Studies On Freezing and Frozen Storage Of Lactic Bacteria Isolated from Dadih For Producing Starter Culture
KAJIAN PROSES PEMBEKUAN DAN DAYA SIMPAN
KULTUR BAKTERI LAKTAT ASAL DADlH UNTUK
PRODUKSI KULTUR STARTER
Oleh :
Darti Nurani
PROGRAM PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2002
ABSTRACT
STUDIES ON FREEZING AND FROZEN STORAGE OF
LACTIC BACTERIA ISOLATED FROM DADIH FOR PRODUCING
STARTER CULTURE
Supervised by Tun Tedja, Ani Suyani dan Ingrid S. Surono
Dadih is a traditional fermented milk of West Sumatra - Indocesia, fermented
in bamboo tube. Some srains of lactic acid bacteria isolated fiom Dadih possess
probiotic properties; hence, it is important to study the effect of preservation of the
lactic acid culture on their viability and biochemical properties during fiozen storage.
Four strains of lactic acid bacteria isolated from Dadih which have good
antimutagenic properties are Lactococcus Iactis subsp lactis R-22, Leuconostoc
pmamesenteroides R-5 1, Lactobacillus casei subsp casei R-52 and Leuconostoc
paramesenteroides R-62. The lactic culture were preserved by fieezing at -20°C by
different freezing methods, fiozen in deep freezer (slow fieezing) and frozen in dry
ice-ethanol mixture (fast freezing). Glycerol lo%, dimethylsulfoxide @MSO) 10%
and skim milk 10% were used as cryoprotectant with phosphat buffer pH 7,O as
control. The cultures were stored in deep freezer at -20°C as well as -70°C. The
addition of glicerol 10% in Lactobacillus cmei subsp. casei R-52 culture frozen by
fast freezing showed relatively stable viability and capability of lactic acid production
as an indicator of a good starter culture. There were no significantly different in
viability and capability of lactic acid production during 8 weeks fiozen storage at
-20°C and -70°C. However, fiozen storage at -70°C could maintain proteolitic
activity better than at -20°C during 8 weeks fiozen storage. Media formulation using
soy milk with 3% of glucose can shorten incubation time comparing with media
formulation using skim milk with 3% of glucose and also coconut water with 3% of
glucose.
SURAT PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul :
KAJIAN PROSES PEMBEKUAN DAN DAYA SIMPAN
KULTUR BAKTERI LAKTAT ASAL DADIH UNTUK PRODUKSI
KULTUR STARTER
adalah benar merupakan hasil karya saya sendiri dan belum pernah
dipublikasikan. Semua sumber data dan informasi yang digunakan telah
dinyatakan secara jelas dan dapat diperiksa kebenarannya.
Judul Tesis
: KAJIAN PROSES PEMBEKUAN DAN DAYA
SIMPAN KULTUR BAKTERI LAKTAT ASAL
DADlH UNTUK PRODUKSI KULTUR STARTER
Nama mahasiswa : DART1 NURANI
Nomor pokok
: 97333
Menyetujui
1. Komisi Pembimbing
\
/Dr. Ir. Tun Tedia Irawadi, MS)
Ketua
i.
/Dr. lr! ~ d ~ u d a nDEA)
MXV'jta
2. Ketua Program Studi
/Dr. Ir. lnarid S. Surono. MScl
Anggota
&&
'-
(Dr. Ir. lrawadi Jamaran)
Tanggal disetujui : 27 Maret 2002
Manuwoto, MSc.)
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan pada tanggal 21 Juli 1961 di Magelang dari pasangan
Sunaryo dan Sriwiyati. Pada tahun 1980 penulis lulus dari SMA Negeri I
Magelang. Penulis memperoleh gelar Sarjana dalam bidang Pengolahan Hasil
Pertanian pada Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Gajah Mada, Jogyakarta
pada tahun 1986. Tahun 1991, penulis menikah dengan Heri Suryanto serta
dikaruniai dua orang anak, Niken Kinanti Suryanto (10 iahun) dan Kenan
Armyansyah Suryanto (8 tahun).
Tahun 1987 sampai sekarang penulis adalah staf pengajar di Jurusan
Teknologi Industri Pertanian, Institut Teknologi Indonesia, Serpong. Tahun 1997,
penulis terdaftar sebagai mahasiswa Pascasarjanti IPB dan mengambil Program
Studi Teknologi Industri Pertanian.
PRAKATA
Puji syukur kehadirat Allah SWT atas perkenan dan ridhoNya penulis
mampu menyelesaikan tesis ini. Pada kesempatan ini penulis ingin menyampailcan
rasa terima kasih yang sebesar-besarnya kepada mereka yang telah terlibat
langsung atau tidak langsung dalam penyusunan tesis :
1. Dr. Ir. Tun Tedja Irawadi, MS, sebagai Ketua Komisi Pembimbing atas
kesabarannya dalam membimbing, nlengarahkan dan memberikan
dukungan moril dalam rangkaian penyusunan tesis ini.
2. Dr. Ani Suryani, DEA, sebagai anggota Komisi Pembimbing dan Kepala
Laboratorium Rekayasa Bioproses - Pusat Antar Universitas Bioteknologi
waktu itu atas
bimbingan, saran, dan diperkenankannya penulis
menggunakan fasilitas laboratorium untuk melakukan penelitian dalam
rangka penyusunan tesis ini.
3. Dr. Ir. Ingrid S. Surono, MSc, sebagai anggota Komisi Pembimbing yang
telah memberikan bimbingan, saran, semangat, kesempatan dan
kepercayam kepada p u l i s untuk mengerjakan sebagian Project
University Research for Graduate Education (URGE), The Young
Academic Program, Batch III tahun 1998/2000, serta yang telah
mengenalkan penulis dengan bakteri asam laktat sehingga penulis dapat
mengenal lebih dekat dan dapat turut mengagumi keunggulan bakteri
laktat asal dadih.
-
4. Dekan Fakultas Teknologi Pertanian Institut Teknologi Indonesia, Ketua
dan Staff Jurusan Teknologi Industri Pertanian, IT1 yang telah memberi
kesempatan kepada penulis untuk melanjutkan studi di Program
Pascasarjana, IPB dan memberikan dukungan moril sehingga penulis
dapat menyelesaikan tesis ini.
5. Rekan-rekan seperjuangan di Laboratorium di lingkungan PAU-
Bioteknologi, IPB periode 1999-2000, baik teknisi, mahasiswa S1, S2 dan
S3 yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu atas kerjasamanya
selama penulis melaksanakan penelitian.
6. IShusus untuk suami Heri Suryanto dan anak-anak tercinta Niken Kinanti
Suryanto dan Kenan Armyansyah Suryanto atas dukungan dan
pengertiannya yang rnendalam serta keleluasaan waktu yang diberikan
sehingga penulis dapat melaksanakan penelitian dan menyusun tesis ini
dengan tenang.
Akhirnya penulis memohon maaf atas segala bentuk kekurangan dan
ketabatasan yang ada, namun penulis berharap semoga hasil penelitian ini dapat
bermanfmt bagi yang memerlukannya.
Bogor, 9 Maret 2002
Penulis
DAFTAR IS1
Kata Pengantar .......................................................................iv
Daftar Isi .............................................................................. vi
Daftar Tabel ..........................................................................
...
vlil
Daftar Garnbar ........................................................................ix
Daftar Lampiran ...................................................................... x
PENDAHULUAN .................................................................
1
.......................................
Latar Belakang .......................
.
.
1
Tujuan Penelitian ........................
2
Ruang Lingkup ............................:..................................... 2
TINJAUAN PUSTAKA .........................................................
4
Isolat Bakteri Asam Lalctat asal Dadih ........................................ 4
Presewasi dan Penyimpanan Mikroba ........................................ 6
Pembekuan Kultur Bakteri ...................................................... 8
Cryoprotectant .................................................................... 12
Media Kultur Starter Bakteri Asam Laktat ..................................
14
METODOLOGI PENELITIAN ................................................. 16
Metode ............................................................................. 17
Rancangan Percobaan ............................................................ 19
.
a
DAFTAR TABEL
1.
Pengaruh metoda pembekuan pada viabilitas kultur bakteri asam
laktat selama penyimpanan beku ..........................................
2.
Pengaruh jenis cryoprotectant pada aktivitas proteolitik kultur bakteri
asam laktat selama penyimpanan beku.. ....................................
.3:
Pengaruh metoda pembekuan pada kemampuan pembentukan asam
laktat kultur bakteri asam laktat selama penyimpanan beku ............
4.
Pengaruh metoda pembekuan pada aktivitas proteolitik kultur bakteri
asam laktat selama peyimpanan beku .....................................
5.
Pengaruh jenis cryoprotectant pada aktivitas proteolitik kultur bakteri
asam laktat selama peyimpanan beku .....................................
6
Pengaruh suhu penyimpanan pada aktivitas proteolitik kultur bakteri
asam laktat selama peyimpanan beku .....................................
7.
Hasil pengamatan rata-rata perubahan viabilitas (log cfidml) kultur
starter bakteri asam laktat selama inhbasi pada media yang berbeda
8.
.
Hasil pengamatan rata-rata perubahan total asam (%) kultur starter
bakteri asam laktat selarna inkubasi pada media yang berbeda
DAFTAR GAMBAR
Viabilitas Lactobacillus casei subsp 'casei R-52 setelah pembekuan
dengan variasi metoda pembekuan selama penyimpanan beku ........
Viabilitas Lactobacillus casei subsp casei R-52 setelah pembekuan
dengan variasi jenis cryoprotectant selama penyimpanan beku .......
Kemampuan produksi asam laktat oleh kultur Lactobacillus carrei
subsp. Casei R-52 setelah pembekuan dengan variasi metoda
pembekuan selama penyimpanan beku ....................................
Aktivitas proteolitik pada kultur Lactobacillus casei subsp. Casei R52 setelah pembekuan dengan variasi metoda pembekuan selama
penyimpanan beku ...........................................................
Aktivitas proteolitik pada kultur Lactobacillus casei subsp. Casei R52 setelah pembekuan dengan variasi jenis cryoprotectant selama
penyimpanan beku ...........................................................
Aktivitas proteolitik Lactobacillus casei subsp. Casei R-52 setelah
pembekuan dan disimpan pada suhu yang berbeda .....................
Kurva perubahan viabilitas kultur starter Lactobacillus u w i subsp.
Casei R-52selama inkubasi pada media yang berbeda .................
Kurva perubahan viabilitas kultur starter Leuconostoc
paramesenteroides R-62selama inkubasi pada media yang berbeda ...
Kurva perubahan kadar asam total kultur starter Lactobacillus casei
subsp. Casei R-52selama inkubasi pada media yang berbeda ..........
Kuiva perubahan kadar asam total kultur starter Leuconosta:
paramesenteroides R-62selama inkubasi pada media yang berbeda ...
DAFTAR LAMPIRAN
Diagram Alir Rancangan Percobaan ............ . .. ......... .. ......... ..
Kultivasi Sel Bakteri Asam Laktat (To and Etzel, 1997) . ... ...... . . ...
Penyiapan Suspensi Pembekuan (To and Etzel, 1997) -... ... . .... . . .....
Penentuan Viabilitas Sel (To and Etzel, 1997) ... ...... . . ... .. ..... . . . . ...
Analisis Pembentukan Asam Laktat (Metode Mann's Acid Test) . . . ..
Analisis Aktivitas Proteolitik (Metode Bergmeyer dan Grassl, 1983)..
Viabilitas Kultur Bakteri Asam Laktat Sebelum maupun Sesudah
Pembekuan dan Penyimpanan ..... . ... ... ...... . ........ ........ . ... ........
Niai Total Asam (%) Kultur Bakteri Asam Laktat Sebelum maupun
Sesudah Pembekuan dan Penyimpanan ... .. ............. .. . ... ..... ... . ...
Aktivitas Proteolitik (UA) Kultur Bakteri Asam Laktat Sebelum
maupun Sesudah Pembekuan dan Penyimpanan ........................
Perbandingan Antar Pengaruh Metoda Pembehan, Cryoprotectant,
suhu dan Waktu Penyimpanan untuk Setiap strain terhadap Viabilitas
Perbandingan Antar Pengaruh Metoda Pembekuan, Cryoprotecctmrt,
suhu dan Waktu Penyimpanan untuk Setiap strain terhadap Total
Asam ... . . ...... .... ... ......... ........................ . .. . ............. .. ....
9
Perbandingan Antar Pengmh Metoda Pembekuan, Cryoprotectunt,
suhu dm Waktu Penyimpanan untuk Setiap strain terhadap W,vitas
Protwlitik .. . ...... ... .............................. ......... ....,........ . ....
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Di Indonesia, susu fermentasi sudah cukup dikenal. Dadih add$ salah
satu produk susu fermentasi tradisional Indonesia yang berasal dari Sumatra
Barat. Dadih serupa yogurt merupakan hasil fermentasi darniah; yang dilakukan
dengan menyimpan susu kerbau dalam tabung bambu selama semdam, dan
ditutup dengan daun pisang. Selma ini dadih hanya dikenal di daerah asalnya.
Berdasarkan hasil penelitian terdahulu diperoleh bahwa 36 strain bakteri
asam laktat asal dadih telah berhasil diisolasi dan diidentifikasi (Surono, et al.,
1983; Hosono, et al., 1989). Beberapa strain diantaranya diketahui bersifat
probiotik. Hal ini didukung oleh hail penelitian selanjutnya yang melaporkan
bahwa bakteri asam laktat asal dadih menunjukkan alctivitas antimutagenik dan
mampu menurunkan kolesterol darah secara in vitro dan in vivo. Disamping itu,
bakteri asam laktat asal dadih juga bersifat antimikroba terhadap bakteri enterik
patogen (Hosono dan Tono-oka, 1995; Surono dan Hosono, 1996; Surono, 2000).
Dengan ditemukannya beberapa strain bakteri asam laktat yang unggul,
hal ini memberikan peluang yang sangat baik untuk dapat diaplikasikan sebagai
kultur starter di industri fermentasi susu, sehingga akan dihasilkan produk dengan
keseragaman mutu yang dapat dikendalikan. Surono, dkk. (1997) melaporkan
bahwa Lactobacillus casei subsp casei R-52 mempunyai daya gumpal terhadap
protein susu yang halus dan tinggi setelah 12 jam inkubasi dengan kadar asam
2
total 0,3 persen yang terus meningkat hingga 0,6 persan selama 24 jam fermentasi,
sehingga berpotensi untuk digunakan sebagai starter susu fermentasi .
Proses presemasi merupakan salah satu tahapan penting dalam upaya
mempertahankan keunggulan suatu isolat yang berpotensi. Selama penyimpanan
sangat dimungkmkan terjadinya p e n m a n viabilitas akibat kernatian sel,
perubahan sifat genetik bahkan kemungkinan hilangnya s&t-sifat yang potensial.
Oleh karena itu metoda presemasi dan penyimpanan yang akau digunakan h a m
sesuai dengan karakter isolat, sehingga dapat memhimalii penufunm viabilitas
dan potensi yang dimilikinya selama penyimpanan. Pembekuan merupakan salah
satu alternatif presemasi kultur bakteri asam laktat.
Tujuan Penditian
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan kondisi terbaik proses
pembekuan dan penyimpanan beku bakteri asam laktat asal dadih dalam
mempertahankan viabilitas dan aktivitas biokimiawinya yang meliputi aktivitas
enzim proteolitik dan kemampuan mernproduksi asam laktat. Disamping itu dari
penelitian ini diharapkan dapat diperoleh hasil formulasi media terbaik dalarn
penyediaan kultur starter bakteri asam laktat asal dadih.
Ruang Lingiarp
Peneditian terdiri dari tiga tahap, yaitu tahap pembekuan, tahap
penyimpanan beku dan tahap formulasi media kultur starter. Pembekuan
dilakukan terhadap empat strain bakteri asam laktat d dadih, yang telah diteliti
sebelumnya mmiliki sifat antimutagen& yang baik. Perlakuan pada proses
3
pembekuan terdiri dari dua macam, yaitu metoda pembekuan dan jenis
cryoprotectant.
Penyimpanan dilakukan terhadap empat strain bakteri asam laktat yang
telah
dibekukan
dengan
dua
macam
perlakuan. Penyimpanan
beku
. dikelompokkan dalam dua kondisi suhu yang berbeda di dalam deepfieezer.
Dari hasil pembekuan dan penyimpanan beku akan diperoleh strain bakteri
asam laktat yang paling stabil selama pembekuan dan penyimpanan beku.
Terhadap strain yang terpilih tersebut, selanjutnya dibuat formulasi media kultur
starter dengan variasi tiga macam formula media
Pengamtan dilakukan terhadap kultur, sebelum dan sesudah pembekuan,
selama penyimpanan beku sdiap selang 2 minggu selama 8 minggu. Penkamatan
meliputi viabilitas, kadar asam total dan &vita proteolitik.
TINJAUAN PUSTAKA
Isolat bakteri asam laktat asal dadih
Bakteri asam laktat adalah kelompok bakteri yang metabolisme
karbohidratnya membentuk asam laktat, baik sebagai satu-satunya produk atau
sebagai produk utama Bakteri ini tergolong bakteri Gram positif, tidak berspora,
anaerob tetapi aerotoleran dan toleran terhadap asam (Salminen dan Atte von
Wright, 1993).
Bakteri asam laktat dapat berasal dari saluran pencemaan manwia,
produk-produk susu dan secara alarniah terdapat pada permukaan tanaman
tertentu. Beberapa spesies bakteri asam laktat digudcan secara komersial untuk
memproduksi susu fennentasi dan produk-produk daging. Bakteri asam laktat
mdiputi genus, Lactowccuss Enterowccuss Lactobacillus, Leucon~stoc, dan
Pediococcus (Salminen dan Atte von Wright, 1993).
Dalam produk pangan umumnya bakteri asam laktat tidak berbahaya dan
memenuhi status GRAS (Generally Rewgnized As Safe). Di Amerilca, bahkan
memberikan efek berxnadaat bagi manusia, karena kornponen metabolit yang
dihasilkannya dapat menghambat bakteri anterik patogm, mengatasi lactose
intolerance, menurunkan kadar kolesterol, antimutagenik dan antikarsinogenik,
serta memperbaiki sistem kekebalan tubuh (Surono, 1 998).
Keaneka-ragaman pengolahan susu secara tradisional di Indonesia
khususnya susu ferrnentasi, seperti misalnya dadih dari Sumatra Barat dan
cologanti dari Nusatenggara Barat, tentunya memugkinkan ketersediaan bakteri
asam laktat yang beragam.
Dadih adalah produk susu fermentasi serupa yogurt dari Surnatera Barat,
yaitu hasil fermentasi alarniah yang dilakukan dengan menyimpan susu dalam
tabung bambu selama semalam, dan ditutup dengan daun pisang dan bambu.
Bakteri asam laktat terdapat dominan dalam dadih dan 36 strain bakteri asam
laktat telah berhasil diisolasi dan diidentifikasi (Surono, et al., -1983; Hosono, et
al., 1989).
Menurut Azria (1986), kandungan mikroba dalam tabung bambu adalah
2,5x1o2 sampai 1,ox1o3 koloni per cm2,yang didominasi oleh bakteri pembentuk
asam dan bersifat proteolitik. Sedang Hosono, et al. (1989) melaporkan bahwa
total bakteri pada dadih segar berasal dari Bukittinggi sebesar 3,s sampai 4,3x108
koloni per gram, didominasi oleh bakteri asam laktat, dan Leuconostoc
paramesenteroides mendominasi populasi bakteri asam laktat pada dadih, yaitu
50 persen dari populasi, sedang Lactobacillus casei subsp casei sebesar 11
persen.
Lactobacillus casei subsp casei, Leuconostoc paramesenteroides,
Enterococcus faecalis subsp liquefaciens, Lactococcus lactis subsp lactis asal
dadih menunjukkan aktivitas antimutagenik dan marnpu menurunkan kadar
kolesterol darah secara in vitro maupun in vivo, serta daya pengikatan sel bakteri
asam laktat terhadap senyawa mutagenik dan mampu menurunkan kadar
kolesterol darah secara in vitro sebesar 34 persen (Surono dan Hosono, 1996;
Hosono dan Tono-oka, 1995).
Bakteri asam laktat asal dadih juga dilaporkan mempunyai sifat
antimikroba terhadap bakteri enterik patogen seperti rnisalnya Salmonella
6
typhymuriwn, Escherichia coli dan Shigella sp (Surono, 2000). Menurut Surono
(1997), sifat antimikroba patogen yang dimiliki oleh bakteri asaml laktat
disebabkan oleh sif-ya
yang cocok dengan nutrisi yang tersedia, sehingga lebih
unggul dalam kompetisinya dengan mikroba patogen. Disamping itu, bakteri
asam laktat juga memproduksi metabolit seperti asam organ&, Hz& dan
bakteriosin, serta menstirnulir sistim kekebalan tubuh.
Hasil penelitian selanjutnya menyatakan bahwa Lactobacillus casei subsp
casei R-52 mempunyai daya gumpal yang halus dan tinggi setelah 12 jam
inkubasi dengan total asam 0,s persen yang terus meningkat hingga 0,6 persen
selama 24 jam fermentasi, sehingga berpotensi untuk digunakan sebagai starter
susu fermentasi (Surono, dkk, 1997).
Preservasi dan Penyimpanan Mikroba
Pada dasamya, preservasi dan penyimpanan rnikroba memiiiki berbagai
tujuan: (1) tujuan taksonomi, mikroba diperlukan untuk 'perpustakaan' strain
dengan karakteristik yang spesifik, baik untuk tujuan identifikasi maupun
pengajaran;
(2) tujuan penelitian, mikroba diperlukan para peneliti untuk
mdakukan penelitian-penditian di berbagai bidang, baik di bidang pangan,
pertanian maupun kesehatan; (3) tujuan industri, berbagai mikroba mempunyai
potensi untuk dimanfaatkan di bidang industri dan untuk menjaga agar potensi ini
tetap stabil, diperlukan penyimpanan yang baik; (4) tujuan lain, misalnya di
bidang kedokteran, mikroba diperlukan untuk pagujian atau referensi.
Penyimpanan mikroba harus dikelola dengan baik, karena pengelolaan
yang kurang baik akan berakibat pada : (1) terjadinyul hntaminasi, strain yang
dikehendaki hilang atau terdesak oleh kontaminan sehingga perlu dilakukan
isolasi kembali dan purifikasi; (2) sfrain mati, apabila strain tidak lagi dapat
ditumbuhkan, maka harus d~lakukanisolasi kembali yang kemungkman tidak
sama dengan aslinya, atau kalau strain tersebut diperoleh dari koleksi kultur
tertentu rnaka perlu pengiriman kembali;
(3) perubahan sifat, strain yang
mengalami transfer berkali-kali, dapat mengalami perubahan sifat genetik bahkan
kemunglunan hilangnya (berkurangnya) sifat-sifat yang potensial.
Berbagai teknik telah dikembangkan untuk penyimpanan rnikroba dm
memilih teknik penyimpanan yang tepat untuk suatu jenis mikroba adalah hal
yang tidak mudah. Masing-masing metoda mempunyai keuntungan maupun
kerugian. UIltuk memilih metoda penyimpanan perlu diperhatikan beberapa
faktor, yaitu jumlah kultur, nilai kultur, fiekuensi penggunaan kultur, fasilitas
yang dimiliki (peralatan dm sumber daya manusia) d m biaya Namun demikian,
penyimpanan yang diterapkan harus tetap dapat mernpertahmkan mikroba agar
tidak mati, tidak terkontaminasi, tidak mengalami perubahan populasi melalui
seleksi, dan tidak mengalami perubahan genetik.
Yang perlu diketahui bahwa tidak ada satu metodapun yang dapat
digunakan untuk menyimpan semua jenis mikroba, bahkan strain yang berbeda di
dalarn satu spesiespun memiliki perbeciaan respon terhadap stress akibat dari
metoda penyimpanan yang dilakukan.
Menurut Moms (1991), terdapat tiga metoda untuk preservasi dan
penyimpanan mikroba, yaitu : (1) metoda continuous growth, (2) metoda
pengeringan dan (3) metoda metabolisme tersuspensi.
8
Preservasi dengan metoda continous growth, adalah preservasi yang
dilakukan dengan menurnbuhkan mikroba secara periodik dari medium lama ke
dalam medium baru untuk memperoleh kondisi pertumbuhan optimum. Cara ini
biasanya diikuti dengan penyimpanan dalam repigerator atau peezer (-10°C
sampai -20°C), dan khususnya untuk biakan jamur dapat disimpan dengan
perendaman dalam minyak mineral (oil storage) atau penyimpanan dengan
perendaman dalam air steril (water storage).
Metode pengeringan umurnnya digunakan untuk mikroba dalam keadaan
fase istirahat, rnisalnya kondisi mikroba dalam bentuk spora. Bentuk kapang
dapat dikeringkan dengan udara kering dan dapat dikeringkan di dalam atau di
atas silica gel.
Metabolisme tersuspensi adalah preservasi dengan cara menurunkan
kandungan cairan sel melalui dehidrasi peeze-drying) atau pembekuan. Produk
Peeze-drying membutuhkan kondisi penyimpanan vakum atau kondisi tekanan
atmosfir dalam gas inert. Sedang, untuk proses pembekuan diperlukan penurunan
suhu sampai di bawah -70°C yang diikuti dengan penyirnpanan pada suhu di
bawah
-139°C. Penyimpanan dapat dilakukan dalam Peezer, pencelupan dalam cairan
nitrogen atau menempatkan di atas cairan nitrogen.
Pembekuan Kultur Bakteri
Pembekuan merupakan salah satu alternatif preservasi kultur bakteri.
Prinsip preservasi mikroba dengan pembekuan adalah "pengeringan sementara"
sel melalui proses pembekuan, karena sebagian cairan sel akan keluar yang
disebabkan oleh perbedaan tekanan osmosis akibat pembentukan kristal es dan
kenaikan konsentrasi bahan terlarut di luar sel (ATCC, 1997).
Menurut Ray dan Speck (1973), proses pembekuan akan menyebabkan
berbagai perubahan fisik, kimiawi maupun biokimiawi sel bakteri. Pada
penurunan suhu 20°C sampai 10°C akan t e r j d perubahan konsentrasi larutan,
perubahan pH dan kenaikan kelarutan gas. Pada penurunan suhu 0°C sampai
-
10°C, pembekuan &an terjadi; yang dimulai dari bagian medium di luar sel
\
dengan terbentuknya kristal es. Suhu awal terjadinya pembekuan sangat
tergantung pada sifat dan konsentrasi zat terlarut di dalam suspensi medium. Jlka
cairan sel dapat mempertahankan kondisi tersebut sampai mencapai suhu -10°C
sampai -15"C, maka pembekuan di atas suhu tersebut, hanya akan terjadi di luar
sel.
Pembekuan selanjutnya &an berlangsung melalui dua kemungkinan, yaitu
dengan mengeluarkan air dari dalam sel dan membekukannya di luar sel
(dehidrasi) atau dengan membekukan cairan sel secara intraseluler. Hal ini
tergantung pada kecepatan pembekuan dan permeabilitas membran sel terhadap
air. Jika kecepatan pembekuan lambat atau permeabilitas membran tinggi, sel
akan membeku melalui pembentukan kristal es secara ekstraseluler. Tetapi jika
kecepatan pembekuan tinggi atau permeabilitas sel rendah, maka sel akan
membeku melalui pembentukan kristal es secara intraseluler.
Pembekuan sel akan menyebabkan kenaikan zat terlarut baik di dalam
maupun di luar sel. Penurunan pH juga akan terjadi dan akan menyebabkan
terjadinya presipitasi zat terlarut baik yang merniliki bobot molekul rendah
maupun tinggi. Disamping itu, perubahan pH akan menyebabkan pula terjadinya
denaturasi makromolekul. Konsentrasi elektrolit yang meningkat akan
mempengaruhi membran lipida yang akan dapat mengakibatkan kebocoran sel.
Kenaikan konsentrasi ion dapat menurunkan kekuatan ikatan hdrofobik, sehingga
konfigurasi makromolekul akan terganggu (Ray dan Speck, 1973).
Selama proses pembekuan kemungkinan kerusakan sel dapat terjadi
karena perbedaan sensitivitas untuk setiap jenis rnikroba terhadap pembekuan.
Menurut Mazur (1966), kerusakan sel selama pembekuan dapat terjadi &bat
terbentuknya
kristal
es
baik
intraseluler
maupun
ekstraseluler
dan
terkonsentrasinya zat terlarut baik ekstraseluler maupun intraseluler.
Kerusakan yang terjadi selama pembekuan dapat mengakibatkan: (1)
perubahan morfologi sel, (2) perubahan struktur sel, (3) perubahan fungsi sel atau
(4) perubahan stabilitas genetik sel (Ray dan Speck, 1973).
Beberapa faktor dapat mempengaruhi ketahanan sel selama proses
pembekuan, yaitu: (1) ukuran dan tipe sel, (2) urnur sel, (3) perrrieabilitas
membran sel, (4) pemakaian ciyQprotectant, (5) metode pembekuan, (6) metode
penyimpanan dan (7) metode thawing.
Faktor tipe sel dikemukakan di dalam ATCC (1997), bakteri tipe Gram
positif lebih tahan terhadap proses pembekuan daripada bakteri Gram negatif
Kultur yang terlalu tua atau terlalu muda akan sangat sensitif terhadap perlakuan
suhu rendah. Umumnya, untuk keperluan pembekuan dipilih sel pada fase
logaritrnik aMzlr atau awal fase stasioner, agar diperoleh hasil yang memuaskan.
11
Faktor permeabilitas sel, menurut ATCC (1997) berpengaruh .terhadap
sensitivitas sel selarna pembekuan. Sel yang berasal dari kultur cair yang diaerasi
akan memiliki permeabilitas yang baik dan akan memiliki toleransi yang tinggi
terhadap proses pembekuan cepat. Dikemukakan oleh Ray dan Speck (1973),
bahwa membran sel yang tersusun oleh sejumlah besar asam lemak tidak jenuh
akan bersifat lebih elastis dan merniliki permeabilitas yang baik terhadap air;
biasanya terdapat pada sel yang ditumbuhkan pada kondisi yang tepat.
Untuk membantu memperkecil kemungkinan terjadinya kerusakan sel
selama pembekuan, maka komponen bahan kimia dapat ditarnbahkan ke dalam
suspensi sel. Bahan kimia tersebut dikenal sebagai cryoprotectant, yang merniliki
sifat-sifat tertentu sehingga dapat berfungsi sebagai pelindung sel selama
pembekuan. Bahan tambahan yang sering digunakan untuk pembekuan sebagian
sel di ATCC adalah gliserol dan dimethylsu2fobide (DMSO) pada konsentrasi 5
sampai 10 persen (vlv).
Pengaruh metoda pembekuan terhadap ketahanan sel berkaitan dengan
suhu dan laju pembekuan yang digunakan, serta jenis sel yang dibekukan. Suhu
dan kecepatan pembekuan sangat menentukan apakah cairan sel akan dibekukan
secara internal atau ekstemal. Apabila laju pembekuan cepat, cairan sel akan
membeku secara internal. Apabila laju pembekuan lambat, cairan sel akan
dikeluarkan dan dibekukan secara ekstemal.
Untuk spesies bakteri tertentu, metode pembekuan cepat maupun lambat
dapat mengakibatkan kerusakan. Oleh karena itu, perlu ditentukan kecepatan
pembekuan yang optimum untuk spesies tertentu untuk mempertahankan
viabilitasnya. Kecepatan pembekuan yang tidak terlalu cepat untuk menghindari
kristalisasi secara internal dan tidak terlalu lambat untuk menghmdari kontak zat
terlarut dengan komponen sel yang dapat mengakibatkan kerusakan (Ray dan
Speck, 1973).
Dalarn ha1 pengaruh faktor metode penyimpanan terhadap ketahanan sel,
menurut Srnione dan Brown (1991), suhu penyimpanan beku berpengaruh
terhadap ketahanan hidup sel selama penyimpanan, yang disebabkan oleh
pembentukan kristal es yang masih dapat terus berlangsung pads suhu di bawah
suhu proses pembekuan.
Cryoprotedant
Cryoprotectant adalah komponen bahan kirnia yang dapat melindungi sel
dari kerusakan selarna proses pembekuan dan penyimpanan beku. Pada umumnya
komponen tersebut mengandung gugus OH dan NH2 dan gugus lainnya yang
memiliki kecenderungan untuk membentuk ikatan lvdrogen yang kuat diantara
komp~nentersebut, dengan makromolekd di permukaan sel atau dengan air (Ray
dan Speck, 1973).
Sedang, Morichi et al. (1963) mengemukakan bahwa ciri struktural
sehingga suatu komponen dapat dipilih sebagai pelindung sel selama pembekuan
adalah: (1) memiliki gugus fungsional dengan elektronegativitas yang tinggi pada
atom a-carbon, (2) lcelompok two acid (adan y-COOH), (3) mendekati bentuk NJ& dan -COOH.
Komponen tertentu mungkin dapat melindungi sel dari proses pembekuan
cepat maupun lambat, sekalipun bentuk kerusakan yang diakibatkan oleh kedua
metode pembekuan tersebut berbeda.
Namun pada dasarnya kemampuan
komponen tersebut untuk membentuk ikatan hidrogen dengan air maupun dengan
struktur sel
dapat mencegah kematian sel &bat pembentukan kristal es
intraseluler maupun terkonsentrasinya zat terlarut.
Mekanisme perlindungan cryoprotectant, di dalam ATCC (1997)
disebutkan bahwa cryoprotectant dapat mengurangi ukuran, jumlah dan kecepatan
pertumbuhan kristal es. Disamping itu cryoprotectant juga dapat m e m b d a n efek
koligatif, membantu berlangsungnya dehidrasi secara osmotik sibelurn
pembekuan, dapat m e n d a n titik beku sel, menstabilkan membran,
meningkatkan permeabilitas sel dan dapat bersifat bufer untuk mengimbangi
adapya perubahan pH selama pembekuan.
Cryoprotectant dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu cryoprotectant
dengan bobot molekul (BM) rendah dan cryoprotectant dengan bobot molekul
tinggi. Masing-masing kelompok dapat membantu mencegah kerusakan sel
selarna pembekuan, namun dengan mekanisme perlindungan yang berbeda.
Cryoprotectcmt BM rendah dapat berpenetrasi ke dalarn sel dan daya
larutnya di dalam air sangat baik, sehingga cenderung digunakan untuk mencegah
kerusakan yang diakibatkan oleh terbentuknya kristal es di dalarn sel (Meryman,
1966). Beberapa senyawa kimia BM rendah telah teruji kemampuannya sebagai
pelindung sel terhadap kerusakan pembekuan baik terhadap bakteri Gram positif
maupun bakteri Gram negatif antara lain gliserol, glikol, glukosa, sukrosa, laktosa,
asarn amino dan dimethylsuIfoxide (DMSO) (Ray dan Speck, 1973):
Cryoprotectant BM tinggi tidak dapat menembus sel, tetapi berperan
untuk
melindungi membran yang sensitif terhadap denaturasi &bat
terkonsentrasinya gararn selama pembekuan (Meryman, 1966).
Beberapa
komponen kimia BM tinggi tersebut antara lain gelatin, mucin, albumin,
polyviniZpyrolidone (PW)dan dekstran. Dilaporkan oleh Moss dan Speck (1963)
bahwa skim milk dapat mempertahankan viabilitas Streptococcus lactis sebesar 98
persen.
Media Kultur Starter Bakteri Asam Laktat
Formulasi media kultur starter susu fermentasi dapat dioptimumkan untuk
mendapatkan starter susu fermentasi yang dapat mernfermentasi susu dengan
cepat dan efisien. Berbagai media yang baik untuk pertumbuhan bakteri asam
laktat adalah susu skim, susu kedelai dan air kelapa, masing-masing mempunyai
keunggulan faktor yang mendukung pertumbuhan bakteri laktat.
Penggunaan susu kedelai sebagai media pada pembuatan minuman
fermentasi sudah lazim dilakukan disamping susu skim. Susu kedelai memiliki
keunggulan nilai nutrisinya untuk kepentingan kesehatan, karena tidak
mengandung kolesterol, laktosa dan juga hanya mengandung sedikit asam lemak
jenuh. Disamping itu harganyapun lebih murah. Menurut Mac Lwd dan Ames
(1988), beberapa jenis gula yang terpenting dalarn susu kedelai adalah sukrosa,
raffinosa dan melobiosa.
Air kelapa mempunyai potensi yang baik untuk dibuat minuman
fermentasi karena kandungan nutrisinya relatif lengkap. Air kelapa mengandung
gula maksimum 4 persen (rata-rata 2 persen) yang terdiri dari sukrosa, glukosa
dan fruktosa (Woodroof, 1979) dan sejurnlah vitamin B.
METODOLOGI
Bahan dan Alat
Kultur bakteri.
Bakteri asam laktat yang akan digunakan dalarn
penelitian ini sejumlah empat strain yang merupakan isolat dari dadih asal
Bukittinggi, yang terdiri dari: Lactococcus Iactis subsp. lactis R-22, Leuconostoc
paramesenteroides R-51, Lnctobacillus subsp casei R-52, dan Leuconostoc
paramesenteroides R-62.
Bahan kirnia. Bahan yang digunakan terdiri dari: (I) media untuk
pertumbuhan mikroba: MRS Broth, Nutrien
Broth,
Bacto-agar;
(2)
cryoprotectant: gliserol, dimethylsulfoxide (DMSO); (3) larutan bufer: Na&P04,
NaOH, HCI ; (4) bahan kirnia untuk analisis : kasein, CaC12, tirosin,
trichloroacetat (TCA), Na2C03, pereaksi folin, lyzozim, o-phenil-PD-galactoside
(ONPG),fenol-ftaline 0 ,
asam asetat glasial.
Alat. Peralatan yang digunakan dalarn penelitian ini terdiri dali : (1)
peralatan kultivasi sel: laminar air flow, inkubator, sentrifus ; (2) peralatan
pembekuan dan penyimpanan: cryotube, deepfreezer, (3) peralatan analisis: water
bath, spektrofotometer, buret, colony counter, pH meter ; (4) peralatan lain: test
tube, tabung sentrifus, tabung eppendor$ cawan petri, rnikropipet, autoklaf, oven,
paper disc, hockey stick, ose, neraca analitik dan peralatan lain.
Metode
Penelitian ini secara garis besar terdiri atas tiga tahap, yaitu: (1) tahap
pembekuan, (2) tahap penyimpanan dan (3) tahap formulasi kultur starter. Bagan
tahapan penelitian disajikan pada Lampiran 1.
Pembekuan dilakukan terhadap empat strain bakteri asam laktat yang
merupakan isolat dari dadih asal Bukittinggi, yang pada penelitian sebelumnya
diketahui memiliki sifat antimutagenik yang batk. Empat strain tersebut adalah
Lactococcus lactis subsp lactis R-22, Leuconostoc paramesenteroides R-51,
Lactobacillus casei subsp casei R-52 dan Leuconostoc paramesenteroides R-62.
Kultivasi sel terhadap masing-masing strain dilakukan sebelum pembekuan yang
prosedumya dapat dilihat pada Lampiran 2.
Pada proses pembekuan selanjutnya diarnati pengaruh dua faktor, yaitu
faktor metoda pembekuan dan faktor jenis cryoprotectant terhadap viabilitas,
aktivitas proteolitik dan kemarnpuan pembentukan asam laktat. Faktor metoda
pembekuan terdiri dari pembekuan cepat dengan pencelupan dalam larutan dry-ice
ethanol selama empat menit dan pembekuan larnbat dalam deepfleezer pada suhu
-20°C. Faktor jenis cryoprotectant terdiri dari gliserol 10 persen, DMSO 10
persen, susu skim 10 persen dan larutan bufer fosfat, pH 7 ( prosedur penyiapan
suspensi pembekuan dapat dilihat pada Lampiran 3 ). Percobaan ini
dikelompokkan menjadi dua kondisi pembekuan yaitu sebelwn dan sesudah
pembekuan. Pengamatan dilakukan terhadap masing-masing sampel sebelum dan
sesudah pembekuan yang meliputi viabilitas, aktivitas proteolitik dan
pembentukan asam laktat ( prosedur analisisnya dapat dillhat pada Lampiran 4, 5
dan 6 ).
Penyimpanan dilakukan terhadap keempat strain bakteri asam laktat yang
masing-masing telah lbekukan dengan perlakuan dua metoda pembekuan dan
empat jenis cryoprotectant yang berbeda. Percobaan tahap penyimpanan ini
bertujuan
untuk mengetahui pengaruh metoda pembekuan dan jenis
cryoprotectant terhadap viabilitas, aktivitas proteolitik dan kemampuan
pembentukan asam laktat. Penyimpanan dikelompokkan m e n j d dua kondisi
suhu penyimpanan yaitu yaitu -20°C dan -70°C dalam deep fleezer. Pengamatan
dilakukan setiap dua rninggu selama delapan minggu. Data yang diperoleh
dianalisis dengan menggunakan andisis sidik ragam, bila terdapat perbedaan
diantara perlakuan dilanjutkan dengan uji Duncan Multiple Test.
Dari hasil pembekuan dan penyimpanan beku tersebut akan diperoleh
strain bakteri asam laktat yang memiliki daya tahan terbaik. Selanjutnya strain
tersebut dicobakan untuk pembuatan kultur starter dengan tiga macam formulasi
media, yaitu susu skim 10 persen + glukosa 3 persen, susu kedelai + glukosa 3
persen dan air kelapa + glukosa 3 persen. Inkubasi dilakukan selama 24 jam pada
suhu ruang, dan setiap selang tiga jam diamati viabilitas dan kemampuan
pembentukan asam laktatnya. Penentuan forrnulasi media terbaik didasarkan pada
kecepatan tercapainya akhir fase logaritmik bakteri asam laktat tersebut selama
waktu inkubasi.
Rancangan Percobaan
Penelitian ini akan dilakukan dalam tiga tahap yaitu tahap pembekuan,
tahap penyimpanan dan tahap formulasi media kultur starter. Data hasil penelitian
tahap pertarna dan kedua dianalisis secara statistik, sedang data hasil penelitian
tahap ketiga akan dianalisis dengan mempertimbangkan kecepatan tercapainya
akhir fase logaritmik bakteri asarn laktat tersebut selama waktu inkubasi.
Pengaruh metoda pembekuan dan jenis cryoprotectant terhadap daya simpan
kultur bakteri asam laktat pada suhu penyimpanan yang berbeda
Rancangan percobaan yang digunakan yaitu Rancangan Acak Lengkap
Pola Faktorial.
Rumus : Y i j =
~ p + K;+ Aj + Bk+ CI+ ABjk+ ACjl + BC ld + ABCjld+ Eijkl
Yijkl
= respon percobaan karena pengaruh bersama taraf ke-j dari faktor A,
taraf ke-k dari faktor B, taraf 1dari faktor C, yang terdapat pada
kelompok ke-i
=
pengaruh
rata-rata yang sebenarnya
C1
= pengaruh taraf ke-i, kelompok K (i=1,2)
Ki
=
pengaruh taraf ke-j, faktor A (i=1,2)
Aj
= pengaruh taraf ke-k, faktor B (k=1,2,3,4)
Bk
= pengaruh tarafke-1, faktor C (1=1,2,3,4)
CI
(AB)jk = pengaruh interaksi antara taraf ke-j faktor A, dan taraf ke-k faktor B
(AC)jl = pengaruh interaksi antara taraf ke-j faktor A, dan taraf ke-1 faktor C
(BC)kl = pengaruh interaksi antara taraf ke-k faktor B, dan taraf ke-1 faktor C
(ABC)j~=pengaruh interaksi antara taraf ke-j faktor A, taraf ke-k faktor B dan
taraf ke-1 faktor C
= pengaruh dari unit percobaan ke-i dalam kombinasi perlakuan (ijk),
Eiu
i= 1,2
Perlakuan. Perlakuan pada penelitian ini terdiri dari tiga faktor, yaitu :
(1) Metode pembekuan (Faktor A), terdiri dari dua tar& yaitu :
a, = metode pembekuan cepat (dengan pencelupan dalam larutan
dry ice-ethanol selarna empat menit)
a2 = metode pembekuan lambat (dalam deepfreezer pada suhu -20°C)
(2) Jenis cryoprotectant (Faktor B), terdiri dari empat tar&, yaitu :
bl = bufer fosfat, pH 7 (kontrol)
b2 = gliserol 10 persen
b3 = dimethylsulfoxzide (DMSO) 10 persen
bh = skim 10 persen
Kelompok. Kelompok pada tahap kedua penelitian ini terdiri dari dua
taraf, yaitu :
2
1
= penyimpanan pada
= penyimpanan pada
Pengamatan.
suhu -20°C
suhu -70°C
Pengamatan akan dilakukan terhadap sampel-sampel
berikut :
(1) sampel sebelum pembekuan
(2) sampel beku setelah penyimpanan 0,2,4,6,8 rninggu
Analisis. Parameter yang dianalisis dalam penelitian ini meliputi :
(I) Uji viabilitas (To dan Etzel, 1997)
(2) Uji produksi asam laktat (Metoda Mann 's Acid Test)
(3) Uji aktivitas proteolitik (Metoda Bergmeyer dan Grassl, 1983)
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pembekuan dan Penyimpanan Beku Kultur Bakteri Asam Laktat
Kultur bakteri asam laktat dibekukan dengan perlakuan dua metoda
pembehan dan empat jenis cryoprotectant. Metoda pembehan terdiri dari
pembekuan cepat dan pembekuan lambat, jenis cryoprotectant terdiri dari gliserol
10 persen, DMSO 10 persen dan susu skim 10 persen dengan bufer fosfat pH 7
sebagai kontrol. Dari hasil pembekuan tersebut, selanjutnya kultur disimpan pada
dua kondisi suhu yang berbeda yaitu -20°C dan -70°C dalam deeppeezer.
Hasil pengamatan viabilitas, total asam dan aktivitas proteolitik kultur
bakteri asam laktat sebelum dan sesudah penyimpanan serta selama penyimpanan
8 minggu, dapat dilihat pada Lampiran 7, 8 dan 9.
Viabilitas kultur bakteri asam laktat selama penyimpanan beku
Hasil analisis ragam viabilitas kultur bakteri asam laktat selama
penyimpanan beku dapat dilihat pada Lampiran 10. Dari hasil analisis tersebut
diperoleh bahwa metoda pembekuan dan jenis cryoprotectant masing-masing
berpengaruh terhadap viabilitas kultur bakteri asam laktat. Tetapi tidak demikian
halnya untuk interaksinya. Faktor suhu penyimpanan juga tidak berpengaruh pada
viabilitas kultur bakteri asam laktat. Hasil uji Duncan pengaruh metoda
pembekuan dan jenis cryoprotectant masing-masing terhadap viabilitas kultur
bakteri asam laktat selama penyimpanan beku dapat dilihat pada Tabel 1 dan 2.
Berdasarkan Tabel 1 dan 2, terlihat bahwa. kultur bakteri laktat strain
Lactobacillus casei subsp casei R-52 memiliki viabilitas yang paling tinggi pada
pembekuan cepat dan pada penambahan gliserol 10 persen. Hal ini apabila
dibandingkan dengan viabilitas ketiga strain yang lain.
Tabel 1. Pengaruh metode pembekuan pada viabilitas kultur bakteri asam
laktat selama penyimpanan beku
I
Perlakuan
R-22
Rata-rata viabilitas (%)
R-5 1
R-52
R-62
Metode cepat
95,0953'
94,0722'
98,l 022'
94,8840'
Metode lambat
91,5034b
90,6363~
92,2531
90,7 172"
Keterangan : huruf yang sama pada kolom yang sama berarti tidak berbeda nyata
R-22= Lactococcus lactis subsp. Lactis R-22
R-5 1= Leuconostoc paramesenteroides R-5 1
R-52= Lactobacillus casei subsp casei R-52
R-62= Leuconostoc paramesenteroides R-62
Tabel 2. Pengaruh jenis cryoprotectant pada viabilitas kultur bakteri asam
laktat selama penyimpanan beku
Rata-rata viabilitas (%)
Perlakuan
R-22
R-5 1
R-52
R-62
Kontrol
89,6650~
90,7131b
88,5325'
87,5238'
Gliserol 10%
94,0588'
94,9575'
96,1588"
95,5756a
DMSO 10%
94,783 1"
96,0350"
94,3 1Oob
94,7881'
Skim 10%
94,0906'
88,9113~
91,8294'
93,3706~
Keterangan : huruf yang sama pada kolom yang sama berarti tidak berbeda nyata
R-22= Lactococcus lactis subsp. Lactis R-22
R-5 1= Leuconostoc paramesenteroides R-5 1
R-52= Lactobacillus casei subsp casei R-52
R-62= Leuconostoc paramesenteroides R-62
Metoda pembekuan cepat temyata lebih dapat menstabilkan viabilitas
kultur bakteri asarn laktat selama delapan minggu penyimpanan. Demikian pula
23
pemakaian gliserol 10 persen ternyata juga lebih dapat menstabilkan viabilitasnya.
Hal ini akan lebih jelas terlihat pada Garnbar 1 dan 2.
Fast = pembekuan cepat
Slow= pembekuan lambat
0
2
4
8
Lama penyimpanan (minggu)
Garnbar 1.
Viabilitas Lactobacillus casei subsp casei R-52
setelah pembekuan dengan variasi metoda pembekuan
selarna penyimpanan beku
Metoda pembekuan cepat dapat mempertahankan viabilitas selama
penyimpanan, karena pada proses pembekuan cepat cairan sel dapat segera
membeku, sehingga dehidrasi cairan sel dapat dihindari. Terbentuknya kristal es
intraseluler sebenarnya dapat memacu kerusakan struktural sel yang akan
menyebabkan kematian sel. Dengan penarnbahan gliserol 10 persen, terbentuknya
knstal es tersebut dapat dirninirnalkan. Karena gliserol adalah jenis cryoprotectant
dengan bobot molekul rendah yang dapat berpenetrasi ke dalam sel dan dapat
membentuk ikatan hidrogen dengan air maupun dengan komponen struktur sel
(Meryrnan, 1966).
Keterangan :
K
=
kontrol, tanpa
G = gliserol 10 persen
D = DMSO 10 persen
S = susu skim 10 persen
Gambar 2.
Viabilitas Lactobacillus casei subsp casei R-52
setelah pembekuan dengan variasi jenis cryoprotectant
selama penyimpanan beku
Pembentukan asam laktat kultur bakteri asam laktat selama penyimpanan
beku
Hasil analisis ragam pembentukan asam laktat kultur bakteri asam laktat
selama penyimpanan beku dapat dilihat pada Lampiran 11. Dari hasil analisis
tersebut diperoleh bahwa hanya metoda pembekuan yang berpengaruh terhadap
pembentukan asam laktat kultur bakteri asam laktat. Sedang, jenis cryoprotectant
tidak mempengaruhi kemampuan pembentukan asam laktat selama 8 minggu
penyimpanan beku. Faktor suhu penyimpanan juga tidak berpengaruh pada
kemampuan pembentukan asam laktat kultur bakteri asam laktat. Hasil uji Duncan
pengaruh metoda pembekuan terhadap kemampuan pembentukan asam laktat
kultur bakteri asam laktat selama penyimpanan beku dapat dilihat pada Tabel 3.
Berdasarkan Tabel 3, terlihat bahwa kultur bakteri laktat strain
Lactobacilius casei subsp casei R-52 memiliki total asam yang paling tinggi pada
pembekuan lambat. Hal ini apabila dibandingkan dengan kemampuan
pembentukan asam laktat dari ketiga strain yang lain pada kondisi yang sama
Tabel 3. Pengaruh metode pembekuan pada kemampuan pembentukan asam
laktat kultur bakteri asam laktat selama penyimpanan beku
I
Rata-rata total asam (%)
Perlakuan
R-22
R-5 1
R-52
R-62
Metode cepat
0,833~
1,057~
1, 12gb
l,OOlb
Metode lambat
1,425"
I
.
1 ,42ga
1,351a
I
I
1,336'
I
Keterangan : huruf yang sama pada kolom yang sama berarti tidak berbeda nyata
R-22= Lactococcus lactis subsp. Iactis 8-22
R-5 1= Leuconostoc paramesenteroides R-5 1
R-52= Lactobacillus casei subsp casei 8-52
R-62= Leuconostoc paramesenteroides R-62
Hasil uji Duncan terhadap rata-rata hasil perhitungan juga memperlihatkan
bahwa metode pembekuan lambat cenderung lebih dapat memacu kemampuan
kultur bakteri asarn laktat untuk membentuk asam laktat selama 8 minggu
penyimpanan beku. Hal ini akan lebih jelas terllhat pada Gambar 3, untuk strain
Lactobacillus casei subsp casei R-52.
Pembekuan lambat dapat memacu pembentukan asam laktat setelah
dibekukan dan tetap stabil selama pmyimpanan 8 minggu; ha1 ini dik&enakm
sekalipun proses pembekuan lambat menyebabkan p e n m a n viabilitas kultur
yang nyata dibandingkan dengan proses pembekuan cepat (Tabel I), namun
keadaan
demikian tidak berpengaruh pada
penman
I
kemampuannya
menghasilkan asam laktat. Pembekuan lambat menyebabkan terkonsentrasinya
ion intraseluler; konsentrasi elektrolit yang meningkat akan mempengaruhi
membran lipid yang akan dapat mengakibatkan kebocoran sel dan memungkinkan
I
keluarnya sebagian enzim 8-galaktosidase yang tetap aktif sehingga lebih
mengaktifkan pembentukan asam laktat, sekalipun selnya telah rnati.
Keteranaan :
Fast = pembekuan cepat
Slow=pembekuan lambat
0.2
0
2
4
8
0
Lama penyirnpanan (rninggu)
Gambar 3.
Kemampuan pembentukan asam laktat kultur Lactobacillus
casei subsp casei R-52 setelah pembekuan dengan variasi
metoda pembekuan selama penyimpanan beku
Di dalam Surono (2000) dilaporkan bahwa aktivitas D-galaktosidase dari
kultur LactobaciIIus casei subsp casei R-52 leblh stabil pada pembekuan dan
penyimpanan dalam larutan nitrogen selama 30 hari dibandingkan dengan
pembekuan dalam larutan dry-ice aceton pada kondisi penyimpanan yang sama.
Namun aktivitas D-galaktosidase selama penyimpanan tersebut lebih dipengardu
oleh tingkat viabilitas yang tinggi dari hail pembekuan cepat dalam larutan
nitrogen.
Dengan dernikian tingkat kernampuan pembentukan asam laktat selama
penyimpanan lebih disebabkan oleh tersedianya Bgalaktosidase yang mash H
di dalam substrat.
Aktivitas proteolitik kultur bakteri asam laktat selama penyimpanan beku
Hasil analisis ragam aktivitas proteolitik kultur bakteri asam laktat selama
penyimpanan beku dapat dilihat pada Lampiran 12. Dari hasil analisis tersebut
diperoleh bahwa metoda pembekuan dan jenis cryoprotectant masing-masing
berpengaruh terhadap aktivitas proteolitik kultur bakteri asam laktat. Tetapi tidak
demikian halnya untuk interaksinya. Faktor suhu penyimpanan berpengaruh pada
aktivitas proteolitik kultur bakteri asam laktat. Hasil uji Duncan pengaruh metoda
pembekuan, jenis cryoprotectant dan suhu penyimpanan masing-masing terhadap
aktivitas proteolitik kultur bakteri asam laktat selama penyimpanan beku dapat
dilihat pada Tabel 4, 5 dan 6.
Tabel 4. Pengaruh metode pembekuan pada aktivitas proteolitik kultur bakteri
asam laktat selama penyimpanan beku
Rata-rata aktivitas proteolitik (UA)
Perlakuan
R-22
R-5 1
R-52
R-62
Metode cepat
0,048"
0,046"
0,049"
0,062"
Metode lambat
0,043~
0,037~
0,043~
0,052~
Keterangan : huruf yang sama pada kolom yang sama berarti tidak berbeda nyata
R-22= Lactococcus lactis subsp. lactzs R-22
R-5 1= Leuconostoc paramesenteroides R-5 1
R-52= Lactobacillus casei subsp casei R-52
R-62= Leuconostoc paramesenteroides R-62
.
.
Tabel 5. Pengaruh jenis cryoprotectant pada aktivitas proteolitik kultur bakteri
asam laktat selama penyimpanan beku
Rata-rata aktivitas proteolitik (UA)
Perlakuan
R-22
R-5 1
R-52
R-62
Kontrol
0,05 la
0,047a
0,05 lb
0,054~
Gliserol 10%
0,052a
0,048a
0,060a
O,06ga
DMSO 10%
0,041"
0,040~
0,038'
0,055~
Skim 10%
0,037'
0,033C
0,04 1'
0,049'
Keterangan : huruf yang sama pada kolom yang sama berarti tidak berbeda nyata
R-22= Lactococcus Iactis subsp. lactis R-22
R-5 1= Leuconostoc paramesenteroides R-5 1
R-52= LactobaciIIus casei subsp casei R-52
R-62= Leuconostoc paramesenteroides R-62
Tabel 6. Pengaruh suhu penyimpanan pada aktivitas proteolitik kultur bakteri
asam laktat selama penyimpanan beku
Rata-rata aktivitas proteolitik (UA)
Kelompok
R-22
R-5 1
R-52
R-62
-20°C
0,043~
0,041~
0,045~
0,055~
-70°C
0,047a
0,043a
0,047a
0,058'
Keterangan : huruf yang sama pada kolom yang sama berarti tidak berbeda nyata
R-22= Lactococcus Iactis subsp. Iactis R-22
R-5 1= Leuconostoc paramesenteroides R-5 1
R-52= LactobaciIIus casei subsp casei R-52
R-62= Leuconostoc paramesenteroides R-62
Berdasarkan Tabel 4, 5 dan 6, terlihat bahwa kultur bakteri laktat strain
Leuconostoc paramesenteroides R-62 memiliki aktivitas proteolitik yang paling
tinggi pada pembekuan cepat, pada penambahan gliserol 10 persen dan pada
penyimpanan suhu -70°C. Hal ini apabila dibandingkan dengan aktivitas
proteolitik ketiga strain ymg lain pada kondisi yang sama.
29
Hasil uji Duncan terhadap rata-rata perhitungan memperlihatkan bahwa
metode pembekuan cepat dan pemakaian gliserol 10 persen masing-masing secara
terpisah cenderung lebih dapat mempertahankan
aktivitas proteolitik kultur
bakteri asam laktat selama 8 rninggu penyimpanan.
Demikian pula suhu
penyimpanan -70°C lebih dapat mempertahankan aktivitas proteolitik kultur
bakteri asam laktat dibandingkan dengan suhu penyimpanan -20°C. Hal ini juga
dapat lebih jelas terlihat pada Gambar 4, 5 dan 6, untuk strain Lact
KULTUR BAKTERI LAKTAT ASAL DADlH UNTUK
PRODUKSI KULTUR STARTER
Oleh :
Darti Nurani
PROGRAM PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2002
ABSTRACT
STUDIES ON FREEZING AND FROZEN STORAGE OF
LACTIC BACTERIA ISOLATED FROM DADIH FOR PRODUCING
STARTER CULTURE
Supervised by Tun Tedja, Ani Suyani dan Ingrid S. Surono
Dadih is a traditional fermented milk of West Sumatra - Indocesia, fermented
in bamboo tube. Some srains of lactic acid bacteria isolated fiom Dadih possess
probiotic properties; hence, it is important to study the effect of preservation of the
lactic acid culture on their viability and biochemical properties during fiozen storage.
Four strains of lactic acid bacteria isolated from Dadih which have good
antimutagenic properties are Lactococcus Iactis subsp lactis R-22, Leuconostoc
pmamesenteroides R-5 1, Lactobacillus casei subsp casei R-52 and Leuconostoc
paramesenteroides R-62. The lactic culture were preserved by fieezing at -20°C by
different freezing methods, fiozen in deep freezer (slow fieezing) and frozen in dry
ice-ethanol mixture (fast freezing). Glycerol lo%, dimethylsulfoxide @MSO) 10%
and skim milk 10% were used as cryoprotectant with phosphat buffer pH 7,O as
control. The cultures were stored in deep freezer at -20°C as well as -70°C. The
addition of glicerol 10% in Lactobacillus cmei subsp. casei R-52 culture frozen by
fast freezing showed relatively stable viability and capability of lactic acid production
as an indicator of a good starter culture. There were no significantly different in
viability and capability of lactic acid production during 8 weeks fiozen storage at
-20°C and -70°C. However, fiozen storage at -70°C could maintain proteolitic
activity better than at -20°C during 8 weeks fiozen storage. Media formulation using
soy milk with 3% of glucose can shorten incubation time comparing with media
formulation using skim milk with 3% of glucose and also coconut water with 3% of
glucose.
SURAT PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul :
KAJIAN PROSES PEMBEKUAN DAN DAYA SIMPAN
KULTUR BAKTERI LAKTAT ASAL DADIH UNTUK PRODUKSI
KULTUR STARTER
adalah benar merupakan hasil karya saya sendiri dan belum pernah
dipublikasikan. Semua sumber data dan informasi yang digunakan telah
dinyatakan secara jelas dan dapat diperiksa kebenarannya.
Judul Tesis
: KAJIAN PROSES PEMBEKUAN DAN DAYA
SIMPAN KULTUR BAKTERI LAKTAT ASAL
DADlH UNTUK PRODUKSI KULTUR STARTER
Nama mahasiswa : DART1 NURANI
Nomor pokok
: 97333
Menyetujui
1. Komisi Pembimbing
\
/Dr. Ir. Tun Tedia Irawadi, MS)
Ketua
i.
/Dr. lr! ~ d ~ u d a nDEA)
MXV'jta
2. Ketua Program Studi
/Dr. Ir. lnarid S. Surono. MScl
Anggota
&&
'-
(Dr. Ir. lrawadi Jamaran)
Tanggal disetujui : 27 Maret 2002
Manuwoto, MSc.)
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan pada tanggal 21 Juli 1961 di Magelang dari pasangan
Sunaryo dan Sriwiyati. Pada tahun 1980 penulis lulus dari SMA Negeri I
Magelang. Penulis memperoleh gelar Sarjana dalam bidang Pengolahan Hasil
Pertanian pada Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Gajah Mada, Jogyakarta
pada tahun 1986. Tahun 1991, penulis menikah dengan Heri Suryanto serta
dikaruniai dua orang anak, Niken Kinanti Suryanto (10 iahun) dan Kenan
Armyansyah Suryanto (8 tahun).
Tahun 1987 sampai sekarang penulis adalah staf pengajar di Jurusan
Teknologi Industri Pertanian, Institut Teknologi Indonesia, Serpong. Tahun 1997,
penulis terdaftar sebagai mahasiswa Pascasarjanti IPB dan mengambil Program
Studi Teknologi Industri Pertanian.
PRAKATA
Puji syukur kehadirat Allah SWT atas perkenan dan ridhoNya penulis
mampu menyelesaikan tesis ini. Pada kesempatan ini penulis ingin menyampailcan
rasa terima kasih yang sebesar-besarnya kepada mereka yang telah terlibat
langsung atau tidak langsung dalam penyusunan tesis :
1. Dr. Ir. Tun Tedja Irawadi, MS, sebagai Ketua Komisi Pembimbing atas
kesabarannya dalam membimbing, nlengarahkan dan memberikan
dukungan moril dalam rangkaian penyusunan tesis ini.
2. Dr. Ani Suryani, DEA, sebagai anggota Komisi Pembimbing dan Kepala
Laboratorium Rekayasa Bioproses - Pusat Antar Universitas Bioteknologi
waktu itu atas
bimbingan, saran, dan diperkenankannya penulis
menggunakan fasilitas laboratorium untuk melakukan penelitian dalam
rangka penyusunan tesis ini.
3. Dr. Ir. Ingrid S. Surono, MSc, sebagai anggota Komisi Pembimbing yang
telah memberikan bimbingan, saran, semangat, kesempatan dan
kepercayam kepada p u l i s untuk mengerjakan sebagian Project
University Research for Graduate Education (URGE), The Young
Academic Program, Batch III tahun 1998/2000, serta yang telah
mengenalkan penulis dengan bakteri asam laktat sehingga penulis dapat
mengenal lebih dekat dan dapat turut mengagumi keunggulan bakteri
laktat asal dadih.
-
4. Dekan Fakultas Teknologi Pertanian Institut Teknologi Indonesia, Ketua
dan Staff Jurusan Teknologi Industri Pertanian, IT1 yang telah memberi
kesempatan kepada penulis untuk melanjutkan studi di Program
Pascasarjana, IPB dan memberikan dukungan moril sehingga penulis
dapat menyelesaikan tesis ini.
5. Rekan-rekan seperjuangan di Laboratorium di lingkungan PAU-
Bioteknologi, IPB periode 1999-2000, baik teknisi, mahasiswa S1, S2 dan
S3 yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu atas kerjasamanya
selama penulis melaksanakan penelitian.
6. IShusus untuk suami Heri Suryanto dan anak-anak tercinta Niken Kinanti
Suryanto dan Kenan Armyansyah Suryanto atas dukungan dan
pengertiannya yang rnendalam serta keleluasaan waktu yang diberikan
sehingga penulis dapat melaksanakan penelitian dan menyusun tesis ini
dengan tenang.
Akhirnya penulis memohon maaf atas segala bentuk kekurangan dan
ketabatasan yang ada, namun penulis berharap semoga hasil penelitian ini dapat
bermanfmt bagi yang memerlukannya.
Bogor, 9 Maret 2002
Penulis
DAFTAR IS1
Kata Pengantar .......................................................................iv
Daftar Isi .............................................................................. vi
Daftar Tabel ..........................................................................
...
vlil
Daftar Garnbar ........................................................................ix
Daftar Lampiran ...................................................................... x
PENDAHULUAN .................................................................
1
.......................................
Latar Belakang .......................
.
.
1
Tujuan Penelitian ........................
2
Ruang Lingkup ............................:..................................... 2
TINJAUAN PUSTAKA .........................................................
4
Isolat Bakteri Asam Lalctat asal Dadih ........................................ 4
Presewasi dan Penyimpanan Mikroba ........................................ 6
Pembekuan Kultur Bakteri ...................................................... 8
Cryoprotectant .................................................................... 12
Media Kultur Starter Bakteri Asam Laktat ..................................
14
METODOLOGI PENELITIAN ................................................. 16
Metode ............................................................................. 17
Rancangan Percobaan ............................................................ 19
.
a
DAFTAR TABEL
1.
Pengaruh metoda pembekuan pada viabilitas kultur bakteri asam
laktat selama penyimpanan beku ..........................................
2.
Pengaruh jenis cryoprotectant pada aktivitas proteolitik kultur bakteri
asam laktat selama penyimpanan beku.. ....................................
.3:
Pengaruh metoda pembekuan pada kemampuan pembentukan asam
laktat kultur bakteri asam laktat selama penyimpanan beku ............
4.
Pengaruh metoda pembekuan pada aktivitas proteolitik kultur bakteri
asam laktat selama peyimpanan beku .....................................
5.
Pengaruh jenis cryoprotectant pada aktivitas proteolitik kultur bakteri
asam laktat selama peyimpanan beku .....................................
6
Pengaruh suhu penyimpanan pada aktivitas proteolitik kultur bakteri
asam laktat selama peyimpanan beku .....................................
7.
Hasil pengamatan rata-rata perubahan viabilitas (log cfidml) kultur
starter bakteri asam laktat selama inhbasi pada media yang berbeda
8.
.
Hasil pengamatan rata-rata perubahan total asam (%) kultur starter
bakteri asam laktat selarna inkubasi pada media yang berbeda
DAFTAR GAMBAR
Viabilitas Lactobacillus casei subsp 'casei R-52 setelah pembekuan
dengan variasi metoda pembekuan selama penyimpanan beku ........
Viabilitas Lactobacillus casei subsp casei R-52 setelah pembekuan
dengan variasi jenis cryoprotectant selama penyimpanan beku .......
Kemampuan produksi asam laktat oleh kultur Lactobacillus carrei
subsp. Casei R-52 setelah pembekuan dengan variasi metoda
pembekuan selama penyimpanan beku ....................................
Aktivitas proteolitik pada kultur Lactobacillus casei subsp. Casei R52 setelah pembekuan dengan variasi metoda pembekuan selama
penyimpanan beku ...........................................................
Aktivitas proteolitik pada kultur Lactobacillus casei subsp. Casei R52 setelah pembekuan dengan variasi jenis cryoprotectant selama
penyimpanan beku ...........................................................
Aktivitas proteolitik Lactobacillus casei subsp. Casei R-52 setelah
pembekuan dan disimpan pada suhu yang berbeda .....................
Kurva perubahan viabilitas kultur starter Lactobacillus u w i subsp.
Casei R-52selama inkubasi pada media yang berbeda .................
Kurva perubahan viabilitas kultur starter Leuconostoc
paramesenteroides R-62selama inkubasi pada media yang berbeda ...
Kurva perubahan kadar asam total kultur starter Lactobacillus casei
subsp. Casei R-52selama inkubasi pada media yang berbeda ..........
Kuiva perubahan kadar asam total kultur starter Leuconosta:
paramesenteroides R-62selama inkubasi pada media yang berbeda ...
DAFTAR LAMPIRAN
Diagram Alir Rancangan Percobaan ............ . .. ......... .. ......... ..
Kultivasi Sel Bakteri Asam Laktat (To and Etzel, 1997) . ... ...... . . ...
Penyiapan Suspensi Pembekuan (To and Etzel, 1997) -... ... . .... . . .....
Penentuan Viabilitas Sel (To and Etzel, 1997) ... ...... . . ... .. ..... . . . . ...
Analisis Pembentukan Asam Laktat (Metode Mann's Acid Test) . . . ..
Analisis Aktivitas Proteolitik (Metode Bergmeyer dan Grassl, 1983)..
Viabilitas Kultur Bakteri Asam Laktat Sebelum maupun Sesudah
Pembekuan dan Penyimpanan ..... . ... ... ...... . ........ ........ . ... ........
Niai Total Asam (%) Kultur Bakteri Asam Laktat Sebelum maupun
Sesudah Pembekuan dan Penyimpanan ... .. ............. .. . ... ..... ... . ...
Aktivitas Proteolitik (UA) Kultur Bakteri Asam Laktat Sebelum
maupun Sesudah Pembekuan dan Penyimpanan ........................
Perbandingan Antar Pengaruh Metoda Pembehan, Cryoprotectant,
suhu dan Waktu Penyimpanan untuk Setiap strain terhadap Viabilitas
Perbandingan Antar Pengaruh Metoda Pembekuan, Cryoprotecctmrt,
suhu dan Waktu Penyimpanan untuk Setiap strain terhadap Total
Asam ... . . ...... .... ... ......... ........................ . .. . ............. .. ....
9
Perbandingan Antar Pengmh Metoda Pembekuan, Cryoprotectunt,
suhu dm Waktu Penyimpanan untuk Setiap strain terhadap W,vitas
Protwlitik .. . ...... ... .............................. ......... ....,........ . ....
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Di Indonesia, susu fermentasi sudah cukup dikenal. Dadih add$ salah
satu produk susu fermentasi tradisional Indonesia yang berasal dari Sumatra
Barat. Dadih serupa yogurt merupakan hasil fermentasi darniah; yang dilakukan
dengan menyimpan susu kerbau dalam tabung bambu selama semdam, dan
ditutup dengan daun pisang. Selma ini dadih hanya dikenal di daerah asalnya.
Berdasarkan hasil penelitian terdahulu diperoleh bahwa 36 strain bakteri
asam laktat asal dadih telah berhasil diisolasi dan diidentifikasi (Surono, et al.,
1983; Hosono, et al., 1989). Beberapa strain diantaranya diketahui bersifat
probiotik. Hal ini didukung oleh hail penelitian selanjutnya yang melaporkan
bahwa bakteri asam laktat asal dadih menunjukkan alctivitas antimutagenik dan
mampu menurunkan kolesterol darah secara in vitro dan in vivo. Disamping itu,
bakteri asam laktat asal dadih juga bersifat antimikroba terhadap bakteri enterik
patogen (Hosono dan Tono-oka, 1995; Surono dan Hosono, 1996; Surono, 2000).
Dengan ditemukannya beberapa strain bakteri asam laktat yang unggul,
hal ini memberikan peluang yang sangat baik untuk dapat diaplikasikan sebagai
kultur starter di industri fermentasi susu, sehingga akan dihasilkan produk dengan
keseragaman mutu yang dapat dikendalikan. Surono, dkk. (1997) melaporkan
bahwa Lactobacillus casei subsp casei R-52 mempunyai daya gumpal terhadap
protein susu yang halus dan tinggi setelah 12 jam inkubasi dengan kadar asam
2
total 0,3 persen yang terus meningkat hingga 0,6 persan selama 24 jam fermentasi,
sehingga berpotensi untuk digunakan sebagai starter susu fermentasi .
Proses presemasi merupakan salah satu tahapan penting dalam upaya
mempertahankan keunggulan suatu isolat yang berpotensi. Selama penyimpanan
sangat dimungkmkan terjadinya p e n m a n viabilitas akibat kernatian sel,
perubahan sifat genetik bahkan kemungkinan hilangnya s&t-sifat yang potensial.
Oleh karena itu metoda presemasi dan penyimpanan yang akau digunakan h a m
sesuai dengan karakter isolat, sehingga dapat memhimalii penufunm viabilitas
dan potensi yang dimilikinya selama penyimpanan. Pembekuan merupakan salah
satu alternatif presemasi kultur bakteri asam laktat.
Tujuan Penditian
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan kondisi terbaik proses
pembekuan dan penyimpanan beku bakteri asam laktat asal dadih dalam
mempertahankan viabilitas dan aktivitas biokimiawinya yang meliputi aktivitas
enzim proteolitik dan kemampuan mernproduksi asam laktat. Disamping itu dari
penelitian ini diharapkan dapat diperoleh hasil formulasi media terbaik dalarn
penyediaan kultur starter bakteri asam laktat asal dadih.
Ruang Lingiarp
Peneditian terdiri dari tiga tahap, yaitu tahap pembekuan, tahap
penyimpanan beku dan tahap formulasi media kultur starter. Pembekuan
dilakukan terhadap empat strain bakteri asam laktat d dadih, yang telah diteliti
sebelumnya mmiliki sifat antimutagen& yang baik. Perlakuan pada proses
3
pembekuan terdiri dari dua macam, yaitu metoda pembekuan dan jenis
cryoprotectant.
Penyimpanan dilakukan terhadap empat strain bakteri asam laktat yang
telah
dibekukan
dengan
dua
macam
perlakuan. Penyimpanan
beku
. dikelompokkan dalam dua kondisi suhu yang berbeda di dalam deepfieezer.
Dari hasil pembekuan dan penyimpanan beku akan diperoleh strain bakteri
asam laktat yang paling stabil selama pembekuan dan penyimpanan beku.
Terhadap strain yang terpilih tersebut, selanjutnya dibuat formulasi media kultur
starter dengan variasi tiga macam formula media
Pengamtan dilakukan terhadap kultur, sebelum dan sesudah pembekuan,
selama penyimpanan beku sdiap selang 2 minggu selama 8 minggu. Penkamatan
meliputi viabilitas, kadar asam total dan &vita proteolitik.
TINJAUAN PUSTAKA
Isolat bakteri asam laktat asal dadih
Bakteri asam laktat adalah kelompok bakteri yang metabolisme
karbohidratnya membentuk asam laktat, baik sebagai satu-satunya produk atau
sebagai produk utama Bakteri ini tergolong bakteri Gram positif, tidak berspora,
anaerob tetapi aerotoleran dan toleran terhadap asam (Salminen dan Atte von
Wright, 1993).
Bakteri asam laktat dapat berasal dari saluran pencemaan manwia,
produk-produk susu dan secara alarniah terdapat pada permukaan tanaman
tertentu. Beberapa spesies bakteri asam laktat digudcan secara komersial untuk
memproduksi susu fennentasi dan produk-produk daging. Bakteri asam laktat
mdiputi genus, Lactowccuss Enterowccuss Lactobacillus, Leucon~stoc, dan
Pediococcus (Salminen dan Atte von Wright, 1993).
Dalam produk pangan umumnya bakteri asam laktat tidak berbahaya dan
memenuhi status GRAS (Generally Rewgnized As Safe). Di Amerilca, bahkan
memberikan efek berxnadaat bagi manusia, karena kornponen metabolit yang
dihasilkannya dapat menghambat bakteri anterik patogm, mengatasi lactose
intolerance, menurunkan kadar kolesterol, antimutagenik dan antikarsinogenik,
serta memperbaiki sistem kekebalan tubuh (Surono, 1 998).
Keaneka-ragaman pengolahan susu secara tradisional di Indonesia
khususnya susu ferrnentasi, seperti misalnya dadih dari Sumatra Barat dan
cologanti dari Nusatenggara Barat, tentunya memugkinkan ketersediaan bakteri
asam laktat yang beragam.
Dadih adalah produk susu fermentasi serupa yogurt dari Surnatera Barat,
yaitu hasil fermentasi alarniah yang dilakukan dengan menyimpan susu dalam
tabung bambu selama semalam, dan ditutup dengan daun pisang dan bambu.
Bakteri asam laktat terdapat dominan dalam dadih dan 36 strain bakteri asam
laktat telah berhasil diisolasi dan diidentifikasi (Surono, et al., -1983; Hosono, et
al., 1989).
Menurut Azria (1986), kandungan mikroba dalam tabung bambu adalah
2,5x1o2 sampai 1,ox1o3 koloni per cm2,yang didominasi oleh bakteri pembentuk
asam dan bersifat proteolitik. Sedang Hosono, et al. (1989) melaporkan bahwa
total bakteri pada dadih segar berasal dari Bukittinggi sebesar 3,s sampai 4,3x108
koloni per gram, didominasi oleh bakteri asam laktat, dan Leuconostoc
paramesenteroides mendominasi populasi bakteri asam laktat pada dadih, yaitu
50 persen dari populasi, sedang Lactobacillus casei subsp casei sebesar 11
persen.
Lactobacillus casei subsp casei, Leuconostoc paramesenteroides,
Enterococcus faecalis subsp liquefaciens, Lactococcus lactis subsp lactis asal
dadih menunjukkan aktivitas antimutagenik dan marnpu menurunkan kadar
kolesterol darah secara in vitro maupun in vivo, serta daya pengikatan sel bakteri
asam laktat terhadap senyawa mutagenik dan mampu menurunkan kadar
kolesterol darah secara in vitro sebesar 34 persen (Surono dan Hosono, 1996;
Hosono dan Tono-oka, 1995).
Bakteri asam laktat asal dadih juga dilaporkan mempunyai sifat
antimikroba terhadap bakteri enterik patogen seperti rnisalnya Salmonella
6
typhymuriwn, Escherichia coli dan Shigella sp (Surono, 2000). Menurut Surono
(1997), sifat antimikroba patogen yang dimiliki oleh bakteri asaml laktat
disebabkan oleh sif-ya
yang cocok dengan nutrisi yang tersedia, sehingga lebih
unggul dalam kompetisinya dengan mikroba patogen. Disamping itu, bakteri
asam laktat juga memproduksi metabolit seperti asam organ&, Hz& dan
bakteriosin, serta menstirnulir sistim kekebalan tubuh.
Hasil penelitian selanjutnya menyatakan bahwa Lactobacillus casei subsp
casei R-52 mempunyai daya gumpal yang halus dan tinggi setelah 12 jam
inkubasi dengan total asam 0,s persen yang terus meningkat hingga 0,6 persen
selama 24 jam fermentasi, sehingga berpotensi untuk digunakan sebagai starter
susu fermentasi (Surono, dkk, 1997).
Preservasi dan Penyimpanan Mikroba
Pada dasamya, preservasi dan penyimpanan rnikroba memiiiki berbagai
tujuan: (1) tujuan taksonomi, mikroba diperlukan untuk 'perpustakaan' strain
dengan karakteristik yang spesifik, baik untuk tujuan identifikasi maupun
pengajaran;
(2) tujuan penelitian, mikroba diperlukan para peneliti untuk
mdakukan penelitian-penditian di berbagai bidang, baik di bidang pangan,
pertanian maupun kesehatan; (3) tujuan industri, berbagai mikroba mempunyai
potensi untuk dimanfaatkan di bidang industri dan untuk menjaga agar potensi ini
tetap stabil, diperlukan penyimpanan yang baik; (4) tujuan lain, misalnya di
bidang kedokteran, mikroba diperlukan untuk pagujian atau referensi.
Penyimpanan mikroba harus dikelola dengan baik, karena pengelolaan
yang kurang baik akan berakibat pada : (1) terjadinyul hntaminasi, strain yang
dikehendaki hilang atau terdesak oleh kontaminan sehingga perlu dilakukan
isolasi kembali dan purifikasi; (2) sfrain mati, apabila strain tidak lagi dapat
ditumbuhkan, maka harus d~lakukanisolasi kembali yang kemungkman tidak
sama dengan aslinya, atau kalau strain tersebut diperoleh dari koleksi kultur
tertentu rnaka perlu pengiriman kembali;
(3) perubahan sifat, strain yang
mengalami transfer berkali-kali, dapat mengalami perubahan sifat genetik bahkan
kemunglunan hilangnya (berkurangnya) sifat-sifat yang potensial.
Berbagai teknik telah dikembangkan untuk penyimpanan rnikroba dm
memilih teknik penyimpanan yang tepat untuk suatu jenis mikroba adalah hal
yang tidak mudah. Masing-masing metoda mempunyai keuntungan maupun
kerugian. UIltuk memilih metoda penyimpanan perlu diperhatikan beberapa
faktor, yaitu jumlah kultur, nilai kultur, fiekuensi penggunaan kultur, fasilitas
yang dimiliki (peralatan dm sumber daya manusia) d m biaya Namun demikian,
penyimpanan yang diterapkan harus tetap dapat mernpertahmkan mikroba agar
tidak mati, tidak terkontaminasi, tidak mengalami perubahan populasi melalui
seleksi, dan tidak mengalami perubahan genetik.
Yang perlu diketahui bahwa tidak ada satu metodapun yang dapat
digunakan untuk menyimpan semua jenis mikroba, bahkan strain yang berbeda di
dalarn satu spesiespun memiliki perbeciaan respon terhadap stress akibat dari
metoda penyimpanan yang dilakukan.
Menurut Moms (1991), terdapat tiga metoda untuk preservasi dan
penyimpanan mikroba, yaitu : (1) metoda continuous growth, (2) metoda
pengeringan dan (3) metoda metabolisme tersuspensi.
8
Preservasi dengan metoda continous growth, adalah preservasi yang
dilakukan dengan menurnbuhkan mikroba secara periodik dari medium lama ke
dalam medium baru untuk memperoleh kondisi pertumbuhan optimum. Cara ini
biasanya diikuti dengan penyimpanan dalam repigerator atau peezer (-10°C
sampai -20°C), dan khususnya untuk biakan jamur dapat disimpan dengan
perendaman dalam minyak mineral (oil storage) atau penyimpanan dengan
perendaman dalam air steril (water storage).
Metode pengeringan umurnnya digunakan untuk mikroba dalam keadaan
fase istirahat, rnisalnya kondisi mikroba dalam bentuk spora. Bentuk kapang
dapat dikeringkan dengan udara kering dan dapat dikeringkan di dalam atau di
atas silica gel.
Metabolisme tersuspensi adalah preservasi dengan cara menurunkan
kandungan cairan sel melalui dehidrasi peeze-drying) atau pembekuan. Produk
Peeze-drying membutuhkan kondisi penyimpanan vakum atau kondisi tekanan
atmosfir dalam gas inert. Sedang, untuk proses pembekuan diperlukan penurunan
suhu sampai di bawah -70°C yang diikuti dengan penyirnpanan pada suhu di
bawah
-139°C. Penyimpanan dapat dilakukan dalam Peezer, pencelupan dalam cairan
nitrogen atau menempatkan di atas cairan nitrogen.
Pembekuan Kultur Bakteri
Pembekuan merupakan salah satu alternatif preservasi kultur bakteri.
Prinsip preservasi mikroba dengan pembekuan adalah "pengeringan sementara"
sel melalui proses pembekuan, karena sebagian cairan sel akan keluar yang
disebabkan oleh perbedaan tekanan osmosis akibat pembentukan kristal es dan
kenaikan konsentrasi bahan terlarut di luar sel (ATCC, 1997).
Menurut Ray dan Speck (1973), proses pembekuan akan menyebabkan
berbagai perubahan fisik, kimiawi maupun biokimiawi sel bakteri. Pada
penurunan suhu 20°C sampai 10°C akan t e r j d perubahan konsentrasi larutan,
perubahan pH dan kenaikan kelarutan gas. Pada penurunan suhu 0°C sampai
-
10°C, pembekuan &an terjadi; yang dimulai dari bagian medium di luar sel
\
dengan terbentuknya kristal es. Suhu awal terjadinya pembekuan sangat
tergantung pada sifat dan konsentrasi zat terlarut di dalam suspensi medium. Jlka
cairan sel dapat mempertahankan kondisi tersebut sampai mencapai suhu -10°C
sampai -15"C, maka pembekuan di atas suhu tersebut, hanya akan terjadi di luar
sel.
Pembekuan selanjutnya &an berlangsung melalui dua kemungkinan, yaitu
dengan mengeluarkan air dari dalam sel dan membekukannya di luar sel
(dehidrasi) atau dengan membekukan cairan sel secara intraseluler. Hal ini
tergantung pada kecepatan pembekuan dan permeabilitas membran sel terhadap
air. Jika kecepatan pembekuan lambat atau permeabilitas membran tinggi, sel
akan membeku melalui pembentukan kristal es secara ekstraseluler. Tetapi jika
kecepatan pembekuan tinggi atau permeabilitas sel rendah, maka sel akan
membeku melalui pembentukan kristal es secara intraseluler.
Pembekuan sel akan menyebabkan kenaikan zat terlarut baik di dalam
maupun di luar sel. Penurunan pH juga akan terjadi dan akan menyebabkan
terjadinya presipitasi zat terlarut baik yang merniliki bobot molekul rendah
maupun tinggi. Disamping itu, perubahan pH akan menyebabkan pula terjadinya
denaturasi makromolekul. Konsentrasi elektrolit yang meningkat akan
mempengaruhi membran lipida yang akan dapat mengakibatkan kebocoran sel.
Kenaikan konsentrasi ion dapat menurunkan kekuatan ikatan hdrofobik, sehingga
konfigurasi makromolekul akan terganggu (Ray dan Speck, 1973).
Selama proses pembekuan kemungkinan kerusakan sel dapat terjadi
karena perbedaan sensitivitas untuk setiap jenis rnikroba terhadap pembekuan.
Menurut Mazur (1966), kerusakan sel selama pembekuan dapat terjadi &bat
terbentuknya
kristal
es
baik
intraseluler
maupun
ekstraseluler
dan
terkonsentrasinya zat terlarut baik ekstraseluler maupun intraseluler.
Kerusakan yang terjadi selama pembekuan dapat mengakibatkan: (1)
perubahan morfologi sel, (2) perubahan struktur sel, (3) perubahan fungsi sel atau
(4) perubahan stabilitas genetik sel (Ray dan Speck, 1973).
Beberapa faktor dapat mempengaruhi ketahanan sel selama proses
pembekuan, yaitu: (1) ukuran dan tipe sel, (2) urnur sel, (3) perrrieabilitas
membran sel, (4) pemakaian ciyQprotectant, (5) metode pembekuan, (6) metode
penyimpanan dan (7) metode thawing.
Faktor tipe sel dikemukakan di dalam ATCC (1997), bakteri tipe Gram
positif lebih tahan terhadap proses pembekuan daripada bakteri Gram negatif
Kultur yang terlalu tua atau terlalu muda akan sangat sensitif terhadap perlakuan
suhu rendah. Umumnya, untuk keperluan pembekuan dipilih sel pada fase
logaritrnik aMzlr atau awal fase stasioner, agar diperoleh hasil yang memuaskan.
11
Faktor permeabilitas sel, menurut ATCC (1997) berpengaruh .terhadap
sensitivitas sel selarna pembekuan. Sel yang berasal dari kultur cair yang diaerasi
akan memiliki permeabilitas yang baik dan akan memiliki toleransi yang tinggi
terhadap proses pembekuan cepat. Dikemukakan oleh Ray dan Speck (1973),
bahwa membran sel yang tersusun oleh sejumlah besar asam lemak tidak jenuh
akan bersifat lebih elastis dan merniliki permeabilitas yang baik terhadap air;
biasanya terdapat pada sel yang ditumbuhkan pada kondisi yang tepat.
Untuk membantu memperkecil kemungkinan terjadinya kerusakan sel
selama pembekuan, maka komponen bahan kimia dapat ditarnbahkan ke dalam
suspensi sel. Bahan kimia tersebut dikenal sebagai cryoprotectant, yang merniliki
sifat-sifat tertentu sehingga dapat berfungsi sebagai pelindung sel selama
pembekuan. Bahan tambahan yang sering digunakan untuk pembekuan sebagian
sel di ATCC adalah gliserol dan dimethylsu2fobide (DMSO) pada konsentrasi 5
sampai 10 persen (vlv).
Pengaruh metoda pembekuan terhadap ketahanan sel berkaitan dengan
suhu dan laju pembekuan yang digunakan, serta jenis sel yang dibekukan. Suhu
dan kecepatan pembekuan sangat menentukan apakah cairan sel akan dibekukan
secara internal atau ekstemal. Apabila laju pembekuan cepat, cairan sel akan
membeku secara internal. Apabila laju pembekuan lambat, cairan sel akan
dikeluarkan dan dibekukan secara ekstemal.
Untuk spesies bakteri tertentu, metode pembekuan cepat maupun lambat
dapat mengakibatkan kerusakan. Oleh karena itu, perlu ditentukan kecepatan
pembekuan yang optimum untuk spesies tertentu untuk mempertahankan
viabilitasnya. Kecepatan pembekuan yang tidak terlalu cepat untuk menghindari
kristalisasi secara internal dan tidak terlalu lambat untuk menghmdari kontak zat
terlarut dengan komponen sel yang dapat mengakibatkan kerusakan (Ray dan
Speck, 1973).
Dalarn ha1 pengaruh faktor metode penyimpanan terhadap ketahanan sel,
menurut Srnione dan Brown (1991), suhu penyimpanan beku berpengaruh
terhadap ketahanan hidup sel selama penyimpanan, yang disebabkan oleh
pembentukan kristal es yang masih dapat terus berlangsung pads suhu di bawah
suhu proses pembekuan.
Cryoprotedant
Cryoprotectant adalah komponen bahan kirnia yang dapat melindungi sel
dari kerusakan selarna proses pembekuan dan penyimpanan beku. Pada umumnya
komponen tersebut mengandung gugus OH dan NH2 dan gugus lainnya yang
memiliki kecenderungan untuk membentuk ikatan lvdrogen yang kuat diantara
komp~nentersebut, dengan makromolekd di permukaan sel atau dengan air (Ray
dan Speck, 1973).
Sedang, Morichi et al. (1963) mengemukakan bahwa ciri struktural
sehingga suatu komponen dapat dipilih sebagai pelindung sel selama pembekuan
adalah: (1) memiliki gugus fungsional dengan elektronegativitas yang tinggi pada
atom a-carbon, (2) lcelompok two acid (adan y-COOH), (3) mendekati bentuk NJ& dan -COOH.
Komponen tertentu mungkin dapat melindungi sel dari proses pembekuan
cepat maupun lambat, sekalipun bentuk kerusakan yang diakibatkan oleh kedua
metode pembekuan tersebut berbeda.
Namun pada dasarnya kemampuan
komponen tersebut untuk membentuk ikatan hidrogen dengan air maupun dengan
struktur sel
dapat mencegah kematian sel &bat pembentukan kristal es
intraseluler maupun terkonsentrasinya zat terlarut.
Mekanisme perlindungan cryoprotectant, di dalam ATCC (1997)
disebutkan bahwa cryoprotectant dapat mengurangi ukuran, jumlah dan kecepatan
pertumbuhan kristal es. Disamping itu cryoprotectant juga dapat m e m b d a n efek
koligatif, membantu berlangsungnya dehidrasi secara osmotik sibelurn
pembekuan, dapat m e n d a n titik beku sel, menstabilkan membran,
meningkatkan permeabilitas sel dan dapat bersifat bufer untuk mengimbangi
adapya perubahan pH selama pembekuan.
Cryoprotectant dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu cryoprotectant
dengan bobot molekul (BM) rendah dan cryoprotectant dengan bobot molekul
tinggi. Masing-masing kelompok dapat membantu mencegah kerusakan sel
selarna pembekuan, namun dengan mekanisme perlindungan yang berbeda.
Cryoprotectcmt BM rendah dapat berpenetrasi ke dalarn sel dan daya
larutnya di dalam air sangat baik, sehingga cenderung digunakan untuk mencegah
kerusakan yang diakibatkan oleh terbentuknya kristal es di dalarn sel (Meryman,
1966). Beberapa senyawa kimia BM rendah telah teruji kemampuannya sebagai
pelindung sel terhadap kerusakan pembekuan baik terhadap bakteri Gram positif
maupun bakteri Gram negatif antara lain gliserol, glikol, glukosa, sukrosa, laktosa,
asarn amino dan dimethylsuIfoxide (DMSO) (Ray dan Speck, 1973):
Cryoprotectant BM tinggi tidak dapat menembus sel, tetapi berperan
untuk
melindungi membran yang sensitif terhadap denaturasi &bat
terkonsentrasinya gararn selama pembekuan (Meryman, 1966).
Beberapa
komponen kimia BM tinggi tersebut antara lain gelatin, mucin, albumin,
polyviniZpyrolidone (PW)dan dekstran. Dilaporkan oleh Moss dan Speck (1963)
bahwa skim milk dapat mempertahankan viabilitas Streptococcus lactis sebesar 98
persen.
Media Kultur Starter Bakteri Asam Laktat
Formulasi media kultur starter susu fermentasi dapat dioptimumkan untuk
mendapatkan starter susu fermentasi yang dapat mernfermentasi susu dengan
cepat dan efisien. Berbagai media yang baik untuk pertumbuhan bakteri asam
laktat adalah susu skim, susu kedelai dan air kelapa, masing-masing mempunyai
keunggulan faktor yang mendukung pertumbuhan bakteri laktat.
Penggunaan susu kedelai sebagai media pada pembuatan minuman
fermentasi sudah lazim dilakukan disamping susu skim. Susu kedelai memiliki
keunggulan nilai nutrisinya untuk kepentingan kesehatan, karena tidak
mengandung kolesterol, laktosa dan juga hanya mengandung sedikit asam lemak
jenuh. Disamping itu harganyapun lebih murah. Menurut Mac Lwd dan Ames
(1988), beberapa jenis gula yang terpenting dalarn susu kedelai adalah sukrosa,
raffinosa dan melobiosa.
Air kelapa mempunyai potensi yang baik untuk dibuat minuman
fermentasi karena kandungan nutrisinya relatif lengkap. Air kelapa mengandung
gula maksimum 4 persen (rata-rata 2 persen) yang terdiri dari sukrosa, glukosa
dan fruktosa (Woodroof, 1979) dan sejurnlah vitamin B.
METODOLOGI
Bahan dan Alat
Kultur bakteri.
Bakteri asam laktat yang akan digunakan dalarn
penelitian ini sejumlah empat strain yang merupakan isolat dari dadih asal
Bukittinggi, yang terdiri dari: Lactococcus Iactis subsp. lactis R-22, Leuconostoc
paramesenteroides R-51, Lnctobacillus subsp casei R-52, dan Leuconostoc
paramesenteroides R-62.
Bahan kirnia. Bahan yang digunakan terdiri dari: (I) media untuk
pertumbuhan mikroba: MRS Broth, Nutrien
Broth,
Bacto-agar;
(2)
cryoprotectant: gliserol, dimethylsulfoxide (DMSO); (3) larutan bufer: Na&P04,
NaOH, HCI ; (4) bahan kirnia untuk analisis : kasein, CaC12, tirosin,
trichloroacetat (TCA), Na2C03, pereaksi folin, lyzozim, o-phenil-PD-galactoside
(ONPG),fenol-ftaline 0 ,
asam asetat glasial.
Alat. Peralatan yang digunakan dalarn penelitian ini terdiri dali : (1)
peralatan kultivasi sel: laminar air flow, inkubator, sentrifus ; (2) peralatan
pembekuan dan penyimpanan: cryotube, deepfreezer, (3) peralatan analisis: water
bath, spektrofotometer, buret, colony counter, pH meter ; (4) peralatan lain: test
tube, tabung sentrifus, tabung eppendor$ cawan petri, rnikropipet, autoklaf, oven,
paper disc, hockey stick, ose, neraca analitik dan peralatan lain.
Metode
Penelitian ini secara garis besar terdiri atas tiga tahap, yaitu: (1) tahap
pembekuan, (2) tahap penyimpanan dan (3) tahap formulasi kultur starter. Bagan
tahapan penelitian disajikan pada Lampiran 1.
Pembekuan dilakukan terhadap empat strain bakteri asam laktat yang
merupakan isolat dari dadih asal Bukittinggi, yang pada penelitian sebelumnya
diketahui memiliki sifat antimutagenik yang batk. Empat strain tersebut adalah
Lactococcus lactis subsp lactis R-22, Leuconostoc paramesenteroides R-51,
Lactobacillus casei subsp casei R-52 dan Leuconostoc paramesenteroides R-62.
Kultivasi sel terhadap masing-masing strain dilakukan sebelum pembekuan yang
prosedumya dapat dilihat pada Lampiran 2.
Pada proses pembekuan selanjutnya diarnati pengaruh dua faktor, yaitu
faktor metoda pembekuan dan faktor jenis cryoprotectant terhadap viabilitas,
aktivitas proteolitik dan kemarnpuan pembentukan asam laktat. Faktor metoda
pembekuan terdiri dari pembekuan cepat dengan pencelupan dalam larutan dry-ice
ethanol selama empat menit dan pembekuan larnbat dalam deepfleezer pada suhu
-20°C. Faktor jenis cryoprotectant terdiri dari gliserol 10 persen, DMSO 10
persen, susu skim 10 persen dan larutan bufer fosfat, pH 7 ( prosedur penyiapan
suspensi pembekuan dapat dilihat pada Lampiran 3 ). Percobaan ini
dikelompokkan menjadi dua kondisi pembekuan yaitu sebelwn dan sesudah
pembekuan. Pengamatan dilakukan terhadap masing-masing sampel sebelum dan
sesudah pembekuan yang meliputi viabilitas, aktivitas proteolitik dan
pembentukan asam laktat ( prosedur analisisnya dapat dillhat pada Lampiran 4, 5
dan 6 ).
Penyimpanan dilakukan terhadap keempat strain bakteri asam laktat yang
masing-masing telah lbekukan dengan perlakuan dua metoda pembekuan dan
empat jenis cryoprotectant yang berbeda. Percobaan tahap penyimpanan ini
bertujuan
untuk mengetahui pengaruh metoda pembekuan dan jenis
cryoprotectant terhadap viabilitas, aktivitas proteolitik dan kemampuan
pembentukan asam laktat. Penyimpanan dikelompokkan m e n j d dua kondisi
suhu penyimpanan yaitu yaitu -20°C dan -70°C dalam deep fleezer. Pengamatan
dilakukan setiap dua rninggu selama delapan minggu. Data yang diperoleh
dianalisis dengan menggunakan andisis sidik ragam, bila terdapat perbedaan
diantara perlakuan dilanjutkan dengan uji Duncan Multiple Test.
Dari hasil pembekuan dan penyimpanan beku tersebut akan diperoleh
strain bakteri asam laktat yang memiliki daya tahan terbaik. Selanjutnya strain
tersebut dicobakan untuk pembuatan kultur starter dengan tiga macam formulasi
media, yaitu susu skim 10 persen + glukosa 3 persen, susu kedelai + glukosa 3
persen dan air kelapa + glukosa 3 persen. Inkubasi dilakukan selama 24 jam pada
suhu ruang, dan setiap selang tiga jam diamati viabilitas dan kemampuan
pembentukan asam laktatnya. Penentuan forrnulasi media terbaik didasarkan pada
kecepatan tercapainya akhir fase logaritmik bakteri asam laktat tersebut selama
waktu inkubasi.
Rancangan Percobaan
Penelitian ini akan dilakukan dalam tiga tahap yaitu tahap pembekuan,
tahap penyimpanan dan tahap formulasi media kultur starter. Data hasil penelitian
tahap pertarna dan kedua dianalisis secara statistik, sedang data hasil penelitian
tahap ketiga akan dianalisis dengan mempertimbangkan kecepatan tercapainya
akhir fase logaritmik bakteri asarn laktat tersebut selama waktu inkubasi.
Pengaruh metoda pembekuan dan jenis cryoprotectant terhadap daya simpan
kultur bakteri asam laktat pada suhu penyimpanan yang berbeda
Rancangan percobaan yang digunakan yaitu Rancangan Acak Lengkap
Pola Faktorial.
Rumus : Y i j =
~ p + K;+ Aj + Bk+ CI+ ABjk+ ACjl + BC ld + ABCjld+ Eijkl
Yijkl
= respon percobaan karena pengaruh bersama taraf ke-j dari faktor A,
taraf ke-k dari faktor B, taraf 1dari faktor C, yang terdapat pada
kelompok ke-i
=
pengaruh
rata-rata yang sebenarnya
C1
= pengaruh taraf ke-i, kelompok K (i=1,2)
Ki
=
pengaruh taraf ke-j, faktor A (i=1,2)
Aj
= pengaruh taraf ke-k, faktor B (k=1,2,3,4)
Bk
= pengaruh tarafke-1, faktor C (1=1,2,3,4)
CI
(AB)jk = pengaruh interaksi antara taraf ke-j faktor A, dan taraf ke-k faktor B
(AC)jl = pengaruh interaksi antara taraf ke-j faktor A, dan taraf ke-1 faktor C
(BC)kl = pengaruh interaksi antara taraf ke-k faktor B, dan taraf ke-1 faktor C
(ABC)j~=pengaruh interaksi antara taraf ke-j faktor A, taraf ke-k faktor B dan
taraf ke-1 faktor C
= pengaruh dari unit percobaan ke-i dalam kombinasi perlakuan (ijk),
Eiu
i= 1,2
Perlakuan. Perlakuan pada penelitian ini terdiri dari tiga faktor, yaitu :
(1) Metode pembekuan (Faktor A), terdiri dari dua tar& yaitu :
a, = metode pembekuan cepat (dengan pencelupan dalam larutan
dry ice-ethanol selarna empat menit)
a2 = metode pembekuan lambat (dalam deepfreezer pada suhu -20°C)
(2) Jenis cryoprotectant (Faktor B), terdiri dari empat tar&, yaitu :
bl = bufer fosfat, pH 7 (kontrol)
b2 = gliserol 10 persen
b3 = dimethylsulfoxzide (DMSO) 10 persen
bh = skim 10 persen
Kelompok. Kelompok pada tahap kedua penelitian ini terdiri dari dua
taraf, yaitu :
2
1
= penyimpanan pada
= penyimpanan pada
Pengamatan.
suhu -20°C
suhu -70°C
Pengamatan akan dilakukan terhadap sampel-sampel
berikut :
(1) sampel sebelum pembekuan
(2) sampel beku setelah penyimpanan 0,2,4,6,8 rninggu
Analisis. Parameter yang dianalisis dalam penelitian ini meliputi :
(I) Uji viabilitas (To dan Etzel, 1997)
(2) Uji produksi asam laktat (Metoda Mann 's Acid Test)
(3) Uji aktivitas proteolitik (Metoda Bergmeyer dan Grassl, 1983)
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pembekuan dan Penyimpanan Beku Kultur Bakteri Asam Laktat
Kultur bakteri asam laktat dibekukan dengan perlakuan dua metoda
pembehan dan empat jenis cryoprotectant. Metoda pembehan terdiri dari
pembekuan cepat dan pembekuan lambat, jenis cryoprotectant terdiri dari gliserol
10 persen, DMSO 10 persen dan susu skim 10 persen dengan bufer fosfat pH 7
sebagai kontrol. Dari hasil pembekuan tersebut, selanjutnya kultur disimpan pada
dua kondisi suhu yang berbeda yaitu -20°C dan -70°C dalam deeppeezer.
Hasil pengamatan viabilitas, total asam dan aktivitas proteolitik kultur
bakteri asam laktat sebelum dan sesudah penyimpanan serta selama penyimpanan
8 minggu, dapat dilihat pada Lampiran 7, 8 dan 9.
Viabilitas kultur bakteri asam laktat selama penyimpanan beku
Hasil analisis ragam viabilitas kultur bakteri asam laktat selama
penyimpanan beku dapat dilihat pada Lampiran 10. Dari hasil analisis tersebut
diperoleh bahwa metoda pembekuan dan jenis cryoprotectant masing-masing
berpengaruh terhadap viabilitas kultur bakteri asam laktat. Tetapi tidak demikian
halnya untuk interaksinya. Faktor suhu penyimpanan juga tidak berpengaruh pada
viabilitas kultur bakteri asam laktat. Hasil uji Duncan pengaruh metoda
pembekuan dan jenis cryoprotectant masing-masing terhadap viabilitas kultur
bakteri asam laktat selama penyimpanan beku dapat dilihat pada Tabel 1 dan 2.
Berdasarkan Tabel 1 dan 2, terlihat bahwa. kultur bakteri laktat strain
Lactobacillus casei subsp casei R-52 memiliki viabilitas yang paling tinggi pada
pembekuan cepat dan pada penambahan gliserol 10 persen. Hal ini apabila
dibandingkan dengan viabilitas ketiga strain yang lain.
Tabel 1. Pengaruh metode pembekuan pada viabilitas kultur bakteri asam
laktat selama penyimpanan beku
I
Perlakuan
R-22
Rata-rata viabilitas (%)
R-5 1
R-52
R-62
Metode cepat
95,0953'
94,0722'
98,l 022'
94,8840'
Metode lambat
91,5034b
90,6363~
92,2531
90,7 172"
Keterangan : huruf yang sama pada kolom yang sama berarti tidak berbeda nyata
R-22= Lactococcus lactis subsp. Lactis R-22
R-5 1= Leuconostoc paramesenteroides R-5 1
R-52= Lactobacillus casei subsp casei R-52
R-62= Leuconostoc paramesenteroides R-62
Tabel 2. Pengaruh jenis cryoprotectant pada viabilitas kultur bakteri asam
laktat selama penyimpanan beku
Rata-rata viabilitas (%)
Perlakuan
R-22
R-5 1
R-52
R-62
Kontrol
89,6650~
90,7131b
88,5325'
87,5238'
Gliserol 10%
94,0588'
94,9575'
96,1588"
95,5756a
DMSO 10%
94,783 1"
96,0350"
94,3 1Oob
94,7881'
Skim 10%
94,0906'
88,9113~
91,8294'
93,3706~
Keterangan : huruf yang sama pada kolom yang sama berarti tidak berbeda nyata
R-22= Lactococcus lactis subsp. Lactis R-22
R-5 1= Leuconostoc paramesenteroides R-5 1
R-52= Lactobacillus casei subsp casei R-52
R-62= Leuconostoc paramesenteroides R-62
Metoda pembekuan cepat temyata lebih dapat menstabilkan viabilitas
kultur bakteri asarn laktat selama delapan minggu penyimpanan. Demikian pula
23
pemakaian gliserol 10 persen ternyata juga lebih dapat menstabilkan viabilitasnya.
Hal ini akan lebih jelas terlihat pada Garnbar 1 dan 2.
Fast = pembekuan cepat
Slow= pembekuan lambat
0
2
4
8
Lama penyimpanan (minggu)
Garnbar 1.
Viabilitas Lactobacillus casei subsp casei R-52
setelah pembekuan dengan variasi metoda pembekuan
selarna penyimpanan beku
Metoda pembekuan cepat dapat mempertahankan viabilitas selama
penyimpanan, karena pada proses pembekuan cepat cairan sel dapat segera
membeku, sehingga dehidrasi cairan sel dapat dihindari. Terbentuknya kristal es
intraseluler sebenarnya dapat memacu kerusakan struktural sel yang akan
menyebabkan kematian sel. Dengan penarnbahan gliserol 10 persen, terbentuknya
knstal es tersebut dapat dirninirnalkan. Karena gliserol adalah jenis cryoprotectant
dengan bobot molekul rendah yang dapat berpenetrasi ke dalam sel dan dapat
membentuk ikatan hidrogen dengan air maupun dengan komponen struktur sel
(Meryrnan, 1966).
Keterangan :
K
=
kontrol, tanpa
G = gliserol 10 persen
D = DMSO 10 persen
S = susu skim 10 persen
Gambar 2.
Viabilitas Lactobacillus casei subsp casei R-52
setelah pembekuan dengan variasi jenis cryoprotectant
selama penyimpanan beku
Pembentukan asam laktat kultur bakteri asam laktat selama penyimpanan
beku
Hasil analisis ragam pembentukan asam laktat kultur bakteri asam laktat
selama penyimpanan beku dapat dilihat pada Lampiran 11. Dari hasil analisis
tersebut diperoleh bahwa hanya metoda pembekuan yang berpengaruh terhadap
pembentukan asam laktat kultur bakteri asam laktat. Sedang, jenis cryoprotectant
tidak mempengaruhi kemampuan pembentukan asam laktat selama 8 minggu
penyimpanan beku. Faktor suhu penyimpanan juga tidak berpengaruh pada
kemampuan pembentukan asam laktat kultur bakteri asam laktat. Hasil uji Duncan
pengaruh metoda pembekuan terhadap kemampuan pembentukan asam laktat
kultur bakteri asam laktat selama penyimpanan beku dapat dilihat pada Tabel 3.
Berdasarkan Tabel 3, terlihat bahwa kultur bakteri laktat strain
Lactobacilius casei subsp casei R-52 memiliki total asam yang paling tinggi pada
pembekuan lambat. Hal ini apabila dibandingkan dengan kemampuan
pembentukan asam laktat dari ketiga strain yang lain pada kondisi yang sama
Tabel 3. Pengaruh metode pembekuan pada kemampuan pembentukan asam
laktat kultur bakteri asam laktat selama penyimpanan beku
I
Rata-rata total asam (%)
Perlakuan
R-22
R-5 1
R-52
R-62
Metode cepat
0,833~
1,057~
1, 12gb
l,OOlb
Metode lambat
1,425"
I
.
1 ,42ga
1,351a
I
I
1,336'
I
Keterangan : huruf yang sama pada kolom yang sama berarti tidak berbeda nyata
R-22= Lactococcus lactis subsp. Iactis 8-22
R-5 1= Leuconostoc paramesenteroides R-5 1
R-52= Lactobacillus casei subsp casei 8-52
R-62= Leuconostoc paramesenteroides R-62
Hasil uji Duncan terhadap rata-rata hasil perhitungan juga memperlihatkan
bahwa metode pembekuan lambat cenderung lebih dapat memacu kemampuan
kultur bakteri asarn laktat untuk membentuk asam laktat selama 8 minggu
penyimpanan beku. Hal ini akan lebih jelas terllhat pada Gambar 3, untuk strain
Lactobacillus casei subsp casei R-52.
Pembekuan lambat dapat memacu pembentukan asam laktat setelah
dibekukan dan tetap stabil selama pmyimpanan 8 minggu; ha1 ini dik&enakm
sekalipun proses pembekuan lambat menyebabkan p e n m a n viabilitas kultur
yang nyata dibandingkan dengan proses pembekuan cepat (Tabel I), namun
keadaan
demikian tidak berpengaruh pada
penman
I
kemampuannya
menghasilkan asam laktat. Pembekuan lambat menyebabkan terkonsentrasinya
ion intraseluler; konsentrasi elektrolit yang meningkat akan mempengaruhi
membran lipid yang akan dapat mengakibatkan kebocoran sel dan memungkinkan
I
keluarnya sebagian enzim 8-galaktosidase yang tetap aktif sehingga lebih
mengaktifkan pembentukan asam laktat, sekalipun selnya telah rnati.
Keteranaan :
Fast = pembekuan cepat
Slow=pembekuan lambat
0.2
0
2
4
8
0
Lama penyirnpanan (rninggu)
Gambar 3.
Kemampuan pembentukan asam laktat kultur Lactobacillus
casei subsp casei R-52 setelah pembekuan dengan variasi
metoda pembekuan selama penyimpanan beku
Di dalam Surono (2000) dilaporkan bahwa aktivitas D-galaktosidase dari
kultur LactobaciIIus casei subsp casei R-52 leblh stabil pada pembekuan dan
penyimpanan dalam larutan nitrogen selama 30 hari dibandingkan dengan
pembekuan dalam larutan dry-ice aceton pada kondisi penyimpanan yang sama.
Namun aktivitas D-galaktosidase selama penyimpanan tersebut lebih dipengardu
oleh tingkat viabilitas yang tinggi dari hail pembekuan cepat dalam larutan
nitrogen.
Dengan dernikian tingkat kernampuan pembentukan asam laktat selama
penyimpanan lebih disebabkan oleh tersedianya Bgalaktosidase yang mash H
di dalam substrat.
Aktivitas proteolitik kultur bakteri asam laktat selama penyimpanan beku
Hasil analisis ragam aktivitas proteolitik kultur bakteri asam laktat selama
penyimpanan beku dapat dilihat pada Lampiran 12. Dari hasil analisis tersebut
diperoleh bahwa metoda pembekuan dan jenis cryoprotectant masing-masing
berpengaruh terhadap aktivitas proteolitik kultur bakteri asam laktat. Tetapi tidak
demikian halnya untuk interaksinya. Faktor suhu penyimpanan berpengaruh pada
aktivitas proteolitik kultur bakteri asam laktat. Hasil uji Duncan pengaruh metoda
pembekuan, jenis cryoprotectant dan suhu penyimpanan masing-masing terhadap
aktivitas proteolitik kultur bakteri asam laktat selama penyimpanan beku dapat
dilihat pada Tabel 4, 5 dan 6.
Tabel 4. Pengaruh metode pembekuan pada aktivitas proteolitik kultur bakteri
asam laktat selama penyimpanan beku
Rata-rata aktivitas proteolitik (UA)
Perlakuan
R-22
R-5 1
R-52
R-62
Metode cepat
0,048"
0,046"
0,049"
0,062"
Metode lambat
0,043~
0,037~
0,043~
0,052~
Keterangan : huruf yang sama pada kolom yang sama berarti tidak berbeda nyata
R-22= Lactococcus lactis subsp. lactzs R-22
R-5 1= Leuconostoc paramesenteroides R-5 1
R-52= Lactobacillus casei subsp casei R-52
R-62= Leuconostoc paramesenteroides R-62
.
.
Tabel 5. Pengaruh jenis cryoprotectant pada aktivitas proteolitik kultur bakteri
asam laktat selama penyimpanan beku
Rata-rata aktivitas proteolitik (UA)
Perlakuan
R-22
R-5 1
R-52
R-62
Kontrol
0,05 la
0,047a
0,05 lb
0,054~
Gliserol 10%
0,052a
0,048a
0,060a
O,06ga
DMSO 10%
0,041"
0,040~
0,038'
0,055~
Skim 10%
0,037'
0,033C
0,04 1'
0,049'
Keterangan : huruf yang sama pada kolom yang sama berarti tidak berbeda nyata
R-22= Lactococcus Iactis subsp. lactis R-22
R-5 1= Leuconostoc paramesenteroides R-5 1
R-52= LactobaciIIus casei subsp casei R-52
R-62= Leuconostoc paramesenteroides R-62
Tabel 6. Pengaruh suhu penyimpanan pada aktivitas proteolitik kultur bakteri
asam laktat selama penyimpanan beku
Rata-rata aktivitas proteolitik (UA)
Kelompok
R-22
R-5 1
R-52
R-62
-20°C
0,043~
0,041~
0,045~
0,055~
-70°C
0,047a
0,043a
0,047a
0,058'
Keterangan : huruf yang sama pada kolom yang sama berarti tidak berbeda nyata
R-22= Lactococcus Iactis subsp. Iactis R-22
R-5 1= Leuconostoc paramesenteroides R-5 1
R-52= LactobaciIIus casei subsp casei R-52
R-62= Leuconostoc paramesenteroides R-62
Berdasarkan Tabel 4, 5 dan 6, terlihat bahwa kultur bakteri laktat strain
Leuconostoc paramesenteroides R-62 memiliki aktivitas proteolitik yang paling
tinggi pada pembekuan cepat, pada penambahan gliserol 10 persen dan pada
penyimpanan suhu -70°C. Hal ini apabila dibandingkan dengan aktivitas
proteolitik ketiga strain ymg lain pada kondisi yang sama.
29
Hasil uji Duncan terhadap rata-rata perhitungan memperlihatkan bahwa
metode pembekuan cepat dan pemakaian gliserol 10 persen masing-masing secara
terpisah cenderung lebih dapat mempertahankan
aktivitas proteolitik kultur
bakteri asam laktat selama 8 rninggu penyimpanan.
Demikian pula suhu
penyimpanan -70°C lebih dapat mempertahankan aktivitas proteolitik kultur
bakteri asam laktat dibandingkan dengan suhu penyimpanan -20°C. Hal ini juga
dapat lebih jelas terlihat pada Gambar 4, 5 dan 6, untuk strain Lact