PENGHAMBATAN QUORUM SENSING PADA Pseudomonas aeruginosa OLEH EKSTRAK Alpinia galanga L
PENGHAMBATAN QUORUM SENSING PADA Pseudomonas
aeruginosa OLEH EKSTRAK Alpinia galanga L
TESIS
Disusun untuk memenuhi sebagian persyaratan
guna memperoleh gelar Magister Sains
Program Studi Biosains
oleh :
Didik Wahyudi
S-900908003
PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS SEBELAS MARET
SURAKARTA
2010
i
PENGHAMBATAN QUORUM SENSING PADA Pseudomonas
aeruginosa OLEH EKSTRAK Alpinia galanga L
TESIS
Oleh :
Didik Wahyudi
S-900908003
Telah disetujui oleh Tim Pembimbing
Pada tanggal 5 Agustus 2010
Komisi
Pembimbing
Pembimbing I
Nama
Tanda Tangan
Prof. Drs. Sutarno, M.Sc. Ph.D
Tanggal
5 Agustus 2010.
NIP. 196008091986121001.
Pembimbing II Dr. Artini Pangastuti, M.Si.
NIP. 197505312000032001.
Mengetahui
Ketua Program Studi Biosains
Program Pascasarjana
Dr. Sugiyarto, M.Si.
NIP. 196704301992031002.
ii
5 Agustus 2010.
PENGHAMBATAN QUORUM SENSING PADA Pseudomonas
aeruginosa OLEH EKSTRAK Alpinia galanga L
TESIS
Oleh :
Didik Wahyudi
S-900908003
Telah dipertahankan di depan penguji
Dinyatakan telah memenuhi syarat
Pada tanggal
Jabatan
Ketua
Agustus 2010
Nama
Tanda Tangan
Prof. Drs. Suranto, M.Sc, Ph.D
Tanggal
..................... ... Agustus 2010
NIP. 195708201985031004.
Sekretaris
Dr. Sugiyarto, M.Si.
..................... ... Agustus 2010
NIP. 196704301992031002.
Anggota Penguji. Prof. Drs. Sutarno, M.Sc., Ph.D
.................... ... Agustus 2010
NIP. 196008091986121001.
Dr. Artini Pangastuti, M.Si.
..................... ... Agustus 2010
NIP. 197505312000032001.
Mengetahui
Direktur Program Pascasarjana UNS
Ketua Program Studi Biosains
Prof. Drs. Suranto, M.Sc., Ph.D.
Dr. Sugiyarto, M.Si.
NIP. 195708201985031004.
NIP. 196704301992031002
iii
PERNYATAAN ARISINALITAS DAN PUBLIKASI TESIS
Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa :
1. Tesis yang berjudul Penghambatan Quorum Sensing pada Pseudomonas
aeruginosa oleh Alpinia galanga L ini adalah karya penelitian saya sendiri dan
tidak terdapat karya ilmiah yang pernah diajukan oleh orang lain untuk
memperoleh gelar akademik serta tidak terdapat karya atau pendapat yang
pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain kecuali yang secara tertulis di
kutip dalam naskah ini dan disebutkan dalam sumber kutipan dan daftar
pustaka. Apabila ternyata di dalam naskah Tesis ini dapat dibuktikan terdapat
unsur-unsur jiplakan, maka saya bersedia Tesis beserta gelar MAGISTER
saya dibatalkan, serta diproses sesuai dengan peraturan perundang-undangan
yang berlaku (UU No. 20 tahun 2003, pasal 25 ayat 2 dan pasal 70).
2. Tesis ini merupakan hak milik Prodi Biosains PPs-UNS. Publikasi sebagian
atau keseluruhan isi Tesis pada jurnal atau forum ilmiah lain harus seijin Ketua
Prodi Biosanis PPs-UNS dan minimal satu kali publikasi menyertakan tim
pembimbing sebagai Author. Apabila dalam waktu sekurang-kurangnya satu
semester (6 bulan sejak pengesahan Tesis) saya tidak melakukan publikasi
dari sebagian atau keseluruhan tesis ini, maka Prodi Biosains PPs-UNS berhak
mempublikasikannya pada jurnal ilmiah yang diterbitkan oleh Prodi Biosains
PPS-UNS, Apabila saya melakukan pelanggaran dari ketentuan publikasi ini,
maka saya bersedia mendapatkan sanksi akademik yang berlaku.
Surakarta,
Agustus 2010
Mahasiswa
Didik Wahyudi.
iv
KATA PENGANTAR
Puji syukur ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa, atas berkat dan kasih
karuniaNya, maka penulis dapat menyajikan tulisan Tesis yang berjudul:
Penghambatan Quorum Sensing Pada Pseudomonas aeruginosa oleh Ekstrak
Alpinia galanga L. Penelitian ini diawali dengan karakterisasi rimpang A. galanga L
(Lengkuas) dan isolasi P. aeruginosa dari sampel klinis di Rumah Sakit Dr.
Moewardi, kemudian dilakukan pengujian awal terhadap kemampuan ekstrak
A. galanga L dalam menghambat sistem quorum sensing P. aeruginosa dengan
menggunakan indikator produksi enzim eksoproteasenya, karena produksi enzim
tersebut diatur oleh sistem quorum sensing bakteri.
Sistem quorum sensing pada P. aeruginosa diawali dari syarat minimal
jumlah bakteri yang harus ada di dalam suatu lingkungan, yaitu 107 – 108 sel,
kemudian bakteri akan terpicu untuk mengeluarkan faktor virulensinya, pada
kondisi yang optimal bisa sampai membentuk biofilm.
Setelah ditemukan
konsentrasi ekstrak A. galanga L yang bisa menghambat produksi enzim
eksoprotease secara kualitatif dilanjutkan uji secara kauntitatif, juga dilakukan
perhitungan terhadap jumlah bakteri pada konsentrasi tersebut. Di dalam tulisan
ini, disajikan pokok-pokok bahasan yang meliputi pengukuran parameterparameter diatas yaitu jumlah bakteri, produksi enzim baik secara kualitatif
maupun luantitatif dan pembentukan biofilmya.
Nilai penting penelitian ini adalah menemukan alternatif bahan antibakteri
yang baru untuk mengatasi adanya efek samping dari mengkonsumsi antibiotik,
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi, alternatif dan pengetahuan
tentang penanggulangan penyakit infeksi dan bermanfaat untuk menjadi wacana
baru tentang bahan pengawet makanan organik yang meminimalkan efek samping
yang bisa ditimbulkan oleh bahan pengawet kimiawi.
Hasil Penelitian
menunjukkan bahwa ekstrak A. galanga L mempunyai kemampuan untuk
menghambat sistem quorum sensing P. aeruginosa pada konsentrasi 8%
berat/vol, namun pada konsentrasi tersebut pertumbuhan P. aeruginosa tidak
terhambat, tetapi pembentukan biofilmnya terhambat. Tidak ada perbedaan antara
kemampuan penghambatan A. galanga L baik dengan pelarut etanol dan etil
asetat. Perlu diadakan penelitian lanjutan tentang identifikasi zat kimia spesifik
pada ekstrak A. galanga L tersebut yang mempunyai kemampuan menghambat
sistem quorum sensing pada P. aeruginosa baik dengan pelarut etanol maupun etil
asetat, juga penelitian terhadap beberapa bakteri yang lain, dan terhadap
beberapa jenis tanaman obat yang lain, yang kita ketahui Indonesia memiliki
keanekaragaman yang sangat tinggi.
Penulis menyadari bahwa penelitian ini masih banyak kekurangan dan
keterbatasan, walaupun telah dikerahkan segala kemampuan untuk lebih teliti,
tetapi masih dirasakan banyak kekurangtepatan, oleh karena itu penulis
mengharapkan kritik dan saran yang membangun agar tulisan ini bermanfaat bagi
semua pihak.
Surakarta, Agustus 2010.
Penulis,
v
UCAPAN TERIMA KASIH
Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang tak ternilai kepada :
1. Prof. Drs. Suranto, M.Sc, Ph.D, sebagai Direktur Pascasarjana Universitas
Sebelas Maret, dan sekaligus Penguji dalam ujian tesis ini.
2. Dr. Sugiyato, M.Si sebagai Ketua Program Studi Biosains dan sekaligus
Penguji dalam ujian tesis ini.
3. Prof. Drs. Sutarno, M.Sc, Ph.D. sebagai Pembimbing I, di tengah
kesibukannya yang luar biasa selalu meluangkan waktu untuk membimbing
dan memberikan masukan dan saran untuk penyelesain tulisan ini.
4. Dr. Artini Pangastuti, M.Si sebagai Pembimbing II, yang telah memberikan
ide, gagasan dan beberapa literature yang dibutuhkan oleh penulis untuk
penyusunan tulisan ini dan arahan dalam pelaksanaan penelitian tesis ini.
5. Ketua dan Pengurus Yayasan Pendidikan Farmasi Nasional Surakarta,
yang memberikan ijin dan beasiswa studi secara penuh sampai lulus.
6. Direktur dan seluruh Staf Karyawan AAK Nasional Surakarta, yang telah
mendukung penulis selama masa studi dan penulisan tesis ini
7. Prof Dr. dr. J. Priyambodo MS, Sp.MK sebagai Kepala Laboratorium
Mikrobiologi Klinik Rumah Sakit Dr. Moewardi Surakarta, yang telah
membantu dalam pengadaan sampel kuman.
8. Prof, dr. Bhisma Murti, M.Sc, Ph.D yang telah membantu dalam hal uji
statistik dan analisis data pada penelitian ini.
9. Drg. HM. Taufik A.K, M.Kes sebagai Kepala Balai Laboratorium Kesehatan
Yogyakarta yang telah memberikan ijin serta akses seluas-luasnya untuk
menggunakan semua peralatan, bahan, media reagensia, dan sarana
prasarana laboratorium.
10. Bpk. Sigit Sulistya, S.Si, Koordinator Laboratorium Mikrobiologi Klinik Balai
Laboratorium Kesehatan Yogyakarta yang telah membantu pelaksanaan
penelitian baik secara teknis maupun non teknis.
11. Dra. Darwani, M.Sc Bidang diklat Balai Laboratorium Kesehatan
Yogyakarta yang telah membimbing pelaksanan penelitian dan
memberikan banyak masukan, ide dan gagasan tentang penelitian tesis ini.
12. Ibu Novena Yety Lindawati, S.Farm, Apt yang telah membantu proses
ekstraksi Alpinia galanga L di laboratorium Farmasi Akademi Farmasi
Nasional Surakarta.
13. Seluruh Staf dosen Program Studi S2 Biosains yang telah memberikan
ilmunya dan selalu terbuka untuk setiap masukan dari mahasiswa.
14. Teman-teman mahasiswa S2 Biosains angkatan 2008 yang selalu
memberikan dukungan dan selalu bekerja sama selama masa perkuliahan.
15. Keluargaku tercinta yang laur biasa; Istriku, Anakku, Bapak, Ibu, KakakKakak dan Adik-Adik yang telah memberi semangat dan motivasi serta
selalu mendukung dalam doa.
Surakarta, Agustus 2010.
Penulis,
vi
MOTTO
Semangat..........!
vii
PERSEMBAHAN
Karya ini kupersembahkan untuk:
Wiwied dan Yosua
viii
PENGHAMBATAN QUORUM SENSING PADA Pseudomonas aeruginosa
OLEH EKSTRAK Alpinia galanga L
Didik Wahyudi; Sutarno; Artini Pangastuti
Program Studi Magister Biosains, Program Pasca Sarjana-UNS Surakarta
ABSTRAK
Quorum sensing merupakan suatu proses yang memungkinkan bakteri
dapat berkomunikasi dengan mensekresikan molekul sinyal yang disebut
autoinducer atau molekul sinyal sebagai ”bahasa”. Sistem quorum sensing juga
mengontrol perilaku bakteri melalui pengubahan ekspresi gen oleh molekul sinyal.
Perilaku bakteri yang diatur sistem quorum sensing antara lain: Bioluminescen,
sekresi virulensi, sporulasi, konjugasi, produksi enzim ekstraseluler, pembentukan
biofilm dan produksi pigmen. P. aeruginosa merupakan opportunistik pathogenic
penyebab utama nosocomial infection. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
kemampuan ekstrak Alpinia galanga L dalam menghambat quorum sensing
P. aeruginosa.
Penelitian diawali dengan isolasi P. aeruginosa dari Rumah Sakit Dr.
Moewardi Surakarta, sampai uji sensitivitas terhadap antibiotik menggunakan
media biakan Luria bertani (LB). Ekstraksi di lakukan dengan menggunakan
pelarut etanol dan etil asetat. Uji kemampuan ekstrak A. galanga L dalam
penghambatan quorum sensing bakteri tersebut berdasarkan produksi enzim
eksoprotease yang dihasilkan oleh P. aeruginosa dengan metode spot plate pada
media LB agar yang ditambahkan 2% susu skim, dilanjutkan dengan uji
pembentukan Biofilm dengan menggunakan metode microtiter plate PVC,
dilakukan juga perhitungan jumlah sel bakteri untuk mengetahui pertumbuhan
P. aeruginosa tersebut dengan metode Optical density (spektrofotometer). Semua
eksperimen dilakukan dengan ulangan tiga kali. Data dianalisis dengan
menggunakan satu arah analisis varians (ANOVA) dengan P-nilai 0,05
menggunakan perangkat lunak statistik paket SPSS.
Hasil Penelitian menunjukkan bahwa ekstrak A. galanga L mempunyai
kemampuan untuk menghambat sistem quorum sensing P. aeruginosa pada
konsentrasi 8% berat/vol, namun pada konsentrasi tersebut pertumbuhan
P. aeruginosa tidak terhambat, tetapi pembentukan biofilmnya terhambat. Tidak
ada perbedaan antara kemampuan penghambatan A. galanga L baik dengan
pelarut etanol dan etil asetat.
Kata kunci: Quorum sensing, Pseudomonas aeruginosa, Alpinia galanga L.
ix
QUORUM SENSING INHIBITION OF Pseudomonas aeruginosa
BY Alpinia galanga L EXTRACT
Didik Wahyudi; Sutarno; Artini Pangastuti
Master of Bioscience, Postgraduate of Sebelas Maret University Surakarta
ABSTRACT
Quorum sensing is a process that allows bacteria to communicate with
secreting a signal molecule called autoinducer or signal molecules as the
"language". Quorum sensing system also controls the behavior of the bacteria in
gene expression modification by signal molecules. The behaviors of bacteria that
are regulated by quorum sensing are: Bioluminescen, secretion of virulence,
sporulation, conjugation, extracellular enzyme production, biofilm formation and
pigment production. P. aeruginosa is an opportunistic pathogenic major cause of
nosocomial infection (infections acquired from hospitals), these cases often occur
in various hospitals in Indonesia. The Objective of this research is to determine the
ability of A. galanga L extracts in inhibiting quorum sensing in P. aeruginosa.
The research started with the isolation of P. aeruginosa from Dr. Moewardi
Hospital in Surakarta, to test the sensitivity to antibiotics using culture media of
Luria Bertani (LB). Extraction was done by using ethanol and ethyl acetate. The
ability test of A. galanga L extracts in the inhibition of bacterial quorum sensing was
based on the production of eksoprotease enzyme produced by P. aeruginosa using
spot plate on LB agar medium was added 2% skim milk, followed by the formation
test biofilm microtiter plate using PVC, also performed calculations to determine
the number of bacterial cells of P. aeruginosa growth by optical density method
(spectrophotometer). All experiments conducted with three replications. Data were
analyzed by using one-way analysis of variance (ANOVA) with P-value of 0.05
using SPSS statistical software package.
Research results showed that the A. galanga L extract has the ability to
inhibit quorum sensing system of P. aeruginosa at a concentration of 8% wt / vol,
but the concentration was not hampered the growth of P. aeruginosa, but inhibited
the biofilm formation. There was no difference between the ability of inhibition of
A. galanga L both with ethanol and ethyl acetate.
Key-words: Quorum Sensing, Pseudomonas aeruginosa, Alpinia galanga L.
x
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ..........................................................................................
LEMBAR PERSETUJUAN ..............................................................................
LEMBAR PENGESAHAN ................................................................................
PERNYATAAN ORISINALITAS DAN PUBLIKASI TESIS ...............................
KATA PENGANTAR ........................................................................................
UCAPAN TERIMA KASIH ..............................................................................
MOTTO ...........................................................................................................
PERSEMBAHAN .............................................................................................
ABSTRAK ........................................................................................................
ABSTRACT......................................................................................................
DAFTAR ISI .....................................................................................................
DAFTAR TABEL ..............................................................................................
DAFTAR GAMBAR .........................................................................................
DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................
i
ii
iii
iv
v
vi
vii
viii
ix
x
xi
xiii
xiv
xvi
BAB 1. PENDAHULUAN
A.
B.
C.
D.
Latar Belakang Masalah ................................................................
Perumusan Masalah .....................................................................
Tujuan penelitian ...........................................................................
Manfaat Penelitian .........................................................................
1
4
5
5
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA DAN KERANGKA KONSEP PENELITIAN
A. Tinjauan Pustaka ...........................................................................
1. Sistem Quorum sensing ..........................................................
2. Autoinducer ..............................................................................
3. Mekanisme Umum Quorum Sensing .......................................
4. Quorum Sensing Hubungannya dengan Patogenitas Bakteri..
5. Pencegahan Quorum Sensing .................................................
6. Potensi Desian Anti Quorum Sensing .....................................
7. Lengkuas (A. galanga L)...................................................
8. P. aeruginosa .......................................................
B. Kerangka Pemikiran.......................................................................
C. Hipotesis.........................................................................................
6
6
8
9
15
16
19
20
22
30
31
BAB III METODOLOGI PENELITIAN ..............................................................
A. Waktu dan Tempat Penelitian.........................................................
B. Alat dan Bahan Penelitian .............................................................
C. Prosedur Penelitian .......................................................................
C.1. Karakterisasi dan Ekstraksi A. galanga L.....................................
C.2. Isolasi Bakteri Uji .........................................................................
C.3. Persiapan Media Biakan ..............................................................
C.4. Penentuan Kurva Standar Pertumbuhan P. aeruginosa...............
C.5. Uji Kualitatif Penghambatan Sistem quorum sensing...................
C.6. Pengukuran Pertumbuhan P. aeruginosa ....................................
32
32
32
33
33
34
36
36
37
38
xi
C.7. Pengujian Kuantitatif Aktivitas Enzim Eksoprotease
P.aeruginosa ...............................................................................
C.5. Uji Pembentukan Biofilm dengan Microtiter Plate (PVC)..............
D. Analisis Statistik .............................................................................
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN.
A. Karakterisasi Bakteri Uji, P. aeruginosa. .......................................
B. Kurva Pertumbuhan P. aeruginosa ................................................
C. Uji Kualitatif Penghambatan Quorum Sensing berdasarkan
enzim eksoprotease yang dihasilkan oleh P. aeruginosa ..............
D. Penghambatan Produksi enzim eksoprotease P. aeruginosa
oleh ekstrak Alpinia galanga L dengan pelarut etanol....................
E. Penghambatan Produksi enzim eksoprotease P. aeruginosa
oleh ekstrak Alpinia galanga L dengan pelarut etil asetat..............
F. Penghambatan Aktivitas enzim eksoprotease P. aeruginosa
secara kuantitatif ............................................................................
G. Hasil Uji Pembentukan biofilm P.aeruginosa dengan Microtiter
Plate Polivinil Chlorida ...................................................................
39
40
41
43
47
49
52
55
57
63
BAB V. PENUTUP
A. Kesimpulan ....................................................................................
B. Saran .............................................................................................
DAFTARA PUSTAKA ......................................................................................
LAMPIRAN-PLAMPIRAN ................................................................................
xii
70
70
71
76
DAFTAR TABEL
Tabel 1.
Tabel 2.
Tabel.3
Tabel.4
Tabel 5.
Tabel 6.
Tabel 7.
Tabel 8
Hasil Uji Sensitivitas antibiotik terhadap P. aeruginosa
Hasil Isolasi dari RSU Dr. Moewardi Surakarta…………...……
44
Kurva Pertumbuhan P. aeruginosa dengan menggunakan
spektrofotometer.........................................................................
47
Rata-rata Luas zona bening yang terbentuk di sekitar
koloni P. aeruginosa dengan pemberian ekstrak galanga L
dengan pelarut Etanol pada medium pertumbuhannya. ...........
52
Rata-rata Luas zona bening yang terbentuk di sekitar
koloni P. aeruginosa dengan pemberian ekstrak A. galanga L
dengan pelarut etil asetat ..........................................................
55
Nilai optical density pertumbuhan P. aeruginosa pada
berbagai jenis perlakuan.............................................................
58
Tabel daftar unit aktivitas enzim eksoprotease pada
P. aeruginosa pada beberapa perlakuan...................................
60
Nilai Rata-rata produksi enzim eksoprotease P. aeruginosa
pada beberapa perlakuan dengan ekstrak A. galanga L...........
62
Rata-rata Produksi biofilm (berdasarkan Optical Density) pada
P. aeruginosa yang terhambat pada media yang ditambahkan
ekstrak A. galanga L dengan pelarut etanol dan etil asetat
pada konsentrasi 6% dan 8%.....................................................
64
xiii
DAFTAR GAMBAR
Gambar 01.
Mekanisme QS pada bakteri Gram-negatif.................................
10
Gambar 02.
Mekanisme QS pada Vibrio fischeri............................................
11
Gambar 03.
Mekanisme QS pada bakteri Gram-positif, Staphylococcus
aureus. P2 dan P3 masing-masing merupakan promotor
untuk gen agrBDCA dan NAIII....................................................
14
Gambar 04.a. Skema umum pencegahan QS degradasi senyawa AI...............
18
Gambar 04.b. Skema umum pencegahan QS kompetisi...................................
18
Gambar 04.c. Skema umum pencegahan QS antagonis...................................
18
Gambar 05.
Target yang berpotensi untuk pencegahan QS.........................
19
Gambar 06.
A. galanga L................................................................................
21
Gambar 07.
P. aeruginosa..............................................................................
24
Gambar 08.
Berbagai infeksi Pseudomonas pada beberapa situs
tubuh manusia (Mayasari, Evita, 2006).....................................
27
Kerangka pemikiran penghambatan system quorum sensing
pada P. aeruginosa oleh ekstrak A. galanga L ...........................
30
Gambar 09.
Gambar 10.
Kurva pertumbuhan P. aeruginosa pada media Luria
Bertani yang diukur dengan Spektrofotometer............................ 48
Gambar 11.
Produksi enzim eksoprotease menyebabkan terbentuknya
zona bening di sekitar koloni P. aeruginosa................................
51
Penghambatan produksi enzim eksoprotease P. aeruginosa
oleh ekstrak A. galanga L dengan pelarut etanol........................
54
Penghambatan produksi enzim eksoprotease P. aeruginosa
oleh ekstrak A. galanga L dengan pelarut etil Asetat...........
56
Pengukuran Nilai Optical Density P. aeruginosa pada
berbagai perlakuan......................................................................
59
Kurva produksi enzim eksoprotease P. aeruginosa.....................
61
Gambar 12.
Gambar 13.
Gambar 14.
Gambar 15.
xiv
Gambar 16.
Gambar 17.
Rata-rata Produksi biofilm pada P. aeruginosa
yang terhambat pada media yang ditambahkan ekstrak
Alpinia alanga L dengan pelarut etanol dan etil asetat
pada konsentrasi 6% dan 8%......................................................
64
Besarnya penurunan produksi biofilm P. aeruginosa
pada jam ke 20 sampai jam ke 40 inkubasi pada
microtiter plate PVC…………………………………………………
66
xv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1
One Way Anova untuk jumlah bakteri pada beberapa
perlakuan dengan SPSS 13 .....................................................
77
One way Anova produksi enzim eksoprotease pada
beberapa perlakuan dengan SPSS 13 ......................................
81
One way Anova Pembentukan Biofilm P. aeruginosa pada
beberapa perlakuan dengan SPSS 13 ……..
85
Lampiran 4
Beberapa komposisi Media Biakan Bakteri................................
87
Lampiran 5
Tabel Uji Biokimia Identifikasi Bakteri Gram Negatif
bentuk Batang............................................................................
88
Surat Keterangan Telah melakukan Penelitian di balai
laboratorium Kesehatan Yogyakarta..........................................
89
Beberapa Foto Aktivitas Penelitian di Balai
Laboratorium Kesehatan Yogyakarta.........................................
90
Daftar Riwayat Hidup Penulis ....................................................
93
Lampiran 2
Lampiran 3
Lampiran 6
Lampiran 7
Lampiran 8
xvi
aeruginosa OLEH EKSTRAK Alpinia galanga L
TESIS
Disusun untuk memenuhi sebagian persyaratan
guna memperoleh gelar Magister Sains
Program Studi Biosains
oleh :
Didik Wahyudi
S-900908003
PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS SEBELAS MARET
SURAKARTA
2010
i
PENGHAMBATAN QUORUM SENSING PADA Pseudomonas
aeruginosa OLEH EKSTRAK Alpinia galanga L
TESIS
Oleh :
Didik Wahyudi
S-900908003
Telah disetujui oleh Tim Pembimbing
Pada tanggal 5 Agustus 2010
Komisi
Pembimbing
Pembimbing I
Nama
Tanda Tangan
Prof. Drs. Sutarno, M.Sc. Ph.D
Tanggal
5 Agustus 2010.
NIP. 196008091986121001.
Pembimbing II Dr. Artini Pangastuti, M.Si.
NIP. 197505312000032001.
Mengetahui
Ketua Program Studi Biosains
Program Pascasarjana
Dr. Sugiyarto, M.Si.
NIP. 196704301992031002.
ii
5 Agustus 2010.
PENGHAMBATAN QUORUM SENSING PADA Pseudomonas
aeruginosa OLEH EKSTRAK Alpinia galanga L
TESIS
Oleh :
Didik Wahyudi
S-900908003
Telah dipertahankan di depan penguji
Dinyatakan telah memenuhi syarat
Pada tanggal
Jabatan
Ketua
Agustus 2010
Nama
Tanda Tangan
Prof. Drs. Suranto, M.Sc, Ph.D
Tanggal
..................... ... Agustus 2010
NIP. 195708201985031004.
Sekretaris
Dr. Sugiyarto, M.Si.
..................... ... Agustus 2010
NIP. 196704301992031002.
Anggota Penguji. Prof. Drs. Sutarno, M.Sc., Ph.D
.................... ... Agustus 2010
NIP. 196008091986121001.
Dr. Artini Pangastuti, M.Si.
..................... ... Agustus 2010
NIP. 197505312000032001.
Mengetahui
Direktur Program Pascasarjana UNS
Ketua Program Studi Biosains
Prof. Drs. Suranto, M.Sc., Ph.D.
Dr. Sugiyarto, M.Si.
NIP. 195708201985031004.
NIP. 196704301992031002
iii
PERNYATAAN ARISINALITAS DAN PUBLIKASI TESIS
Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa :
1. Tesis yang berjudul Penghambatan Quorum Sensing pada Pseudomonas
aeruginosa oleh Alpinia galanga L ini adalah karya penelitian saya sendiri dan
tidak terdapat karya ilmiah yang pernah diajukan oleh orang lain untuk
memperoleh gelar akademik serta tidak terdapat karya atau pendapat yang
pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain kecuali yang secara tertulis di
kutip dalam naskah ini dan disebutkan dalam sumber kutipan dan daftar
pustaka. Apabila ternyata di dalam naskah Tesis ini dapat dibuktikan terdapat
unsur-unsur jiplakan, maka saya bersedia Tesis beserta gelar MAGISTER
saya dibatalkan, serta diproses sesuai dengan peraturan perundang-undangan
yang berlaku (UU No. 20 tahun 2003, pasal 25 ayat 2 dan pasal 70).
2. Tesis ini merupakan hak milik Prodi Biosains PPs-UNS. Publikasi sebagian
atau keseluruhan isi Tesis pada jurnal atau forum ilmiah lain harus seijin Ketua
Prodi Biosanis PPs-UNS dan minimal satu kali publikasi menyertakan tim
pembimbing sebagai Author. Apabila dalam waktu sekurang-kurangnya satu
semester (6 bulan sejak pengesahan Tesis) saya tidak melakukan publikasi
dari sebagian atau keseluruhan tesis ini, maka Prodi Biosains PPs-UNS berhak
mempublikasikannya pada jurnal ilmiah yang diterbitkan oleh Prodi Biosains
PPS-UNS, Apabila saya melakukan pelanggaran dari ketentuan publikasi ini,
maka saya bersedia mendapatkan sanksi akademik yang berlaku.
Surakarta,
Agustus 2010
Mahasiswa
Didik Wahyudi.
iv
KATA PENGANTAR
Puji syukur ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa, atas berkat dan kasih
karuniaNya, maka penulis dapat menyajikan tulisan Tesis yang berjudul:
Penghambatan Quorum Sensing Pada Pseudomonas aeruginosa oleh Ekstrak
Alpinia galanga L. Penelitian ini diawali dengan karakterisasi rimpang A. galanga L
(Lengkuas) dan isolasi P. aeruginosa dari sampel klinis di Rumah Sakit Dr.
Moewardi, kemudian dilakukan pengujian awal terhadap kemampuan ekstrak
A. galanga L dalam menghambat sistem quorum sensing P. aeruginosa dengan
menggunakan indikator produksi enzim eksoproteasenya, karena produksi enzim
tersebut diatur oleh sistem quorum sensing bakteri.
Sistem quorum sensing pada P. aeruginosa diawali dari syarat minimal
jumlah bakteri yang harus ada di dalam suatu lingkungan, yaitu 107 – 108 sel,
kemudian bakteri akan terpicu untuk mengeluarkan faktor virulensinya, pada
kondisi yang optimal bisa sampai membentuk biofilm.
Setelah ditemukan
konsentrasi ekstrak A. galanga L yang bisa menghambat produksi enzim
eksoprotease secara kualitatif dilanjutkan uji secara kauntitatif, juga dilakukan
perhitungan terhadap jumlah bakteri pada konsentrasi tersebut. Di dalam tulisan
ini, disajikan pokok-pokok bahasan yang meliputi pengukuran parameterparameter diatas yaitu jumlah bakteri, produksi enzim baik secara kualitatif
maupun luantitatif dan pembentukan biofilmya.
Nilai penting penelitian ini adalah menemukan alternatif bahan antibakteri
yang baru untuk mengatasi adanya efek samping dari mengkonsumsi antibiotik,
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi, alternatif dan pengetahuan
tentang penanggulangan penyakit infeksi dan bermanfaat untuk menjadi wacana
baru tentang bahan pengawet makanan organik yang meminimalkan efek samping
yang bisa ditimbulkan oleh bahan pengawet kimiawi.
Hasil Penelitian
menunjukkan bahwa ekstrak A. galanga L mempunyai kemampuan untuk
menghambat sistem quorum sensing P. aeruginosa pada konsentrasi 8%
berat/vol, namun pada konsentrasi tersebut pertumbuhan P. aeruginosa tidak
terhambat, tetapi pembentukan biofilmnya terhambat. Tidak ada perbedaan antara
kemampuan penghambatan A. galanga L baik dengan pelarut etanol dan etil
asetat. Perlu diadakan penelitian lanjutan tentang identifikasi zat kimia spesifik
pada ekstrak A. galanga L tersebut yang mempunyai kemampuan menghambat
sistem quorum sensing pada P. aeruginosa baik dengan pelarut etanol maupun etil
asetat, juga penelitian terhadap beberapa bakteri yang lain, dan terhadap
beberapa jenis tanaman obat yang lain, yang kita ketahui Indonesia memiliki
keanekaragaman yang sangat tinggi.
Penulis menyadari bahwa penelitian ini masih banyak kekurangan dan
keterbatasan, walaupun telah dikerahkan segala kemampuan untuk lebih teliti,
tetapi masih dirasakan banyak kekurangtepatan, oleh karena itu penulis
mengharapkan kritik dan saran yang membangun agar tulisan ini bermanfaat bagi
semua pihak.
Surakarta, Agustus 2010.
Penulis,
v
UCAPAN TERIMA KASIH
Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang tak ternilai kepada :
1. Prof. Drs. Suranto, M.Sc, Ph.D, sebagai Direktur Pascasarjana Universitas
Sebelas Maret, dan sekaligus Penguji dalam ujian tesis ini.
2. Dr. Sugiyato, M.Si sebagai Ketua Program Studi Biosains dan sekaligus
Penguji dalam ujian tesis ini.
3. Prof. Drs. Sutarno, M.Sc, Ph.D. sebagai Pembimbing I, di tengah
kesibukannya yang luar biasa selalu meluangkan waktu untuk membimbing
dan memberikan masukan dan saran untuk penyelesain tulisan ini.
4. Dr. Artini Pangastuti, M.Si sebagai Pembimbing II, yang telah memberikan
ide, gagasan dan beberapa literature yang dibutuhkan oleh penulis untuk
penyusunan tulisan ini dan arahan dalam pelaksanaan penelitian tesis ini.
5. Ketua dan Pengurus Yayasan Pendidikan Farmasi Nasional Surakarta,
yang memberikan ijin dan beasiswa studi secara penuh sampai lulus.
6. Direktur dan seluruh Staf Karyawan AAK Nasional Surakarta, yang telah
mendukung penulis selama masa studi dan penulisan tesis ini
7. Prof Dr. dr. J. Priyambodo MS, Sp.MK sebagai Kepala Laboratorium
Mikrobiologi Klinik Rumah Sakit Dr. Moewardi Surakarta, yang telah
membantu dalam pengadaan sampel kuman.
8. Prof, dr. Bhisma Murti, M.Sc, Ph.D yang telah membantu dalam hal uji
statistik dan analisis data pada penelitian ini.
9. Drg. HM. Taufik A.K, M.Kes sebagai Kepala Balai Laboratorium Kesehatan
Yogyakarta yang telah memberikan ijin serta akses seluas-luasnya untuk
menggunakan semua peralatan, bahan, media reagensia, dan sarana
prasarana laboratorium.
10. Bpk. Sigit Sulistya, S.Si, Koordinator Laboratorium Mikrobiologi Klinik Balai
Laboratorium Kesehatan Yogyakarta yang telah membantu pelaksanaan
penelitian baik secara teknis maupun non teknis.
11. Dra. Darwani, M.Sc Bidang diklat Balai Laboratorium Kesehatan
Yogyakarta yang telah membimbing pelaksanan penelitian dan
memberikan banyak masukan, ide dan gagasan tentang penelitian tesis ini.
12. Ibu Novena Yety Lindawati, S.Farm, Apt yang telah membantu proses
ekstraksi Alpinia galanga L di laboratorium Farmasi Akademi Farmasi
Nasional Surakarta.
13. Seluruh Staf dosen Program Studi S2 Biosains yang telah memberikan
ilmunya dan selalu terbuka untuk setiap masukan dari mahasiswa.
14. Teman-teman mahasiswa S2 Biosains angkatan 2008 yang selalu
memberikan dukungan dan selalu bekerja sama selama masa perkuliahan.
15. Keluargaku tercinta yang laur biasa; Istriku, Anakku, Bapak, Ibu, KakakKakak dan Adik-Adik yang telah memberi semangat dan motivasi serta
selalu mendukung dalam doa.
Surakarta, Agustus 2010.
Penulis,
vi
MOTTO
Semangat..........!
vii
PERSEMBAHAN
Karya ini kupersembahkan untuk:
Wiwied dan Yosua
viii
PENGHAMBATAN QUORUM SENSING PADA Pseudomonas aeruginosa
OLEH EKSTRAK Alpinia galanga L
Didik Wahyudi; Sutarno; Artini Pangastuti
Program Studi Magister Biosains, Program Pasca Sarjana-UNS Surakarta
ABSTRAK
Quorum sensing merupakan suatu proses yang memungkinkan bakteri
dapat berkomunikasi dengan mensekresikan molekul sinyal yang disebut
autoinducer atau molekul sinyal sebagai ”bahasa”. Sistem quorum sensing juga
mengontrol perilaku bakteri melalui pengubahan ekspresi gen oleh molekul sinyal.
Perilaku bakteri yang diatur sistem quorum sensing antara lain: Bioluminescen,
sekresi virulensi, sporulasi, konjugasi, produksi enzim ekstraseluler, pembentukan
biofilm dan produksi pigmen. P. aeruginosa merupakan opportunistik pathogenic
penyebab utama nosocomial infection. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
kemampuan ekstrak Alpinia galanga L dalam menghambat quorum sensing
P. aeruginosa.
Penelitian diawali dengan isolasi P. aeruginosa dari Rumah Sakit Dr.
Moewardi Surakarta, sampai uji sensitivitas terhadap antibiotik menggunakan
media biakan Luria bertani (LB). Ekstraksi di lakukan dengan menggunakan
pelarut etanol dan etil asetat. Uji kemampuan ekstrak A. galanga L dalam
penghambatan quorum sensing bakteri tersebut berdasarkan produksi enzim
eksoprotease yang dihasilkan oleh P. aeruginosa dengan metode spot plate pada
media LB agar yang ditambahkan 2% susu skim, dilanjutkan dengan uji
pembentukan Biofilm dengan menggunakan metode microtiter plate PVC,
dilakukan juga perhitungan jumlah sel bakteri untuk mengetahui pertumbuhan
P. aeruginosa tersebut dengan metode Optical density (spektrofotometer). Semua
eksperimen dilakukan dengan ulangan tiga kali. Data dianalisis dengan
menggunakan satu arah analisis varians (ANOVA) dengan P-nilai 0,05
menggunakan perangkat lunak statistik paket SPSS.
Hasil Penelitian menunjukkan bahwa ekstrak A. galanga L mempunyai
kemampuan untuk menghambat sistem quorum sensing P. aeruginosa pada
konsentrasi 8% berat/vol, namun pada konsentrasi tersebut pertumbuhan
P. aeruginosa tidak terhambat, tetapi pembentukan biofilmnya terhambat. Tidak
ada perbedaan antara kemampuan penghambatan A. galanga L baik dengan
pelarut etanol dan etil asetat.
Kata kunci: Quorum sensing, Pseudomonas aeruginosa, Alpinia galanga L.
ix
QUORUM SENSING INHIBITION OF Pseudomonas aeruginosa
BY Alpinia galanga L EXTRACT
Didik Wahyudi; Sutarno; Artini Pangastuti
Master of Bioscience, Postgraduate of Sebelas Maret University Surakarta
ABSTRACT
Quorum sensing is a process that allows bacteria to communicate with
secreting a signal molecule called autoinducer or signal molecules as the
"language". Quorum sensing system also controls the behavior of the bacteria in
gene expression modification by signal molecules. The behaviors of bacteria that
are regulated by quorum sensing are: Bioluminescen, secretion of virulence,
sporulation, conjugation, extracellular enzyme production, biofilm formation and
pigment production. P. aeruginosa is an opportunistic pathogenic major cause of
nosocomial infection (infections acquired from hospitals), these cases often occur
in various hospitals in Indonesia. The Objective of this research is to determine the
ability of A. galanga L extracts in inhibiting quorum sensing in P. aeruginosa.
The research started with the isolation of P. aeruginosa from Dr. Moewardi
Hospital in Surakarta, to test the sensitivity to antibiotics using culture media of
Luria Bertani (LB). Extraction was done by using ethanol and ethyl acetate. The
ability test of A. galanga L extracts in the inhibition of bacterial quorum sensing was
based on the production of eksoprotease enzyme produced by P. aeruginosa using
spot plate on LB agar medium was added 2% skim milk, followed by the formation
test biofilm microtiter plate using PVC, also performed calculations to determine
the number of bacterial cells of P. aeruginosa growth by optical density method
(spectrophotometer). All experiments conducted with three replications. Data were
analyzed by using one-way analysis of variance (ANOVA) with P-value of 0.05
using SPSS statistical software package.
Research results showed that the A. galanga L extract has the ability to
inhibit quorum sensing system of P. aeruginosa at a concentration of 8% wt / vol,
but the concentration was not hampered the growth of P. aeruginosa, but inhibited
the biofilm formation. There was no difference between the ability of inhibition of
A. galanga L both with ethanol and ethyl acetate.
Key-words: Quorum Sensing, Pseudomonas aeruginosa, Alpinia galanga L.
x
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ..........................................................................................
LEMBAR PERSETUJUAN ..............................................................................
LEMBAR PENGESAHAN ................................................................................
PERNYATAAN ORISINALITAS DAN PUBLIKASI TESIS ...............................
KATA PENGANTAR ........................................................................................
UCAPAN TERIMA KASIH ..............................................................................
MOTTO ...........................................................................................................
PERSEMBAHAN .............................................................................................
ABSTRAK ........................................................................................................
ABSTRACT......................................................................................................
DAFTAR ISI .....................................................................................................
DAFTAR TABEL ..............................................................................................
DAFTAR GAMBAR .........................................................................................
DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................
i
ii
iii
iv
v
vi
vii
viii
ix
x
xi
xiii
xiv
xvi
BAB 1. PENDAHULUAN
A.
B.
C.
D.
Latar Belakang Masalah ................................................................
Perumusan Masalah .....................................................................
Tujuan penelitian ...........................................................................
Manfaat Penelitian .........................................................................
1
4
5
5
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA DAN KERANGKA KONSEP PENELITIAN
A. Tinjauan Pustaka ...........................................................................
1. Sistem Quorum sensing ..........................................................
2. Autoinducer ..............................................................................
3. Mekanisme Umum Quorum Sensing .......................................
4. Quorum Sensing Hubungannya dengan Patogenitas Bakteri..
5. Pencegahan Quorum Sensing .................................................
6. Potensi Desian Anti Quorum Sensing .....................................
7. Lengkuas (A. galanga L)...................................................
8. P. aeruginosa .......................................................
B. Kerangka Pemikiran.......................................................................
C. Hipotesis.........................................................................................
6
6
8
9
15
16
19
20
22
30
31
BAB III METODOLOGI PENELITIAN ..............................................................
A. Waktu dan Tempat Penelitian.........................................................
B. Alat dan Bahan Penelitian .............................................................
C. Prosedur Penelitian .......................................................................
C.1. Karakterisasi dan Ekstraksi A. galanga L.....................................
C.2. Isolasi Bakteri Uji .........................................................................
C.3. Persiapan Media Biakan ..............................................................
C.4. Penentuan Kurva Standar Pertumbuhan P. aeruginosa...............
C.5. Uji Kualitatif Penghambatan Sistem quorum sensing...................
C.6. Pengukuran Pertumbuhan P. aeruginosa ....................................
32
32
32
33
33
34
36
36
37
38
xi
C.7. Pengujian Kuantitatif Aktivitas Enzim Eksoprotease
P.aeruginosa ...............................................................................
C.5. Uji Pembentukan Biofilm dengan Microtiter Plate (PVC)..............
D. Analisis Statistik .............................................................................
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN.
A. Karakterisasi Bakteri Uji, P. aeruginosa. .......................................
B. Kurva Pertumbuhan P. aeruginosa ................................................
C. Uji Kualitatif Penghambatan Quorum Sensing berdasarkan
enzim eksoprotease yang dihasilkan oleh P. aeruginosa ..............
D. Penghambatan Produksi enzim eksoprotease P. aeruginosa
oleh ekstrak Alpinia galanga L dengan pelarut etanol....................
E. Penghambatan Produksi enzim eksoprotease P. aeruginosa
oleh ekstrak Alpinia galanga L dengan pelarut etil asetat..............
F. Penghambatan Aktivitas enzim eksoprotease P. aeruginosa
secara kuantitatif ............................................................................
G. Hasil Uji Pembentukan biofilm P.aeruginosa dengan Microtiter
Plate Polivinil Chlorida ...................................................................
39
40
41
43
47
49
52
55
57
63
BAB V. PENUTUP
A. Kesimpulan ....................................................................................
B. Saran .............................................................................................
DAFTARA PUSTAKA ......................................................................................
LAMPIRAN-PLAMPIRAN ................................................................................
xii
70
70
71
76
DAFTAR TABEL
Tabel 1.
Tabel 2.
Tabel.3
Tabel.4
Tabel 5.
Tabel 6.
Tabel 7.
Tabel 8
Hasil Uji Sensitivitas antibiotik terhadap P. aeruginosa
Hasil Isolasi dari RSU Dr. Moewardi Surakarta…………...……
44
Kurva Pertumbuhan P. aeruginosa dengan menggunakan
spektrofotometer.........................................................................
47
Rata-rata Luas zona bening yang terbentuk di sekitar
koloni P. aeruginosa dengan pemberian ekstrak galanga L
dengan pelarut Etanol pada medium pertumbuhannya. ...........
52
Rata-rata Luas zona bening yang terbentuk di sekitar
koloni P. aeruginosa dengan pemberian ekstrak A. galanga L
dengan pelarut etil asetat ..........................................................
55
Nilai optical density pertumbuhan P. aeruginosa pada
berbagai jenis perlakuan.............................................................
58
Tabel daftar unit aktivitas enzim eksoprotease pada
P. aeruginosa pada beberapa perlakuan...................................
60
Nilai Rata-rata produksi enzim eksoprotease P. aeruginosa
pada beberapa perlakuan dengan ekstrak A. galanga L...........
62
Rata-rata Produksi biofilm (berdasarkan Optical Density) pada
P. aeruginosa yang terhambat pada media yang ditambahkan
ekstrak A. galanga L dengan pelarut etanol dan etil asetat
pada konsentrasi 6% dan 8%.....................................................
64
xiii
DAFTAR GAMBAR
Gambar 01.
Mekanisme QS pada bakteri Gram-negatif.................................
10
Gambar 02.
Mekanisme QS pada Vibrio fischeri............................................
11
Gambar 03.
Mekanisme QS pada bakteri Gram-positif, Staphylococcus
aureus. P2 dan P3 masing-masing merupakan promotor
untuk gen agrBDCA dan NAIII....................................................
14
Gambar 04.a. Skema umum pencegahan QS degradasi senyawa AI...............
18
Gambar 04.b. Skema umum pencegahan QS kompetisi...................................
18
Gambar 04.c. Skema umum pencegahan QS antagonis...................................
18
Gambar 05.
Target yang berpotensi untuk pencegahan QS.........................
19
Gambar 06.
A. galanga L................................................................................
21
Gambar 07.
P. aeruginosa..............................................................................
24
Gambar 08.
Berbagai infeksi Pseudomonas pada beberapa situs
tubuh manusia (Mayasari, Evita, 2006).....................................
27
Kerangka pemikiran penghambatan system quorum sensing
pada P. aeruginosa oleh ekstrak A. galanga L ...........................
30
Gambar 09.
Gambar 10.
Kurva pertumbuhan P. aeruginosa pada media Luria
Bertani yang diukur dengan Spektrofotometer............................ 48
Gambar 11.
Produksi enzim eksoprotease menyebabkan terbentuknya
zona bening di sekitar koloni P. aeruginosa................................
51
Penghambatan produksi enzim eksoprotease P. aeruginosa
oleh ekstrak A. galanga L dengan pelarut etanol........................
54
Penghambatan produksi enzim eksoprotease P. aeruginosa
oleh ekstrak A. galanga L dengan pelarut etil Asetat...........
56
Pengukuran Nilai Optical Density P. aeruginosa pada
berbagai perlakuan......................................................................
59
Kurva produksi enzim eksoprotease P. aeruginosa.....................
61
Gambar 12.
Gambar 13.
Gambar 14.
Gambar 15.
xiv
Gambar 16.
Gambar 17.
Rata-rata Produksi biofilm pada P. aeruginosa
yang terhambat pada media yang ditambahkan ekstrak
Alpinia alanga L dengan pelarut etanol dan etil asetat
pada konsentrasi 6% dan 8%......................................................
64
Besarnya penurunan produksi biofilm P. aeruginosa
pada jam ke 20 sampai jam ke 40 inkubasi pada
microtiter plate PVC…………………………………………………
66
xv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1
One Way Anova untuk jumlah bakteri pada beberapa
perlakuan dengan SPSS 13 .....................................................
77
One way Anova produksi enzim eksoprotease pada
beberapa perlakuan dengan SPSS 13 ......................................
81
One way Anova Pembentukan Biofilm P. aeruginosa pada
beberapa perlakuan dengan SPSS 13 ……..
85
Lampiran 4
Beberapa komposisi Media Biakan Bakteri................................
87
Lampiran 5
Tabel Uji Biokimia Identifikasi Bakteri Gram Negatif
bentuk Batang............................................................................
88
Surat Keterangan Telah melakukan Penelitian di balai
laboratorium Kesehatan Yogyakarta..........................................
89
Beberapa Foto Aktivitas Penelitian di Balai
Laboratorium Kesehatan Yogyakarta.........................................
90
Daftar Riwayat Hidup Penulis ....................................................
93
Lampiran 2
Lampiran 3
Lampiran 6
Lampiran 7
Lampiran 8
xvi