlakuan kolkisin
6. Hasil analisis sidik ragam peubah panjang daun tunas pucuk jeruk
Siam Simadu pada umur delapan minggu setelah perlakuan kolkisin
7. Hasil analisis sidik ragam peubah lebar daun tunas pucuk jeruk Siam
Simadu pada umur delapan minggu setelah perlakuan kolkisin
8. Hasil analisis sidik ragam peubah tinggi tunas yang baru muncul dari
tunas samping jeruk Siam Simadu pada umur delapan minggu setelah
perlakuan kolkisin
9. Hasil analisis sidik ragam peubah jumlah daun tunas yang baru
muncul dari tunas samping jeruk Siam Simadu pada umur delapan
minggu setelah perlakuan kolkisin
10. Hasil analisis sidik ragam peubah panjang daun tunas yang baru
muncul dari tunas samping jeruk Siam Simadu pada umur delapan
minggu setelah perlakuan kolkisin
11. Hasil analisis sidik ragam peubah lebar daun tunas yang baru muncul
dari tunas samping jeruk Siam Simadu pada umur delapan minggu
setelah perlakuan kolkisin

38
38
38

39
39
39
40

40

40
40

41

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Jeruk merupakan komoditas buah yang paling banyak diimpor di
Indonesia. Berdasarkan data dari Direktorat Jenderal Hortikultura (2013)
nilai impor jeruk Indonesia mencapai US $ 227.300.473. Jeruk impor lebih
diminati konsumen karena memiliki kriteria yaitu warna yang menarik,
kulitnya mudah dikupas, rasanya segar dan hampir tidak mempunyai biji
(seedless). Jeruk Siam Simadu merupakan jeruk Siam lokal yang hampir
mendekati kategori tipe jeruk yang sesuai dengan kriteria konsumen dan
pasar dunia untuk dikonsumsi dalam keadaan segar tetapi mempunyai biji
yang relatif banyak yaitu lebih dari 15 biji per buah sehingga kalah bersaing
dengan jeruk impor (Husni et al. 2010).
Perbaikan kualitas jeruk lokal yang sudah memiliki rasa dan warna
yang sesuai dengan kriteria konsumen dan pasar dapat dilakukan dengan
merakit tanaman jeruk lokal tersebut memiliki buah jeruk seedless. Jeruk
Siam (Citrus nobilis Lour) termasuk dalam kelompok jeruk dengan jumlah
kromosom 2n=2x=18. Menurut Wu dan Mooney (2002), metode yang
paling efektif untuk mendapatkan tanaman jeruk seedless atau triploid
(2n=3x=27) yaitu dengan cara menyilangkan tanaman jeruk tetraploid
(2n=4x=36) dengan tanaman jeruk diploid (2n=2x=18).
Tanaman jeruk tetraploid dapat dihasilkan dengan perlakuan kolkisin.
Menurut Takahira et al. (2011), kolkisin dapat digunakan untuk
menggandakan jumlah kromosom. Kolkisin dapat menghambat
pembentukan dan aktivitas benang-benang spindle pada saat pembelahan sel
mitosis serta mencegah inti dan sel membelah sehingga jumlah kromosom
sel mengganda (Ascough et al. 2008). Menurut Dhooghe et al. (2011),
penggandaan jumlah kromosom menggunakan kolkisin sangat tergantung
pada konsentrasi kolkisin yang diberikan, lama perendaman, dan jenis
eksplan.
Gmitter et al. (1991) berhasil mendapatkan tanaman jeruk tetraploid
Orlando Tangelo dengan menggunakan eksplan ovul yang diberi perlakuan
kolkisin 0.1% selama 21 hari. Berdasarkan penelitian Zeng et al. (2006),
perlakuan kolkisin 0.1% diberikan selama 4 hari pada kalus embrionik dapat
menghasilkan tanaman jeruk tetraploid Frost (Citrus sinensis Osbeck).
Aleza et al. (2009) dapat memperoleh tanaman jeruk tetraploid varietas
Clemenules dengan pemberian kolkisin 0.1% selama 3 jam pada
penyambungan tunas pucuk.
Perumusan Masalah
Jeruk Siam Simadu merupakan jeruk Siam lokal yang hampir
mendekati kategori tipe jeruk yang sesuai dengan kriteria konsumen dan
pasar dunia untuk dikonsumsi dalam keadaan segar. Buah jeruk ini
mempunyai biji yang banyak yaitu lebih dari 15 biji per buah sehingga kalah
bersaing dengan jeruk impor. Perbaikan kualitas jeruk lokal yang sudah
memiliki rasa dan warna yang sesuai dengan kriteria konsumen dan pasar

2
dapat dilakukan dengan merakit tanaman jeruk lokal tersebut memiliki buah
seedless.
Metode yang efektif digunakan untuk mendapatkan tanaman jeruk
seedless atau triploid (2n=3x=27) yaitu dengan cara menyilangkan tanaman
jeruk tetraploid (2n=4x=36) dengan tanaman jeruk diploid (2n=2x=18).
Tanaman jeruk tetraploid dapat dihasilkan dengan perlakuan kolkisin.
Kolkisin dapat digunakan untuk menggandakan jumlah kromosom dengan
cara menghambat pembentukan dan aktivitas benang-benang spindle pada
saat pembelahan sel mitosis serta mencegah inti dan sel membelah.
Penggandaan jumlah kromosom menggunakan kolkisin sangat tergantung
pada konsentrasi kolkisin yang diberikan, lama perendaman, dan jenis
eksplan.
Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan planlet jeruk
Siam Simadu tetraploid yang akan dijadikan sebagai tetua untuk
menghasilkan jeruk Siam Simadu seedless.
Manfaat Penelitian
Planlet jeruk Siam Simadu tetraploid yang diperoleh akan digunakan
sebagai tetua untuk merakit tanaman triploid melalui persilangan dalam
upaya mendapatkan buah jeruk Siam Simadu seedless.
Ruang Lingkup Penelitian
Rangkaian percobaan dilakukan untuk menjawab tujuan dari
penelitian (Gambar 1). Terdapat tiga percobaan yang dilaksanakan dari
bulan Januari 2013 sampai Agustus 2013 di Laboratorium Kultur Jaringan
Kelompok Peneliti Biologi Sel dan Jaringan, Balai Besar Penelitian dan
Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BBBIOGEN), Cimanggu, Bogor serta Laboratorium Micro Technique
Departemen Agronomi dan Hortikultura, IPB. Percobaan 1 adalah induksi
tetraploid tunas pucuk jeruk Siam Simadu secara in vitro menggunakan
kolkisin. Percobaan 2 adalah induksi tetraploid tunas samping jeruk Siam
Simadu secara in vitro menggunakan kolkisin. Percobaan 3 adalah induksi
tetraploid embrio somatik jeruk Siam Simadu secara in vitro menggunakan
kolkisin. Tiga set percobaan dilakukan untuk mendapatkan planlet jeruk
Siam Simadu tetraploid.

3

Percobaan 1
Induksi tetraploid
tunas pucuk jeruk
Siam Simadu

Percobaan 2
Induksi tetraploid
tunas samping jeruk
Siam Simadu

Percobaan 3
Induksi tetraploid
embrio somatik
jeruk Siam Simadu

Perlakuan
konsentrasi
kolkisin :
0%, 0.1%, 0.2%,
dan 0.3%
Lama perendaman
3 jam

Perlakuan
konsentrasi
kolkisin :
0%, 0.1%, 0.2%,
dan 0.3%
Lama perendaman
6 jam

Perlakuan
konsentrasi
kolkisin :
0%, 0.1%, 0.2%,
dan 0.3%
Lama perendaman
1 jam

Analisis tingkat ploidi

Planlet jeruk Siam Simadu tetraploid

Gambar 1 Bagan Alir kegiatan penelitian induksi tetraploid jeruk Siam
Simadu menggunakan kolkisin secara in vitro

2 TINJAUAN PUSTAKA
Tanaman Jeruk
Jeruk (Citrus sp) adalah tanaman buah tahunan yang berasal dari Asia.
Menurut Spiegel-Roy dan Goldschmidt (1996), China di percaya sebagai
tempat pertama kali jeruk tumbuh. Sejak ratusan tahun yang lalu, jeruk sudah
tumbuh di Indonesia baik secara alami maupun yang dibudidayakan. Jeruk
yang ada di Indonesia didatangkan dari Amerika dan Italia oleh orang Belanda
(Khan 2007). Daerah-daerah yang terkenal sebagai daerah pusat jeruk di
Indonesia diantaranya Garut (Jawa Barat), Tawamangu (Jawa Tengah), Batu
(Jawa Timur), Tejakula (Bali), Selayar (Sulawesi Selatan), Pontianak
(Kalimantan Barat), Brastagi (Sumatera Utara) dan Soe (Nusa Tenggara Timur)
(Martosupono et al. 2007).
Berbagai jenis jeruk banyak dijumpai dan dibudidayakan di Indonesia
mulai dari dataran rendah hingga dataran tinggi. Beberapa jenis jeruk
tersebut telah menjadi unggulan daerah maupun nasional seperti jeruk manis
Pacitan dari daerah Pacitan, Jawa Timur; jeruk manis Waturejo dari Jawa
Tengah; keprok SoE dari Nusa Tenggara Timur; Keprok Batu 55 dari Batu,
Jawa Timur; Siam Madu, Keprok Maga, dan Beras Sitepu dari Medan,
Sumut; Siam Pontianak dari Kalimantan Barat; dan Pamelo Nambangan, Sri

4
Nyonya, serta Magetan dari Magetan, Jawa Timur (Martasari dan Mulyanto
2008).
Jeruk merupakan sumber vitamin C yang sangat baik. Jus jeruk
mengandung asam askorbat 20-60 mg per 100 ml. Vitamin lain yang tak
kalah penting adalah vitamin A, tiamin, niasin, riboflavin, asam pantotenat,
biotin, asam folat, inositol, dan tokoferol. Kandungan vitamin A berkisar
antara 250-420 IU, tiamin 70-120 μg, asam folat 1.2 μg, dan inositol 135 mg
setiap 100 ml jus (BB Pascapanen 2009).
Jeruk Siam Simadu
Salah satu varietas atau jenis jeruk yang banyak disukai oleh
masyarakat adalah jeruk Siam. Jenis jeruk ini banyak disukai masyarakat
karena rasanya yang lebih manis dibanding jeruk keprok. Jeruk Siam dan
jeruk keprok sulit dibedakan karena mempunyai aroma daun yang sama,
ukuran bunga dan buah yang hampir sama (Badan Litbang Pertanian 2005).
Nama ilmiah jeruk siam adalah Citrus nobilis, dinamakan jeruk siam
karena berasal dari Siam (Thailand) (Deptan 1994). Klasifikasi botani
tanaman jeruk adalah sebagai berikut:
Divisi
: Spermatophyta
Sub Divisi
: Angiospermae
Kelas
: Dicotyledonae
Ordo
: Rutales
Famili
: Rutaceae
Subfamili
: Aurantioidae
Genus
: Citrus
Spesies
: Citrus nobilis Lour
Jeruk siam memiliki ciri khas yang tidak dimiliki jeruk keprok lainnya
karena mempunyai kulit yang tipis sekitar 2 mm, permukaannya halus dan
licin, mengkilap serta kulit menempel lebih lekat dengan dagingnya. Dasar
buahnya berleher pendek dengan puncak berlekuk. Tangkai buahnya pendek,
dengan panjang sekitar 3 cm dan berdiameter 2.6 mm. Biji buahnya
berbentuk ovoid, warnanya putih kekuningan dengan jumlah sekitar 20 biji.
Daging buahnya lunak dengan rasa manis dan harum. Bobot buah cukup
berat dengan berat per buah sekitar 75.6 g. Satu pohon rata-rata
menghasilkan sekitar 7.3 kg buah. Panen biasanya dapat dilakukan pada
bulan Mei – Agustus (Deptan 1994).

Gambar 2 Jeruk Siam Simadu (Balitjestro 2013)

5
Jeruk Siam Simadu (Gambar 2) berasal dari Sumatra Utara. Jeruk ini
memiliki rasa yang manis sedikit asam, ukuran buah sedang, warna daging
buah oranye, warna kulit buah kekuningan, dan tumbuh di dataran rendah
yaitu kurang dari 1200 mdpl (Balitjestro 2013). Ketinggian tempat
penanaman berpengaruh jelas terhadap rasa. Penanaman di atas 900 dpl
menyebabkan rasa buah jeruk siam menjadi sedikit asam (Deptan 1994).
Buah Jeruk Tanpa Biji (Seedless)
Seedless adalah merupakan sifat buah yang memiliki sedikit biji.
Menurut Khalil et al. (2011) jeruk dapat dikatakan seedless jika memiliki
biji kurang dari 5 biji per buah.Sifat seedless tersebut dapat diperoleh secara
alami pada beberapa jenis tanaman yang mempunyai kemampuan
membentuk buah dengan biji yang sangat sedikit tanpa adanya penyerbukan
dan pembuahan yang disebut dengan buah partenokarpi (Frost dan Soost
1968; Spiegel-Roy dan Goldschmidt 1996). Sifat tersebut merupakan sifat
yang mempunyai nilai ekonomi tinggi pada tanaman jeruk karena
merupakan karakter yang harus dimiliki buah jeruk konsumsi segar agar
dapat bersaing di pasar global (Spiegel-Roy dan Goldschmidt 1996; Cai et
al. 2007). Sifat tersebut juga merupakan salah satu objek penelitian yang
banyak dilakukan pada program pemuliaan tanaman jeruk, baik secara
konvensional maupun non konvensional (Nicotra 2007).
Metode yang paling efektif untuk mendapatkan tanaman jeruk tanpa
biji atau triploid (2n=3x=27) yaitu dengan cara menyilangkan tanaman jeruk
tetraploid (2n=4x=36) dengan tanaman jeruk diploid (2n=2x=18) (Wu dan
Mooney 2002; Grosser dan Chandler 2004; Reforgiato Recupero et al.
2005). Menurut Aleza et al. (2009), metode yang paling efektif untuk
mendapatkan tanaman jeruk triploid adalah dengan cara menyerbuki putik
kultivar tetraploid dengan pollen yang berasal dari varietas diploid.
Tanaman jeruk tetraploid dibutuhkan untuk menghasilkan buah jeruk tanpa
biji.
Perkembangan Penelitian Tanaman Jeruk Tetraploid
Tanaman jeruk tetraploid dapat dihasilkan dari 1) pembibitan nuselus
secara spontan (Barrett dan Hutchison 1978), 2) perlakuan kolkisin pada
meristem aksilar (Barrett 1974), 3) persilangan jeruk 2x × 4x (Cameron dan
Soost 1969), 4) variasi somaklonal yang terjadi secara spontan pada kultur
jaringan (Vardi 1981; Zhang 1985), dan 5) melalui hibridisasi somatik
(Kobayashi dan Ohgawara 1988; Grosser dan Gmitter 1990). Perlakuan
kolkisin banyak digunakan untuk menghasilkan tanaman jeruk tetraploid
karena cepat dan mudah.
Gmitter et al. (1991) berhasil mendapatkan tanaman jeruk tetraploid
Orlando Tangelo dengan menggunakan eksplan ovul yang diberi perlakuan
kolkisin 0.1% selama 21 hari. Mirza et al. (2003) melakukan poliploidisasi
pada empat kultivar embrio jeruk dengan menggunakan kolkisin 0.01% dan
0.10%. Berdasarkan penelitian Zeng et al. (2006), perlakuan kolkisin 0.1%
diberikan selama 4 hari pada kalus embrionik dapat menghasilkan tanaman

6
jeruk tetraploid Frost (Citrus sinensis Osbeck). Aleza et al. (2009) dapat
memperoleh tanaman jeruk tetraploid varietas Clemenules dengan
pemberian kolkisin 0.1% selama 3 jam pada penyambungan tunas pucuk.
Induksi Mutasi Kromosom dengan Mutagen Kimia
Pada dasarnya evolusi tanaman terjadi karena mutasi yang terus
menerus di alam. Oleh karena itu banyak yang beranggapan bahwa
keragaman yang ada sekarang terutama disebabkan oleh mutasi (Lubis
2005). Mutasi adalah perubahan pada materi genetik suatu organisme yang
terjadi secara tiba-tiba, acak, dan merupakan dasar bagi sumber variasi yang
bersifat terwariskan (heritable). Mutasi dapat terjadi secara spontan
(spontaneous mutation) dan dapat juga terjadi melalui induksi (induced
mutation). Secara mendasar tidak terdapat perbedaan antara mutasi yang
terjadi secara alami dan mutasi hasil induksi. Keduanya dapat menimbulkan
variasi genetik untuk dijadikan dasar seleksi tanaman, baik seleksi secara
alami (evolusi) maupun seleksi buatan (pemuliaan) (BATAN 2005).
Menurut Crowder (2006) mutasi adalah suatu proses dimana suatu gen
mengalami perubahan struktur. Dalam arti luas, mutasi dihasilkan dari
segala macam tipe perubahan bahan genetik yang mengakibatkan perubahan
penampakan fenotipe yang diturunkan yang bukan dihasilkan dari proses
seksual. Batasan ini termasuk keragaman kromosom dan position effect
maupun mutasi gen.
Bahan mutagen dapat secara kimia dan fisik. Mutasi fisik bersifat
sebagai radiasi pengion (ionizing radiation) yang dapat melepas energi
(ionisasi), begitu melewati atau menembus materi. Mutagen fisika termasuk
diantaranya sinar-X, radiasi gamma, radiasi beta, neutrons, dan partikel dari
akselerator sudah umum digunakan dalam pemuliaan tanaman. Mutagen
kimia pada umumnya berasal dari senyawa alkyl (alkylating agents)
misalnya seperti ethyl methane sulphonate (EMS), diethyl sulphate (DES),
methyl methane sulphonate (MMS), hydroxylamine, nitrous acids, acridines,
dan sebagainya. Beberapa mutagen kimia penting lainnya ialah gas metan,
asam nitrat, kolkisin, digitonin, hidroksil amin, akridin, etil etan sulfonat
(EES), 5-bromo urasil, 2-aminopurin.
Tanaman jeruk mempunyai jumlah kromosom 2n = 2x = 18, melalui
perlakuan kolkisin diharapkan terjadi ploidisasi kromosom untuk
menghasilkan tanaman jeruk Siam Simadu tetraploid. Kolkisin adalah suatu
alkaloid yang dihasilkan oleh tanaman krokus (Colchicum autumnale, L.)
yang banyak ditanam di Eropa, India, dan Afrika Utara (Snustad et al. 1997).
Lama waktu perendaman dan konsentrasi kolkisin akan mempengaruhi
terjadinya poliploidi. Poliploidi adalah keadaan suatu individu yang
memiliki lebih dari dua set kromosom (Welsh 1991; Snustad et al. 1997;
Griffiths et al. 1999). Poespodarsono (1988) melaporkan bahwa kepekaan
masing-masing spesies tanaman terhadap perlakuan kolkisin sangat berbeda.
Rumus kimia kolkisin adalah C22H25O6N dan merupakan senyawa alkaloid
yang mudah larut dalam air dan digunakan dalam konsentrasi rendah
(Gambar 3).

7

Gambar 3 Struktur kimia kolkisin (Matthew 1998)
Mitosis Sel Somatik
Mitosis merupakan pembelahan sel somatik. Setiap sel yang
membelah secara mitosis akan menghasilkan dua sel baru yang jumlah
kromosom dan kandungan genetiknya identik dengan sel asal
(Sastrosumarjo et al. 2006). Kolkisin merupakan inhibitor mitosis karena
dapat mengikat tubulin (suatu protein), konstituen utama mikrotubula.
Mikrotubula mempunyai fungsi dalam pembentukan benang spindle pada
mitosis. Kolkisin dapat menghambat pembentukan dan aktivitas benangbenang pembelahan pada saat mitosis, dimana pada tahap metafase
kromosom tidak bergerak ke arah dua kutubnya tetapi tetap berada di daerah
ekuator bahkan dapat kembali mengganda (Strickberger 1985).
Kolkisin dapat menyebabkan jumlah ploidi yang dihasilkan sel
berbeda dengan normalnya karena adanya perubahan jumlah kromosom.
Perubahan tersebut dapat karena komposisi molekul DNA suatu gen atau
pada benang kromatinnya. Perlakuan kolkisin dalam waktu yang makin
lama bisa menghasilkan pertambahan genom sebagai suatu deret ukur
seperti 4x, 8x, 16x dan seterusnya (Brewbaker 1983). Ciri-ciri fisik tunas
poliploid yang umum adalah meningkatnya ukuran sel, laju pertumbuhan sel
lambat, daun lebih tebal, bunga lebih besar dan sedikit, buah lebih besar,
serta menurunnya fertilitas pada berbagai tingkat dibandingkan dengan
tunas diploid (Griffith et al. 1999).
Kolkisin adalah senyawa antimitotik. Setiap organisme mempunyai
respons yang berbeda terhadap pemberian perlakuan kolkisin. Jika
konsentrasi larutan kolkisin dan lamanya waktu perlakuan kurang mencapai
keadaan yang tepat, maka poliploidi belum dapat diperoleh. Konsentrasi
terlalu tinggi akan menyebabkan kematian pada tanaman (Suryo 2007).
Menurut Welsh (1991) bahwa setiap tanaman memiliki ambang batas
maksimum untuk tingkat ploidinya, apabila melebihi batas tersebut
umumnya tanaman tidak normal, lemah atau tidak dapat hidup. Toleransi
setiap sel tanaman terhadap perlakuan kolkisin berbeda-beda.

8

3 METODE
Kegiatan penelitian dilaksanakan dari bulan Januari 2013 sampai
Agustus 2013. Tempat pelaksanaan penelitian in vitro dilakukan di
Laboratorium Kultur Jaringan Kelompok Peneliti Biologi Sel dan Jaringan,
Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya
Genetik Pertanian (BB-BIOGEN), Cimanggu, Bogor. Uji sitologi dilakukan
di Laboratorium Micro Technique, Departemen Agronomi dan Hortikultura,
Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini terdiri atas tiga
percobaan yaitu Induksi tetraploid tunas pucuk jeruk Siam Simadu secara in
vitro menggunakan kolkisin, Induksi tetraploid tunas samping jeruk Siam
Simadu secara in vitro menggunakan kolkisin, dan Induksi tetraploid embrio
somatik jeruk Siam Simadu secara in vitro menggunakan kolkisin.
Rancangan percobaan yang digunakan pada percobaan Induksi
tetraploid tunas pucuk jeruk Siam Simadu secara in vitro menggunakan
kolkisin yaitu Rancangan Kelompok Lengkap Teracak (RKLT) satu faktor
yaitu konsentrasi kolkisin. Konsentrasi kolkisin yang diberikan yaitu 0%,
0.1%, 0.2% dan 0.3%. Setiap perlakuan diulang sebanyak lima kali, satu
ulangan terdiri atas dua tunas pucuk jeruk yang ditanam dalam satu botol.
Tunas pucuk direndam pada larutan perlakuan kolkisin 0%, 0.1%, 0.2% dan
0.3% selama tiga jam.
Rancangan percobaan yang digunakan pada percobaan Induksi
tetraploid tunas samping jeruk Siam Simadu secara in vitro menggunakan
kolkisin yaitu Rancangan Kelompok Lengkap Teracak (RKLT) satu faktor
yaitu konsentrasi kolkisin. Konsentrasi kolkisin yang diberikan yaitu 0%,
0.1%, 0.2% dan 0.3%. Setiap perlakuan diulang sebanyak sepuluh kali, satu
ulangan terdiri atas dua tunas samping jeruk yang ditanam dalam satu botol.
Tunas pucuk direndam pada larutan perlakuan kolkisin 0%, 0.1%, 0.2% dan
0.3% selama enam jam.
Rancangan percobaan yang digunakan pada percobaan Induksi
tetraploid embrio somatik jeruk Siam Simadu secara in vitro menggunakan
kolkisin yaitu Rancangan Kelompok Lengkap Teracak (RKLT) satu faktor
yaitu konsentrasi kolkisin. Konsentrasi kolkisin yang diberikan yaitu 0%,
0.1%, 0.2% dan 0.3%. Setiap perlakuan diulang sebanyak lima kali, satu
ulangan terdiri atas lima embrio somatik jeruk yang ditanam dalam satu
botol. Embrio somatik direndam pada larutan perlakuan kolkisin 0%, 0.1%,
0.2% dan 0.3% selama satu jam.
Bahan
Bahan tanaman yang digunakan yaitu tunas pucuk, tunas samping, dan
embrio somatik fase globular in vitro jeruk Siam Simadu (Gambar 4). Bahan
media yang digunakan adalah media dasar Murashige-Skoog (MS), vitamin
MS, vitamin Morel and Wetmore (MW) dan ekstrak malt (EME) 0.5 g L-1.
Zat pengatur tumbuh yang digunakan adalah IBA (Indole 3-Butyric Acid),
TDZ (Thidiazuron) dan NAA (Naphthalene Acetic Acid). Bahan mutasi
yang digunakan yaitu kolkisin C22 H25O6N (SIGMA). Bahan untuk analisis

9
sitologi yang digunakan yaitu Aceto orcein 2%, 8-hydroxyquinolin 0.002 M,
HCL 1.0 N, CH3COOH 45%, cat kuku bening dan aquades.

1

3

2

Gambar 4 (1) Tunas pucuk, (2) tunas samping, dan (3) embrio somatik fase
globular (kanan) in vitro jeruk Siam Simadu
Alat
Peralatan yang digunakan yaitu gelas ukur, labu takar, erlenmeyer,
gelas piala, pipet volumetrik, magnetic stirer, spatula, hot plate, botol kultur,
corong, timbangan analitik, pH meter, autoclave, oven, Laminar Air Flow
Cabinet, cawan petri, lampu bunsen, pinset, hand sprayer, pisau, gunting,
shaker, milipore 0.20 µm, jarum suntik, pensil, silet, cover glass, gelas
arloji, dan mikroskop Olympus BX51.
Prosedur Analisis Data
Analisis data menggunakan uji F. Apabila hasil uji F berbeda nyata,
maka dilakukan uji lanjut DMRT (Duncan’s Multiple Range Test) pada taraf
nyata 5%. Pengolahan data menggunakan program Statistic Analysis System
(SAS 9.1.3 portable). Penghitungan tebal daun, jumlah kloroplas pada sel
penjaga (guard cell), kerapatan stomata, ukuran stomata, dan jumlah
kromosom dengan menggunakan microsoft office excel serta dihitung ratarata dan standar deviasinya.
Pelaksanaan Percobaan
Pembuatan larutan kolkisin dilakukan dengan cara melarutkan
kolkisin ke dalam aquades steril, pH larutan tersebut diukur hingga 5.6.
Larutan kontrol merupakan aquades steril yang diukur pH hingga 5.6.
Sterilisasi larutan kolkisin dan kontrol menggunakan milipore 0.20 µm di
dalam laminar.
Pembuatan media dilakukan dengan cara menimbang hara makro MS,
hara mikro MS, vitamin MW, vitamin MS dan zat pengatur tumbuh (IBA,
TDZ, dan NAA) sesuai dengan takaran, lalu dibuat larutan stok dengan
jumlah volume tertentu. Setiap satu liter media dibuat dengan cara
mencampurkan larutan stok hara makro MS dan hara mikro MS
menggunakan pipet. Campurkan vitamin ke dalam larutan tersebut.
Tambahkan zat pengatur tumbuh apabila digunakan. Gula pasir sebanyak

10
30 g L-1 ditambahkan pada campuran larutan stok. Apabila media yang
dibuat menggunakan EME 0.5 g L-1, maka ditambahkan ke dalam campuran
larutan stok. Aquades ditambahkan sampai volume campuran larutan stok
mencapai hampir 1 liter. Campuran larutan stok diukur pH hingga 5.8.
Campuran larutan stok ditambahkan 2.5 g L-1 phytagel sebagai pemadat.
Campuran larutan stok dimasak dan terus diaduk sampai mendidih. Media
campuran tersebut dimasukkan ke dalam botol-botol sebanyak 25 ml per
botol lalu ditutup dengan alumunium foil. Alumunium foil penutup botol
diberi kode, kemudian media disterilisasi dalam autoclave selama 15 menit
pada suhu 121 oC. Media yang telah disterilisasi disimpan di ruang media
pada suhu 16 oC.
Planlet (tunas pucuk dan tunas samping) dan embrio somatik jeruk
Siam Simadu diletakkan dalam ruang gelap selama satu malam kemudian
diletakkan kembali ke ruang terang pada pukul 07.00. Perlakuan kolkisin
dilakukan pada pukul 09.00. Hal ini dilakukan agar perlakuan kolkisin tepat
diberikan saat pembelahan mitosis terjadi sehingga dapat menghambat
pembentukan benang-benang spindle serta mencegah inti dan sel membelah
sehingga jumlah kromosom sel mengganda.
Percobaan I. Induksi Tetraploid Tunas Pucuk Jeruk Siam Simadu
(Citrus nobilis Lour.) Menggunakan Kolkisin secara In Vitro
Induksi tetraploid tunas pucuk jeruk Siam Simadu menggunakan
kolkisin secara in vitro dilakukan dengan cara merendam tunas tanpa daun
pada larutan perlakuan kolkisin yaitu 0%, 0.1%, 0.2% dan 0.3% yang
disterilisasi dengan milipore selama 3 jam. Tunas yang telah diberi
perlakuan kolkisin kemudian dibilas dengan aquades steril dan dikeringkan
dengan kertas saring lalu ditanam pada media recovery (MS + vitamin MW
+ EME 0.5 g L-1) dan diletakkan dalam ruang terang selama dua minggu
kemudian disubkultur ke media pertumbuhan (MS + vitamin MW) dan
diletakkan dalam ruang terang. Induksi akar dilakukan dengan
menggunakan media MS + vitamin MS + IBA 3 ppm dan media MS +
vitamin MS + NAA 3 ppm. Pengamatan yang dilakukan adalah LD50
(Lethal Dose), pertambahan tinggi tunas, jumlah buku, jumlah daun baru
yang terbentuk, panjang, lebar dan tebal daun (diukur pada bagian tengah
daun), panjang akar, jumlah akar, dan analisis stomata (jumlah kloroplas,
kerapatan stomata, serta ukuran panjang dan lebar stomata pada sel penjaga)
Analisis stomata dilakukan dengan memotong daun. Bagian atas daun
diletakkan pada gelas arloji dan ditetesi aquades. Bagian atas daun dikerok
dengan hati-hati menggunakan silet sampai menghasilkan lapisan yang tipis.
Lapisan tipis daun yang dihasilkan kemudian dibalik dan ditetesi aquades
secukupnya lalu ditutup dengan cover glass. Sekeliling cover glass diberi cat
kuku bening dan dikeringkan. Preparat diamati menggunakan mikroskop
pada perbesaran 10 x 100. Pengamatan dilakukan pada lima bidang pandang
yang dipilih secara acak.

11
Percobaan II. Induksi Tetraploid Tunas Samping Jeruk Siam Simadu
Menggunakan Kolkisin secara In Vitro
Induksi tetraploid tunas samping jeruk Siam Simadu menggunakan
kolkisin secara in vitro dilakukan dengan cara merendam tunas samping
tanpa daun pada larutan perlakuan kolkisin yaitu 0%, 0.1%, 0.2% dan 0.3%
yang disterilisasi dengan milipore selama 6 jam. Tunas yang telah diberi
perlakuan kolkisin kemudian dibilas dengan aquades steril dan dikeringkan
dengan kertas saring lalu ditanam pada media recovery (MS + vitamin MW
+ EME 0.5 g L-1) dan diletakkan dalam ruang terang selama dua minggu
kemudian disubkultur ke media pertumbuhan (MS + vitamin MS + TDZ 0.2
ppm) dan diletakkan dalam ruang terang. Induksi akar dilakukan dengan
menggunakan media MS + vitamin MS + IBA 3 ppm dan media MS +
vitamin MS + NAA 3 ppm. Pengamatan yang dilakukan adalah LD50
(Lethal Dose), pertambahan tinggi tunas, jumlah buku, jumlah daun baru
yang terbentuk, panjang, lebar dan tebal daun (diukur pada bagian tengah
daun), dan analisis stomata (jumlah kloroplas, kerapatan stomata, serta
ukuran panjang dan lebar stomata pada sel penjaga)
Percobaan III. Induksi Tetraploid Embrio Somatik Jeruk Siam Simadu
Menggunakan Kolkisin secara In Vitro
Induksi tetraploid embrio somatik jeruk Siam Simadu menggunakan
kolkisin secara in vitro dilakukan dengan cara merendam embrio somatik
pada larutan perlakuan kolkisin yaitu 0%, 0.1%, 0.2% dan 0.3% yang
disterilisasi dengan milipore selama 1 jam. Embrio somatik yang telah
diberi perlakuan kolkisin kemudian dibilas dengan aquades steril dan
dikeringkan dengan kertas saring lalu ditanam pada media recovery
(pemulihan) dan disimpan dalam ruang terang selama dua minggu kemudian
disubkultur ke media yang sama dan disimpan dalam ruang terang.
Pengamatan yang dilakukan adalah LD50 (Lethal Dose), persentase planlet
normal dan abnormal, jumlah kromosom serta persentase planlet diploid dan
tetraploid.
Analisis kromosom dilakukan dengan cara mengambil ujung akar
jeruk yang tampak aktif, biasanya berbentuk normal dengan ujung akar
bening keputihan lebih kurang 1 cm (di dalam laminar). Ujung akar berasal
dari planlet jeruk Siam Simadu yang diletakkan dalam ruang gelap selama
satu malam kemudian diletakkan kembali dalam ruang terang selama 30
menit. Ujung akar dimasukkan ke dalam air dan dibersihkan dari agar-agar
media. Ujung akar yang telah bersih dimasukkan ke dalam botol yang
dilapisi alumunium foil dan berisi 8-hydroxyquinolin 0.002 M. Botol
tersebut disimpan di lemari es yang tertutup rapat dan tidak terkena cahaya
selama 24 jam. Ujung akar dimasukkan ke dalam CH3COOH 45% selama
10 menit. Ujung akar diangkat dan dimasukkan ke dalam botol yang berisi
larutan 1 N HCL : 45% CH3COOH dengan perbandingan 3 : 1 (v/v) pada
suhu 60 oC menggunakan waterbath selama 3 menit. Ujung akar diangkat
dan dimasukkan ke dalam Aseto orcein 2% selama 20 menit. Aseto orcein
2% diteteskan ke gelas arloji. Ujung akar dipotong sekitar 1-2 mm dan

12
letakkan di gelas arloji yang telah ditetesi aseto orcein 2% kemudian ditutup
dengan cover glass. Cover glass ditekan dengan tangan agar tidak bergeser
dan dipukul-pukul menggunakan ujung penghapus pensil agar sel-sel
terpisah. Bersihkan sisa aseto orcein 2% yang menempel diluar cover glass
menggunakan kertas saring kemudian dipanaskan sedikit menggunakan api
bunsen. Cover glass ditekan halus dan dihangatkan lagi sedikit. Sekeliling
cover glass diberikan cat kuku bening dan dikeringkan agar tidak bergeser.
Preparat diamati menggunakan mikroskop pada perbesaran 10 x 100.
Pengamatan dilakukan pada lima sel dari setiap preparat

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Kondisi Umum
Planlet (tunas pucuk dan tunas samping) dan embrio somatik jeruk
Siam Simadu yang digunakan pada penelitian ini berasal dari planlet dan
embrio somatik yang tersedia di Laboratorium Biologi Sel dan Jaringan,
BB-Biogen. Planlet dan embrio somatik tersebut berasal dari nuselus yang
diisolasi dari buah muda jeruk Siam Simadu yang telah berumur 30-90 hari
setelah anthesis. Tunas pucuk, tunas samping, dan embrio somatik jeruk
Siam Simadu yang telah diberikan perlakuan kolkisin disimpan pada ruang
kultur dengan penyinaran menggunakan lampu 20 watt selama 16 jam/hari
dengan intensitas cahaya rata-rata 1500-2000 lux, dengan suhu 16-20 oC.
Laboratorium tempat dilakukannya penelitian sangat menjaga kestabilan
suhu ruang kultur supaya tetap terjaga pada kisaran 16 - 20oC (Gambar 5).
Kestabilan suhu ruang kultur tersebut dibantu dengan kondisi Air
Conditioner (AC) yang tetap dihidupkan selama 24 jam.

Gambar 5 Kondisi ruang kultur dan ruang tanam
Tingkat kontaminasi yang terjadi cukup tinggi. Kontaminasi
merupakan gangguan utama yang terjadi pada eksplan yang ditanam secara
in vitro. Kontaminasi pada media mengganggu pertumbuhan eksplan
bahkan dapat menyebabkan kematian. Kontaminasi disebabkan oleh
cendawan dan bakteri yang tumbuh di permukaan media atau disekeliling

13
eksplan. Keberadaan cendawan ditandai dengan munculnya cendawan
berwarna putih, hijau, dan hitam di permukaan media. Kemungkinan
terjadinya kontaminasi disebabkan oleh larutan kolkisin yang kurang steril,
wadah yang digunakan untuk menyimpan larutan kolkisin kurang steril,
kertas saring yang digunakan kurang steril, eksplan belum benar-benar
kering ketika ditiriskan saat perlakuan sehingga media menjadi berair dan
meyebabkan kontaminasi.
Kendala yang terjadi secara umum saat penelitian adalah kesulitan
mengukur pH larutan kolkisin hingga 5.6. Kendala yang terjadi saat induksi
tetraploid tunas pucuk adalah kesulitan memotong daun terkecil tunas pucuk
karena apabila tidak hati-hati meristem apikal akan ikut terpotong (Gambar
6 A). Pemotongan daun ini bertujuan agar kolkisin mudah masuk ke dalam
sel-sel meristem apikal dan mengurangi terjadinya kimera. Kendala yang
terjadi saat induksi tetraploid tunas samping adalah kesulitan memotong
tunas samping apabila tidak hati-hati meristem akan ikut terpotong karena
kebanyakan planlet jeruk Siam Simadu yang tersedia memiliki buku (node)
yang pendek (Gambar 6 B). Kendala yang terjadi saat induksi tetraploid
embrio somatik adalah globular yang memiliki ukuran beragam sehingga
sulit memilih globular dengan ukuran yang sama agar keragaman yang
dihasilkan dari percobaan ini sedikit (Gambar 6 C).

Gambar 6 (A) Daun kecil tunas pucuk, (B) buku (node) jeruk Siam Simadu
yang pendek, (C) globular yang memiliki ukuran beragam

Gambar 7 (A) Tunas samping yang membentuk kalus hijau bertekstur
kompak, (B) tunas samping yang hanya membesar, (C) tunas
samping yang membentuk kalus putih bertekstur remah

14
Beberapa tunas samping tidak membentuk tunas baru tetapi
membentuk kalus atau hanya membesar (Gambar 7 B). Kalus yang
terbentuk berwarna hijau bertekstur kompak (Gambar 7 A) dan putih
kekuningan bertekstur remah (Gambar 7 C). Beberapa embrio somatik
(globular) tidak berkecambah tetapi membentuk kalus (Gambar 8 A),
beberapa kalus tersebut kembali membentuk embrio lalu berkecambah, serta
beberapa embrio somatik berakar dan tidak berkecambah (Gambar 8 B).

Gambar 8 (A) Embrio somatik yang membentuk kalus, (B) embrio somatik
yang membentuk akar
Percobaan I. Induksi Tetraploid Tunas Pucuk Jeruk Siam Simadu
(Citrus nobilis Lour.) Menggunakan Kolkisin secara In Vitro
Nilai LD50 dapat diperoleh dengan menghitung pola respon kematian
tanaman terhadap berbagai konsentrasi kolkisin yang diberikan. Gambar 9
memperlihatkan bahwa semakin tinggi konsentrasi kolkisin, maka semakin
tinggi persentase tunas pucuk jeruk yang mati. Pola respon kematian tunas
pucuk jeruk terhadap berbagai konsentrasi kolkisin menghasilkan respon
linear. Persamaaan respon kematian tunas pucuk jeruk terhadap berbagai
konsentrasi kolkisin yaitu y = 270x - 3, nilai LD50 diperoleh pada
konsentrasi kolkisin sebesar 0.2%.

Gambar 9 Kurva LD50 tunas pucuk jeruk Siam Simadu satu bulan setelah
perlakuan kolkisin

15
Meningkatnya persentase tunas pucuk yang mati disebabkan karena
larutan kolkisin yang bersifat racun dapat merusak sel-sel tanaman. Menurut
Suryo (2007), konsentrasi kolkisin yang terlalu tinggi akan menyebabkan
kematian pada tanaman. Kematian tunas pucuk ini terjadi beberapa hari
setelah perlakuan kolkisin, tunas pucuk jeruk yang awalnya berwarna hijau,
kemudian berubah perlahan menjadi warna coklat dan mati (Gambar 10).

Gambar 10 Tunas pucuk jeruk Siam Simadu yang mati akibat perlakuan
kolkisin

Pertambahan tinggi tunas (cm)

Perlakuan konsentrasi kolkisin memberikan pengaruh yang berbeda
nyata terhadap pertambahan tinggi, jumlah daun, jumlah buku, panjang daun
dan lebar daun tunas jeruk Siam Simadu. Induksi tetraploid menggunakan
kolkisin menurunkan pertumbuhan tunas jeruk Siam Simadu. Hal ini terlihat
dari perlakuan kolkisin menghasilkan pertambahan tinggi, jumlah daun,
jumlah buku, panjang daun dan lebar daun yang lebih rendah dibandingkan
dengan tunas kontrol (kolkisin 0%) (Gambar 11, Gambar 12, Gambar 13,
Ga