AMOBILISASI ENZIM -AMILASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148 DENGAN MENGGUNAKAN CM-Sephadex C-50
ABSTRACT
THE IMMOBILIZATION OF -AMYLASE ENZYME FROM Bacillus
subtilis ITBCCB148 USING CM-Sephadex C-50
BY
Feraliana
-amylase is an enzyme that breaks -1,4 glycoside bond in amylum. It has
been widely used in a number of industrial processes such as food industry and non
food industry. In industrial process, this enzyme must be able to work in an extreme
pH and temperature. However, an enzyme is not normally stable in these conditions.
The aim of this research is to increase the stability of -amylase obtained from
Bacillus subtilis ITBCCB148 with immobilization method using CM-Sephadex C-50.
To achieve this aim, the steps done in this research were production, isolation, and
purification of the enzyme which includes fractionation with ammonium sulphate,
dialysis and chromatography with CM-cellulose. The pure enzyme was then
immobilized using CM-Sephadex C-50. The activity of -amylase was determined by
Fuwa and Mandels methods, while the protein concentration was determined by
Lowry method.
The result showed that the specific activity of pure enzyme was 21.400 U/mg,
an increase of 15 times compared to the enzyme raw extract with a recovery of 11%.
The optimum temperature for pure enzyme was 60oC, KM value of 6.32 mg mL-1
substrate and Vmax value of 138.89 mol mL-1 min.-1. The thermal stability test at
60°C for 60 minutes showed the residual activity of 23%, t1/2 = 33.64 minutes, ki =
-1
0.0206 min.-1
i = 103.97 kJ mol . The immobilized enzyme has optimum
temperature of 70oC, KM value of 6.90 mg mL-1 substrate and Vmax. value of 90.09
mol mL-1 min.-1. The thermal stability test of immobilized enzyme at 60°C for 60
minutes showed the residual activity was 51%, ki = 0.0136 min.-1, t1/2 = 50.96
-1
minutes
i = 105.12 kJ mol .
Compared to the pure enzyme, the thermal stability of the immobilized enzyme
was increased 1.51 times. The decrease of KM value, the increase of Vmax value, the
decrease of ki, the increase of t1/2 and
i showed that the immobilization process has
increased the rigidity of the enzyme, as a result the enzyme was more stable against
pH and temperature.
Key word :
-amylase, Bacillus subtilis ITBCCB148, immobilization process, CMSephadex C-50.
ABSTRAK
AMOBILISASI ENZIM -AMILASE DARI Bacillus
subtilis ITBCCB148 DENGAN MENGGUNAKAN CM-Sephadex C-50
Oleh
Feraliana
-1,4 glikosida
pada amilum. Enzim ini banyak dimanfaatkan dalam proses-proses industri baik
yang berhubungan dengan pangan maupun non-pangan. Dalam proses industri,
enzim ini harus mampu bekerja pada pH ekstrim dan mempunyai stabilitas termal
yang tinggi. Namun, umumnya enzim tidak stabil pada kondisi tersebut.
-amilase dari
Bacillus subtilis ITBCCB148 dengan cara amobilisasi menggunakan CMSephadex C-50. Untuk mencapai tujuan tersebut, dilakukan produksi, isolasi, dan
pemurnian enzim meliputi : fraksinasi dengan amonium sulfat, dialisis, dan
kromatografi kolom penukar kation CM-selulosa. Enzim hasil pemurnian
kemudian diamobilisasi dengan menggunakan CM-Sephadex C-50. Penentuan
aktivitas -amilase dilakukan dengan metode Fuwa dan metode Mandels,
sedangkan penentuan kadar protein dilakukan dengan metode Lowry.
Hasil penelitian menunjukkan enzim hasil pemurnian memiliki aktivitas
spesifik sebesar 21.400 U/mg, meningkat kemurniannya 15 kali dibandingkan
ekstrak kasar enzim dengan perolehan 11%. Enzim ini memiliki suhu optimum
60°C, harga KM = 6,32 mg mL-1 substrat dan harga Vmaks = 138,89 mol mL-1
menit-1. Uji stabilitas termal pada suhu 60°C selama 60 menit masih memiliki
-1
aktivitas sisa 23%, t1/2 = 33,64 menit, ki = 0,0206 menit-1
i = 103,97 kJ mol .
Amobilisasi enzim hasil pemurnian dengan menggunakan CM-Sephadex C-50
menghasilkan enzim hasil amobilisasi dengan suhu optimum yaitu 70°C dengan
nilai KM yaitu 6,90 mg mL-1 dan Vmaks yaitu 90,09 mol mL-1 menit -1. Uji
stabilitas termal enzim sesudah amobilisasi pada suhu 60°C selama 60 menit
masih memiliki aktivitas sisa sebesar 51%, ki = 0,0136 menit-1, t1/2 = 50,96 menit,
-1
i = 105,12 kJ mol .
Hasil amobilisasi menunjukkan peningkatan stabilitas termal enzim hingga
1,51 kali dibandingkan enzim hasil pemurnian sebelum amobilisasi. Data yang
diperoleh menunjukkan penurunan nilai KM dan kenaikan nilai Vmaks, penurunan
nilai ki, peningka
i yang menunjukkan bahwa amobilisasi
meningkatkan rigiditas enzim sehingga lebih stabil terhadap pH dan suhu.
Kata kunci :
-amilase, Bacillus subtilis ITBCCB148, Amobilisasi Enzim, CMSephadex C-50.
V. KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa :
-amilase hasil pemurnian hingga tahap
kromatografi kolom menggunakan CM-selulosa adalah 21.400 U/mg,
kemurniannya meningkat sebesar 15 kali dibandingkan dengan ekstrak kasar
enzim dengan perolehan 11%.
2. Enzim
-amilase hasil pemurnian memiliki suhu optimum 60oC, nilai KM =
6,32 mg mL-1 substrat, nilai Vmaks =
mL-1menit-1, dan uji
stabilitas enzim hasil pemurnian pada suhu 60oC selama 60 menit masih
memiliki aktivitas sisa = 23%.
3. Enzim hasil amobilisasi mengalami pergeseran suhu optimum menjadi 70 oC,
nilai KM = 6,90 mg mL-1 substrat, nilai Vmaks = 90,09
mL-1 menit-1,
enzim hasil amobilisasi dapat digunakan hingga 3 kali pengulangan, dan uji
stabilitas enzim hasil amobilisasi pada suhu 60oC selama 60 menit masih
memiliki aktivitas sisa = 51%.
4. Uji stabilitas enzim hasil pemurnian pada suhu 60oC memiliki t½ = 33,64
menit, ki = 0,0206 menit-1
i
= 103,97 kJ mol-1-.
5. Uji stabilitas enzim hasil amobilisasi pada suhu 60oC memiliki t½ = 50,96
menit, ki = 0,0136 menit-1
i
= 105,12 kJ mol-1-. Stabilitas termal
enzim hasil amobilisasi meningkat hingga 1,51 kali dibandingkan dengan
enzim hasil pemurnian. Penurunan nilai ki, peningkatan waktu paruh (t½),
dan peningkatan nilai p
i)
menunjukkan bahwa enizm hasil amobilisasi lebih stabil dibandingkan
dengan enzim hasil pemurnian.
B. Saran
Dari hasil penelitian yang diperoleh, maka disarankan untuk dilakukan
-amilase dengan
CM-Sephadex C-50 secara kromatografi penukar ion dan mencari alternatif
matriks pengamobil selain CM-Sephadex C-50
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Enzim adalah katalis yang memiliki keunggulan sifat dapat membantu prosesproses kimia kompleks pada kondisi percobaan yang lunak dan lebih ramah
lingkungan (Mateo, 2007). Kelebihan enzim sebagai katalisator antara lain enzim
memiliki spesifitas tinggi, mempercepat reaksi kimiawi spesifik tanpa
pembentukan senyawa samping, produktivitas tinggi, dan umumnya produk akhir
yang terbentuk tidak terkontaminasi sehingga mengurangi biaya purifikasi
(Chaplin dan Bucke, 1990). Salah satu enzim yang sering digunakan dalam
-amilase. Enzim
-
amilase adalah enzim yang dapat mengkatalisis penguraian pati menjadi glukosa,
maltosa, dan oligosakarida. Pada industri pangan enzim
-amilase digunakan
dalam memproduksi sirup gula cair, sari buah, dan selai sedangkan pada industri
non pangan banyak dipakai pada industri tekstil (Richana, 2000).
-amilase dapat diperoleh dari berbagai sumber, salah satunya dari
Bacillus Subtilis.
-amilase dihasilkan dari Bacillus subtilis secara
ekstraseluler, enzim ini memiliki kelebihan dibandingkan enzim yang dihasilkan
secara intraseluler, yaitu enzim ini dapat diperoleh dalam keadaan murni dengan
cara pemisahan dan pemurnian yang tidak begitu rumit (Smith, 1990).
2
-amilase dapat digunakan dalam industri jika memiliki kestabilan termal
yang tinggi dan rentang pH yang lebar sehingga diperlukan metode yang tepat
untuk mendapatkan enzim dengan kestabilan yang tinggi (Soemitro, 2005). Salah
satu cara yang dapat digunakan untuk mendapatkan enzim yang stabil adalah
dengan teknik amobilisasi. Chibata (1978) menjelaskan bahwa metode
amobilisasi enzim ada tiga macam yaitu : (1) Metode penjebakan, (2) Metode
pengikatan (adsorbsi) pada bahan pendukung, dan (3) Metode ikatan silang.
Amobilisasi enzim dengan metode pengikatan (adsorpsi) dapat dilakukan dengan
berbagai cara yaitu dengan adsopsi fisik, ikatan ionik, dan ikatan kovalen.
Amobilisasi enzim dengan metode pengikatan (adsorbsi) dengan cara ikatan ion
dapat dilakukan dengan berbagai bahan pendukung, salah satunya dengan CMSephadex C-50 (karboksi metil Sephadex C-50). Diantara yang telah
menggunakan metode pengikatan (adsorbsi) dengan cara ikatan ion sebagai
pengamobil yaitu Devi Susanti (2010), dengan menggunakan CM-selulosa
(karboksi metil selulosa). Hal ini mengindikasikan bahwa CM-Sephadex C-50
(karboksi metil Sephadex C-50) sangat berpeluang sebagai adsorben pengamobil
enzim
-amilase yang dihasilkan oleh Bacillus subtilis ITBCCB148.
B. Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah :
3
1. Memproduksi, mengisolasi dan memurnikan enzim
Bacillus
subtilis
ITBCCB148
hingga
tahap
-amilase dari
kromatografi
kolom
menggunakan CM-selulosa.
2. Menentukan karakteristik enzim yang meliputi suhu optimum, stabilitas
termal, dan nilai KM dan VMaks enzim hasil pemurnian.
3. Menentukan karakteristik enzim yang meliputi suhu optimum, stabilitas
termal, nilai KM dan VMaks, serta pemakaian berulang enzim hasil hasil
amobilisasi.
4. Menentukan konstanta laju inaktivasi termal (ki), waktu paruh (t½), dan
i)
enzim hasil pemurnian.
5. Menentukan konstanta laju inaktivasi termal (ki), waktu paruh (t½), dan
perubahan energ
i)
enzim hasil amobilisasi.
C. Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai kemampuan
CM-Sephadex C-50 sebagai bahan pengamobil enzim
substilis ITBCCB148.
-amilase dari Bacillus
THE IMMOBILIZATION OF -AMYLASE ENZYME FROM Bacillus
subtilis ITBCCB148 USING CM-Sephadex C-50
BY
Feraliana
-amylase is an enzyme that breaks -1,4 glycoside bond in amylum. It has
been widely used in a number of industrial processes such as food industry and non
food industry. In industrial process, this enzyme must be able to work in an extreme
pH and temperature. However, an enzyme is not normally stable in these conditions.
The aim of this research is to increase the stability of -amylase obtained from
Bacillus subtilis ITBCCB148 with immobilization method using CM-Sephadex C-50.
To achieve this aim, the steps done in this research were production, isolation, and
purification of the enzyme which includes fractionation with ammonium sulphate,
dialysis and chromatography with CM-cellulose. The pure enzyme was then
immobilized using CM-Sephadex C-50. The activity of -amylase was determined by
Fuwa and Mandels methods, while the protein concentration was determined by
Lowry method.
The result showed that the specific activity of pure enzyme was 21.400 U/mg,
an increase of 15 times compared to the enzyme raw extract with a recovery of 11%.
The optimum temperature for pure enzyme was 60oC, KM value of 6.32 mg mL-1
substrate and Vmax value of 138.89 mol mL-1 min.-1. The thermal stability test at
60°C for 60 minutes showed the residual activity of 23%, t1/2 = 33.64 minutes, ki =
-1
0.0206 min.-1
i = 103.97 kJ mol . The immobilized enzyme has optimum
temperature of 70oC, KM value of 6.90 mg mL-1 substrate and Vmax. value of 90.09
mol mL-1 min.-1. The thermal stability test of immobilized enzyme at 60°C for 60
minutes showed the residual activity was 51%, ki = 0.0136 min.-1, t1/2 = 50.96
-1
minutes
i = 105.12 kJ mol .
Compared to the pure enzyme, the thermal stability of the immobilized enzyme
was increased 1.51 times. The decrease of KM value, the increase of Vmax value, the
decrease of ki, the increase of t1/2 and
i showed that the immobilization process has
increased the rigidity of the enzyme, as a result the enzyme was more stable against
pH and temperature.
Key word :
-amylase, Bacillus subtilis ITBCCB148, immobilization process, CMSephadex C-50.
ABSTRAK
AMOBILISASI ENZIM -AMILASE DARI Bacillus
subtilis ITBCCB148 DENGAN MENGGUNAKAN CM-Sephadex C-50
Oleh
Feraliana
-1,4 glikosida
pada amilum. Enzim ini banyak dimanfaatkan dalam proses-proses industri baik
yang berhubungan dengan pangan maupun non-pangan. Dalam proses industri,
enzim ini harus mampu bekerja pada pH ekstrim dan mempunyai stabilitas termal
yang tinggi. Namun, umumnya enzim tidak stabil pada kondisi tersebut.
-amilase dari
Bacillus subtilis ITBCCB148 dengan cara amobilisasi menggunakan CMSephadex C-50. Untuk mencapai tujuan tersebut, dilakukan produksi, isolasi, dan
pemurnian enzim meliputi : fraksinasi dengan amonium sulfat, dialisis, dan
kromatografi kolom penukar kation CM-selulosa. Enzim hasil pemurnian
kemudian diamobilisasi dengan menggunakan CM-Sephadex C-50. Penentuan
aktivitas -amilase dilakukan dengan metode Fuwa dan metode Mandels,
sedangkan penentuan kadar protein dilakukan dengan metode Lowry.
Hasil penelitian menunjukkan enzim hasil pemurnian memiliki aktivitas
spesifik sebesar 21.400 U/mg, meningkat kemurniannya 15 kali dibandingkan
ekstrak kasar enzim dengan perolehan 11%. Enzim ini memiliki suhu optimum
60°C, harga KM = 6,32 mg mL-1 substrat dan harga Vmaks = 138,89 mol mL-1
menit-1. Uji stabilitas termal pada suhu 60°C selama 60 menit masih memiliki
-1
aktivitas sisa 23%, t1/2 = 33,64 menit, ki = 0,0206 menit-1
i = 103,97 kJ mol .
Amobilisasi enzim hasil pemurnian dengan menggunakan CM-Sephadex C-50
menghasilkan enzim hasil amobilisasi dengan suhu optimum yaitu 70°C dengan
nilai KM yaitu 6,90 mg mL-1 dan Vmaks yaitu 90,09 mol mL-1 menit -1. Uji
stabilitas termal enzim sesudah amobilisasi pada suhu 60°C selama 60 menit
masih memiliki aktivitas sisa sebesar 51%, ki = 0,0136 menit-1, t1/2 = 50,96 menit,
-1
i = 105,12 kJ mol .
Hasil amobilisasi menunjukkan peningkatan stabilitas termal enzim hingga
1,51 kali dibandingkan enzim hasil pemurnian sebelum amobilisasi. Data yang
diperoleh menunjukkan penurunan nilai KM dan kenaikan nilai Vmaks, penurunan
nilai ki, peningka
i yang menunjukkan bahwa amobilisasi
meningkatkan rigiditas enzim sehingga lebih stabil terhadap pH dan suhu.
Kata kunci :
-amilase, Bacillus subtilis ITBCCB148, Amobilisasi Enzim, CMSephadex C-50.
V. KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa :
-amilase hasil pemurnian hingga tahap
kromatografi kolom menggunakan CM-selulosa adalah 21.400 U/mg,
kemurniannya meningkat sebesar 15 kali dibandingkan dengan ekstrak kasar
enzim dengan perolehan 11%.
2. Enzim
-amilase hasil pemurnian memiliki suhu optimum 60oC, nilai KM =
6,32 mg mL-1 substrat, nilai Vmaks =
mL-1menit-1, dan uji
stabilitas enzim hasil pemurnian pada suhu 60oC selama 60 menit masih
memiliki aktivitas sisa = 23%.
3. Enzim hasil amobilisasi mengalami pergeseran suhu optimum menjadi 70 oC,
nilai KM = 6,90 mg mL-1 substrat, nilai Vmaks = 90,09
mL-1 menit-1,
enzim hasil amobilisasi dapat digunakan hingga 3 kali pengulangan, dan uji
stabilitas enzim hasil amobilisasi pada suhu 60oC selama 60 menit masih
memiliki aktivitas sisa = 51%.
4. Uji stabilitas enzim hasil pemurnian pada suhu 60oC memiliki t½ = 33,64
menit, ki = 0,0206 menit-1
i
= 103,97 kJ mol-1-.
5. Uji stabilitas enzim hasil amobilisasi pada suhu 60oC memiliki t½ = 50,96
menit, ki = 0,0136 menit-1
i
= 105,12 kJ mol-1-. Stabilitas termal
enzim hasil amobilisasi meningkat hingga 1,51 kali dibandingkan dengan
enzim hasil pemurnian. Penurunan nilai ki, peningkatan waktu paruh (t½),
dan peningkatan nilai p
i)
menunjukkan bahwa enizm hasil amobilisasi lebih stabil dibandingkan
dengan enzim hasil pemurnian.
B. Saran
Dari hasil penelitian yang diperoleh, maka disarankan untuk dilakukan
-amilase dengan
CM-Sephadex C-50 secara kromatografi penukar ion dan mencari alternatif
matriks pengamobil selain CM-Sephadex C-50
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Enzim adalah katalis yang memiliki keunggulan sifat dapat membantu prosesproses kimia kompleks pada kondisi percobaan yang lunak dan lebih ramah
lingkungan (Mateo, 2007). Kelebihan enzim sebagai katalisator antara lain enzim
memiliki spesifitas tinggi, mempercepat reaksi kimiawi spesifik tanpa
pembentukan senyawa samping, produktivitas tinggi, dan umumnya produk akhir
yang terbentuk tidak terkontaminasi sehingga mengurangi biaya purifikasi
(Chaplin dan Bucke, 1990). Salah satu enzim yang sering digunakan dalam
-amilase. Enzim
-
amilase adalah enzim yang dapat mengkatalisis penguraian pati menjadi glukosa,
maltosa, dan oligosakarida. Pada industri pangan enzim
-amilase digunakan
dalam memproduksi sirup gula cair, sari buah, dan selai sedangkan pada industri
non pangan banyak dipakai pada industri tekstil (Richana, 2000).
-amilase dapat diperoleh dari berbagai sumber, salah satunya dari
Bacillus Subtilis.
-amilase dihasilkan dari Bacillus subtilis secara
ekstraseluler, enzim ini memiliki kelebihan dibandingkan enzim yang dihasilkan
secara intraseluler, yaitu enzim ini dapat diperoleh dalam keadaan murni dengan
cara pemisahan dan pemurnian yang tidak begitu rumit (Smith, 1990).
2
-amilase dapat digunakan dalam industri jika memiliki kestabilan termal
yang tinggi dan rentang pH yang lebar sehingga diperlukan metode yang tepat
untuk mendapatkan enzim dengan kestabilan yang tinggi (Soemitro, 2005). Salah
satu cara yang dapat digunakan untuk mendapatkan enzim yang stabil adalah
dengan teknik amobilisasi. Chibata (1978) menjelaskan bahwa metode
amobilisasi enzim ada tiga macam yaitu : (1) Metode penjebakan, (2) Metode
pengikatan (adsorbsi) pada bahan pendukung, dan (3) Metode ikatan silang.
Amobilisasi enzim dengan metode pengikatan (adsorpsi) dapat dilakukan dengan
berbagai cara yaitu dengan adsopsi fisik, ikatan ionik, dan ikatan kovalen.
Amobilisasi enzim dengan metode pengikatan (adsorbsi) dengan cara ikatan ion
dapat dilakukan dengan berbagai bahan pendukung, salah satunya dengan CMSephadex C-50 (karboksi metil Sephadex C-50). Diantara yang telah
menggunakan metode pengikatan (adsorbsi) dengan cara ikatan ion sebagai
pengamobil yaitu Devi Susanti (2010), dengan menggunakan CM-selulosa
(karboksi metil selulosa). Hal ini mengindikasikan bahwa CM-Sephadex C-50
(karboksi metil Sephadex C-50) sangat berpeluang sebagai adsorben pengamobil
enzim
-amilase yang dihasilkan oleh Bacillus subtilis ITBCCB148.
B. Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah :
3
1. Memproduksi, mengisolasi dan memurnikan enzim
Bacillus
subtilis
ITBCCB148
hingga
tahap
-amilase dari
kromatografi
kolom
menggunakan CM-selulosa.
2. Menentukan karakteristik enzim yang meliputi suhu optimum, stabilitas
termal, dan nilai KM dan VMaks enzim hasil pemurnian.
3. Menentukan karakteristik enzim yang meliputi suhu optimum, stabilitas
termal, nilai KM dan VMaks, serta pemakaian berulang enzim hasil hasil
amobilisasi.
4. Menentukan konstanta laju inaktivasi termal (ki), waktu paruh (t½), dan
i)
enzim hasil pemurnian.
5. Menentukan konstanta laju inaktivasi termal (ki), waktu paruh (t½), dan
perubahan energ
i)
enzim hasil amobilisasi.
C. Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai kemampuan
CM-Sephadex C-50 sebagai bahan pengamobil enzim
substilis ITBCCB148.
-amilase dari Bacillus